CN109852627B - 用于CRISPRi系统的质粒、其构建方法及其在使鼠疫菌目的基因定向沉默中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于CRISPRi系统的质粒、其构建方法及其在使鼠疫菌目的基因定向沉默中的应用，属于基因编辑技术领域，其中质粒包含sgRNA表达质粒和pdCas9‑tetO质粒，将本发明构建的双质粒CRISPRi系统转化入鼠疫耶尔森氏菌中在诱导剂脱水四环素盐酸盐存在下可使目的基因定向沉默。本发明的CRISPRi系统可以大幅度降低目的基因的转录水平与蛋白水平，并使鼠疫菌表现出缺失目的基因的相关表型，能作为在鼠疫菌中进行高通量基因功能研究的新型工具。

Description

用于CRISPRi系统的质粒、其构建方法及其在使鼠疫菌目的基 因定向沉默中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其属于基因编辑技术领域，具体涉及用于CRISPRi系统的质粒、其构建方法及其在使鼠疫菌目的基因定向沉默中的应用。

背景技术

鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis，以下也称鼠疫菌)是自然疫源性烈性传染病-鼠疫的病原菌。远在2000年前即有鼠疫疫情的记载，曾引发三次世界范围内的大流行，给人类带来了巨大的灾难。

鼠疫是我国法定的甲类传染病，同时鼠疫菌也是传染性强、致病性高的A类生物战剂之一。随着防疫水平的提高，鼠疫发病率得到了控制，但是在治疗方面，除了大剂量应用抗生素外尚无其他有效的治疗手段，且仍没有能针对鼠疫耶尔森菌的疫苗问世。虽然近年来对鼠疫菌基因组功能研究有很大进展，但是仍有1000多个基因尚不清楚其具体功能及其在感染宿主过程中的作用。因此进一步从基因水平认识鼠疫耶尔森氏菌及其致病机制仍然是当前攻克鼠疫的一大难关。

CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas)系统是由存在部分细菌与古细菌中一段成簇规律间隔的短回文重复序列与序列附近能够编码具有核酸酶结构域的一系列基因组成的，靶向切断外源DNA发挥适应性免疫防御作用。根据原理将Ⅱ型CRISPR/Cas系统改造，得到CRISPR/Cas9系统，其借助发挥酶切作用的Cas9蛋白与人工合成的sgRNA(single guide RNA)来实现目的基因编辑。

CRISPR/Cas9技术现在已经成为国内外实验室中研究基因功能的一种常用工具，其不仅可以靶向敲除目的基因，也可以实现基因的插入及修改。在对鼠疫耶尔森氏菌的研究中，传统基因敲除技术都是基于同源重组原理的基因敲除技术，近些年有报道证实了CRISPR/Cas系统在鼠疫菌中应用的可行性(Yan,M.Y.,Yan,H.Q.,Ren,G.X.,Zhao,J.P.,Guo,X.P.,&Sun,Y.C.(2017).CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering inBacteria.Appl Environ Microbiol,83(17).)，这些基因编辑技术可以实现鼠疫菌中的基因敲除，对其基因组进行修改编辑，虽然可以用于研究鼠疫菌的基因功能，但存在操作复杂，效率低下，且不可逆等缺点。因此，在鼠疫耶尔森氏菌的研究中，亟需一种操作更加简便、更加适合高通量操作的基因编辑技术，以有效研究鼠疫耶尔森氏菌的基因功能和调控基因的表达，有助于更深入认识鼠疫耶尔森氏菌和开发针对鼠疫耶尔森菌的疫苗。

背景技术部分的内容仅仅是发明人所知晓的技术，并不当然代表本领域的现有技术。

发明内容

为解决现有技术中存在的一个或多个问题，本发明一方面提供一种用于CRISPRi系统的sgRNA表达质粒，所述sgRNA表达质粒包含合成片段pgtet，该合成片段pgtet替换pgRNA载体原有的P_J23119启动子；

其中所述合成片段pgtet包含：P_J23119启动子、由P_J23119启动子启动表达的tetR基因和四环素启动子P_LtetO-1；其中所述四环素启动子P_LtetO-1含有两个tetO元件。

上述sgRNA表达质粒的结构模式图如图1中C幅所示。

上述合成片段pgtet的序列为SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列。

上述sgRNA表达质粒表达得到sgRNA，该sgRNA具有SEQ ID NO:26-35所示的序列；所述sgRNA靶向于对应的目的基因转录起始区的上游65bp～下游92bp。

本发明另一方面提供一种上述的sgRNA表达质粒的构建方法，包括：

构建载体pgRNA-tetO-JtetR：利用限制性核酸酶EcoR I与Hind III对载体pgRNA与合成片段pgtet分别进行酶切，再用T4连接酶对两个酶切片段进行连接；

