CN110257420A - 基于CasRx的植物基因沉默载体及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CasRx的植物基因沉默载体及其构建方法和应用，涉及植物分子生物学领域中的定向基因沉默技术。本植物基因沉默载体是CasRx双元表达载体pHLW‑CasRx；其结构是35S驱动CasRx蛋白表达、AtU6‑26启动子驱动sgRNA表达；其系列是SEQ ID NO.1所示。本发明建立的基于CasRx的植物基因沉默载体能够快速简单特异地对植物基因进行高效的基因沉默，弥补了植物中基于CasRx的高效定向基因沉默系统，同时解决了RNAi技术诸多缺陷；本发明建立的植物基因沉默体系简单、快速、高特异性，能够快速高效高特异性的对植物靶标基因进行表达量敲低和RNA干扰。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子生物学领域中的定向基因沉默技术，尤其涉及一种基于CasRx（黄瘤胃球菌XPD3002的核糖核酸酶效应子）的植物基因沉默载体及其构建方法和应用。
背景技术
基因沉默是指在不改变基因组DNA序列的情况下使基因不表达或低水平表达的现象；在基因沉默技术的实际操作中，人们常采用转录后水平的基因沉默机制（RNAi技术）；RNAi技术已经成功用于植物基因功能解析、植物抗病虫害和品质改良等方面，但RNAi技术存在抑制效率不一致、脱靶效应明显、容易出现非预期效应和对非靶标生物的不利影响等缺点，因此开发一种适合植物的高特异性的、操作简便的高效基因沉默技术成为必要。CRISPR-Cas【规律成簇间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats, CRISPR）和CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated proteins,Cas）】系统是来源于细菌和古细菌的获得性免疫系统，主要用于清除噬菌体等外源DNA。该系统主要包括两个成分crRNA和Cas蛋白，crRNA和Cas蛋白形成有功能的复合物，复合物识别靶标序列并切开特异的位点。近年来，研究人员鉴定出可以靶向RNA的CasRx蛋白并成功应用于人类细胞系的基因沉默操作，通过比较，研究人员发现与RNAi技术相比，基于CasRx的基因沉默技术的特异性和沉默效率更高，同时该系统不受RNA类型的限制，成功克服了RNAi技术存在的诸多问题，但植物中尚无基于CasRx的基因沉默技术的报道。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种基于CasRx的植物基因沉默载体及其构建方法和应用。
本发明通过以下技术方案来实现：
一、基于CasRx的植物基因沉默载体
基于CasRx的植物基因沉默载体是CasRx双元表达载体pHLW-CasRx，
其结构是35S驱动CasRx蛋白表达、AtU6-26启动子驱动sgRNA表达，如图1；
其系列是SEQ ID NO.1所示。
其构建过程：
①将CasRx基因克隆至双元表达载体pPTG-gRNA-Cas9-U6-1中，形成新的中间双元表
达载体pHLW-CasRx-M；
②将含有AtU6启动子、BsaI酶切位点、gRNA scaffold和终止子的片段构建到CasRx的中间双元表达载体pHLW-CasRx-M中，形成新的CasRx双元表达载体pHLW-CasRx。
二、基于CasRx的植物基因沉默载体的构建方法
①根据烟草的目的基因设计靶标序列，如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；根据后续的快速构建方法设计含有BsaI酶切位点的引物对，如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11所示；
②通过快速构建方法将配对的靶标序列，如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，构建进入CasRx双元载体pHLW-CasRx中。
三、基于CasRx的植物基因沉默载体的应用
①将构建好的基于CasRx的植物基因沉默载体转化农杆菌并挑取阳性克隆摇菌制备菌悬液；
②使用无菌注射器将菌悬液平推进烟草中，两天后取样并提取RNA开展荧光定量实验，检测定向敲低效果。
本发明具有下列优点和积极效果：
①本发明建立的基于CasRx的植物基因沉默载体能够快速简单特异地对植物基因进行高效的基因沉默，弥补了植物中基于CasRx的高效定向基因沉默系统，同时解决了RNAi技术诸多缺陷；
②本发明建立的植物基因沉默体系简单、快速、高特异性，能够快速高效高特异性的对植物靶标基因进行表达量敲低和RNA干扰；
③实验结果证明通过农杆菌介导的烟草瞬时遗传转化，基于CasRx的植物基因沉默载体成功地对烟草基因NtPDS进行了高效的定向基因沉默。
