CN114480391B - 用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的启动子及其应用 - Google Patents
用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的启动子及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114480391B CN114480391B CN202210093746.6A CN202210093746A CN114480391B CN 114480391 B CN114480391 B CN 114480391B CN 202210093746 A CN202210093746 A CN 202210093746A CN 114480391 B CN114480391 B CN 114480391B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- promoter
- cas9
- gene
- expression
- crispr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 title claims abstract description 89
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 58
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 44
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 29
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 24
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 claims description 12
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 abstract description 28
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 32
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 20
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000009869 Neu-Laxova syndrome Diseases 0.000 description 3
- 102100038824 Peroxisome proliferator-activated receptor delta Human genes 0.000 description 3
- 101710117029 Peroxisome proliferator-activated receptor delta Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102100021010 Nucleolin Human genes 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 108010044762 nucleolin Proteins 0.000 description 1
- 238000000059 patterning Methods 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002786 root growth Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000036561 sun exposure Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的启动子，所述启动子用于启动Cas9核酸酶的表达，称为pNUC1。本发明还公开了包含pNUC1的表达盒组以及包含所述表达盒组的重组载体。实验证明，采用数据驱动策略选定的pNUC1驱动Cas9核酸酶的表达，可以极高效地定点编辑拟南芥基因组。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的启动子、表达盒及其用途。
背景技术
成簇有规律的间隔短回文重复序列及其相关系统(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas system)是大多数细菌和古细菌中RNA介导的适应性免疫系统，由CRISPR基因座和Cas蛋白组成，通过切割噬菌体等入侵者的核酸基因组来消灭噬菌体或其他外来质体。CRISPR基因座被转录成非编码RNA，可以与Cas蛋白形成复合物以介导互补入侵DNA的切割。利用CRISPR/Cas9系统靶向编辑基因组，已成功应用于拟南芥、水稻、玉米、烟草以及番茄等多种植物。