构建靶向目的基因的sgRNA表达质粒：利用Golden-gate法，将目的基因对应的引物对进行退火处理得到退火产物，利用限制性核酸内切酶Bbs I对所述载体pgRNA-tetO-JtetR和所述退火产物分别进行酶切，用T4连接酶对两个酶切片段进行连接。

上述目的基因对应的引物对分别为：

对应目的基因phoP的SEQ ID NO:1-2；对应目的基因slyA的SEQ ID NO:3-4；对应目的基因hmsH的SEQ ID NO:5-6；对应目的基因cobB的SEQ ID NO:7-8；对应目的基因pla的SEQ ID NO:9-10；对应目的基因ail的SEQ ID NO:11-12；对应目的基因cspB的SEQ ID NO:13-14；对应目的基因ibpB的SEQ ID NO:15-16；对应目的基因hdeD的SEQ ID NO:17-18；或对应目的基因yscB的SEQ ID NO:19-20。

本发明另一方面提供一种用于CRISPRi系统的pdCas9-tetO质粒，该pdCas9-tetO质粒与上述的sgRNA表达质粒配合在CRISPRi系统中使用；所述pdCas9-tetO质粒为包含具有两个tetO元件的四环素启动子P_LtetO-1的质粒，该四环素启动子P_LtetO-1替换pdCas9载体原有的tetR基因、tetR基因的启动子和四环素启动子。

上述pdCas9-tetO质粒的结构模式图如图1中D幅所示。

本发明另一方面提供上述pdCas9-tetO质粒的构建方法，包括：

将SEQ ID NO:24-25所示的引物对进行退火处理得到退火产物，利用限制性核酸酶Aat II与Bgl II对载体pdCas9与所述退火产物分别进行酶切，再用T4连接酶对两个酶切片段进行连接。

本发明的又一方面还提供一种CRISPRi系统，包含上述的sgRNA表达质粒和上述的pdCas9-tetO质粒。

本发明的又一方面还提供了上述CRISPRi系统作为鼠疫耶尔森氏菌目的基因定向沉默工具的用途，是将上述sgRNA表达质粒和上述pdCas9-tetO质粒转化入鼠疫耶尔森氏菌中在诱导剂存在下使目的基因定向沉默。

上述将sgRNA表达质粒和pdCas9-tetO质粒转化入鼠疫耶尔森氏菌中在诱导剂存在下使目的基因定向沉默的原理为：将所述sgRNA表达质粒和pdCas9-tetO质粒转化入鼠疫耶尔森氏菌后，所述sgRNA表达质粒和pdCas9-tetO质粒在诱导剂存在下分别表达得到sgRNA和dCas9蛋白，所述表达得到的sgRNA和dCas9蛋白结合后的dCas9-sgRNA结构在sgRNA的导向作用下靶向目的基因，通过抑制所述目的基因的转录实现所述目的基因的沉默。

上述转化通过电击转化，所述电击的电压为2.5kV。

上述诱导剂为脱水四环素盐酸盐，所述诱导剂的浓度不低于0.02μg/ml，优选1μg/ml；还可以使用其他类型诱导剂，例如四环素衍生物。

上述目的基因定向沉默为可逆诱导沉默。

上述使目的基因定向沉默的表型包括：抑制鼠疫耶尔森氏菌生物膜的形成。

基于以上技术方案，本发明构建了适用于鼠疫耶尔森氏菌高通量基因功能研究的sgRNA表达质粒和pdCas9-tetO质粒双质粒系统，首次将CRISPRi技术应用于鼠疫耶尔森氏菌的基因研究中，尤其是作为鼠疫耶尔森氏菌基因功能研究中的基因沉默工具。通过将构建的双质粒系统转化入鼠疫菌细胞中，在诱导剂的存在下表达得到sgRNA和dCas9蛋白，随后两者结合并靶向目的基因的特定位点，抑制RNA聚合酶、转录因子等与目的基因的结合，从而抑制目的基因的转录以及转录的延伸，最终实现目的基因的表达沉默。具有以下有益效果：

1)本发明首次在鼠疫耶尔森氏菌中应用CRISPRi技术，具体作为鼠疫耶尔森氏菌研究中的基因沉默工具，进行以脱水四环素盐酸盐(anhydrotetracycline，即aTc)为诱导剂的可诱导的目的基因沉默，通过sgRNA与dCas9结合靶向抑制目的基因的转录，并通过表型实验验证目的基因转录抑制。本发明的CRISPRi系统可以在不改变鼠疫菌基因组的前提下高效地沉默目的基因，大幅度降低目的基因的转录水平与蛋白水平，并使鼠疫菌表现出缺失目的基因的相关表型。因此，CRISPRi技术可以作为一种在鼠疫菌中进行基因功能研究的新型工具，为鼠疫耶尔森氏菌基因功能的研究提供了有效工具。