附图说明
图1是基于CasRx的植物基因沉默载体的结构示意图；
图2是RT-qPCR检测基因沉默效果图；
图3是本发明中所有使用到的引物表。
具体实施方式
一、本发明生物材料的来源：
1、载体pPTG-gRNA-Cas9-U6-1由申请人前期构建（专利公开号为：107603980A），CasRx基因全长由上海生物生工有限公司合成得到；
2、所有的引物均由申请人自行设计并委托上海生物生工有限公司合成；
3、所有使用的PCR聚合酶均购买自北京全式金有限公司；
4、所有使用的限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购买自New England Biolabs。
二、实施例
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不应理解为对本发明的限制：
1、实施例1
本实施例用于说明基于CasRx的植物基因沉默载体的构建过程。
A、挑取含有pPTG-gRNA-Cas9-U6-1质粒的单菌落，分别接种于含有50ng/mL Kan的50mL LB液体培养基中，37℃、200r/min恒温摇床过夜培养；
B、离心收集菌体，使用碱裂解法提取pPTG-gRNA-Cas9-U6-1质粒，通过Nanodrop 2000测定质粒浓度；
C、使用SwaI、BamHI对pPTG-gRNA-Cas9-U6-1质粒进行酶切验证，同时使用引物SP-DL/SP-R对pPTG-gRNA-Cas9-U6-1质粒进行PCR和测序验证；
D、人工合成长度为3039bp的全长CasRx（包含核定位序列和HA标签）的片段（SEQ IDNO.1），这个片段依次包含左端同源臂位点、HA标签、SV40核定位序列、CasRx全长、核定位序列和右端同源臂；使用引物INF-CasRx-F和INF-CasRx-R进行PCR得到产物INF-CasRx，并回收对应的酶切产物；
E、使用SwaI、BamHI对pPTG-gRNA-Cas9-U6-1质粒进行双酶切，并回收对应的酶切产物；
F、取步骤E中的酶切产物和步骤D中的PCR产物混合使用pEASY-Uni Seamless Cloningand Assembly Kit进行同源重组反应，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取阳性克隆、PCR并送样测序验证，得到CasRx的中间双元载体pHLW-CasRx-M；
G、人工合成长度为554 bp的片段，依次包含左端同源臂、AtU6-26启动子、BsaI酶切位点、gRNA scaffold、终止子和右端同源臂，使用引物INF-gRNA-F和INF-gRNA-R进行PCR，并回收对应的PCR产物；
H、使用AscI单酶切质粒pHLW-CasRx-M，并回收对应的片段，得到线性化的pHLW-CasRx-M；
I、将步骤G中的PCR产物与步骤H中的线性化的载体进行混合，使用pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Kit进行同源重组反应；取5ul反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态，并使用50ng/ml Kan的培养基进行过夜培养，挑取单菌落、摇菌、提取质粒，使用SP-DL/SP-R进行PCR得到的产物送样测序，鉴定得到质粒CasRx双元表达载体pHLW-CasRx。
2、实施例2
a、根据烟草NtPDS的CDS序列，设计两个靶标序列及对应的引物，含有核心序列的引物末端含有对应的BsaI位点，每个靶点构建一个对应的载体；
b、靶标T1的基因沉默载体的构建：以质粒pHLW-CasRx为模板，使用引物对T1-1-F/T1-1-R和T1-2-F/T1-2-R进行PCR，如得到两端带有BsaI位点、同时含有1个靶标序列的两个片段，回收纯化PCR产物；
c、取70ng步骤b中的两个产物和100ng实施例1中步骤I中的载体pHLW-CasRx，使用BsaI先进行酶切15分钟，然后加入T4 DNA连接酶进行循环酶切连接反应；
d、取5ul步骤c中的反应产物与50ulDH5α感受态细胞冰上孵育30分钟，42℃ 30秒，加入500ul 液体LB培养基，37℃、200r/min培养1个小时，离心去掉400ul上清，将剩下的液体重悬菌体，并涂布与含有50ng/ml Kan的固体LB培养基上，37℃培养过夜；
e、挑取单菌落，接种、摇菌、提取质粒，使用引物SP-DL/SP-R进行PCR和测序鉴定载体pHLW-CasRx-T1是否构建成功，构建成功的载体标记为A1，A1含有靶标T1；
f、以同样的方式，将PCR引物对换成T2-1-F/T2-1-R和T2-2-F/T2-2-R，构建得到载体标记为A2，A2含有靶标T2。
3、实施例3
本实施例用于说明基于CasRx的植物基因沉默载体对烟草基因进行定向基因沉默的功能验证。
选取烟草基因NtPDS为研究对象，靶标序列如表1所示：
表1：烟草目的基因靶标序列
| 靶标编号 | 靶标序列 | 目的基因 |
| T1 | CCTGAAGCTCTTCCTGCGCCATTAAATGGA | NtPDS |
| T2 | GGCCGGAGCCAGAAGATGTTGGCAGAAGCA | NtPDS |
ⅰ、根据设计的两个靶标序列，使用上述的方式构建一个载体含有单个靶标序列的CasRx载体，标号为A1（T1）和A2（T2）。
ⅱ、取5ul得到的载体A1和A2，使用标准的电击转化法转化农杆菌株系EHA105感受态细胞，并进行筛选鉴定，然后挑取单菌落接种于含有利福平50ng/ml和Kan 50ng/ml的LB液体培养基中28℃、180r/min摇菌过夜，次日上午取种子液按照1：100的比例加入新鲜的含有利福平50ng/ml和Kan 50ng/ml的LB 液体培养基中28℃、180r/min摇菌至OD600为0.6左右，离心去掉上清液，加入含有100um/ml的乙酰丁香酮的MES-K重悬液重悬菌体，作为后续实验的侵染液；
ⅲ、取3周大的烟草叶片，利用无针头注射器注射叶片（先用针头在叶片上扎一个小孔）（注射烟草顶端以下第3-5片叶片），暗培养1d，转入光照培养2d，其中使用注释空载体的作为对照实验；
ⅳ、取对应的烟草叶片并使用CTAB法提取烟草RNA，并开展RT-qPCR，检测CasRx对烟草基因沉默的效果，RT-qPCR使用的引物见表2，内参基因为NtEF1a。
表2 RT-qPCR使用到的引物。
ⅴ、统计分析发现，带有靶点T1和T2的CasRx载体均可以定向基因沉默烟草相关基因，其效率分别达到了87%和81%。
本发明的工作机理：通过构建带有CasRx和引导RNA表达盒的双元载体，农杆菌介导遗传转化，在植物细胞内表达CasRx蛋白和引导RNA，引导RNA指引CasRx蛋白与特定的RNA结合并激活CasRx核酸酶活性，从而降解特定的RNA，达到定向基因沉默的效果。
本发明的创新点：本发明构建了构建了适合植物的高效的基于CasRx的双元载体并成功首次实现了植物体内的基于CasRx的定向基因沉默。
序列表
<110> 中国科学院武汉植物园
<120> 基于CasRx的植物基因沉默载体及其构建方法和应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3039
<212> CasRx序列
<400> 1
<210> 2
<211> 632
<212> A1载体的表达盒序列
<400> 2
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<210> 3
<211> 632
<212> A2载体的表达盒序列
<400> 3
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<210> 4
<211> 30
<212> T1序列
<400> 4
<210> 5
<211> 30
<212> T2序列
<400> 5
<210> 6
<211> 44
<212> INF-gRNA-F
<400> 6
<210> 7
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<211> 63
<212> T1-2-R
<400> 11
cttg 4
Claims (3)
1.一种基于CasRx的植物基因沉默载体，其特征在于：
是CasRx双元表达载体pHLW-CasRx；
其结构是35S驱动CasRx蛋白表达、AtU6-26启动子驱动sgRNA表达，如图1；
其系列是SEQ ID NO.1所示。
2.按权利要求1所述的基于CasRx的植物基因沉默载体的构建方法，其特征在于：
①根据烟草的目的基因设计靶标序列，如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；根据后续的快速构建方法设计含有BsaI酶切位点的引物对，如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11所示；
②通过快速构建方法将配对的靶标序列，如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，构建进入CasRx双元载体pHLW-CasRx中。
3.按权利要求1所述的基于CasRx的植物基因沉默载体的应用，其特征在于：
①将构建好的基于CasRx的植物基因沉默载体转化农杆菌并挑取阳性克隆摇菌制备菌悬液；
②使用无菌注射器将菌悬液平推进烟草中，两天后取样并提取RNA开展荧光定量实验，检测定向敲低效果。
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