在拟南芥的CRISPR/Cas9系统中，大多使用花椰菜花叶病毒(CaMV35S)启动子驱动Cas9的表达，但多项研究表明，CRISPR/Cas9系统在拟南芥中的编辑效率远低于水稻，且发生基因编辑的T1代大部分为体细胞突变。这主要是由于CaMV 35S启动子在植物的胚胎形成过程中表达量不高，而在营养组织中强烈表达，但只有生殖细胞中发生的突变才能传递给下一代。因此，选用合适的启动子驱动Cas9的表达以提高拟南芥中基因编辑的效率非常重要。近年来，为了提高CRISPR/Cas9系统在拟南芥中产生可遗传突变的效率，生殖细胞特异性或细胞分裂特异性基因启动子，如pEC1.2en-EC1.1融合和pYAO等(WANG Z P,XING H L,DONG L,et al.Egg cell-specific promoter-controlled CRISPR/Cas9 efficientlygenerates homozygous mutants for multiple target genes in Arabidopsis in asingle generation[J].Genome biology,2015,16:144；YAN L,WEI S,WU Y,et al.High-Efficiency Genome Editing in Arabidopsis Using YAO Promoter-Driven CRISPR/Cas9 System[J].Molecular plant,2015,8(12):1820-3)，已被用作替代启动子驱动Cas9的表达。使用以上Cas9系统，尽管在在T1代产生了可遗传的非嵌合突变，但效率仍然较低，不超过10％，由此可见，找到更高效驱动Cas9基因表达的启动子对于进一步提高靶点编辑效率尤为重要。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供以下技术方案。
一方面，本发明提供用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的启动子，其特征在于，所述启动子用于启动Cas9核酸酶的表达，所述启动子称为pNUC1，其是：
a.所述启动子pNUC1的序列如SEQ ID NO:1自5'末端第1448-2919位所示；
b.与a限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子NUC1p功能的核苷酸分子；或
c.与a或b限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子pNUC1功能的核苷酸分子。
在一些实施方案中，所述启动子与SEQ ID NO:1自5'末端第1448-2919位所示序列具有75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
另一方面，本发明提供用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的表达盒组，其特征在于，所述表达盒组包含多个表达盒，第一表达盒包含上述的启动子pNUC1，由所述启动子pNUC1启动Cas9核酸酶的编码基因表达，
在一些实施方案中，第二表达盒包含启动sgRNA的转录的启动子。
在一些实施方案中，启动sgRNA的转录的启动子为AtU6-26启动子。
在一些实施方案中，所述第一表达盒还包括Cas9核酸酶和筛选标记。
在一些实施方案中，所述筛选标记选自mCherry荧光蛋白、DsRed2荧光蛋白、潮霉素抗性、除草剂(BASTA)抗性。
在一些实施方案中，所述筛选标记为mCherry荧光蛋白的编码基因。
在一些实施方案中，所述Cas9核酸酶为：
a.所述Cas9核酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
b.与SEQ ID NO:2所示序列相比具有1至10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的与SEQ ID NO:2所示序列功能相同的Cas9核酸酶；或
c.所述Cas9核酸酶的基因序列如SEQ ID NO:1自5'末端第3040-7140位所示。
在一些实施方案中，所述Cas9核酸酶的终止子为rbcS-E9t终止子。
在一些实施方案中，所述rbcS-E9t终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1自5'末端第7196-7830位所示。
在一些实施方案中，所述mCherry荧光蛋白为：
a.所述mCherry荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；或
b.所述mCherry荧光蛋白的基因序列如SEQ ID NO:1自5'末端第418-1128位所示。
在一些实施方案中，所述mCherry荧光蛋白的启动子为At2S3。
在一些实施方案中，所述At2S3启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1自5'末端第1-417位所示。
在一些实施方案中，所述mCherry荧光蛋白的终止子为MAS终止子。
在一些实施方案中，所述MAS终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1自5'末端第1134-1386位所示。
在一些实施方案中，所述第一表达盒自5'端至3'端依次包括如下元件:mCherry荧光蛋白的启动子、mCherry荧光蛋白的编码基因、mCherry荧光蛋白的终止子；启动子pNUC1；Cas9核酸酶的编码基因和Cas9核酸酶的终止子。
在一些实施方案中，所述第一表达盒还包括一个或多个Flag标签和/或一个或多个核定位信号序列。
在一些实施方案中，所述第一表达盒自5'端至3'端依次包括如下元件:mCherry荧光蛋白的启动子、mCherry荧光蛋白的编码基因、mCherry荧光蛋白的终止子；启动子pNUC1、3xFlag标签、第一核定位信号、Cas9核酸酶的编码基因、第二核定位信号和Cas9核酸酶的终止子。
在一些实施方案中，所述3xFlag标签的核苷酸序列如SEQ ID NO:1自5'末端第2923-2988位所示。
在一些实施方案中，所述第一核定位信号的核苷酸序列如SEQ ID NO:1自5'末端第2995-3015位所示。