2)虽然已经证实了CRISPR/Cas基因编辑技术在鼠疫菌中进行基因敲除的可行性，但其是对鼠疫菌基因组进行修改编辑，是一种非可逆的基因编辑技术。并且，现有研究中在利用CRISPR/Cas9技术进行基因操作时，由于表达的Cas9蛋白发挥酶切作用，会对目的基因的本底沉默产生较为显著的影响，从而影响表型结果。而本发明公开的CRISPRi技术具备可以“诱导沉默”与“沉默可逆”的特点，基于构建的sgRNA表达质粒和pdCas9-tetO质粒以及质粒转化的高效性可以实现高通量的沉默并建库。其中构建的sgRNA表达质粒在pgRNA载体上引入一个稳定表达的tetR基因和含有两个tetO元件的四环素启动子P_LtetO-1，构建的pdCas9-tetO质粒利用含有两个tetO元件的四环素启动子P_LtetO-1来替换pdCas9载体上原有的tetR基因、tetR基因的启动子和旧的四环素启动子，改善了双质粒系统诱导表达的严格性，可以显著降低目的基因的本底沉默，将双质粒系统对细菌本身基因表达的影响降到最低，使得CRISPRi技术更加适合于鼠疫菌中的基因沉默。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是sgRNA表达质粒和pdCas9载体模式图；

图2是本发明一个实施例构建的pgRNA-teto-JtetR-phoP和pdCas9-tetO质粒与现有技术中pgRNA-phoP和pdCas9质粒相对表达对比结果；

图3是鼠疫菌中目的基因的转录抑制水平与诱导的目的基因沉默和不诱导的目的基因沉默之间的关系；

图4是鼠疫菌中目的基因phoP的转录水平与不同诱导剂浓度条件下诱导的目的基因沉默之间的关系；

图5是鼠疫菌中目的基因蛋白水平表达与诱导目的基因沉默和不诱导目的基因沉默之间的关系；

图6是鼠疫菌中目的基因去诱导后蛋白表达水平变化；

图7是鼠疫菌生物膜形成与不同诱导剂浓度条件下诱导的生物膜相关基因沉默之间的关系。

具体实施方式

针对现有技术中存在的CRISPR/Cas系统在鼠疫菌基因编辑过程中存在的需要对基因组进行基因敲除式的非可逆修改编辑，以及操作复杂、效率低下等问题，本发明的目的是提供一种更加适合于鼠疫菌基因功能研究的CRISPRi技术。

CRISPRi(CRISPR interference)技术是对CRISPR/Cas9技术进一步改造，其把CRISPR/Cas9中Cas9蛋白中发挥核酸酶切功能的两个活性位点突变失活，获得dCas9蛋白，其不能切断但可以结合到目的基因并抑制目的基因的转录。

基于以上原理，本发明构建了用于CRISPRi技术诱导鼠疫耶尔森氏菌目的基因定向沉默的sgRNA表达质粒和pdCas9-tetO质粒，其中构建的sgRNA表达质粒在pgRNA载体上引入一个稳定表达的tetR基因和含有两个tetO元件的四环素启动子P_LtetO-1，构建的pdCas9-tetO质粒利用含有两个tetO元件的四环素启动子P_LtetO-1来替换pdCas9载体上原有的tetR基因、tetR基因的启动子和旧的四环素启动子，改善了双质粒系统诱导表达的严格性，可以显著降低目的基因的本底沉默，将双质粒系统对细菌本身基因表达的影响降到最低，使得本发明的CRISPRi技术更加适合于鼠疫菌中的基因编辑操作。同时，验证了本发明构建的双质粒系统在鼠疫菌中作为定向基因沉默工具的有效性。

以下结合具体实施例详述本发明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的公开内容不限于下述的实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。本发明中使用的限制性核酸内切酶及缓冲液购买自NEB公司；T4连接酶及缓冲液，ExTaq酶及缓冲液购买自Takara。

实施例1：sgRNA表达质粒和pdCas9-tetO质粒

1.1.构建质粒pgRNA-phoP：以pgRNA载体(空载体，其模式结构图如1A所示，获自Addgene#44251，网址：https://www.addgene.org/)为模板，利用下表1中所示的引物phop-1o-F(SEQ ID NO:21)与phop-1o-R(SEQ ID NO:22)按照下表2所示的体系以及下表3所示的PCR程序对pgRNA载体进行PCR扩增，得到PCR扩增片段，再利用限制性核酸酶Spe I与HindIII按照下表4所示的酶切体系对pgRNA载体与其PCR扩增片段分别进行酶切，再用T4连接酶按照下表5所示的连接体系对两个酶切片段进行连接，得到针对鼠疫耶尔森氏菌目的基因phoP的sgRNA表达质粒(对照质粒)，命名为质粒pgRNA-phoP。在该实施例中，质粒pgRNA-phoP与pdCas9载体(其模式结构图如图1中B幅所示，获自Addgene#44249，网址：https://www.addgene.org/)构成转化入鼠疫耶尔森氏菌细胞的一对质粒，用作对照。

