JP6056042B2 - イネ科植物を短稈化させる遺伝子および短稈イネ科植物の作出方法 - Google Patents
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Description
[1]イネ科植物において、Os02g0280200遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、短稈イネ科植物の作出方法、
[2]アンチセンス法または突然変異誘発法によってOs02g0280200遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、[1]記載の方法、
[3]Os02g0280200遺伝子の全長cDNAのアンチセンス配列を含有するベクターでイネ科植物を形質転換することを特徴とする、[2]記載の方法、
[4]Os02g0280200遺伝子の第2エキソンのアンチセンス配列を含有するベクターでイネ科植物を形質転換することを特徴とする、[2]記載の方法、
[5]Os02g0280200遺伝子の塩基配列の479位にチミンからシトシンへのヌクレオチド変異を導入することを特徴とする、[2]記載の方法、
[6]配列番号2で示される塩基配列を含有するベクターでイネ科植物を形質転換することを特徴とする、[5]記載の方法、
[7]配列番号4で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を含有するベクターでイネ科植物を形質転換することを特徴とする、[5]記載の方法、
[8]配列番号6で示される塩基配列を含有するベクターでイネ科植物を形質転換することを特徴とする、[5]記載の方法、
[9]配列番号8で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を含有するベクターでイネ科植物を形質転換することを特徴とする、[5]記載の方法、
[10]Os02g0280200遺伝子の発現が抑制された、短稈イネ科植物、
[11]配列番号2で示される塩基配列を含む短稈遺伝子、
[12]配列番号4で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする短稈遺伝子、
[13]Os02g0280200遺伝子の全長cDNAのアンチセンス配列からなるDNA、
[14]Os02g0280200遺伝子の第2エキソンのアンチセンス配列からなるDNA、
[15]配列番号3で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列のアンチセンス配列からなるDNA、および
[16]配列番号7で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列のアンチセンス配列からなるDNA
を提供する。
コシヒカリの第2染色体をインディカ品種 Kasalathに部分置換した系統(D60D60galgal)とd60コシヒカリ系統(d60d60GalGal)との交雑F2から、短稈ホモ型(d60d60GalGal)個体を選抜し、ジャポニカ品種/インディカ品種間で差を示す第2染色体上のSSR(Simple Sequence Repeat)マーカーでファインマッピングを行った。DNA多型解析により、使用した各SSRマーカーとd60遺伝子との連鎖を調べ、組み換え価0%の位置を決定した。ここで、組み換え価は、以下の式によって求められ、完全に連鎖している場合の組み換え価は0%である。
組み換え価(%)=(組み換え型配偶子数/全配偶子数)×100
コシヒカリの第2染色体をインディカ品種 Kasalathに部分的に置換した系統(D60D60galgal)とd60コシヒカリ系統(d60d60GalGal)とを交雑し、得られたF1(D60d60Galgal)をさらに自殖してF2を得た。すなわち、コシヒカリゲノムにおいてd60が座乗する第2染色体がインディカ品種Kasalathに部分的に置換された系統SL204(第2染色体の短腕末端から60.3cMまでがKasalathに置換された系統、D60D60galgal)とコシヒカリd60系統(d60d60GalGal)との交雑F2 5122個体を播種し、第3葉期にd60ホモ型の短くて丸い葉をもつ短稈(d60d60GalGal)532個体を選抜して鳥取大学フィールドサイエンスセンターで栽培した。これら短稈ホモ型F2全個体から葉をサンプリングしてDNAを抽出した。
