JP2021509582A - ブドウ球菌(Staphylococcus)属細菌の栄養要求株 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年1月5日出願の米国仮特許出願第62/614,096号に基づく優先権を主張するものであって、その内容全体は、あらゆる目的のために、すべて完全な形で、参照により本明細書に組み入れられる。
多くの細菌は、ペプチドグリカン層の生合成において2つのアミノ酸、D-アラニンおよびD-グルタミン酸を利用するが、このペプチドグリカン層は、こうした細菌において機能的な細胞壁の構築のために必要である。ブドウ球菌(Staphylococcus)属の種を含めて、グラム陽性細菌は、細胞壁におけるペプチドグリカン層の合成に、D-アラニンおよびD-グルタミン酸を利用する。
本明細書は概して、増殖をD-アラニンに依存する組換えブドウ球菌属細菌(たとえば、表皮ブドウ球菌)に関する。抗生物質を使用することなく、標的環境における細菌(たとえば、組換えブドウ球菌属細菌(たとえば表皮ブドウ球菌))の増殖を選択的に制御しうることは、本明細書の研究成果である。本明細書のいくつかの実施形態によれば、栄養要求性という特性は、抗生物質耐性遺伝子の存在を必要としない、プラスミドの存在の維持に有用である。したがって、いくつかの実施形態において、組換えブドウ球菌属細菌は抗生物質耐性遺伝子を含まない。いくつかの実施形態において、外来栄養分を代謝により生成する能力を復帰させる、酵素または他の成分の発現を可能にするポリヌクレオチドを、微生物中に維持するべきプラスミドに組み込む。いくつかの実施形態において、組換えブドウ球菌属細菌は、pUBTR114ベースの(に基づく)ベクターで形質転換される。さらなる実施形態において、pUBTR114ベースのベクターはpUBTR119*-Sal-GFPである。
いくつかの実施形態において、組換えブドウ球菌属細菌は前述の方法によって作製される。
1. 定義
別段の指示のない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者に共通して理解される意味を有する。
本明細書は、D-アラニン要求株であるトリプルノックアウトブドウ球菌属細菌について記載する。本明細書は、アラニンラセマーゼ遺伝子(たとえば、alr1およびalr2)のダブルノックアウト、およびアラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子(dat、SE1423)のノックアウトを有するように遺伝子改変された、操作されたブドウ球菌属細菌、たとえば表皮ブドウ球菌を提供する。本明細書は、望ましいD-アラニン要求性を示す、トリプルノックアウト表皮ブドウ球菌株(SEΔalr1Δalr2Δdat)を提供する。
本明細書は、遺伝子改変微生物、たとえば細菌、を提供する。本明細書に記載の方法は、いかなるブドウ球菌属細菌細胞においても、その細胞のdatのタンパク質ホモログをコードする遺伝子を不活化もしくはノックアウトすることによって、またはそうでなくても、このタンパク質の発現もしくは活性を不活化することによって、実行できると考えられる。ある菌株をブドウ球菌属に帰属するためには、それが、クラスターを形成し、カタラーゼを産生し、適切な細胞壁構造(ペプチドグリカン型およびタイコ酸の存在を含む)を有し、DNAのG + C含量が30-40 mol%であるグラム陽性球菌であることが必要である。例を挙げると、黄色ブドウ球菌(S. aureus)群、たとえばS. argenteus、黄色ブドウ球菌(S. aureus)、S. schweitzeri、S. simiaeなど;S. auricularis群、たとえばS. auricularisなど;S. carnosus群、たとえばS. carnosus、S. condimenti、S. massiliensis、S. piscifermentans、S. simulansなど;表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)群、たとえばS. capitis、S. caprae、表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)、S. saccharolyticusなど;溶血性ブドウ球菌(S. haemolyticus)群、たとえばS. devriesei、溶血性ブドウ球菌(S. haemolyticus)、S. hominisなど;S. hyicus-intermedius群、たとえばS. agnetis、S. chromogenes、S. felis、S. delphini、S. hyicus、S. intermedius、S. lutrae、S. microti、S. muscae、S. pseudintermedius、S. rostri、S. schleiferiなど;S. lugdunensis群、たとえばS. lugdunensisなど;腐生ブドウ球菌(S. saprophyticus)群、たとえばS. arlettae、S. cohnii、S. equorum、S. gallinarum、S. kloosii、S. leei、S. nepalensis、S. saprophyticus、S. succinus、S. xylosusなど;S. sciuri群、たとえばS. fleurettii、S. lentus、S. sciuri、S. stepanovicii、S. vitulinusなど;S. simulans群、たとえばS. simulansなど;S. warneri群、たとえばS. pasteuri、S. warneriなど、があるがそれに限定されない。ある実施形態において、ブドウ球菌属細菌は表皮ブドウ球菌である。
本明細書は、標準的な分子生物学の手法、たとえば(Sambrook et al. 2001)に記載の技法を利用する。pJB38 (Boss et al., 2013)は、ノックアウトベクターのプラスミド骨格として使用されたが、このベクターは、アレル交換大腸菌-ブドウ球菌シャトルベクターであるpJB38をベースとして、機能性を改善するためにプラスミド上に追加の設計特性をさらに含んでいる(Bose, J.L., et al. Applied and environmental microbiology. 2013;79(7):2218-2224)。SE1423ノックアウトを作製するための特異的なプライマーが設計された(下記の実施例1において表1として記載)。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のブドウ球菌属細菌(たとえば表皮ブドウ球菌であって、アラニンラセマーゼ遺伝子(たとえばalr1およびalr2)のダブルノックアウト、およびアラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子(dat、SE1423)ノックアウトを有するように遺伝子改変されている)は、治療特性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、そのタンパク質は可溶性治療用タンパク質である。可溶性治療用タンパク質は、水溶液に溶解性の治療用タンパク質である。いくつかの実施形態において、発現した治療用タンパク質のすべて、発現した治療用タンパク質の大半、または発現した治療用タンパク質の一部は、本明細書に記載のブドウ球菌属細菌において可溶性でありうる。いくつかの実施形態において、可溶性治療用タンパク質は活性のあるタンパク質であって、たとえば、酵素活性または生物活性を有するが、この生物活性は、たとえば、リガンドもしくは受容体との結合活性、細胞内シグナル伝達経路を活性化する能力、またはヒトなどの哺乳動物において免疫応答を引き起こす能力などである。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質はグリコシル化されており、そうでなければ、1つもしくは複数のグリコシルトランスフェラーゼによってin vitroで修飾され、またはプロテアーゼに対する耐性を高めるように修飾される。
本発明に係る使用のための製剤は、治療上有効な量の望ましいポリペプチドを生成することができる、製薬上有効な任意の量の組換えブドウ球菌属細菌を、たとえば、遺伝子改変微生物、たとえば細菌、の重量比で、少なくとも約0.01%、約0.05%、約0.1%、約0.2%、約0.3%、約0.4%、約0.5%、約0.6%、約0.7%、約0.8%、約0.9%、約1.0%,約1.5%、約2.0%、約3.0%、約4.0%、約5.0%、約6.0%、約7.0%、約8.0%、約9.0%、約10.0%、約11.0%、約12.0%、約13.0%、約14.0%、約15.0%、約16.0%、約17.0%、約18.0%、約19.0%、約20.0%、約25.0%、約30.0%、約35.0%、約40.0%、約45.0%、約50.0%またはそれ以上、含むことが可能であり、その上限が遺伝子改変微生物、たとえば細菌の重量比で約90.0%であることは、さらに明白であろう。
本明細書は、組換えブドウ球菌属細菌を作製する方法であって、(i) D-アラニンアミノトランスフェラーゼ(dat)ノックアウトを含むプラスミドをブドウ球菌株(SEΔalr1Δalr2)のコンピテント細胞に導入して形質転換すること;(ii) 形質転換細胞中のノックアウトプラスミドの存在を検出すること;(iii) ステップ(ii)で同定された形質転換細胞を培養すること;ならびに(iv) 単離されたコロニーを精製すること、を含む方法を特徴とする。好ましい実施形態において、形質転換体におけるノックアウトプラスミドの存在は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって検出される。特定の実施形態において、その方法はさらに、単離されたコロニーのD-アラニン要求性を試験することを含む。
