ITMI20000332A1 - Mezzi e metodi per l'espressione di proteine omologhe ed eterologhe in ceppi di rhodococcus - Google Patents

Mezzi e metodi per l'espressione di proteine omologhe ed eterologhe in ceppi di rhodococcus Download PDF

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Ferra Francesca De
Y Ros Immaculada Margarit
Francesco Rodriguez
Luca Paolo Serbolisca
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Description

"Mezzi e metodi per l’espressione di proteine omologhe ed eterologhe in ceppi di Rhodococcus"
Descrizione
La presente invenzione riguarda un vettore plasmidico di Rhodococcus, un nuovo promotore costitutivo, un vettore ad espressione contenente detto promotore, microrganismi trasformati con il vettore ad espressione e loro impiego per la produzione di proteine.
I batteri del genere Rhodococcus rivestono un notevole interesse nel campo della biodegradazione e della biotrasformazione di composti organici (Warhurst and Fewson, 1994, Crit. Rev. Biotechnol., 14:29-73).
Sono noti, ad esempio, processi che utilizzano ceppi di Rhodococcus per la rimozione selettiva di zolfo organico da combustibili fossili, (US 5,358,870, US 5,132,219, PCT/US92/01868, EP-445896) e per la produzione di enzimi coinvolti nell’ottenimento di acrilammide (Kobayashi et al., 1992, Tends Biotechnol., 10:402-408), acidi carbossilici, L-amminoacidi (WO9804733) ed enantiomeri di composti chirali (US5672504).
II principale fattore limitante nell'ottimizzazione di processi di biocatalisi che utilizzano questi batteri è, tuttavia, la mancanza di idonei strumenti genetici.
Con questo termine si intendono vettori ad espressione in Rhodococcus che:
- siano presenti nelle cellule in copie multiple;
- siano mantenuti stabilmente all'interno delle cellule in assenza di costosi agenti selettivi (ad esempio antibiotici), che incidono considerevolmente sull'economicità di un processo industriale; e
- contengano un promotore forte, cioè in grado di consentire un’ efficiente espressione di un gene, oppure un promotore forte costitutivo che non richieda l’uso di induttori e non sia suscettibile ai repressori.
Infatti, un limite nella rimozione di zolfo organico da combustibili fossili con ceppi di Rhodococcus che producono il complesso enzimatico sox, è dovuto alla presenza, a monte dei corrispondenti geni, di un promotore fortemente inibito da solfato.
Per superare questo inconveniente, i geni codificanti tale, complesso enzimatico sono stati posti in vettori di Rhodococcus sotto il controllo di promotori eterologhi costitutivi quali quello del gene per la resistenza al cloramfenicolo di Rhodococcus fascians (Piddington, C.S. et al., 1995, Appi, and Env. Microbiol., 61,2,:468-475) o del gene sacB di B.subtilis (Denis-Larose, C. et al, 1998, Appi, and Env. Microbiol., 64,11:4363-4367) e del gene per la resistenza alla Kanamicina di E.coli (Serbolisca et al Appi, Microbiol. Biothecnol. 1999, 52:122-126). Il mantenimento dei vettori, tuttavia, richiedeva la presenza di un agente selettivo nel mezzo di coltura e, inoltre, l'espressione dell'operone sox posto sotto il controllo del promotore sac B risultava molto bassa (Lau. P. et al. 1999 ACS Fuel Chem. :32- 33).
E' stato ora trovato che gli inconvenienti della tecnica nota sopra discussi possono essere superati mediante il vettore ad espressione della presente invenzione.
In accordo con ciò, costituisce un primo scopo della presente invenzione il vettore plasmidico di clonaggio pSM843 stabile in Rhodococcus.
Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione un nuovo promotore costitutivo di Rhodococcus in grado di dirigere l'espressione di un gene omologo od eterologo con elevata efficienza e caratterizzato dalla sequenza SEQ. ID. No 2.
Costituisce un ulteriore scopo della presente invenzione un vettore ad espressione in Rhodococcus che comprende detto promotore costitutivo.
Costituisce inoltre uno scopo della presente invenzione un ceppo di Rhodococcus trasformato con detto vettore ad espressione .
Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione un procedimento per la produzione di proteine omologhe od eterologhe in batteri di Rhodococcus trasformati con detto vettore ad espressione.
Ulteriori scopi della presente invenzione appariranno evidenti dalla lettura della descrizione e dagli esempi che seguono.
Breve descrizione delle figure
Figura 1: Si riporta la mappa di restrizione del plasmide di 11 kb pSM841.
Figura 2: Si riporta la mappa di restrizione del plasmide di 7,3 :<b pSM843.
Figura 3: Si riporta la mappa di restrizione del plasmide di E ,coli pSM839.
Figura 4: Si riporta la mappa di restrizione del plasmide pSM846.
Figura 5: Si riporta la mappa di restrizione del plasmide di pSM847 .
In particolare, il vettore ad espressione secondo la presente invenzione comprende:
(a) i geni rep e trbA che codificano per proteine implicate nella replicazione in Rhodococcus;
(b) un gene denominato parA il cui prodotto risulta necessario per il mantenimento del plasmide in assenza di pressione selettiva ed è caratterizzato dalla sequenza SEQ ID.No 1;
(c) un promotore costitutivo di Rhodococcus avente la sequenza SEQ. ID. No 2;
(d) un sito di clonaggio multiplo a valle del promotore; ed (e) almeno un gene che codifica per un marcatore genetico scelto, ad esempio, tra i geni dell'operone cad (SEQ. ID. No 3), che conferiscono la resistenza al cadmio oppure .i geni che codificano per la resistenza ad un antibiotico.