在一些实施方案中，所述第二核定位信号的核苷酸序列如SEQ ID NO:1自5'末端第7141-7188位所示。
在一些实施方案中，所述第一表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一些实施方案中，所述第二表达盒通过AtU6-26启动子启动sgRNA转录。
在一些实施方案中，所述AtU6-26启动子的序列如SEQ ID NO:4自5'末端第1-424位所示。
在一些实施方案中，所述第二表达盒自5'端至3'端依次包括AtU6-26启动子、sgRNA(single guide RNA)区段、U6-26终止子。
在一些实施方案中，所述sgRNA区段包括靶标片段(target)序列和支架(scaffold)序列。
在一些实施方案中，所述靶标片段具有如下结构:5'-Nx-NGG-3'，N表示A、G、C和T中的任一种，X＝19。
在一些实施方案中，所述靶标片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:7自5'末端第1949-1931位所示。(因为该载体序列元件的方向有正有反，这里的启动子的方向是反的，所以序列的方向是1949位为5’端)
在一些实施方案中，所述sgRNA区段的核苷酸序列如SEQ ID NO:7自5'末端第1930-1855位所示。
在一些实施方案中，所述U6-26终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO:7自5'末端第1854-1663位所示。
在一些实施方案中，所述第二表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:7自5'末端第2374-1663位所示。
另一方面，本发明提供重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如上所述的表达盒组。
在一些实施方案中，所述重组载体在植物中表达，优选在拟南芥中表达。
另一方面，本发明还提供定向编辑植物基因组的方法，包括将包含上述的表达盒组的重组载体导入植物中的步骤。
定义
基因GL2：是拟南芥内源基因GLABRA2(GL2)，控制叶片和茎表皮毛发育。该基因突变后，植物呈无毛表型。
Flag标签：是载体中一种融合标签蛋白，通常不会与目的蛋白相互作用，利用相应的Flag标签抗体可对融合蛋白进行检测和纯化，提高目的蛋白的纯化效率。
3xFlag标签：是串联3个Flag标签，更有利于被抗体结合，检测蛋白的表达量。
启动子pNUC1功能：例如相对于CaMV 35S启动子、pEC1.2en-EC1.1融合启动子、pYAO启动子中的任意一个或多个启动子提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率(例如在植物如拟南芥中的编辑效率，)，例如提高5％，10％，20％，…1倍(100％)，2倍…10倍或更高，例如通过定点编辑植物基因(例如拟南芥内源基因GL2)测量的。
有益效果
本发明采用数据驱动的策略来识别潜在的基因启动子，以提高CRISPR/Cas9编辑效率。根据先前通过大规模微阵列数据基于图形高斯模型构建的基因共表达网络，称为AtGGM2014(参考文献：MA S,BOHNERT H J,DINESH-KUMAR S P.AtGGM2014,an Arabidopsisgene co-expression network for functional studies[J].Science China Lifesciences,2015,58(3):276-86.)，发现Yan等人报道的YAO基因(使用该基因启动子驱动Cas9表达可以提高编辑效率)(参考文献：YAN L,WEI S,WU Y,et al.High-EfficiencyGenome Editing in Arabidopsis Using YAO Promoter-Driven CRISPR/Cas9 System[J].Molecular plant,2015,8(12):1820-3.)在模块21中(图1)，理论上讲，该模块中的所有基因都具有与YAO相似的表达模式，并且可以用作驱动Cas9表达的替代启动子。通过使用大规模公开可用的RNA-Seq数据集来比较模块内所有基因的表达水平，NUC1是其中表达最高的基因，比YAO的表达量高出16倍。并且以往研究表明，NUC1主要表达于胚胎发育和细胞分裂相关区域(参考文献：PETRICKA J J,NELSON T M.Arabidopsis nucleolin affectsplant development and patterning[J].Plant physiology,2007,144(1):173-86.)，确实与YAO相似。因此，本发明使用pNUC1启动子驱动Cas9的表达，构建一个CRISPR/Cas9系统，命名为pHY07。本系统还提供了一种含有启动子pNUC1的表达盒。
经实验证明，利用pNUC1的启动子驱动Cas9核酸酶编码基因的表达，可以非常高效的编辑基因组，在T1代就可获得35.7％的纯合突变体，其效率要远高于其他已有启动子驱动的CRISPR/Cas9系统。
附图说明
图1模块21中所有基因的表达水平。节点代表基因，颜色代表基因表达水平，颜色的深浅表示表达量的高低，颜色越深代表基因的表达量越高。
图2阳性种子的筛选。箭头所指的为阳性种子。
图3转化的T1代植物的表型。从左往右分别显示了野生型表型、嵌合表型和无毛表型的植物。在拍摄前将在1/2MS(含潮霉素15μg/mL)培养上生长一周的T1幼苗移到土壤中，并在长日照(16小时光照/8小时黑暗)下生长两周。比例尺：1厘米。
图4为T1代植物表型统计。其中，WT代表野生型表型、Chimera代表嵌合表型、Glabrous代表无毛表型。