本発明はキットも提供する。ある態様において、本発明のキットは、(a) 本発明の組換えブドウ球菌属細菌、および(b) その使用説明書を含む。本発明の組成物は上記で説明している。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、増殖をD-アラニンに依存する組換えブドウ球菌属細菌を含む。
以下の実施例は、本発明の範囲に含まれる実施形態をさらに説明し実証する。実施例が説明のためにのみ与えられ、本発明を制限すると解釈されるべきでないのは、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変更が可能であるからである。
SE1423ノックアウト(KO)を生じさせるために用いた方法を以下に簡単に記載する。最初に、pJB38を用いてSE1423 KOプラスミドを作製した(Boss et al., 2013)。
表皮ブドウ球菌12228株のゲノム配列に基づいて、SE1423ノックアウト(KO)ベクターを開発するために、PCR用にオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。プライマー配列、その具体的な用途、およびPCR産物の大きさを下記の表1に示す。
TAS + クロラムフェニコール(10μg/mL)のプレートを用いて、Gm2163から単離されたpJB-1423KOプラスミドを、表皮ブドウ球菌株(SEΔalr1Δalr2)のコンピテント細胞に導入して形質転換した。プライマー1423-5F (EcoRI)および1423-3R (SalI)を用いて1.5 KbのPCR産物を検出することによって、形質転換体にpJB-1423KOプラスミドが存在することを確認した。テストした全26クローンにおいて、1.5 KbのPCR産物が観察されたのに対して、SE宿主細胞由来の細胞溶解物を含む反応において、2.3 KbのPCR産物が観察された。確認された2つのクローンの細胞を、TSA + Cm (10μg/mL) + D-アラニン (40μg/mL)の新プレート上に画線した。相同組換えによるプラスミドの組込みのために、プレートを43℃にて24時間インキュベートした。単離されたコロニーを精製のために43℃にて再度画線した。2回目の相同組換えによってプラスミド骨格を環状にして出すために、単離された4つのコロニーを250-mLバッフル付き振盪フラスコ内の50 mL TSB + D-アラニン (40μg/mL)に植菌した。培養物を30℃にて24時間振盪した。分取した0.5 mL培養物を50mL新培地の入ったフラスコに移した。継代を3回繰り返した。フラスコの細胞をTSA + アンヒドロテトラサイクリン (ATC 2μg/mL) + D-アラニン(DA、40μg/mL)上に播種した。30℃にて2日間培養後、約100-200個のコロニーが、10-5希釈培養物100μl用いて播種したプレート上に形成された。コロニーのさらなる分析は以下に記載する。
TSA+ATC+DAプレートから得られた全部で25個の単離コロニーをTASプレートおよびTSA+ATC+DAプレート上に植菌した。プレートを30℃にて一晩インキュベートした。すべてのクローンはD-アラニン添加プレート(TSA+ATC+DA)上でよく増殖した。図1に示すように、3つのクローン(#7、#12および#18)はD-アラニン添加なしのTSA上で増殖できず、D-アラニン要求性を示した。その栄養要求表現型は、TSA+ATC+DAプレート上のパッチから得られた細胞をTSAプレート上に再度植菌した際に再び観察された。留意すべき点として、2回目の相同組換えの結果、SE1423をノックアウトすることなくプラスミド骨格が除去されうるので、TSA+ATC+DAプレートから得られたクローンの一部は、野生型SE1423遺伝子座を保持していると推測された。
この実施例は、抗生物質を使用することなく発現プラスミドを維持することができる、表皮ブドウ球菌発現系の開発を記載する。