表1：构建sgRNA表达质粒所用的引物序列

表2：PCR扩增体系

表3：PCR扩增程序

表4：酶切体系

时间：4-5小时；条件：37℃恒温。

表5：连接体系

时间：12-16小时；条件：16℃恒温。

1.2.构建载体pgRNA-tetO-JtetR：按照上表4所示的酶切体系利用限制性核酸酶EcoR I与Hind III对载体pgRNA(同1.1的来源)与合成片段pgtet(SEQ ID NO:23所示的序列)分别进行酶切，再按照上表5所示的连接体系用T4连接酶对两个酶切片段进行连接，得到载体命名为pgRNA-tetO-JtetR。

基于构建的载体pgRNA-tetO-JtetR和上表1中所示的引物对序列，根据下述Golden gate法构建靶向不同目的基因的sgRNA表达质粒：

将上表1所示的各引物对按照下表6所示的退火体系和下表7所示的退火程序进行退火，分别得到退火产物；然后根据下表8所示的Golden gate法体系和下表9所示的程序利用限制性核酸内切酶Bbs I对上述退火产物和载体pgRNA-tetO-JtetR进行酶切，利用T4连接酶对酶切片段进行连接，得到上表1中所示的针对不同目的基因的sgRNA表达质粒，各质粒命名如表1所示。构建的sgRNA表达质粒的结构模式图如图1中C幅所示，其包含一个由P_J23119启动子启动表达的tetR基因和具有两个tetO元件的四环素启动子P_LtetO-1，从而替换pgRNA载体原有的P_J23119启动子。

在该实施例中共构建了针对10个存在于鼠疫耶尔森氏菌染色体或质粒上的目的基因(参见表10)的sgRNA表达质粒(对应表1)，下表10列出了上述10个目的基因的功能、靶向该10个基因的sgRNA的序列及其靶向的基因起始转录区的相对位置。

表6：引物退火体系

表7：引物退火程序

表8：Golden gate法体系

表9：Golden gate法程序

表10：10个基因的功能、靶向基因的sgRNA序列及靶向位置

1.3.构建质粒pdCas9-tetO：根据上表6所示退火体系和上表7所示退火程序将下表11所示的引物pdcas-tetO-F(SEQ ID NO:24)与pdcas-tetO-R(SEQ ID NO:25)进行退火处理得到退火产物，根据上表4的酶切体系利用限制性核酸酶Aat II与Bgl II对载体pdCas9(同1.1的来源)与退火产物分别进行酶切，再根据上表5所示的连接体系用T4连接酶对两个酶切片段进行连接，获得质粒，命名为pdCas9-tetO，其模式结构图如图1中D幅所示。所构建的pdCas9-tetO质粒包含具有两个tetO元件的四环素启动子P_LtetO-1，从而替换了pdCas9载体原有的tetR基因、tetR基因的启动子和四环素启动子(原有的只含有一个tetO元件)，使得pdCas9-tetO质粒的表达更加严格。

表11：构建pdCas9-tetO质粒所用的引物序列

1.4.sgRNA表达质粒和pdCas9-tetO质粒双质粒系统

将1.3构建的质粒pdCas9-tetO与上述1.2构建的sgRNA表达质粒一起通过电击方式转化入鼠疫耶尔森氏菌细胞以表达出sgRNA和dCas9蛋白，在该实施例中使用的电击的电压为2500v。表达之后得到的sgRNA和dCas9蛋白结合能够根据sgRNA的导向作用靶向结合目的基因的特定位点，抑制目的基因的转录。

本发明人对上述构建的靶向鼠疫耶尔森氏菌的phoP基因的sgRNA表达质粒pgRNA-teto-JtetR-phoP和pdCas9-tetO质粒的相对表达量进行分析，并与上述1.1构建的sgRNA表达质粒pgRNA-phoP和pdCas9载体的相对表达量进行对比。分别将pgRNA-teto-JtetR-phoP和pdCas9-tetO组成的一对质粒以及1.1构建的对照质粒pgRNA-phoP和pdCas9组成的一对质粒通过电压为2500v的电击方式转化入鼠疫耶尔森氏菌细胞，在诱导剂(0、0.5、1μg/ml脱水四环素盐酸盐，aTc)下进行诱导培养，然后根据下表12中所示的引物(SEQ ID NO:36-43)分别对转化入鼠疫耶尔森氏菌中的质粒表达后得到的针对phoP基因的sgRNA(命名为phoP-sgRNA)、dCas9蛋白(通过mRNA体现)的相对表达量和基因phoP(通过mRNA体现)的转录水平抑制倍数进行检测，结果如图2所示。