Il vettore ad espressione contiene, inoltre, l'origine di replicazione in E.coli e può quindi essere impiegato come vettore shuttle in Rhodococcus ed E.coli.
Il vettore ad espressione, indicato qui di seguito pSM846, è stato ottenuto mediante:
(1) costruzione del vettore di clonaggio pSM843;
(2) isolamento di un promotore costitutivo di Rhodococcus; ed
(3) inserimento di detto promotore costitutivo nel vettore pSM843.
Il vettore plasmidico pSM843 è stato preparato mediante riduzione delle dimensioni del plasmide di 130 kb di Rhodococcus sp. DS7 contenente l'operone sox, i geni che conferiscono resistenza al cadmio, e quelli per la resistenza all'arsenico (Margarit et al. 1997 and Serbolisca et. al, 1999). Tale riduzione è stata effettuata mediante la seguente strategia:
(a) ricerca di plasmidi derivati da delezione del plasmide di 130 kb in seguito a trasformazione di un ceppo ricevente ed isolamento di un plasmide di 22 kb;
(b) digestione di detto plasmide con opportuni enzimi di restrizione, self-ligasi ed isolamento del plasmide di 11 kb PSM841;
(c) caratterizzazione del plasmide ottenuto in (b) e
(d) costruzione del plasmide pSM843 di 7.3 kb contenente almeno un marcatore genetico ed i geni parA, rep e trbA necessari, rispettivamente, per la stabilità e replicazione in Rhodococcus.
Dopo ogni riduzione è stata controllata la stabilità dei vettori ottenuti in modo da selezionare solo quelli che erano mantenuti in almeno il 90% di cellule del ceppo ospite per almeno 30-40 generazioni, in terreno completo ed in assenza di pressione selettiva.
Per la costruzione del vettore ad espressione è stata effettuata una ricerca di promotori costitutivi all'interno del cromosoma di un ceppo di Rhodococcus utilizzando un nuovo metodo, che rientra tra gli scopi della presente invenzione.
Tale metodo si basa sull'osservazione che ceppi di Rhodococcus possiedono la capacità di integrare casualmente frammenti di DNA estraneo nel proprio cromosoma, senza che sia necessaria una omologia di sequenza superiore a 3 bp fra il DNA donatore e quello dell'ospite. L'efficienza di integrazione è stata stimata intorno a 10<2 >-10<3 >colonie per μg di DNA in esperimenti di trasformazione di cellule di Rhodococcus .
Il metodo consiste nel:
(i) trasformare un ceppo di Rhodococcus direttamente con un gene reporter privo del proprio promotore oppure con un plasmide multicopie di E.coli contenente tale gene e linearizzato a monte del gene reporter;
(ii) selezionare i cloni che esprimono tale gene, cioè i cloni che hanno integrato nel proprio cromosoma il gene reporter a valle di una sequenza promotore;
(iii) digerire il DNA cromosomale dei cloni selezionati con enzimi di restrizione che tagliano a monte ed a valle del gene;
(iv) amplificare il DNA ottenuto nello stadio (III); e (v) sequenziare il promotore a monte del gene reporter.
Con gene reporter si intende un frammento di DNA che codifica per un prodotto che consente la selezione dei cloni che lo esprimono. Esempi di geni reporter utili a tale scopo possono essere scelti tra quelli che codificano per la resistenza ad antibiotici o metalli pesanti o per enzimi quali XylE o le stesse proteine Sox.
Rispetto alle tecniche attualmente utilizzate, questo metodo è più efficiente e veloce, in quanto non richiede la preparazione di banche genomiche con frammenti di DNA cromosomale a monte del gene reporter. Tale metodo può essere applicato a tutti quei microrganismi che come Rhodococcus sono in grado di integrare casualmente frammenti di DNA estraneo nel proprio cromosoma senza la necessità di una elevata omologia di sequenza fra il DNA donatore e quello dell'ospite.
Con questo metodo è stato identificato un promotore costitutivo di un gene di Rhodococcus avente la sequenza SEQ. ID.No 2. Tale promotore è stato inserito nel vettore plasmidico pSM843, ottenendo il vettore ad espressione pSM846 che può essere utilizzato per la produzione di proteine di interesse in Rhodococcus.
La stabilità segregazionale e strutturale del vettore ad espressione pSM846 in ceppi di Rhodococcus è stata determinata operando come riportato nell'esempio 4. I risultati hanno evidenziato che il vettore viene mantenuto in più del 90% della popolazione cellulare anche dopo successivi passaggi in coltura in assenza di agenti selettivi, dimostrando così una notevole stabilità segregazionale .
Inoltre, l'analisi dei plasmidi isolati dai ceppi trasformati ha evidenziato che, anche dopo diverse generazioni in coltura liquida, questo plasmide si mantiene strutturalmente stabile in ceppi diversi di Rhodococcus con un numero di copie per cellula da 4 a 8.
Il vettore ad espressione della presente invenzione può essere utilizzato per l'espressione di geni che codificano per proteine di interesse quali ad esempio, gli enzimi coinvolti nella rimozione selettiva di zolfo organico da combustibili fossili (SoxA, SoxB, SoxC, SoxD) produzione di L-amminoacidi (amidasi, aspartasi), produzione di enantiomeri di composti chirali (epossido idrolasi, ketoesteroriduttasi) , produzione di acidi carbossilici (nìtrilasi), etc.