图5为T1代拟南芥内源基因GLABRA2(GL2)的定点编辑效果的测序分析。其中，WT代表无编辑，Chimeric代表嵌合编辑，Bi-allelic/Heterozygous代表双等位或杂合编辑，Homozygous代表纯合编辑。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
本发明使用的野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)均为Columbia-0生态型(购自拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC)。拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0生态型)在下文中简称为野生型拟南芥。
载体pCAMBIA1300购自艾博抗贸易有限公司)，载体pUC57购自金斯瑞生物科技股份有限公司，2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)购自Vazyme公司。下述实施例中gl2(AT1G79840)突变体表型记载在如下文献中:D.B.Szymanski,R.A.Jilk,S.M.Pollock,M.D.Marks,Control of GL2expression in Arabidopsis leaves andtrichomes.Development 125,1161-1171(1998)。
gl2突变体的表型为植株叶片和茎表皮毛缺失的明显表型。
实施例1.重组质粒的构建
1.重组质粒pHY07的构建
1)本发明中使用的Cas9序列来自载体pHEE401(购自addgene质粒网站，货号：71286)，以载体pHEE401为模板，以人工合成的Cas9-F:5'-
GTACCGAGCTCGAATTCCATGGATTACAAGGACCACGACGGGGATTACAAGGACCACGACATTGATT-3'(SEQ ID NO:8)，
Cas9-R:5'-TATGACCATGATTACGAATTGTTGTCAATCAATTGGCAAG-3'(SEQ ID NO:9)为引物，使用2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)(Vazyme#P525-01)高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，得到片段1，该片段包含SEQ ID NO:1中的3xFlag标签、第一核定位信号、Cas9核酸酶的编码基因、第二核定位信号和rbcS-E9t终止子，回收约4949bp的片段1；
2)使用限制性内切酶EcoRI单酶切pCAMBIA1300载体，回收约8958bp的载体骨架1；
3)将片段1与载体骨架1使用II One Step Cloning Kit(Vazyme#C112)重组，得到重组质粒1，命名为pCambia1300-Cas9；
4)用限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切重组质粒1，回收约13875bp(正确大小为13875，这里少的32bp是所用重组酶重组时需要同源臂，两个片段中都含有，重组以后会少同源的32bp)的载体骨架2；
5)人工合成mCherry荧光蛋白基因(金斯瑞：C4164EL260-5)，获得约1426bp的片段2，该片段包含了SEQ ID NO:1所述pAt2S3启动子、所述mCherry荧光蛋白的编码基因、所述MAS终止子，(该荧光蛋白标记参考文献:GAO X H,CHEN J L,DAI X H,et al.An EffectiveStrategy for Reliably Isolating Heritable and Cas9-Free Arabidopsis MutantsGenerated by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing[J].Plant physiology,2016,171(3):1794-800)；
6)将片段2与载体骨架2使用II One Step Cloning Kit(Vazyme#C112)重组，得到重组质粒2，命名为pCambia1300-Cas9-mCherry。
7)以野生型拟南芥的基因组DNA为模板，以人工合成的pNUC1-F:
5'-ACCGAGCTCGAATTCCATGACTGCTCGCTGCTTTGTAGAATG-3'(SEQ ID NO:10)，pNUC1-R:5'-CGTGGTCCTTGTAATCCATGGAGAACTGAGAAAGAGACGACTG-3'(SEQ ID NO:11)为引物，使用2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)(Vazyme#P525-01)高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，得到NUC1p启动子片段，回收约1470bp的片段3；
8)使用限制性内切酶NcoI单酶切重组质粒2，回收约15265bp的载体骨架3；
9)将片段3与载体骨架3使用II One Step Cloning Kit(Vazyme#C112)重组，得到重组质粒4，pCambia1300-Cas9-mCherry-pNUC1，命名为：pHY07。
重组质粒pHY07表达SEQ ID NO:2所示的Cas9核酸酶和SEQ ID NO:3所示的mCherry荧光蛋白。
重组质粒pHY07经测序，具有第一表达盒，所述第一表达盒的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，其中SEQ ID NO:1自5'末端第1-417位为pAt2S3启动子，第418-1128位为mCherry荧光蛋白的编码基因，第1134-1386位为MAS终止子，第1387-1443位为多克隆位点，第1448-2919位为启动子pNUC1序列，第2923-2988位为3xFlag标签，第2995-3015位为第一核定位信号，第3040-7140位为Cas9核酸酶的编码基因，第7141-7188位为第二核定位信号，第7196-7830位为rbcS-E9t终止子(两个核定位信号帮助Cas9蛋白更好进入细胞核)。
2.重组质粒pUC57-AtU6-26-sgRNA的构建
AtU6-26片段(AtU6-26的启动子用来启动sgRNA的转录)由金斯瑞公司合成，该片段包含SEQ ID NO:4中所述AtU6-26启动子序列、然后通过AflIII和AatII两个酶切位点连接到该公司提供的载体pUC57(1.8K)上，得到重组质粒pUC57-AtU6-26-sgRNA(此时的重组质粒是未包含目标靶向序列的空质粒，后文中pUC57-U6-GL2质粒的构建为具体含有GL2靶向序列的重组质粒)，该重组质粒具有一个功能区段，功能区段的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，其中SEQ ID NO:4自5'末端第1-424位为AtU6-26启动子，第427-432位和第445-450位均为限制性内切酶BbsI的酶切位点，第453-528位为sgRNA区段的支架序列，第529-720位为3'-UTR区段的核苷酸序列。
实施例2.使用pHY07/pUC57-AtU6-26-sgRNA系统对拟南芥内源基因GL2进行定点编辑
1.GL2的靶标片段设计
使用CRISPR-P 2.0网站设计GL2的靶标片段，GL2靶标片段位于目的基因GL2上，GL2靶标片段的核苷酸序列为:5'-AGCTTGATGCAGCAATGGCG-3'(下划线处碱基未包含)
2.重组质粒pUC57-U6-GL2的构建
1)人工合成pUC57-U6-GL2_P1F:5'-GTCGAAGTAGTGATTGGCTTGATGCAGCAATGGCGGTTTTAGAGCTA GAAATAGC-3'(SEQ ID NO:12)、pUC57-U6_P2R：5'-GAGTAAACTTGGTCTGACAG-3'(SEQ ID NO:13)、pUC57-U6_P3F：5'-CTGTCAGACCAAGTTTACTC-3'(SEQ ID NO:14)和pUC57-U6_P4R：5'-AATCACTACTTCGACTCTAGC-3'(SEQ ID NO:15)(下划线表示GL2的靶标序列)。
2)以实施例1中所述重组质粒pUC57-AtU6-26-sgRNA为模板，通过设计的两对引物将该质粒片段的全长分为两个片段扩增出来，在设计引物时将GL2的靶标片段加在GL2_P1F引物中合成，以pUC57-U6-GL2_P1F和pUC57-U6_P2R为第一对引物，以pUC57-U6_P3F和pUC57-U6_P4R为第二对引物，用2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)(Vazyme#P525)高保真酶进行PCR扩增，PCR扩增程序为：95℃3min；95℃30s，56℃30s，72℃45s，35个循环；72℃5min。得到PCR扩增产物1和产物2，通过胶回收得到1351bp的片段1和1270bp的片段2。
3)用II One Step Cloning Kit(Vazyme#C112)，将片段1和片段2进行重组，通过该重组反应可将GL2的靶标序列引入重组质粒pUC57-AtU6-26-sgRNA，得到新的重组质粒，命名为pUC57-AtU6-26-GL2。
3.重组质粒pHY07-pUC57-U6-GL2的构建
(1)将pHY07用HindIII(Thermo Fisher公司产品)酶切(37℃30min)，得到载体骨架1；
(2)人工合成pHY07-Fu-F：5'-TTTCAAATAAATTATCAAGCTACCACGTAGGATCCGCTAGC-3'(SEQ ID NO:16)和pHY07-Fu-R：5'-CGACCTGCAGGCATGCAAGCTCTTTTGCTGGCCTTTTGCTC-3'(SEQ ID NO:17)；
(3)以重组质粒pUC57-AtU6-26-GL2为模板，以pHY07-Fu-F和pHY07-Fu-R为引物，扩增AtU6-26-GL2序列，使用2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)(Vazyme#P525)高保真酶，PCR扩增程序为：95℃3min；95℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。得到PCR扩增产物3，通过胶回收得到826bp的片段3；
(4)用II One Step Cloning Kit(Vazyme#C112)，将载体骨架1和片段3进行重组，得到重组质粒2，命名为pHY07-pUC57-U6-GL2。
经测序，重组质粒pHY07-pUC57-U6-GL2的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。重组质粒pHY07-pUC57-U6-GL2具有第一表达盒和第二表达盒。
除了pNUC1，已经报道一些启动子驱动Cas9表达能够提高基因编辑效率。我们选择其中两个有代表性的启动子(pEC1.2en-EC1.1融合启动子和pYAO启动子)来比较它们与pNUC1启动子的效率。将重组质粒pHY07-pUC57-U6-GL2中的pNUC1启动子替换为pEC1.2en-EC1.1融合启动子和pYAO启动子，得到重组质粒pEC1.2en-EC1.1-pUC57-U6-GL2和pYAO-pUC57-U6-GL2。pEC1.2en-EC1.1融合启动子和pYAO启动子的核苷酸序列SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示。