表12：用于检测相对表达量的引物核苷酸序列

图2示出了phoP-sgRNA、dCas9蛋白的相对表达量结果和基因phoP转录水平抑制倍数的结果，其中图2中左侧一栏(图2中A、C、E幅)代表转化入鼠疫耶尔森氏菌细胞的是对照质粒pgRNA-phoP和pdCas9，图2中右侧一栏(图2中B、D、F幅)代表转化入鼠疫耶尔森氏菌细胞的是pgRNA-teto-JtetR-phoP和pdCas9-tetO。对于phoP-sgRNA的相对表达量检测结果，以图2之A幅中不加诱导剂组sgRNA相对表达量为1作为对照，结果显示，图2之A幅中在0.5μg/ml aTc和在1μg/ml aTc的诱导条件下的sgRNA相对表达量基本一致，其相对表达量大约为20，而在图2之B幅中，在0.5μg/ml aTc和1μg/ml aTc的诱导条件下的sgRNA相对表达量差异显著，且高浓度诱导剂时sgRNA相对表达量显著提高，其相对表达量大约为100，因此，与图2之A幅中sgRNA的相对表达量相比，图2之B幅中的sgRNA的相对表达量受诱导剂调控更加明显，而且sgRNA的相对表达量显著提高。也即是说，该实施例构建的pgRNA-teto-JtetR-phoP表达质粒相对于pgRNA-phoP对照质粒受诱导剂aTc调控更加明显。

对于dCas9相对表达量(通过mRNA体现)的检测结果，以图2之C中不加诱导剂组dCas9mRNA相对表达量为1作为对照，结果显示，图2之C和图2之D中在诱导剂存在下的dCas9表达水平基本保持一致，因此，dCas9表达受诱导调控不明显，在双质粒系统中sgRNA的相对表达量对整个系统的可诱导性的作用更大。由于本发明人已经在pgRNA载体上引入了一个稳定表达的tetR基因，为了改善pdCas9载体诱导表达的严格性，相应地用含有两个tetO元件的四环素启动子P_LtetO-1对载体pdCas9中原有的tetR基因进行替换，来构建pdCas9-tetO。

对于目的基因phoP转录水平抑制倍数(通过mRNA体现)结果，将野生型phoP基因转录水平抑制倍数为1作为对照，结果显示，在无诱导剂存在的情况下，图2之E中无诱导剂组phoP基因转录水平抑制倍数相对于野生型phoP基因转录水平抑制倍数显著提高，其抑制倍数可达100倍，即图2之E中无诱导剂组显著提高目的基因phoP的本底沉默，而图2之F中无诱导剂组phoP基因转录水平相对于野生型phoP基因转录水平基本一致，因此，在无诱导剂存在的情况下，双质粒系统pgRNA-teto-JtetR-phoP和pdCas9-tetO与pgRNA-phoP和pdCas9对照质粒系统相比可以明显降低目的基因的本底沉默，使整个双质粒系统对细菌本身基因表达影响降低到最低水平。

以上试验结果表明，构建的pgRNA-teto-JtetR-phoP和pdCas9-tetO双质粒系统相对于对照质粒系统pgRNA-phoP和pdCas9更有利于对鼠疫耶尔森氏菌的基因功能进行研究。双质粒系统pgRNA-teto-JtetR-phoP和pdCas9-tetO受诱导剂的调控更加明显，对于目的基因转录水平更容易观察；并且双质粒系统可以明显降低鼠疫耶尔森氏菌目的基因的本底沉默，使整个双质粒系统对细菌本身基因表达影响到最低水平。上表10中所列的针对其它目的基因的sgRNA表达质粒和pdCas9-tetO质粒组成的双质粒系统也具有与pgRNA-teto-JtetR-phoP和pdCas9-tetO双质粒系统相同的实验结果，再此不一一列示。

实施例2：诱导剂的使用

2.1.本发明人选取了鼠疫菌中位于染色体或质粒上的9个与鼠疫耶尔森氏菌表型相关的基因(ail，cobB，cspB，hdeD，hmsH，ibpB，pla，slyA，yscB，各个基因的功能如上表10所示)，并利用实施例1中构建的sgRNA表达质粒(参见表10)和dCas9-tetO质粒通过电击转化入细菌的方式来构建相对应的目的基因沉默株，并使用1μg/ml的aTc为诱导剂，将构建的沉默株分为诱导条件下的沉默株(在转化时就开始添加诱导剂)和非诱导条件下的沉默株，同时设立野生对照菌株，对试验的每个菌株培养至对数中期，即OD₆₂₀为1.0左右。

利用上表12中所示的核苷酸序列对试验的每个菌株qRT-PCR(实时荧光定量PCR)实验进行目的基因转录水平(以mRNA表示)的检测，检测结果见图3，其中WT代表野生对照菌株，sgRNA-ail、sgRNA-cobB、sgRNA-cspB、sgRNA-hdeD、sgRNA-hmsH、sgRNA-ibpB、sgRNA-pla、sgRNA-slyA、sgRNA-yscB分别表示对应基因的沉默株，其中未加*标记的代表非诱导条件下的沉默株、加*标记的代表诱导条件下的沉默株。