Il vettore ad espressione può essere utilizzato in varie specie di Rhodocogcus ed in batteri filogeneticamente vicini quali Gordona e Nocardia.
La capacità del promotore di dirigere l'espressione costitutiva del gene posto sotto il suo controllo è stata verificata ponendo a valle di tale promotore l'operone sox isolato secondo quanto riportato da Serbolisca, L., de Ferra, F., Margarit, I., Appi. Microbiol. Biotechnol., 1999.
52: 122-126.
I risultati ottenuti hanno dimostrato che questo promotore consente un'espressione efficiente e costitutiva delle proteine SoxA, SoxB e SoxC in presenza di zolfo inorganico nel mezzo di coltura.
I ceppi contenenti i vettori pSM843, pSM846 e pSM847 sono stati depositati presso il Centraalbureau Voor Schimmelcultures come Rhodococcus SMV 112, SMV 113 e SMV 114 dove hanno ricevuto rispettivamente i numeri CBS 102445, 102446 e 102447.
Nella sperimentazione che segue sono stati impiegati:
- il plasmide di 130 Kb contenente l'operone sox che codifica per gli enzimi responsabili della conversione del dibenzotiofene (DBT) a 2-idrossibifenile, ed i geni che codificano per la resistenza al cadmio ed all'arsenico. Tale plasmide è stato isolato dal ceppo Rhodococcus sp. DS7 (Margarit, I. et al., 1997, 9<th >Proceedings of thè International Conference on Coal Science:1579-1582);
- il plasmide pSM789, incapace di replicarsi in Rhodococcus, ottenuto inserendo nel plasmide di E. coli pUC18 il frammento HindiII-EcoRI di 4549 bp che contiene l'operone sox privo di promotore isolato da Rhodococcus sp. DS7 (Margarit, I. et al., 1997, 9<th >Proceedings of thè International Conference on Coal Science:1579-1582) .
Il ceppo Rhodococcus sp. DS7 era stato precedentemente classificato come Arthrobacter sulla base di saggi microbiologici (D'Addario 1996 Proceedings of thè Symposium AAA Biotechnology . Shejbal, E. ed. Ferrara:139-149) . Successivamente, il confronto della sequenza del DNA 16 S con quelle delle banche dati ha indicato che il ceppo apparteneva al genere Rhodococcus . Le omologie più consistenti sono state trovate con Rhodococcus erithreus e Rhodococcus erythropolis .
- il ceppo Rhodococcus DS-2, ottenuto da Rhodococcus sp. DS7, incapace di desolforare perché privo del plasmide di 130 kb (Margarit, I. et al., 1997, 9<th >Proceedings of thè International Conference on Coal Science:1579-1582).
Gli esempi sperimentali che seguono sono illustrativi e non limitativi per l'invenzione stessa.
Esempio 1
Costruzione del vettore plasmidico pSM843
Cellule elettrocompetenti di Rhodococcus DS-2 (100 μl) (BIORAD Gene Pulser TM, 400 ohm, 25 uF) sono state trasformate con il plasmide di 130 kb (100 ng). I cloni ricombinanti sono stati selezionati su piastre di LB-agar addizionato con 0,5 mM di CdCl2 e poi piastrati su terreno minimo (10 g/1 KH2PO4 pH 7.4, 2.5 g/1 NH4Cl, 0.2 g/1 MgCl2 .6H2O, 0.02 g/1 CaCl2, 0.01 g/1 FeCl3, 0.005 g/1 MnCl2.2H20, 0.003 g/1 ZnCl2, 0.0009 g/1 CuCl2.2H2O, agarosio 0,8%} contenente dibenzotiofene (DBT) come unica fonte di zolfo. Uno dei cloni cadmio resistenti risultava incapace di desolforare il DBT. Da questo clone è stato estratto il DNA plasmidico che, esaminato su gel di agarosio allo 0.7%, mostrava delle dimensioni di circa 100 kb.
Operando come sopra descritto, dalla trasformazione di DS-2 con il plasmide di 100 kb se ne è ottenuto uno di 35 kb che non conferiva più la resistenza all'arsenico e da questo uno di 22 kb.
Per i tre vettori è stata controllata la stabilità plasmidica, in modo da selezionare solo quelli che venivano mantenuti nel ceppo ospite per almeno 30-40 generazioni in assenza di pressione selettiva.
Il plasmide di 22 kb {1 μg) è stato digerito con 4 U dell'enzima di restrizione Sex AI (Boehringer), in 10 μl dei sali forniti dal produttore, incubando per 60 minuti a 37°C e 15 minuti a 70°C. Il plasmide linearizzato (2 μl) è stato self-ligato in 10 μl di tampone, in presenza di 1 U di T4 DNA ligasi, per 16 ore a 16°C. 1 μl della miscela di ligasi è stato utilizzato per trasformare cellule elettrocompetenti DS-2 . Da uno dei cloni contenenti plasmidi di dimensioni ridotte, è stato isolato un plasmide di 18.7 kb. Questo plasmide è stato digerito con l'enzima EcoRI ottenendo un vettore di 15.8 kb che è stato ulteriormente ridotto mediante digestione con gli enzimi SspI e Dral, che lasciano estremità tronche.
Il plasmide risultante di 11 kb, denominato pSM841 (figura 1), è stato sequenziato ed ha rivelato la presenza:
- dell’operone cad che conferisce la resistenza al cadmio e avente la sequenza SEQ. ID.No.3;
- i geni rep, ORF81 e trbA codificanti proteine implicate nella replicazione descritti da Denis-Larose, C. et al, 1998, Appl, and Env. Microbiol., 64,11:4363-4367. Tra questi due geni è stata identificata una sequenza di 15 bp che, per omologia còn altre sequenze, potrebbe corrispondere all'origine di replicazione del plasmide; ed
- un gene parA la cui sequenza (SEQ ID No. 1) mostra una omologia parziale con quella di geni implicati nella ripartizione dei plasmidi che ha luogo durante la divisione cellulare. A monte di questo gene sono state identificate 2 sequenze ripetute di 24 bp ciascuna.
Per confermare l'importanza della regione di DNA contenente il gene parA nel mantenimento di pSM841, è stato costruito un plasmide di 8.8 kb privo di tale regione. I risultati hanno evidenziato una riduzione della stabilità plasmidica superiore al 50%.
Una volta identificati i geni indispensabili per il mantenimento del plasmide pSM841, è stato costruito un vettore di 7.3 kb contenente:
1- un frammento Dral-EcoRI di 2717 bp comprendente l'operone cad;
2- un frammento Sspl-Ncol di 2716 bp comprendente i geni trb A e rep A;
3- un frammento EcoRI-NcoI di 1857 bp comprendente il gene par A ed un sito di clonaggio multiplo (MCS).
Tali frammenti sono stati isolati dal plasmide pSM841 mediante amplificazione e poi ligati in presenza di T4 DNA ligasi a 16°C per una notte.
Il plasmide risultante, denominato pSM843, ha la mappa di restrizione riportata in figura 2.
Esempio 2
Isolamento del promotore costitutivo
Il plasmide pSM789 (5 μg) è stato digerito con 40 Unità (U) dell'enzima di restrizione HindlII (Boehringher) in 50 μl di tampone fornito dalla casa produttrice.
Dopo incubazione a 37°C per 60 minuti è stata effettuata la denaturazione/estrazione delle proteine aggiungendo un volume di fenolo-cloroformio (1:1) ed un volume di cloroformio :isoamil alcol (23:1). Il DNA è stato quindi precipitato aggiungendo alla fase acquosa 5 μl di una soluzione 3 M di Na-acetato e 300 μl di etanolo e poi risospeso in 10 μl di H2O. In questo modo si è ottenuto un plasmide lineare aperto esattamente a monte della regione RBS del primo gene dell'operone sox (sox A).
Il DNA linearizzato (0.2 μg) è stato utilizzato per trasformare 100 μl di cellule di Rhodococcus sp. DS-2 ed i trasformanti sono stati poi selezionati su piastre di terreno minimo contenente 0.04 g/1 DBT e 1% di C2H5OH come uniche fonti, rispettivamente, di zolfo e carbonio.
Sono stati isolati 100 cloni capaci di crescere utilizzando DBT. Poiché il plasmide pSM789 era incapace di replicarsi in Rhodococcus, i trasformanti ottenuti (circa 10<2 >per μς di DNA utilizzato) dovevano contenere l'operone sox all'interno del loro cromosoma, a valle di un promotore che ne consentiva la sua espressione.
Per determinare se l'integrazione avveniva in punti diversi del cromosoma, il DNA cromosomale è stato estratto da 20 cloni (Current Protocols in Molecular Biology - Voli) e digerito con 20 U dell'enzima Noti, per il quale esiste una sola sequenza di riconoscimento all'interno dell'operone sox. Il DNA digerito è stato sottoposto ad elettroforesi su gel di agarosio 0.8%, visualizzato mediante colorazione con EtBr 0.5% e trasferito su nylon (Nylon Membranes, positively charged - Boehringer) mediante Southern blot (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. 1989 Molecular cloning: a laboratory manual 2<nd >edn. Cold Spring Harbor, NY).
Il DNA è stato quindi ibridato con una sonda la cui sequenza nucleotidica corrispondeva ad un frammento di 770 bp del gene sox C, utilizzando il metodo non radioattivo provvisto dal kit DIG SYSTEM- Boehringer. La reazione di ibridazione è stata effettuata a 68°C.
Per i cloni esaminati si è osservata una sola banda, di peso molecolare differente per ogni clone, che indicava un singolo evento di integrazione del plasmide pSM789 in punti diversi del cromosoma.
Allo scopo di verificare se questi clorii erano in grado di desolforare DBT in presenza di zolfo inorganico, essi sono stati piastrati su terreno minimo contenente sia DBT che MgSO4.7H20 (0,20 g/1), in parallelo con il ceppo Rhodococcus sp. DS7. Dopo 12 ore, ponendo la piastra sotto i raggi UV a 254 mn, si osservava un alone di fluorescenza per tutti i cloni ricombinanti, mentre nessun alone era evidenziabile per il ceppo nativo. Ciò indicava che l'attività dei promotori isolati non era repressa da solfato. Il clone che mostrava un alone più consistente è stato denominato SMV110.
Esempio 3
Caratterizzazione del promotore contenuto in SMV110
1 μg di DNA cromosomale del clone SMV110 è stato digerito con 20 U dell'enzima Clal, in 10 μl di tampone (Boehringer), a 37°C per 16 ore. Dopo inattivazione degli enzimi a 70°C per 15 minuti, 2 μl del DNA digerito sono stati trattati con 1 U dell'enzima T4 DNA ligasi in 10 μl di tampone (Boehringer), incubando a 16°C per 16 ore.