すなわち、上記のようにして抽出した各F2植物体由来のゲノムDNA200ngを鋳型にして、各SSRマーカーについて各200nMのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、400μM dNTPs、2.5mM MgCl2、1×LA PCR BufferII(TAKARA)、0.5U LA TaqDNAポリメラーゼ(TAKARA)を含む全量25μlの反応液を作製した。サーマルサイクラーを用いて、変性94℃1分間、アニーリング55℃1分間、伸長72℃1分間の一連の反応を35回行った。PCR反応の後、電気泳動装置QIAxelで電気泳動を行った。電気泳動カートリッジはQIAxel DNA screening Kit(2400)を用い、サンプル注入を5kVで10秒、電気泳動を5kVで420秒行った。
イネの第2染色体の短腕末端から10.2ないし10.5Mb付近で推定される遺伝子Os02g0280200およびOs02g0280300をd60候補遺伝子として配列解析を行った。
一方、Os02g0280300遺伝子領域については、コシヒカリとコシヒカリd60系統の配列間で変異が見出されなかった。
したがって、d60遺伝子は、Os02g0280200遺伝子の機能欠損型であると推測された。コシヒカリのOs02g0280200遺伝子の全長塩基配列の一例を配列番号1に示す。コシヒカリd60系統におけるOs02g0280200遺伝子の全長塩基配列の一例を配列番号2に示す。コシヒカリのOs02g0280200遺伝子によってコードされるアミノ酸配列の一例を配列番号3に示す。コシヒカリd60系統におけるOs02g0280200遺伝子によってコードされるアミノ酸配列の一例を配列番号4に示す。
Os02g0280200遺伝子の全長cDNAのアンチセンス配列またはOs02g0280200遺伝子の第2エキソンのアンチセンス配列をコシヒカリに導入した。アンチセンス配列の導入は下記のとおり行い、最終的に、再分化した植物体を得た。
イネActin1プロモーター、Nosターミネーター、および選択マーカーとして、イネ由来W548L/S627I 2点変異型アセト乳酸シンターゼ遺伝子を含有するpSTARA系バイナリーベクターR−5(製品名:pSTARA R−5;クミアイ化学工業株式会社製)を制限酵素XbaIおよびKpnIで消化し、全長cDNAのアンチセンス配列(配列番号9)または第2エキソンのアンチセンス配列(配列番号10)を挿入し、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefacience)EHA105株にエレクトロポレーションによって導入した。スペクチノマイシン100ppmを含むLB培地で形質転換体を選抜した。
2.胚盤由来カルスの誘導
滅菌したコシヒカリの種子(25〜35粒)をN6D培地に胚を上向きに置床し、30℃、明所(16時間明期)で5日間培養した。
3.アグロバクテリウムの前培養
バイナリーベクターを導入したアグロバクテリウムEHA105株(グリセロールストックより)は、感染前日、LB液体培地(スペクチノマイシン100ppm含む)で培養した。
4.アグロバクテリウムの感染と共存培養
1)5日間培養した胚盤由来カルスのシュートと胚乳部分を除去し、N6D培地に仮置きした。
2)50mlのファルコンチューブにAAM溶液を40ml入れ、アセトシリンゴン100mg/mlを16μL添加した。
3)上記3で前培養したアグロバクテリウムを集菌し、AAM溶液に懸濁、希釈した。
4)上記1)のカルスを新しい50mlファルコンチューブに入れ、上記3)のアグロバクテリウム懸濁液を加え、1.5分間ゆっくりと転倒混和した。
5)500mlビーカーの上に置いた滅菌済茶こしへ上記4)を注ぎ、カルスが入った茶こしを滅菌済キムタオルの上において余分な水分を除去した。
6)2N6−AS培地にカルス同士が接触しないように置床した(1プレートにつき、約25個のカルス)。
7)24℃の暗所で3日間共存培養した。
5.アグロバクテリウムの除去と選抜
1)共存培養したカルスを50mlファルコンチューブへ移し、カルベニシリン(500mg/L)を含む滅菌水で7〜8回洗浄した。
2)洗浄後、水が透きとおってきたら滅菌水中に10分間静置した。
3)新しいピペットにかえて滅菌水500ml使いきりまで洗浄し、カルスを滅菌済キムタオル(登録商標)に移し、余分な水分を除去した。
4)カルスをカルベニシリン400mg/Lを適当量の選抜試薬を含む選抜培地(N6D培地)に置床(1プレートに14カルス)した。
5)30℃、明所(以降、16時間明期)で一ヶ月間培養した。(二週間目に継代培養を行った。)
6.植物体再分化
1)新しいカルスが増殖してきたら、カルベニシリン(200mg/L)および0.25μMビスピリバックナトリウム塩を含む再分化培地(RE−III)に移植した。
2)30℃、明所で一ヶ月間培養した。(二週間目に継代培養を行った。)
3)カルスからシュートと根が分化した後、ホルモンフリー(HF)培地へ移植した。
上記の結果から、d60遺伝子の機能相補性が証明され、d60遺伝子がOs02g0280200遺伝子の機能欠損型であることが確認できた。また、Os02g0280200遺伝子の発現を抑制することによって、短稈イネ科植物が得られることが証明された。
実施例3で得られた両形質転換体から、実施例1に記載のようにゲノムDNAを抽出し、下記の各プライマーを用いてPCR増幅し、電気泳動により増幅バンドを検出した。コントロールとして、形質転換されていないコシヒカリを用いた。
cDNA全長のアンチセンス遺伝子形質転換体用プライマー:3303Fおよび3303R
フォワードプライマー配列:TTTTGTAGGTAGAAGTCTAGATCAG(配列番号13)
リバースプライマー配列:GGAAATTCGAGCTCGGTACCATGGC(配列番号14)
第2エキソンのアンチセンス遺伝子形質転換体用のプライマー:3309Fおよび3309R
フォワードプライマー配列:TGTAGGTAGAAGTCTAGAACGATCC(配列番号15)
リバースプライマー配列:AATTCGAGCTCGGTACCACGTCGTC(配列番号16)
その結果、cDNA全長のアンチセンス遺伝子形質転換体において891bpのバンドが検出され、第2エキソンのアンチセンス遺伝子形質転換体において194bpのバンドが検出された。一方、コントロールでは、これらのバンドは検出されなかった。これらの結果から、実施例3で得られた形質転換体中に、目的のDNAが確かに組み込まれたことが確認できた。したがって、実施例3で示されたイネ形質転換体の短稈化は、Os02g0280200遺伝子の発現抑制によるものであることが証明された。
Claims (13)
- イネ科植物において、配列番号1で示されるOs02g0280200遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、短稈イネ科植物の作出方法。
- 配列番号1で示されるOs02g0280200遺伝子の全長cDNAのアンチセンス配列を含有するベクターでイネ科植物を形質転換することを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 配列番号1で示されるOs02g0280200遺伝子の第2エキソンのアンチセンス配列を含有するベクターでイネ科植物を形質転換することを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 配列番号1で示されるOs02g0280200遺伝子の塩基配列の479位にチミンからシトシンへのヌクレオチド変異を導入することを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 配列番号2で示される塩基配列を含む遺伝子を交雑によりイネ科植物に導入することを特徴とする、請求項4記載の方法。
- 配列番号4で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子を交雑によりイネ科植物に導入することを特徴とする、請求項4記載の方法。
- 配列番号6で示される塩基配列を含む遺伝子を交雑によりイネ科植物に導入することを特徴とする、請求項4記載の方法。
- 配列番号8で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子を交雑によりイネ科植物に導入することを特徴とする、請求項4記載の方法。
- 配列番号2で示される塩基配列を含む短稈遺伝子。
- 配列番号4で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする短稈遺伝子。
- 配列番号6で示される塩基配列を含む短稈遺伝子。
- 配列番号8で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする短稈遺伝子。
- 請求項9〜12のいずれか1項記載の短稈遺伝子あるいは配列番号3または配列番号7で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列のアンチセンス配列からなるDNAが導入された、短稈イネ科植物。
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