图3结果显示，鼠疫耶尔森氏菌的9个目的基因的沉默株在非诱导的条件均表现出与野生株基本一致的转录水平；在诱导的条件下的沉默株均显著抑制目的基因的转录水平，抑制倍数可高达400倍(例如对ail基因的抑制)。上述试验结果验证了CRISPRi技术在鼠疫耶尔森氏菌中作为定向基因沉默工具时应在诱导剂存在下诱导目的基因沉默，该实施例中使用aTc为诱导剂，本领域技术人员还可以选择使用四环素盐酸盐衍生物作为诱导剂。

2.2.本发明人选取鼠疫菌的phoP基因(其功能见上表10所示)，并利用上述实施例1中构建的双质粒系统pgRNA-teto-JtetR-phoP和dCas9-tetO通过电击转化入鼠疫菌中构建鼠疫菌phoP基因沉默株sgRNA-phoP，用于检验在不同诱导剂浓度(0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0μg/ml aTc)存在下的沉默效果(在转化时就开始添加诱导剂)，并设立野生对照菌株，对试验的每个菌株培养至对数中期，即OD₆₂₀为1.0左右。利用上表12中所示的核苷酸序列(phop-F和phop-R)对试验的每个菌株qRT-PCR实验进行目的基因转录水平(以mRNA表示)的检测，检测结果见图4，其中WT代表野生对照菌株，sgRNA-phoP代表目的基因phop沉默株。

图4结果显示，在0μg/ml aTc存在下的phoP基因沉默株的转录水平与野生对照菌株基本保持一致，在0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0μg/ml aTc存在下的phoP基因沉默株的转录水平均显著低于野生对照菌株的转录水平，表明当诱导剂aTc的浓度在不低于0.02μg/ml的条件下均能够抑制目的基因的转录，当aTc的诱导浓度为1μg/ml时，可以实现最佳的基因沉默效果。

实施例3：蛋白水平表达

本发明人选取鼠疫菌的4个目的基因hmsH，phoP，pla，slyA(各自基因功能见上表10所示)，利用实施例1所构建的对应目的基因的双质粒系统，通过电击转化入鼠疫菌构建相对应的目的基因沉默株，并在非诱导条件下和以1μg/ml的aTc作为诱导剂的诱导条件下(在转化时就开始添加诱导剂)进行诱导培养，同时设立鼠疫菌野生株作为对照，对试验的每个菌株培养至对数中期，即OD₆₂₀为1.0左右。利用Western blotting(蛋白印迹)实验验证野生株与相应沉默株的目的基因的蛋白水平变化，以GroEL蛋白作为内参保持上样量的一致。结果如图5所示，图中M代表Marker标记，WT代表野生株，sgRNA-hmsH、sgRNA-phoP、sgRNA-pla、sgRNA-slyA分别代表目的基因沉默株，HmsH、PhoP、Pla、SlyA分别代表各自目的基因对应的蛋白表达印记，GroEL代表蛋白内参。

图5结果显示，选择的4个目的基因沉默株在非诱导条件下的蛋白表达印记与野生株的蛋白表达印记基本相同，表明目的基因沉默株在非诱导条件下的蛋白表达水平与野生株的蛋白表达水平基本保持一致；选择的4个目的基因沉默株在1μg/ml的aTc诱导条件下的蛋白表达印记与野生株的蛋白表达印记相比，明显较浅较细，表明目的基因沉默株在1μg/ml的aTc诱导条件下的蛋白表达水平明显低于野生株的蛋白表达水平；以上结果表明目的基因沉默株在诱导的条件下蛋白表达水平下降明显，与上述实施例2转录水平变化一致。

实施例4：诱导目的基因沉默的可逆性

本发明人选取鼠疫菌的phoP基因，利用实施例1所构建的双质粒系统pgRNA-teto-JtetR-phoP和pdCas9-tetO，通过电击转入鼠疫菌构建phoP基因沉默株sgRNA-phoP，将其在1μg/ml的aTc诱导条件下培养至对数中期，通过离心重悬的方法去除诱导剂，并继续培养，分别于sgRNA-phoP去诱导后0h、12h对沉默株进行1:10传代培养，并利用Western blotting检测经传代培养后的蛋白表达水平。结果如图6中所示，其中M代表Marker标记，WT代表野生株，sgRNA-phoP代表目的基因沉默株，dCas9代表dCas9蛋白表达，PhoP代表目的基因蛋白表达，GroEL代表蛋白内参，*号代表进行1:10传代培养。

图6中结果显示，phoP基因沉默株在去诱导后4h、8h目的基因PhoP蛋白表达水平持续恢复，相对应的抑制PhoP蛋白水平表达的dCas9蛋白表达水平持续下降；在去诱导后24h目的基因phoP蛋白表达水平迅速恢复到与野生型蛋白表达水平一致，相应的dCas9蛋白表达也迅速消失。