Un'aliquota (1 μl) della miscela di ligasi è stata utilizzata per trasformare cellule di E.coli XLl-Blue rese elettrocompetenti (Dower, W.J. et al. 1988 Nucleic Acids Research, 16: 6127-6145).
I trasformanti sono stati selezionati su piastre di terreno LB agarizzato contenente 100 μg/ml di Ampicillina. Il DNA plasmidico estratto da uno dei cloni così ottenuti è stato analizzato mediante analisi di restrizione. I risultati indicavano che il plasmide era costituito da un frammento di 4.5 kb, derivante dal DNA cromosomale di DS-2, e dal plasmide pSM789. La mappa di questo nuovo plasmide, denominato pSM839, è mostrata in figura 3.
Quindi, il frammento di 4.5 kb è stato amplificato con la tecnica della Polymerase Chain Reaction (PCR), (Leung, D. W., Chen, E., Goeddel, D.V., 1989 Technique- a journal methods in celi and molecular biology, 1, n°l: 11-15), utilizzando la seguente coppia di oligonucleotidi:
L'amplificazione è stata condotta in una apparecchiatura DNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer Cetus) utilizzando 100 μl di una miscela di reazione contenente: 5 ng di DNA plasmidico, 60 pmoli dei due oligonucleotidi, 200 μΜ di dNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) e 1 U di Taq polimerasi (Boehringher), nel tampone consigliato dal produttore. Dopo denaturazione per 2 minuti a 94°C, si è fatto partire il programma ciclico che comprende: 1 minuto a 98°C, 1 minuto a 60°C e 3 minuti a 72°C per 25 cicli complessivi, seguita da 8 minuti a 72°C (estensione finale).
Il frammento di 4.5 kb amplificato è stato poi sequenziato mediante DNA sequencer ABI 373 (Perkin Elmer). La sequenza e le possibili "open reading frames" sono state confrontate con quelle presenti in banche di DNA e di proteine utilizzando il motore di ricerca BLAST fornito da NCBI (Altscul, S.F., Madden, Th, Schaffer, A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D., 1997 Nucleic Acids Research 25: 3398-3402).
I risultati hanno evidenziato che l'integrazione del pSM789 nel DNA cromosomale del ceppo DS-2 era avvenuta all'interno di un gene che codifica per una proteina omologa ad alcune endoglucanasi ed amilasi di altri microrganismi.
Quindi si è ipotizzato che nel clone SMV11Q l'espressione dell'operone sox dovesse essere controllata dal promotore di tale gene. Per caratterizzare tale promotore, è stato determinato il punto esatto di inizio della trascrizione dell'operone sox mediante "primer extension" utilizzando il kit 5' RACE System (BRL).
I risultati indicavano che l'inizio della trascrizione dell'operone sox avveniva ad una distanza di 622 bp dal 5' dell'operone e che, pertanto, il promotore doveva essere situato immediatamente a monte di tale regione.
L'analisi della sequenza a monte del sito di inizio della trascrizione rivelava la presenza della regione -10 presunta .
Esempio 4
Costruzione del vettore ad espressione pSM846
Un frammento di 1100 bp contenente il promotore costitutivo è stato amplificato tramite PCR a partire dal plasmide pSM839 utilizzando i seguenti oligonucleotidi:
Il frammento amplificato è stato digerito con gli enzimi HindlII e BamHI, eluito da agarosio ed introdotto nel plasmide pUCl8. Il plasmide risultante è stato digerito con gli enzimi AflIII-Hpal e ligato a pSM843, previamente digerito con Afilli e Ncol (che formano estremità compatibili con i precedenti) in presenza di T4 DNA ligasi a 16°C per una notte. In questo modo si è ottenuto un nuovo vettore shuttle di E.coli-Rhodococcus, denominato pSM846, contenente il promotore seguito da un MCS per l'espressione costitutiva di proteine in Rhodococcus. Il ceppo di Rhodococcus DS-2 contenente il plasmide pSM846, la cui mappa è riportata in figura 4, è stato denominato SMV112.
Esempio 5
Allo scopo di verificare la stabilità del plasmide pSM846 nei ceppi trasformati di Rhodococcus dopo un prolungato periodo di coltura in assenza di pressione selettiva, tre cloni indipendenti del ceppo SMV112 sono stati fatti crescere a 30° C, 200 rpm per 16 ore in beute da 100 ml, contenenti 20 ml di terreno LB (Bacto Triptone 10 g/l, yeast extract 5 g/1, NaCl 10 g/1.
Le tre colture (0,1 ml) sono state utilizzate per inoculare ulteriori 20 ml dei medesimi terreni facendo crescere le nuove colture a 30° C, 200 rpm per 16 ore. Questa procedura è stata ripetuta per altre 3 volte, seguendo la crescita cellulare come incremento della densità ottica misurata a 600 nm (O.D.600).
Al termine di ogni crescita, aliquote delle colture sono state prelevate, opportunamente diluite e quindi piastrate su terreno LB agar. Le piastre sono state incubate a 30° C per 16 ore e quindi si è proceduto al conteggio delle colonie (CFU/ml). In questo modo è stato determinato che al termine dell'esperimento il numero di generazioni era di almeno 35.
Per determinare la percentuale di cellule che avevano mantenuto il plasmide per almeno 35 generazioni, ed erano perciò resistenti al cadmio, 100 singole colonie provenienti dal piastramento per diluizione dopo la 5° crescita delle tre colture, sono state poste su piastre di LB contenenti CdCl2 alla concentrazione di 0.5 mM.