表皮ブドウ球菌におけるタンパク質生産のために、大腸菌/黄色ブドウ球菌シャトルベクターであるpJB38(Bose et al., 2013)を使用する。非ABR(抗生物質耐性)タンパク質発現系を開発するために考えられるアプローチの1つは、pJB38の改変である。この選択肢を検討するために、pJB38をクローニング宿主の枯草菌SCK6に導入して形質転換することができるかどうかを試験した。Qiagen HiSpeed Plasmid Midi Kitの試薬およびプロトコールを用いて、大腸菌DH5α株から単離されたpJB38 DNAを、コンピテント細胞の調製および形質転換のためのBTRプロトコールを用いて、SCK6ΔalrAに導入して形質転換した(下記)。形質転換細胞をLB寒天培地 + D-アラニン(DA、40μg/mL)+ クロラムフェニコール(Cm、10μg/mL)上に播種した。30℃にて2日間培養後、小コロニーが出現し始めた。30℃にて3日間培養後コロニーを計数した。250μLのコンピテント細胞を、(5μL中)0.6μgのpJB38 DNAで形質転換すると、50μL細胞を播種したプレート上に61個のさまざまな大きさのコロニーが観察された。これに基づくと、形質転換効率は5.2 x 102 cfu/μg DNAとなる。
表皮ブドウ球菌NRRL B-4268株の形質転換コンピテント細胞を調製し、形質転換した。Qiagen Midi Prep Kit(付属書類IIを参照されたい)を用いて、pUBTR114-TP(テストタンパク質遺伝子を保有するpUBTR114)を枯草菌SCK6から単離した。形質転換された表皮ブドウ球菌細胞を、カナマイシン10μg/mLを含むトリプトンソイ寒天(TSA)プレート上に播種した。プレートを37℃にて一晩インキュベートした。約950 ngのプラスミドDNAを用いた形質転換から、5個のコロニーが観察された。5個すべてのコロニーを、新たなカナマイシンプレート上に植菌後、37℃にて再増殖させた。細胞を、つまようじを用いて釣菌し、Trisバッファー(100 mM、pH 8.0)100μL中に懸濁した。溶解物(0.5μL)を分取し、Taqポリメラーゼおよびプライマーペアs.p.amyQ-Nde-F2/Sbf-TP-R(表2)を用いた25-μL PCR反応においてテンプレートとして使用した。非形質転換表皮ブドウ球菌の細胞溶解物、およびSCK6から単離されたプラスミドDNAをそれぞれ陰性対照および陽性対照として使用した。5つすべてのクローンから得られた細胞溶解物は、予測通り1.5 KbのPCR産物を生成した。したがって、これらの実験は、pUBTR114ベースのベクターが、表皮ブドウ球菌に導入されて形質転換し、カナマイシン選択により維持されうることを実証した。
pJB38-sGFPで形質転換された表皮ブドウ球菌において検出可能なGFPの発現および分泌が実証されている。したがって、評価のために、発現カセット「SarAP1-SsaA-His-sGFP」をpUBTR119-TPにクローニングすることとした。このプラスミドは、pUBTR114-TPに類似している。2つのプラスミドの相違は、pUBTR119-TPにおいてTPコード配列の上流に、第2のプロモーター配列、ならびに、より使いやすいクローニング部位が存在することである。
オーバーラップPCR法を用いて、pUBTR119-GFP のXho部位を異なる制限酵素部(SalI)で置き換えた。このプラスミドには、MluI-XhoI断片(840 bp)およびXhoI-KpnI断片(251 bp)がある。2つの断片のPCR増幅およびオーバーラップPCRのために、5’-CTCGAG-3’から5’-GTCGAC-3’へのヌクレオチドの変更を含む新たなプライマーを設計した。オーバーラップPCR産物(1.1 Kb)をMluIおよびKpnIで消化し、あらかじめMluI-KpnI で消化されたpUBTR119-GFPとライゲーションした。上記のようにカナマイシン選択により、ライゲーション反応物をSCK6コンピテント細胞に導入して形質転換した。多数のコロニーが形成された。コロニーを新たなプレートLB+Kan(10μg/mL)上に植菌した。プライマーMlu-F2およびSal-R2(表2)を用いて、12個のクローンをPCRで分析した。プライマーSal-R2はSalI部位に特異的である。0.84 Kbの予想されるPCR産物のバンドは弱かったが、8個のクローンについては反応物中に明確に存在した。12個すべてのクローンは、プラスミドDNAミニプレップのために、液体培地(LB+Kan)中で増殖させた。これらすべてのクローンは、正しいサイズのプラスミドのバンドを示し、それらはSalI消化により線状化された。クローン#4をミニプレップのために増殖させた。制限酵素消化によりDNAを分析した:MluI+ KpnI;およびSalI。予測通り、2つのバンド(4.5 Kbおよび1.1 Kb)がMluI+KpnI消化から観察され、SalIはプラスミドを線状化した。新規プラスミドはpUBTR119*-Sal-GFPと名付けられた。
野生型SE NRRL B-4268コンピテント細胞を、pUBTR119*-Sal-GFPプラスミドDNAを用いて形質転換し、TSA+Kan (10μg/mL)のプレートに播種した。37℃にて一晩培養した後、約440 ngおよび約880 ngプラスミドDNAを用いた形質転換から、それぞれ2個および9個のコロニーが観察された。11個すべてのクローンを新たなTSK+Kanプレート上に植菌し、プライマーSar-GFP-FおよびSar-GFP-Rを用いたPCRによって細胞を調べた。表皮ブドウ球菌細胞およびpUBTR119*-Sal-GFPプラスミドDNAを、それぞれ陰性対照および陽性対照として使用した。陰性対照以外のすべての反応において、1.1 KbのPCR産物が生成された(図3)。