4.拟南芥转化和筛选
将获得的重组质粒(pHY07-pUC57-U6-GL2、p EC1.2en-EC1.1-pUC57-U6-GL2或pYAO-pUC57-U6-GL2)转化到根癌农杆菌GV3101(感受态购买自上海唯地生物技术有限公司)中，然后利用Floral dip的方法(参考文献:Steven J,Clough and Andrew F.Bent(1998)Floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal 16(6),735–743)将重组质粒转化到野生型拟南芥中，获得T1代拟南芥种子。
根据筛选标记mCherry荧光蛋白，将T1代拟南芥种子先在荧光显微镜下挑选出发荧光的阳性种子(见图2)，然后将挑出的阳性种子在1/2MS培养基(1/2MS培养基配方如下：MS(Murashige&Skoog)2.2g/L，蔗糖10g/L，琼脂粉8g/L)(含潮霉素15μg/mL)上进行二次筛选，获得42株转化了pHY07-pUC57-U6-GL2的拟南芥阳性植株、46株转化了pEC1.2en-EC1.1-pUC57-U6-GL2的拟南芥阳性植株和35株转化了pYAO-pUC57-U6-GL2的拟南芥阳性植株(非阳性转拟南芥萌发后根部停止生长)。
一周后，将上述拟南芥阳性植株移至土中，两周后，根据它们的叶面表型，将这些植物分为三类：1)无毛表型，即所有叶面均无毛，2)嵌合表型，其中部分叶面不含表皮毛，3)野生型表型(见图3)，结果表明，其中pHY07-pUC57-U6-GL2的42株阳性植株中有19株(45.2％)具有无毛表型，15株(35.7％)具有嵌合表型，8株(19％)具有野生型表型。pEC1.2en-EC1.1-pUC57-U6-GL2的46株阳性植株中有6株(13％)具有无毛表型，3株(6.5％)具有嵌合表型，37株(80.4％)具有野生型表型。pYAO-pUC57-U6-GL2的35株阳性植株中有3株(8.6％)具有无毛表型，29株(82.8％)具有嵌合表型，3株(8.6％)具有野生型表型(见图4和表1)。
表1T1代植物表型特征统计
5.利用PCR产物测序分析pHY07/pUC57-U6-sgRNA系统对拟南芥内源基因GL2的编辑结果
分别提取上述pHY07-pUC57-U6-GL2、p EC1.2en-EC1.1-pUC57-U6-GL2和pYAO-pUC57-U6-GL2 T1代阳性植株叶片的基因组DNA，以其为模板，以人工合成的GL2-F:5'-GATAAGCTTCGTGCAGCTCTT-3'(SEQ ID NO:18)和GL2-R:5'-AAGAGCTGGAGAAACAGGTAA-3'(SEQID NO:19)为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，将PCR扩增产物进行测序分析。
使用DSDecodeM(参考文献：Liu W.,Xie X.,Ma X.,Li J.,Chen J.,and Liu Y.-G.2015.DSDecode:A Web-based Tool for Decoding of Sequencing Chromatograms forGenotyping of Targeted Mutations.Mol.Plant8(9):1431-1433.)对测序结果解码后统计pHY07-pUC57-U6-GL2、p EC1.2en-EC1.1-pUC57-U6-GL2和pYAO-pUC57-U6-GL2定点编辑拟南芥内源基因GL2的效率，统计结果(见图5)所示，结果表明，pHY07-pUC57-U6-GL2 42株T1代阳性植株中，其中，15株(35.7％)含有纯合突变，8株(19％)含有双等位基因或杂合突变，18株(42.9％)含有嵌合突变，1株(2.4％)为野生型。非嵌合(纯合/双等位基因/杂合)突变率为54.8％。并且，5株具有WT样表型的植物确实是纯合或双等位基因/杂合突变体，只是发生了6/9bp碱基缺失，这些突变只影响有限数量的氨基酸，可能不会干扰GL2的功能。而pEC1.2en-EC1.1-pUC57-U6-GL246株阳性苗中，只有4株(8.7％)含有纯合突变，8株(17.4％)含有双等位基因或杂合突变，31株(67.4％)含有嵌合突变，3株(6.5％)为野生型，非嵌合(纯合/双等位基因/杂合)突变率为26.1％，pYAO-pUC57-U6-GL2 35株阳性苗中，仅7株(20％)含有纯合突变，1株(2.9％)含有双等位基因或杂合突变，27株(77.1％)含有嵌合突变，无野生型植株，非嵌合(纯合/双等位基因/杂合)突变率为22.9％。而纯合突变的效率越高，说明该系统越好，因为基因突变体一般最终都要筛选纯合突变体进行进一步的功能研究，之前的系统在T1代筛选到的纯合突变体的效率都比较低；双等位基因或杂合突变也是可遗传的突变类型，进行T2代筛选得到纯合突变体后，也可以进行后续功能研究；嵌合突变属于体细胞突变，一个植株可能拥有多种基因型，这种突变是不能用于基因功能研究的，应该尽可能减少这种突变类型。
结果表明，pHY07/pUC57-U6-sgRNA系统对植物基因组的编辑效率显著的高于pEC1.2en-EC1.1/pUC57-U6-sgRNA和pYAO/pUC57-U6-sgRNA系统的编辑效率。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的启动子，其特征在于，所述启动子用于启动Cas9核酸酶的表达，所述启动子称为pNUC1，所述启动子pNUC1的序列如SEQ ID NO:1自5'末端第1448-2919位所示。