E' stato osservato che il plasmide era mantenuto in più del 90% della popolazione cellulare, dimostrando così una notevole stabilità segregazionale anche dopo successivi passaggi in coltura in assenza di pressione selettiva.
Per verificare la stabilità strutturale del plasmide pSM846, al termine del 5° passaggio di crescita, da una aliquota delle colture di 12 cloni è stato estratto il DNA plasinidico utilizzando il metodo riportato in Serbolisca et al. (1999). I DNA ottenuti sono stati digeriti con vari enzimi di restrizione per i quali esistono siti unici o duplici nel plasmide pSM846 ed analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio per 2 ore a 90 V, 90 mA; i gel sono stati colorati con Bromuro di Etidio 1 mg/ml. La visualizzazione del gel su un trans-illuminatore a luce UV ha rivelato le bande attese secondo la mappa di restrizione del plasmide, dimostrando che pSM846 era strutturalmente stabile in Rhodococcus per diverse generazioni in assenza di pressione selettiva.
Esempio 6
Determinazione del numero di copie di pSM846 per cellula Il numero medio di copie del plasmide pSM846 per cellula è stato stimato mediante PCR quantitativa su preparazioni di DNA totale da cellule di Rhodococcus DS-2 contenenti tale plasmide. La tecnica si basa sulla determinazione della quantità di DNA ottenuto tramite amplificazione di un frammento del plasmide. Tale quantità è direttamente correlata alla concentrazione del plasmide stesso, utilizzato come stampo nella reazione di amplificazione.
Il DNA totale è stato preparato secondo il metodo illustrato in Current Protocols in Molecular Biology -Ausubel et. al. Ed. Wiley Interscience Section 2.4.1 con la seguente modifica: per ottenere una lisi cellulare completa le cellule centrifugate da 1.5 ml di coltura sono state risospese in 567 microlitri di TE (TrisHCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH8) contenente lisozima 50 μg/ml e sono state incubate a 37° C per 20 minuti prima di aggiungere SDS e proteinasi K come da protocollo.
Dopo un trattamento di 10 minuti con RNasi, la concentrazione di DNA totale è stata stimata su gel di agarosio ed i campioni sono stati diluiti a 100 pg di DNA per microlitro.
Sul DNA così ottenuto sono state effettuate reazioni di PCR utilizzando due oligonucleotidi (primers) che appaiano all'interno dell’operone per la resistenza al cadmio ed aventi la sequenza:
La standardizzazione è stata operata mediante una seconda reazione di PCR sulla porzione di DNA cromosomale codificante per l ' RNA 16S di Rhodococcus DS7 utilizzando i oligonucleotidi specifici per tale sequenza .
La stima del numero di copie di plasmide è stata effettuata sia sul ceppo contenente il plasmide pSM846, che su di un ceppo contenente una sola copia dei geni per la resistenza al cadmio integrati nel cromosoma e sul ceppo DS7 .
Le reazioni di amplifica sono state condotte secondo le istruzioni del kit Syber Green della PerkinElmer-AB.
Il DNA amplificato è stato marcato con il marcatore fluorescente Syber Green e quantificato con lo strumento PE Applied Biosystems GeneAmp 5700. Ogni campione è stato amplificato in triplo ed i valori di fluorescenza sono stati confrontati con curve di calibrazione incluse in ogni esperimento per ogni coppia di primers. La quantità di DNA ottenuto amplificando con i primers specifici per il plasmide è stata quindi corretta per la quantità di DNA cromosomale amplificato con i primers specifici per i geni RNA 16S .
Il confronto tra i tre ceppi esaminati ha permesso di stabilire che il ceppo DS7 contiene mediamente 2-3 copie del plasmide di 130 kb per cellula, mentre cellule di Rhodococcus DS-2 trasformate con pSM846 contengono dalle 4 alle 8 copie di plasmide per cellula.
Esempio 7
Costruzione del plasmide pSM847
Scopo della sperimentazione era quello di ottenere un ceppo contenente più copie dei geni sox sotto il controllo del promotore costitutivo identificato.
Il frammento di DNA contenente il promotore identificato all'esempio 3, è stato amplificato a partire dal plasmide pSM839 mediante PCR, utilizzando gli oligonucleotidi :
che appaiano con la sequenza SEQ. ID.No 2, all'interno dei quali sono stati introdotti i siti di restrizione Ndel e Hindi II .
Circa 500 ng del DNA ottenuto dalla reazione di amplificazione sono stati digeriti con 4 U degli enzimi Ndel e HindiII per 60 min. a 37°C e purificati su gel di agarosio Nusieve all'1.5% (EMC products). Parallelamente 1 μg del plasmide pSM789 è stato digerito con 4 U degli stessi enzimi per 60 minuti a 37°C. Quindi, 50 ng di vettore e 25 ng di inserto purificato da agarosio sono stati ligati in presenza di 1 U dell'enzima T4 ligasi. La miscela di ligasi è stata poi utilizzata per trasformare cellule competenti di E.coli XL- blue.
500 ng del plasmide estratto da uno dei cloni di E.coli contenenti l'inserto desiderato, e 500 ng del plasmide pSM843 sono stati digeriti separatamente con 4 U dell'enzima di restrizione SspI (New England Biolabs). Le reazioni sono state condotte a 37°C per 60 minuti ed a 70°C per 10 minuti.
Quindi, 150 ng del plasmide lineare pSM843 sono stati ligati con 50 ng del plasmide di E. coli in 10 μl di tampone (Boenringer), in presenza di 1 U di T4 DNA ligasi, incubando per 16 ore a 16°C. 1 μl della miscela di ligasi è stato utilizzato per trasformare cellule elettrocompetenti di Rhodococcus DS-2. Le cellule sono state piastrate su terreno minimo in presenza di DBT e coltivate a 37°C per 4-5 giorni.
Da una delle colonie così ottenute è stato estratto il DNA plasmidico secondo il metodo descritto in Serbolisca et al. (1999, Appi. Env. Microbiol. 52:122-126) e sottoposto ad analisi di restrizione con enzimi per i quali esistono siti nei plasmidi di partenza. Il vettore così ottenuto, contenente l'operone sox sotto il controllo del promotore costitutivo, è stato denominato pSM847 (Figura 5) ed il ceppo che lo contiene SMV114.
Esempio 8
Il ceppo SMV114 è stato coltivato in parallelo con il ceppo nativo Rhodococcus DS7 in terreno minimo più DBT in assenza e presenza di 0,20 g/1 di MgSO4.7H2O.
L'analisi elettroforetica ed il Western blot delle proteine solubili estratte dalle colture batteriche ha rivelato che:
1. quando i ceppi vengono fatti crescere in DBT in assenza di solfato, SMV114 esprime quantità di proteine Sox A, B e C superiori a DS7;
2. in presenza di solfato inorganico, il ceppo Rhodococcus DS7 non esprime gli enzimi Sox, mentre SMV114 esprime le stesse quantità di enzimi rispetto alla crescita in assenza di solfato.
L'attività desolforante del ceppo SMV114 è stata misurata su resting cells utilizzando come substrato DBT e confrontata con quella del ceppo nativo Rhodococcus sp. DS7. Da un pre-inoculo in terreno minimo, sono stati effettuati due inoculi per ciascun ceppo in 100 ml dello stesso terreno, in assenza ed in presenza di zolfo inorganico (0,20g/l di MgSO4.7H2O, 80 mM). Le crescite sono state condotte per 20 ore a 30°C in beute con frangiflutti. La densità ottica di partenza, misurata a 660 nm, era di OD 0.25 per le colture in MgSO4 DBT e di 0.4 per le colture con solo DBT. Il peso secco è stato determinato in triplo, da 5 ml di coltura centrifugata a 5000-6000 rpm per 10 minuti, congelata a -80°C e liofilizzata.
Fer la misurazione dell'attività desolforante, 10 ml di coltura sono stati prelevati e centrifugati a 5000-6000 rpm per 10 minuti, a temperatura ambiente. Le cellule sono state risospese, in 9,75 ml di Tris-HCl 20 mM pH 7, introdotte in beute da 50 mi ed incubate in un bagno agitato a 30°C per 5 minuti. Dopo avere aggiunto alla sospensione 250 μl di DBT 40 mM, è stato effettuato immediatamente un primo prelievo (1 ml), che è stato estratto con 2 mi di etilacetato, per la determinazione del background di prodotto al tempo zero. Successivi prelievi sono stati effettuati dopo 1 e 2 ore. 20 μl della fase organica chiarificata sono stati analizzati tramite HPLC su una colonna cromatografica in fase inversa C18 Vydac tipo TP218-5418, con un programma che prevede un flusso di 1 ml/min per 15 min in 80% acetonitrile. Dall'area corrispondente al prodotto 2-idrossibifenile (2 HBP) e tenendo conto del peso secco, è stata calcolata l'attività specifica come mg di 2HBP prodotto per ora per grammo di peso secco.
I valori di attività ottenuti in assenza di zolfo inorganico corrispondevano a 5 /- 0.6 mg/h.g sia per il ceppo nativo che per SMV114. Quando coltivato in presenza di 0,2 g/l MgSO4, il ceppo Rhodococcus DS7 non esprimeva alcuna attività desolforante, mentre il ceppo SMV114 manteneva la sua attività.
Esempio 9
E' stata inoltre investigata la possibilità di utilizzare il plasmide pSM847 in altre specie di Rhodococcus . 100 ng del plasmide sono stati utilizzati per trasformare cellule elettrocompetenti di ceppi di Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous e Rhodococcus opacus. In tutti i casi sono state ottenute colonie capaci di desolforare il DBT, che contenevano il plasmide delle dimensioni attese. Anche in questo caso, almeno il 90% dei cloni manteneva il plasmide per circa 40 generazioni in assenza di pressione selettiva.
SEQ ID NO: 2
SEQUENCE TYPE: Nucleotide SEQUENCE LENGHT: 1355 base pairs STRANDEDNESS: Single
TOPOLOGY: Linear
PROPERTIES: Promoter
SEQ ID NO : 3
SEQUENCE TYPE : Nucleotide SEQUE1NCE LENGHT : 2806 base pairs STRANDEDNESS : Single
TOPOLOGY : Linear
PROPERTIES : operon
A G A G C C C
G
SEQ ID NO: 4
SEQUENCE TYPE: Nucleotide SEQUENCE LENGHT: 22 base pairs STRANDEDNESS: Single TOPOLOGY: Linear
PROPERTIES: Primer
SEQ ID NO: 5
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PROPERTIES: Primer
SEQ Ip NO: 6
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PROPERTIES: Primer
SEQ ID NO: 7
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PROPORTIES : Primer
5EQ ID NO: 8
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PROPERTIES: Primer
SEQ ID NO: 9
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PROPERTIES: Primer
SEQ ID NO: 10
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PROPERTIES: Primer
SEQ ID NO: 11
SEQUENCE TYPE: Nucleotide SEQUENCE LENGHT: 23 base pairs STRANDEDNESS : Single
TOPOLOGY : Linear
PROPERTIES: Primer

Claims (18)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Un vettore di clonaggio pSM843 che comprende: (a) i geni rep, 0RF81 e trbA che codificano per proteine implicate nella replicazione in Rhodococcus; (b) il gene parA avente la sequenza SEQ. ID. No. 1; ed (e) almeno un gene che codifica per un marcatore genetico scelto tra i geni dell'operone cad, che conferiscono la resistenza al cadmio, oppure i geni che codificano per la resistenza ad un antibiotico.
  2. 2. Il vettore secondo la rivendicazione 1, depositato con il numero CBS 102446.
  3. 3. Un vettore ad espressione che comprende: (a) i geni rep, ORF81 e trbA che codificano per proteine implicate nella replicazione in Rhodococcus; (b) il gene parA avente la sequenza SEQ. ID. No. 1; (c) un promotore costitutivo di Rhodococcus avente la sequenza SEQ. ID. No. 2; (d) un sito di clonaggio multiplo a valle del promotore; (e) almeno un gene che codifica per un marcatore genetico scelto tra i geni dell'operone cad, che conferiscono la resistenza al cadmio, oppure i geni che codificano per la resistenza ad un antibiotico; e (f) contiene l'origine di replicazione in E.coli, depositato con il numero CBS 102445.
  4. 4. Il vettore secondo la rivendicazione 3, che comprende a valle del promotore costitutivo uno o più geni che codificano per una proteina di interesse.
  5. 5. Il vettore ad espressione secondo la rivendicazione 4, dove le proteine sono scelte tra enzimi coinvolti nella rimozione selettiva dì zolfo organico da combustibili fossili oppure enzimi coinvolti nella produzione di Liamminoacidi, di enantiomeri di composti chirali e acidi carbossilici .
  6. 6. Il vettore ad espressione pSM847 secondo la rivendicazione 4, che comprende a valle del promotore costitutivo l'operone sox che codifica per gli enzimi Soxa, SoxB e SoxC depositato con il numero CBS 102447.
  7. 7. Il vettore ad espressione secondo la rivendicazione 3, ottenuto mediante: (1) costruzione del vettore plasmidico di clonaggio pSM843; (2) isolamento di un promotore costitutivo di Rhodococcus; ed (3) inserimento di detto promotore costitutivo nel vettore pSM843.
  8. 8. Un microrganismo trasformato con il vettore ad espressione secondo le rivendicazioni da 3 a 6, dove detto microrganismo è scelto tra Rhodococcus, Gordona e Nocardia .
  9. 9. Un ceppo di Rhodococcus trasformato con il vettore ad espressione pSM847 depositato con il numero CBS 102447.
  10. 10. Un procedimento per la produzione di proteine omologhe od eterologhe di interesse che comprende il coltivare in opportune condizioni un microrganismo trasformato con il vettore ad espressione in accordo alle rivendicazioni da 3 a 6.
  11. 11. il procedimento secondo la rivendicazione 10, dove la proteina è scelta tra enzimi coinvolti nella rimozione selettiva di zolfo organico da combustibili fossili e nella produzione di L-amminoacidi, di produzione di L-amminoacidi, di enantiomeri di composti chirali e acidi carbossìlici.
  12. 12. Il procedimento secondo la rivendicazione 11, dove le proteine sono gli 'enzimi Sox ed il ceppo è Rhodococcus SMV114 CBS 102447.
  13. 13. Un processo per la rimozione di zolfo organico da combustili fossili caratterizzato dal fatto di utilizzare un microrganismo scelto tra Rhodococcus, Gordona e Nocardia trasformato con il vettore ad espressione CBS 102445 contenente a valle del promotore costitutivo l'operone sox.
  14. 14. Il processo secondo la rivendicazione 13, dove il microrganismo è Rhodococcus SMV114 CBS 102447.
  15. 15. Un metodo per la ricerca di promotori in microrganismi capaci di integrare casualmente frammenti di DNA estraneo nel proprio cromosoma senza richiedere una omologia di sequenza superiore a 3 bp fra il DNA donatore e quello dell'ospite che consiste nel: (i) trasformare detto microrganismo direttamente con un gene reporter privo del proprio promotore oppure con un plasmide multicopie di E.coli contenente tale gene e linearizzato a monte del gene reporter; (ii) selezionare i cloni che esprimono tale gene, cioè i cloni che hanno integrato nel proprio cromosoma il gene reporter a valle di una sequenza promotore; (iii) digerire il DNA cromosomale dei cloni selezionati con enzimi ddi restrizione che tagliano a monte ed a valle del gene; (iv) amplificare il DNA ottenuto nello stadio (III); (v) sequenziare il promotore a monte del gene reporter.
  16. 16. Il metodo secondo la rivendicazione 15, dove il microrganismo è un ceppo di Rhodococcus.
  17. 17. 11 metodo secondo la rivendicazione 15, dove il gene reporter è scelto tra quelli che codificano per la resistenza ad antibiotici, metalli pesanti oppure enzimi quali XylE o le proteine Sox.
  18. 18. Un promotore costitutivo di Rhodococcus caratterizzato dalla sequenza SEQ. ID. No 2.
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