pUBTR119*Sal-GFP構築物で形質転換されたSEトリプルノックアウト株でのタンパク質発現を評価するために、振盪フラスコ実験を計画した。この実験に使用する菌株および培地を表3に示す。枯草菌(B. subtilis)および表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)における増殖およびタンパク質発現のための振盪フラスコ培養プロトコールを以下に示す。記載の培地からグルコースを除いた培地5 mLに菌株を植菌し、37℃、225 rpmにて一晩増殖させた。一夜培養物(0.5 mL)を用いて、250-mLバッフル付きフラスコ内の2 %グルコースを添加した記載の培地50 mLに植菌した。培養物は37℃、225 rpmにて24時間増殖させた。すべての菌株が良好な増殖を示した。培養ブロスは、Eppendorf Centrifuge 5417C において13,000 rpm (17,900 x g)で3分間1.5 mL培養物を遠心分離することによって集められた。図5はHisタグ融合タンパク質を検出するためのウェスタンブロットを示す。
ミニプレップのためにQiagen QIAprep Spin Miniprep Kit(カタログ# 27106)を使用した;ミディプレップのためにQiagen HiSpeed Plasmid Midi Kit(カタログ# 12643)を使用した。主要なポイントは、P1 Bufferにリゾチームを添加することである。
1. 単離されたコロニーを、必要な抗生物質を添加した5 mL LBに植菌し、37℃、225 rpmにて一晩増殖させた。
2. それぞれの一夜培養物3 mLを1.5-mLエッペンドルフチューブに取り出し、Eppendorf Centrifuge 5417C内で1分間13,000 rpmで遠心分離した。上清を廃棄した。
3. ペレットを250μL P1 Bufferに再懸濁した。リゾチームを終濃度200μg/mLとなるように添加した;新調製の10 mg/mLリゾチーム水溶液5μLを添加した。サンプルをボルテックスで攪拌し、37℃にて30分間インキュベートした。
4. メーカーのハンドブックで指示される通り、残りのプロトコールに従う。
SCK6コンピテント細胞調製
1. -80℃グリセロール保存バイアルから、単離するためにLBプレート上にSCK6を画線する。37℃にて一晩インキュベートする。
2. 単離されたコロニーを、18x150 mm ガラス管に入った5 mL LBに植菌する。37℃にて225 rpmで一晩振盪する。
3. 一夜培養物の1:100希釈物を作製し、OD600を測定する。
4. 125-mLバッフル付きフラスコ内の15 mL LB + 1% キシロース中で、培養物を、初発OD600が1.0となるまで希釈する。37℃にて225 rpmで2時間振盪する。
5. 培養物を10%グリセロール中で-80℃にて完全に凍結させる:50%グリセロール3.6 mLをフラスコに添加し、-80℃にて1.5-mLエッペンドルフチューブ内で、分取した450μLを完全に凍結させる。
1. コンピテント細胞を室温で融解し、それぞれの形質転換に200μLを使用する。
2. 形質転換を行うDNA(プラスミドまたはライゲーション反応液)を直接、200μLコンピテント細胞の入った1.5-mLエッペンドルフチューブに添加した。
3. エッペンドルフチューブを18x150 mmガラス管に入れ、90分間225 rpmで37℃に置いた。
4. サンプルを、必要な抗生物質を添加した1-4 LBプレート上に播種した。プレートを37℃にて一晩培養する。
・増殖培地:表皮ブドウ球菌および枯草菌SCK6野生型宿主用には、TSB + 20 g/Lグルコース、ならびにpUBTR114またはpUBTR119構築物の形質転換体用には、TSB + 20 g/L グルコース + 10μg/mLカナマイシン
・-80℃グリセロール擦過物を用いて、18X150 mmガラス管内の、上記の各菌株用の増殖培地5 mLに植菌する。37℃にて225 rpmで一晩増殖させる。
・0.5 mL一夜培養物を用いて、各菌株用の上記と同じ増殖培地50 mL を入れた250-mLバッフル付きフラスコに植菌する。37℃にて225 rpmで24時間増殖させる。
・それぞれの24時間培養物から2 x1.5 mLを分取して取り出すことによって、フラスコからサンプリングする。Eppendorf Centrifuge 5417C内で13,000 rpm (17,900 x g)にて3分間遠心分離する。上清を新たなエッペンドルフチューブに移し、SDS-PAGE分析および抗-Hisウェスタンブロットに使用する。ペレットも取っておく。全サンプルは-20℃で保存される。
・残りの24時間培養物のA600を測定する。
使用した成分/試薬:Expedeon社より
・20X Teo-Tricine-SDS電気泳動用バッファー #B50500
・RunBlue SDSゲル 4-12%、12ウェル、10cm x 10cm #NXG41212
・10X DTT還元剤 #A32001
・4X LDSサンプルバッファー #B31010
・Invitrogen Novex Mini-Cell XCELL SureLock 電気泳動セル
・転写バッファー:20X Tris-Glycine ブロッティングバッファー # B86500
・BioRad Plus Protein Western スタンダード # 161-0376
・Genscript One-Hour Western Kit # L00204T
・Genscript Hisタグ抗体pAB、ウサギ #A00174;10ul量を-20℃にて保存
・サンプル混合物:
○XμL サンプル
○5μL 4X LDS サンプルバッファー
○2μL 10X DTT 還元剤
○YμL 脱イオン水
○総容量=20μL
・調製ステップ:
○サンプルはボルテックスで攪拌して混合する。
○3分間煮沸する。
○短時間遠心分離して室温に冷却する。
○再度ボルテックス攪拌する。
・760 mLのMilli Q H2Oに40 mLの20X電気泳動用バッファーを添加する
・ゲルをパウチから取り出して脱イオン水ですすぐ。そのゲルを次に、プレートの短い辺が内側に向くように電気泳動ユニットにセットする。ゲルをあるべき位置に固定したら、電気泳動用バッファーを内側の容器に入れる(約200 mL)。続行する前に漏れがないか確認する。残りの電気泳動用バッファーを外側の容器に加える。
・ウェルを電気泳動用バッファーですすぐ。
・5μLのBioRad Westernスタンダードとともに、適量の調製サンプルを上からロードする。
・ゲルを、室温、150ボルトで約1時間電気泳動する(色素の先端がゲルの下端に到達するまで十分に時間をかけて泳動する)。
・1,000 mL転写用バッファーを作製:50 mL 20X Tris-Glycineブロッティングバッファー + 200 mL メタノール + 770 mL MQH20。転写を冷たい状態に保つためにバッファーを冷却する。
・転写用バッファーにスポンジを浸す。
・サンドイッチを構成する前に、ゲルを7分間、転写用バッファー中で平衡化し、ニトロセルロース(NC)メンブレン/ブロッティングメンブレンを10分間、転写用バッファー中で平衡化する。
・サンドイッチを構成する:パラフィルム片の上に、あらかじめ浸漬したワットマン紙片を置く。ワットマン紙の上に、あらかじめ浸漬したゲルを置く。あらかじめ浸漬したNCメンブレンをゲルの上に載せる。ガラス製パスツールピペットを用いて、気泡を除くために膜の上にそっと転がす。NCメンブレンの上にあらかじめ浸漬したワットマン紙片を載せる。再度その上をそっと撫で転がして気泡を除く。サンドイッチしたものを持ち上げて、ブロットモジュールの中にある(転写用バッファーをすべて除去するために絞っておいた)2枚のスポンジの上に置く。ゲルを1枚だけ電気泳動する場合、ユニットの約0.5 cm上にとどまるように、残りのブロットモジュールに絞ったスポンジを詰める。2枚のゲルを泳動する場合、1つめのサンドイッチの上に絞ったスポンジを置く。2つめのサンドイッチを厳密に上記のように構成する。これをスポンジの上に置く。上記のように残りのブロットモジュールにスポンジを詰める。
・十分量の転写用バッファーを用いて、ブロットモジュール内のゲル/メンブレンサンドイッチを覆う。外側のバッファー容器には約550 mL MQH20を使用する。
・室温にて30ボルトで90分間泳動する。
・GenScript One-Hour Western Kitプロトコール;TMB基質でシグナル発色。
・10μL 抗-His Ab + 100μL WB-1;50μL/ゲルを使用
当業者は、本明細書に記載の、本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識し、日常の実験だけを用いて確認することができるであろう。このような均等物は以下の特許請求の範囲に含まれるものとする。
Bose JL et al., 2013. Genetic tools to enhance the study of gene function and regulation in Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology 79:2218-2224.
Jentsch S. 1983. Restriction and modification in Bacillus subtilis: Sequence specificities of restriction/modification systems BsuM, BsuE, and BsuF. Journal of Bacteriology. 156:800-808.
Kost C. et al., 2012. PLOS One. Vol. 7, Issue 7. E41349.
Moscoso M et al., 2017. Protective efficacy of a D-alanine auxotroph Staphylococcus aureus as a vaccine candidate against staphylococcal disease. 27th ECCMID, April 22, 2017, Vienna, Austria.
Pucci M.J. et al., 1992. J of Bacteriology. p.336-342.
Thompson R et al., 1998. Pathogenicity and immunogenicity of a Listeria monocytogenes strain that requires D-alanine for growth. Infection and Immunity 66:3552-3561.
Claims (16)
- 2つの不活化アラニンラセマーゼ遺伝子(alr1およびalr2):および
不活化されたD-アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子(dat)
を含む、組換えブドウ球菌属(Staphylococcus)細菌。 - ブドウ球菌属細菌がその増殖をD-アラニンに依存する、請求項1に記載の組換えブドウ球菌属細菌。
- ブドウ球菌属細菌が表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis))、およびその亜種である、請求項1に記載の組換えブドウ球菌属細菌。
- ブドウ球菌属細菌が、1つまたは複数の追加変異をさらに含む、請求項1に記載の組換えブドウ球菌属細菌。
- 追加変異が、不活化されたグルタミン酸ラセマーゼ遺伝子、MurIを含む、請求項4に記載の組換えブドウ球菌属細菌。
- 細菌がpUBTR114ベースのベクターで形質転換されている、請求項1〜5のいずれか1つに記載の組換えブドウ球菌属細菌。
- pUBTR114ベースのベクターがpUBTR119*-Sal-GFPである、請求項6に記載の組換えブドウ球菌属細菌。
- 組換えブドウ球菌属細菌を作製する方法であって:
(i) D-アラニンアミノトランスフェラーゼ(dat)ノックアウトを含むプラスミドを、ブドウ球菌属菌株のコンピテント細胞に導入して形質転換すること、ここで、前記ブドウ球菌属菌株は不活性のアラニンラセマーゼ遺伝子alr1およびalr2を含む(SEΔalr1Δalr2);
(ii) 形質転換細胞においてノックアウトプラスミドの存在を検出すること;
(iii) ステップ(ii)で同定された形質転換細胞を培養すること;ならびに
(iv) 単離されたコロニーを精製すること
を含む、前記方法。 - 単離されたコロニーのD-アラニン要求性を試験することをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 形質転換体におけるノックアウトプラスミドの存在を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって検出する、請求項8に記載の方法。
- 組換えブドウ球菌属細菌が、表皮ブドウ球菌およびその亜種である、請求項8に記載の方法。
- 組換えブドウ球菌属細菌をpUBTR114ベースのベクターで形質転換することをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- pUBTR114ベースのベクターがpUBTR119*-Sal-GFPである、請求項12に記載の方法。
- 請求項8に記載の方法によって作製される、組換えブドウ球菌属細菌。
- 請求項1〜8または14のいずれか1つに記載の組換えブドウ球菌属細菌を含むキット。
- pUBTR114ベースのベクターをさらに含む、請求項15に記載のキット。
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Non-Patent Citations (3)
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ANTONIE VAN LEEUWENHOEK, 2017年, vol. 110, JPN6022053465, pages 133 - 143, ISSN: 0005124134 * |
NATURE COMMUNICATIONS, 2017年, vol. 8, JPN6022053467, pages 1 - 17, ISSN: 0005124135 * |
VIRULENCE, 2018年1月, vol. 9, no. 1, JPN6022053462, pages 604 - 620, ISSN: 0005124133 * |
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