以上试验结果验证了鼠疫菌诱导的基因沉默是可逆的，诱导基因沉默后去除诱导源，目的基因的蛋白水平将持续恢复至野生型蛋白表达水平，当沉默株经过传代培养后，其基因蛋白表达水平迅速恢复至野生型蛋白表达水平，表明鼠疫菌的诱导基因沉默的可逆性依赖于细菌的生长。

实施例5：生物膜形成的影响

鼠疫菌的生物膜形成与基因hmsH相关，hmsH基因沉默或缺失的鼠疫菌会出现生物膜形成下降的现象。本发明人利用实施例1所构建的双质粒系统pgRNA-teto-JtetR-hmsH和pdCas9-tetO，通过电击转化入鼠疫菌构建hmsH基因沉默株sgRNA-hmsH，分别在0、0.25、0.5、0.75、1.0μg/ml的aTc诱导条件下诱导培养(在转化时就开始添加诱导剂)，同时设立野生株对照，对试验的每个菌株培养至对数中期，即OD₆₂₀为1.0左右。分别对试验的每个菌株进行结晶紫染色半定量实验，结果如图7所示，示出了鼠疫菌相对生物膜形成与诱导hmsH基因沉默之间的关系，其中WT代表野生株，sgRNA-hmsH代表沉默株。

图7结果显示，sgRNA-hmsH沉默株在非诱导条件下与野生株的相对生物膜形成基本一致，而在诱导条件下，沉默株的相对生物膜形成下降，并且与野生株差异显著，表现为在一定范围内(0.25μg/ml-1.0μg/ml)诱导浓度越高，沉默株的相对生物膜形成越低，生物膜形成抑制效果越好。以上实验结果表明，sgRNA-hmsH沉默株在诱导条件下确实导致基因hmsH沉默，从而抑制了基因hmsH的蛋白表达，导致用于生物膜形成的蛋白缺失，影响生物膜的形成。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 用于CRISPRi系统的质粒、其构建方法及其在使鼠疫菌目的基因定向沉默中的应用

<160> 61

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcacatcctt gataaaacgt taac 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaacgttaac gttttatcaa ggat 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcacgttcca acggtttcag ccga 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaactcggct gaaaccgttg gaac 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcacagcaac ttgtttgatg atca 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaactgatca tcaaacaagt tgct 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcaccgctgc accacgaacg cccc 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaacggggcg ttcgtggtgc agcg 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcactgatgc tgcattagca ctcc 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaacggagtg ctaatgcagc atca 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcacacagta accacagact aaag 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaacctttag tctgtggtta ctgt 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcacgtgcca ctacatggca attg 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaaccaattg ccatgtagtg gcac 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gcacagcgag ataataggta gcca 24

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aaactggcta cctattatct cgct 24

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcacttttta acgcgctttc atcg 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aaaccgatga aagcgcgtta aaaa 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcacagaaat aatgcaaaat ttac 24

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aaacgtaaat tttgcattat ttct 24

<210> 21

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

actagtatcc ttgataaaac gttaacgttt tagagctaga aatagc 46

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aagcttcaaa aaaagcaccg actcg 25

<210> 23

<211> 850

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gaattcttaa gacccacttt cacatttaag ttgtttttct aatccgcata tgatcaattc 60

aaggccgaat aagaaggctg gctctgcacc ttggtgatca aataattcga tagcttgtcg 120

taataatggc ggcatactat cagtagtagg tgtttccctt tcttctttag cgacttgatg 180

ctcttgatct tccaatacgc aacctaaagt aaaatgcccc acagcgctga gtgcatataa 240

tgcattctct agtgaaaaac cttgttggca taaaaaggct aattgatttt cgagagtttc 300

atactgtttt tctgtaggcc gtgtacctaa atgtactttt gctccatcgc gatgacttag 360

taaagcacat ctaaaacttt tagcgttatt acgtaaaaaa tcttgccagc tttccccttc 420

taaagggcaa aagtgagtat ggtgcctatc taacatctca atggctaagg cgtcgagcaa 480

agcccgctta ttttttacat gccaatacaa tgtaggctgc tctacaccta gcttctgggc 540

gagtttacgg gttgttaaac cttcgattcc gacctcatta agcagctcta atgcgctgtt 600

aatcacttta cttttatcta atctagacat catcgtgagt acctcctgcg gccactagta 660

ttatacctag gactgagcta gctgtcaatc cctatcagtg atagagattg acatccctat 720

cagtgataga gatactgagc acgggtcttc gagaagacct gttttagagc tagaaatagc 780

aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 840

tttgaagctt 850

<210> 24

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ggacgtctcc ctatcagtga tagagattga catccctatc agtgatagag atactgagca 60

cagatcttc 69

<210> 25

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gaagatctgt gctcagtatc tctatcactg atagggatgt caatctctat cactgatagg 60

gagacgtcc 69

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

atccttgata aaacgttaac 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gttccaacgg tttcagccga 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

agcaacttgt ttgatgatca 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

cgctgcacca cgaacgcccc 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tgatgctgca ttagcactcc 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

acagtaacca cagactaaag 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gtgccactac atggcaattg 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

agcgagataa taggtagcca 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tttttaacgc gctttcatcg 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gtaaattttg cattatttct 20