2.用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的表达盒组，其特征在于，所述表达盒组包含多个表达盒，第一表达盒包含根据权利要求1所述的启动子，由所述启动子启动Cas9核酸酶的编码基因表达。
3.根据权利要求2所述的用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的表达盒组，其特征在于，所述Cas9核酸酶为：
a.所述Cas9核酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；或
b.所述Cas9核酸酶的基因序列如SEQ ID NO:1自5'末端第3040-7140位所示。
4.根据权利要求2或3所述的用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的表达盒组，其特征在于，所述第一表达盒自5'端至3'端依次包括如下元件:mCherry荧光蛋白的启动子、mCherry荧光蛋白的编码基因、mCherry荧光蛋白的终止子；启动子pNUC1；Cas9核酸酶的编码基因和Cas9核酸酶的终止子。
5.根据权利要求2或3所述的用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的表达盒组，其特征在于，所述第一表达盒自5'端至3'端依次包括如下元件:mCherry荧光蛋白的启动子、mCherry荧光蛋白的编码基因、mCherry荧光蛋白的终止子；启动子pNUC1、3xFlag标签、第一核定位信号、Cas9核酸酶的编码基因、第二核定位信号和Cas9核酸酶的终止子。
6.根据权利要求2或3所述的用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的表达盒组，其特征在于，第二表达盒自5'端至3'端依次包括AtU6-26启动子、sgRNA区段、U6-26终止子。
7.根据权利要求6所述的用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的表达盒组，其特征在于，所述sgRNA区段包括靶标片段序列和支架序列。
8.重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如权利要求1所述的启动子或如权利要求2-7中任一项所述的表达盒组。
9.根据权利要求8所述的重组载体，其中所述重组载体在植物中表达。
10.根据权利要求9所述的重组载体，其中所述重组载体在拟南芥中表达。
11.定向编辑植物基因组的方法，其特征在于，包括将根据权利要求8所述的重组载体导入植物中的步骤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210093746.6A CN114480391B (zh) | 2022-01-26 | 2022-01-26 | 用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的启动子及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210093746.6A CN114480391B (zh) | 2022-01-26 | 2022-01-26 | 用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的启动子及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114480391A CN114480391A (zh) | 2022-05-13 |
| CN114480391B true CN114480391B (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=81475365
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210093746.6A Active CN114480391B (zh) | 2022-01-26 | 2022-01-26 | 用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的启动子及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114480391B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114686456B (zh) * | 2022-05-10 | 2023-02-17 | 中山大学 | 基于双分子脱氨酶互补的碱基编辑系统及其应用 |
| CN114717259B (zh) * | 2022-05-26 | 2023-06-20 | 山西大学 | 一种温控诱导型基因编辑系统及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105177038A (zh) * | 2015-09-29 | 2015-12-23 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种高效定点编辑植物基因组的CRISPR/Cas9系统 |
| WO2018043219A1 (ja) * | 2016-09-02 | 2018-03-08 | 国立大学法人名古屋大学 | Ｃａｓタンパク質発現カセット |
| CN110257420A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-09-20 | 中国科学院武汉植物园 | 基于CasRx的植物基因沉默载体及其构建方法和应用 |
-
2022