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ccttgataaa acgttaacg 19

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gttgataacg gactagcc 18

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

agctctatct ctattatctc c 21

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

catctttttg actacttctt c 21

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gccacactgg aactgagaca cg 22

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

cgctgaaagt gctttacaac cc 22

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

agataaagtc gctgtactgg a 21

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ttggttaaca cataactcac g 21

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

agaatggcat cagatggagt t 21

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

aataggtggg ctgtaaagga g 21

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

ttaccaccag agcaatcaca g 21

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

aacaaatcac gccatcaacc t 21

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

tttcgctccc gtatttttca t 21

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

caggtgtcgc cacatcttct a 21

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

gggtggacgt ctctggcttc c 21

<210> 51

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

tcctgctgtt atacctgctt t 21

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

gtatggatta ttgggggcag g 21

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

ttcacatcat cgagtttgga g 21

<210> 54

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

aaccactatc gcatctcact g 21

<210> 55

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

gaactcttta cgaaccagcc c 21

<210> 56

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

ggttttggtt ttatttctcc t 21

<210> 57

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

actcaacgtt ctggccttca t 21

<210> 58

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

ggaagaaaac cgtttgtt 18

<210> 59

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

cttgttgcat tagggagc 18

<210> 60

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

taaggatcta aaaagaccgg g 21

<210> 61

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

ctagcaacca taaagcaact g 21

Claims (9)

1.一种作为鼠疫耶尔森氏菌目的基因定向沉默工具的CRISPRi系统，其包含sgRNA表达质粒和pdCas9-tetO质粒；其中：

所述sgRNA表达质粒包含合成片段pgtet，该合成片段pgtet替换pgRNA载体原有的P_J23119启动子；

其中所述合成片段pgtet包含：P_J23119启动子、由P_J23119启动子启动表达的tetR基因和四环素启动子P_LtetO-1；其中所述四环素启动子P_LtetO-1含有两个tetO元件；

所述pdCas9-tetO质粒为包含具有两个tetO元件的四环素启动子P_LtetO-1的质粒，该四环素启动子P_LtetO-1替换pdCas9载体原有的tetR基因、tetR基因的启动子和四环素启动子。

2.根据权利要求1所述的CRISPRi系统，其特征在于，所述合成片段pgtet的序列为SEQID NO:23所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的CRISPRi系统，其特征在于，所述sgRNA表达质粒的构建方法包括：

构建载体pgRNA-tetO-JtetR：利用限制性核酸酶EcoR I与Hind III对载体pgRNA与合成片段pgtet分别进行酶切，再用T4连接酶对两个酶切片段进行连接；

构建靶向目的基因的sgRNA表达质粒：利用Golden-gate法，将目的基因对应的引物对进行退火处理得到退火产物，利用限制性核酸内切酶Bbs I对所述载体pgRNA-tetO-JtetR和所述退火产物分别进行酶切，用T4连接酶对两个酶切片段进行连接。

4.根据权利要求3所述的CRISPRi系统，其特征在于，所述目的基因对应的引物对分别为：

对应目的基因phoP的SEQ ID NO:1-2；

对应目的基因slyA的SEQ ID NO:3-4；

对应目的基因hmsH的SEQ ID NO:5-6；

对应目的基因cobB的SEQ ID NO:7-8；

对应目的基因pla的SEQ ID NO:9-10；

对应目的基因ail的SEQ ID NO:11-12；

对应目的基因cspB的SEQ ID NO:13-14；

对应目的基因ibpB的SEQ ID NO:15-16；

对应目的基因hdeD的SEQ ID NO:17-18；或

对应目的基因yscB的SEQ ID NO:19-20。

5.根据权利要求1所述的CRISPRi系统，其特征在于，所述pdCas9-tetO质粒的构建方法包括：

将SEQ ID NO:24-25所示的引物对进行退火处理得到退火产物，利用限制性核酸酶AatII与Bgl II对载体pdCas9与所述退火产物分别进行酶切，再用T4连接酶对两个酶切片段进行连接。

6.权利要求1-5中任一项所述的CRISPRi系统在作为鼠疫耶尔森氏菌目的基因定向沉默工具中的用途，其特征在于，将所述sgRNA表达质粒和所述pdCas9-tetO质粒转化入鼠疫耶尔森氏菌中在诱导剂存在下使目的基因定向沉默，其中所述目的基因定向沉默为可逆诱导沉默。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述诱导剂为脱水四环素盐酸盐，所述诱导剂的浓度不低于0.02μg/ml。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述诱导剂的浓度为1μg/ml。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的用途，其特征在于，所述转化通过电击转化，所述电击的电压为2.5kV；和/或

所述使目的基因定向沉默的表型包括：抑制鼠疫耶尔森氏菌生物膜的形成。

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