- 2022-01-26 CN CN202210093746.6A patent/CN114480391B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105177038A (zh) * | 2015-09-29 | 2015-12-23 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种高效定点编辑植物基因组的CRISPR/Cas9系统 |
| WO2017054721A1 (en) * | 2015-09-29 | 2017-04-06 | Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences | A CRISPR/Cas9 System for high efficient site-directed altering of plant genomes |
| WO2018043219A1 (ja) * | 2016-09-02 | 2018-03-08 | 国立大学法人名古屋大学 | Ｃａｓタンパク質発現カセット |
| CN110257420A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-09-20 | 中国科学院武汉植物园 | 基于CasRx的植物基因沉默载体及其构建方法和应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| "Data-driven optimization yielded a highly-efficient CRISPR/Cas9 system for gene editing in Arabidopsis";耿海英 等;《bioRxiv》;第1-19页 * |
| "High efficiency genome editing in Arabidopsis using Yao promoter-driven CRISPR/ Cas9 system";闫留华 等;《MOLECULAR PLANT》;第1-12页 * |
| "基于CRISPR-Cas9 基因编辑技术在作物中的应用";殷文晶 等;《生物工程学报》;第39卷(第2期);第399-423页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114480391A (zh) | 2022-05-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106749574B (zh) | 一种植物雄性育性相关蛋白ms6021及其编码基因与应用 | |
| CN105746362B (zh) | 一种育性基因及其应用 | |
| CN114480391B (zh) | 用于提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的启动子及其应用 | |
| CN110526993B (zh) | 一种用于基因编辑的核酸构建物 | |
| CN108291234A (zh) | 倍数孢子体形成基因 | |
| CN112500463B (zh) | 控制玉米株高和穗位高基因ZmCOL14及其应用 | |
| CN107653262A (zh) | ZmCCT9在调控玉米开花期性状中的应用 | |
| CN108441499A (zh) | 雄性育性相关基因ht2925及其应用 | |
| CN101565461B (zh) | 与水稻株型和穗粒数相关的锌指蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN107630033B (zh) | 蛋白质OsZFP213在调控植物抗逆性中的应用 | |
| JP3051874B2 (ja) | 植物を矮性化させる方法 | |
| CN104911191B (zh) | 一种育性调控基因fg3及其应用 | |
| CN105504031B (zh) | 来源于大豆的粒重相关蛋白及其相关生物材料与应用 | |
| CN108341857B (zh) | 一种与水稻产量相关蛋白及其编码基因与应用 | |
| KR20190122595A (ko) | 식물의 염기 교정용 유전자 구조체, 이를 포함하는 벡터 및 이를 이용한 염기 교정 방법 | |
| CN114805508B (zh) | 水稻抽穗期基因dhd3功能以及应用 | |
| CN113817033B (zh) | ZmELF3.1蛋白及其功能缺失突变体在调控作物气生根数目或层数的应用 | |
| WO1998000436A9 (en) | Plant plastid division genes | |
| CN106883291B (zh) | 植物株型相关蛋白prog2及其编码基因与应用 | |
| WO1998000436A1 (en) | Plant plastid division genes | |
| CN108660139A (zh) | 植物育性调控基因np2及其编码蛋白和应用 | |
| CN115697043A (zh) | 通过靶向诱变获得突变植物的方法 | |
| JP6056042B2 (ja) | イネ科植物を短稈化させる遺伝子および短稈イネ科植物の作出方法 | |
| EP1055729A1 (en) | Transgenic plants exhibiting an altered flowering time | |
| CN110129357A (zh) | 一种无标签用于基因编辑的试剂组合及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |