JP5017653B2 - イネの第２染色体にある新規の短稈遺伝子のｄｎａマーカー選抜法 - Google Patents

Description

本発明は、短稈遺伝子ｄ６０および配偶子致死遺伝子Ｇａｌの存在を判別するためのＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーを利用して、短稈イネ科植物を選抜する方法に関する。

イネ科植物はイネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、キビ、アワ、ヒエ、トウモロコシ、シコクビエ、モロコシ等を含む、農業上極めて重要な植物である。しかし、強風、例えば台風等によって稈の長いイネ科植物は倒伏してしまい、果実の収穫量が大きく減少することとなる。そこで、稈の短いイネ科植物の育種が長年に亘って行われ、結果見出されたのが半矮性遺伝子ｓｄ１である。ｓｄ１はジベレリンＧＡの生合成系におけるＣ２０酸化酵素遺伝子の欠損型であり、緑の革命を成し遂げた多収性品種の、半矮性と呼ばれる穂の長さは完全だが植物体全体の背が低い形質を表出する遺伝子である。この半矮性の導入によって作物が倒伏しにくくなり、施肥に応じた収量の増加と気候条件に左右されにくい安定生産が実現した。しかしながら、有用な半矮性遺伝子はｓｄ１だけで短稈育種の遺伝子源がわずか１種類に限られていた。

半矮性遺伝子ｄ６０は近年見出された、ｓｄ１（およびｓｄ１と同様にジベレリンＧＡの生合成に関与する遺伝子の欠損型）とは異なる、新たな短稈イネ科植物の育種に有用であると期待されている遺伝子である。ｄ６０遺伝子は、本発明者が突然変異系統北陸１００号に着目して遺伝子分析を行った結果見出したものであり、ｓｄ１に偏重している短稈育種の選択肢を大きく拡大する有用遺伝子である。さらに、この遺伝子は詳細な染色体上での位置が不明であるが、第１染色体に存在するｓｄ１とは遺伝的にも機能的にも独立しており、稈を約２０％短縮し、直立葉型の草型をもたらす遺伝子である（非特許文献１および２）。

ｄ６０はイネに普遍的に存在する配偶子致死遺伝子ｇａｌと共存すると雌雄の配偶子が致死となるため、コシヒカリｄ６０系統、北陸１００号などｄ６０を持つ品種・系統（遺伝子型ｄ６０ｄ６０ＧａｌＧａｌ）と他の品種・系統（Ｄ６０Ｄ６０ｇａｌｇａｌ）との交雑Ｆ１（Ｄ６０ｄ６０Ｇａｌｇａｌ）では，花粉と種子の稔性が７５％となり、後代Ｆ２では６可稔長稈（４Ｄ６０Ｄ６０：２Ｄ６０ｄ６０ＧａｌＧａｌ）：２部分不稔長稈（Ｄ６０ｄ６０Ｇａｌｇａｌ＝Ｆ１型）：１短稈（ｄ６０ｄ６０ＧａｌＧａｌ）の比に分離する特異な遺伝様式をとり、ｄ６０の遺伝にはＧａｌが不可欠である。ｄ６０はＧａｌの同時の人為突然変異なくしては自然界では得られなかった貴重な短稈遺伝子である（非特許文献１および２）。
Tomita, M.: The gametic lethal gene gal: activated only in the presence of the semidwarfing gene d60 in rice. In Rice Genetics III (Ed. G.S. Khush, ISBN 971-22-0087-6), International Rice Research Institute, pp. 396-403 (1996) Tomita, M., Yamagata, H. and Tanisaka, T.: Developmental cytology on gametic abortion caused by induced complementary genes gal and d60 in ｊaponica rice. In Advances in Rice Genetics (Eds. G.S. Khush, D.S. Brar and B. Hardy, ISBN 971-22-0199-6), International Rice Research Institute, pp. 178-181 (2003)

ｄ６０遺伝子を有する、すなわち遺伝的に短稈であるイネ科植物を得るためには、種を交配し、多数の個体を実際に栽培し、各個体が出穂した後に稈長を実際に測定しなければならず、広大な圃場や多大な人力、相当の年月が必要である。さらに、ｄ６０遺伝子は配偶子致死遺伝子ｇａｌと補足し合って配偶子致死、すなわち不稔となる特異的な遺伝様式をとるため、雑種第２世代における短稈植物はｄ６０遺伝子を有するのみならずＧａｌ遺伝子を有するものとなり、その出現率は１／９で、選抜をさらに難しくしている。また、ＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーを使用することによって実際に栽培を行うことなく実験室内でｄ６０を有するか否かを判別することが可能であるが、ｄ６０遺伝子の染色体上での位置が未だ解明されていないため、ｄ６０遺伝子そのものを検出するＤＮＡマーカーは開発されていなかった。

そこで本発明者は、ｄ６０と連鎖する遺伝子、および／またはＧａｌと連鎖する遺伝子をＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーとして使用して、間接的にｄ６０およびＧａｌの存在を判別することとした。

より具体的には、本発明者はｄ６０遺伝子が第２染色体においてｄ３０遺伝子並びにＲＭ３４１およびＲＭ４５２とそれぞれ近位でありかつ連鎖していることを新たに見出し、そしてＧａｌ遺伝子が第５染色体においてｄ１およびＲＭ２８９と近位でありかつ連鎖していること、そしてｄ６０遺伝子とｇａｌ遺伝子の組合せによる配偶子致死のためｄ６０遺伝子とＧａｌ遺伝子がペアとなって遺伝するため、いずれかの遺伝子の存在を判別することによりもう一方の遺伝子の存在も高確率で判別することを新たに見出したのであって、かかる知見に基づきｄ６０と連鎖する遺伝子あるいは染色体部位をＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーとして検出することでｄ６０およびＧａｌの存在を間接的に判別し、Ｇａｌと連鎖する遺伝子あるいは染色体部位をＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーとして検出することでｄ６０およびＧａｌの存在を間接的に判別することとした。

かかる発明によって、実際に試験個体を栽培し評価する必要が大幅に減少し、種子や幼苗の時期においても標的遺伝子と連鎖するＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーを使用するため高い確率で標的遺伝子ｄ６０およびＧａｌを有する個体または植物を選択することができ、短稈イネ科植物、とりわけ短稈イネをより容易に得ることができる。また、このようなｄ６０遺伝子を標的とした選抜により、従来のｓｄ１遺伝子のみに依存していた短稈イネ科植物の選抜とは全く別の、新規な短稈イネ科植物の育種が可能となる。

従って、第１の態様において本発明は、イネ科植物の第２染色体に存在する第１のＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーであって、ｄ６０遺伝子と連鎖しているＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーを検出することによってｄ６０遺伝子およびＧａｌ遺伝子の存在を判別すること、またはイネ科植物の第５染色体に存在する第２のＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーであって、Ｇａｌ遺伝子と連鎖しているＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーを検出することによりｄ６０遺伝子およびＧａｌ遺伝子の存在を判別することを特徴とする、短稈イネ科植物の選抜法を提供する。

好ましくは本発明は、イネ科植物の第２染色体に存在する第１のＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーであって、ｄ６０遺伝子と連鎖しているＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーを検出することによってｄ６０遺伝子の存在を判別すること、並びにイネ科植物の第５染色体に存在する第２のＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーであって、Ｇａｌ遺伝子と連鎖しているＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーを検出することによりＧａｌ遺伝子の存在を判別することを特徴とする、短稈イネ科植物の選抜法を提供する。

連鎖している遺伝子を見出すための方法の例としては、以下のような方法がある。半矮性遺伝子ｄ６０とその遺伝に不可欠な配偶子致死遺伝子Ｇａｌについて、それらと連鎖する遺伝子マーカーの分離がメンデル比の３：１から歪むことを利用して、全染色体を網羅するように選択した適当な数の遺伝子マーカーを持つ系統とｄ６０系統との交雑Ｆ２を展開し、ｄ６０が第２染色体、Ｇａｌが第５染色体にそれぞれ存在することを見出した。さらに、イネ科植物の第２染色体および第５染色体を部分的に置換した染色体部分断片置換型系統とｄ６０系統との交雑Ｆ２を展開し、完全連鎖している場合の遺伝子型の分離比（１００％）と比較として、連鎖の確率を計算する。連鎖の確率が９０％以上、好ましくは９５％以上である遺伝子あるいは染色体部位をＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーとすることが、判別の精度の向上の点から好ましい。

また、イネ科植物の第２染色体中のｄ６０遺伝子と近位である遺伝子あるいは染色体部位を、ｄ６０遺伝子のＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーとして選択し、第５染色体中のＧａｌ遺伝子と近位である遺伝子あるいは染色体部位をＧａｌ遺伝子のＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーとして選択してもよい。これらのＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーのうち、ｄ６０遺伝子およびＧａｌに対して連鎖の確率が９０％以上、好ましくは９５％以上であるものを用いてｄ６０遺伝子におよびＧａｌ遺伝子の存在を判別する精度を向上させることができる。

「近位」であるとは、当該ＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーが標的遺伝子から３０ｃＭ（センチモルガン、以下同じ）以内、例えば１０ｃＭ以内、好ましくは５ｃＭ以内にあることを意味し、常套の方法によって確認することができる。

このようにして見出された、標的遺伝子と連鎖している遺伝子あるいは染色体部位をＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーとして使用する。「ＤＮＡマーカー」とは、遺伝分析のための目印（マーカー）として利用することができる、個体または系統によってＤＮＡの塩基配列に違いが見られるＤＮＡ多型を意味し、ＲＦＬＰ（制限酵素ＤＮＡ断片長多型）、ＡＦＬＰ（増幅断片長多型）、ＳＳＲ（単純反復配列）、ＳＴＳ（配列タグ部位）、ＳＮＰ（一塩基多型）、ＲＡＰＤ（増幅断片多型）などの種類がある。「遺伝子マーカー」とは、遺伝解析に利用できる遺伝的に決定されている形質が明瞭に分かる遺伝子を意味する。

本発明において好ましい第１のＤＮＡマーカーは、例えばＲＭ４５２（配列番号１および２）、ＲＭ４３８（配列番号３および４）、ＲＭ５２１（配列番号５および６）、ＲＭ５５０（配列番号７および８）、ＲＭ３２４（配列番号９および１０）、ＲＭ２７（配列番号１１および１２）、ＲＭ２９０（配列番号１３および１４）、ＲＭ３０１（配列番号１５および１６）、ＲＭ２９（配列番号１７および１８）、ＲＭ３００（配列番号１９および２０）、ＲＭ４２４（配列番号２１および２２）、ＲＭ５６１（配列番号２３および２４）、ＲＭ３４１（配列番号２５および２６）、ＲＭ４９２（配列番号２７および２８）、ＲＭ６２０３（配列番号２９および３０）、ＲＭ５６９９（配列番号３１および３２）、ＲＭ１２８５３（配列番号３３および３４）、ＲＭ１２８５６（配列番号３５および３６）、ＲＭ１２８８５（配列番号３７および３８）、ＲＭ１２９３７（配列番号３９および４０）、ＲＭ１２９２４（配列番号４１および４２）、ＲＭ１２９６７（配列番号４３および４４）、ＲＭ１２９８８（配列番号４５および４６）、ＲＭ１３０４３（配列番号４７および４８）、ＲＭ１２９６３（配列番号４９および５０）、ＲＭ５６１９（配列番号５１および５２）、ＲＭ１３０２８（配列番号５３および５４）、ＲＭ１３０６９（配列番号５５および５６）、ＲＭ１３０８１（配列番号５７および５８）、ＲＭ１３１１０（配列番号５９および６０）、ＲＭ１３０６５（配列番号６１および６２）、ＲＭ１３００８（配列番号６３および６４）、ＲＭ１３００２（配列番号６５および６６）、ＲＭ１３５８（配列番号６７および６８）、ＲＭ１０８１（配列番号６９および７０）、ＲＭ３１７８（配列番号７１および７２）、ＲＭ７４２６（配列番号７３および７４）、ＲＭ５１０１（配列番号７５および７６）、ＲＧ１７１（ＲＦＬＰ）、Ｒ３１９１（ＲＦＬＰ）、ＲＺ３２４（ＲＦＬＰ）、Ｓ１４１１５（ＲＦＬＰ）、Ｅ６１８３２（ＲＦＬＰ）、Ｒ１９８９（ＲＦＬＰ）、Ｓ１９１７（ＲＦＬＰ）、Ｓ２５７７（ＲＦＬＰ）、Ｓ２５２５（ＲＦＬＰ）、Ｍ１６２Ｂ（ＲＦＬＰ）、Ｓ１４１２（ＲＦＬＰ）、Ｃ１０６（ＲＦＬＰ）、ＲＺ３８６（ＲＦＬＰ）、ＲＧ１５７（ＲＦＬＰ）、ＲＧ１４４（ＲＦＬＰ）、Ｇ１３１４Ｂ（ＲＦＬＰ）、ＸＮｐｂ１３２（ＲＦＬＰ）、Ｃ１９６（ＲＦＬＰ）、ＸＮｐｂ１９９（ＲＦＬＰ）、Ｅ２５Ｍ６０．０７８−Ｐ２（ＡＦＬＰ）、Ｅ２５Ｍ４８．１１６−Ｐ１（ＡＦＬＰ）、Ｅ２３Ｍ５０．５８２−Ｐ１（ＡＦＬＰ）、Ｅ２５Ｍ４８．３２５−Ｐ１（ＡＦＬＰ）、ＰＣ１８０ＭＢ（ＡＦＬＰ）、ＰＣ７３Ｍ１４（ＡＦＬＰ）、ＰＣ１７Ｍ３（ＡＦＬＰ）、ＰＣ４１Ｍ２（ＡＦＬＰ）等が含まれ、特にＲＭ４５２またはＲＭ３４１が好ましい。

好ましい第１の遺伝子マーカーは、例えばｄ３０、ｇｈ２等が含まれ、特にｄ３０が好ましい。

本発明において好ましい第２のＤＮＡマーカーは、例えばＲＭ２６７（配列番号７７および７８）、ＲＭ２８９（配列番号７９および８０）、ＲＭ１６９（配列番号８１および８２）、ＲＭ５１６（配列番号８３および８４）、ＲＭ５０９（配列番号８５および８６）、ＲＭ５９８（配列番号８７および８８）、ＲＭ４６５（配列番号８９および９０）、ＲＭ１８１０３（配列番号９１および９２）、ＲＭ２７８７７（配列番号９３および９４）、ＲＭ１８１５２（配列番号９５および９６）、ＲＭ１８１５９（配列番号９７および９８）、ＲＭ１８１２０（配列番号９９および１００）、ＲＭ１８０８０（配列番号１０１および１０２）、ＲＭ１８１１５（配列番号１０３および１０４）、ＲＭ１８０７３（配列番号１０５および１０６）、ＲＭ１８１７７（配列番号１０７および１０８）、ＲＭ２４９（配列番号１０９および１１０）、ＲＭ１８１９６（配列番号１１１および１１２）、ＲＭ７２９３（配列番号１１３および１１４）、ＲＭ３３８１（配列番号１１５および１１６）、ＲＭ２６７６（配列番号１１７および１１８）、ＲＭ６６４５（配列番号１１９および１２０）、ＲＭ３８３８（配列番号１２１および１２２）、ＲＭ５１４０（配列番号１２３および１２４）、ＲＭ８０１４（配列番号１２５および１２６）、ＲＭ６２２９（配列番号１２７および１２８）、ＲＧ４０３（ＲＦＬＰ）、Ｒ５６９（ＲＦＬＰ）、Ｅ３００６６５（ＲＦＬＰ）、Ｓ２３５１（ＲＦＬＰ）、Ｃ１３８８（ＲＦＬＰ）、Ｃ１００４（ＲＦＬＰ）、Ｓ１２９２８（ＲＦＬＰ）、Ｒ５６６（ＲＦＬＰ）、Ｐ１６９（ＲＦＬＰ）、Ｓ１１２９（ＲＦＬＰ）、Ｓ５９３３（ＲＦＬＰ）、Ｓ２８０１Ｓ（ＲＦＬＰ）、ＴＰ１Ｋ１Ｂ（ＲＦＬＰ）、ＲＲＦ０８−２（ＲＦＬＰ）、ＲＺ２９１（ＲＦＬＰ）、ＸＮｐｂ２５５（ＲＦＬＰ）、Ｅ２４Ｍ５０．３８６−Ｐ１（ＡＦＬＰ）、Ｅ２５Ｍ５９．１９６−Ｐ２（ＡＦＬＰ）、Ｅ１３Ｍ５９．０９２−Ｐ１（ＡＦＬＰ）、ＥＭ１５−５（ＡＦＬＰ）、ＰＣ１７３Ｍ９（ＡＦＬＰ）等が含まれ、特にＲＭ２８９またはＲＭ１６９が好ましい。

好ましい第２の遺伝子マーカーは、例えばｄ１が好ましい。

「検出」とは、上記ＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーを検出するためのあらゆる常套の方法を使用することができ、使用するＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーの種類に応じて当業者が適当に選択することができる。例えばＤＮＡマーカーを検出する方法としては、ＰＣＲ法、サザンブロッティング法、ＡＦＬＰ法が挙げられる。例えば遺伝子マーカーを検出する方法としては、形態形質の観察等が挙げられる。

ＰＣＲを利用する方法としては、例えば下記のとおりに検出を行う。
〔ＤＮＡ抽出〕
植物体（またはその一部）を液体窒素で凍結粉砕し、ＤＮＡ抽出液を加え、振盪しながらインキュベートする。この溶液をから、抽出および重合沈殿によって、高分子ＤＮＡをスプールアウトする。スプールアウトしたＤＮＡを精製し、ＤＮＡ溶液を製造する。
〔ＰＣＲ〕
各イネ科植物体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして、プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ等を含む反応液を調製する。サーマルサイクラー等を用いて、変性・アニーリング・伸長の一連の反応を繰り返し行う。ＰＣＲ産物を電気泳動する。ＰＣＲの反応条件およびプライマーは、例えばTheor Appl Genet (2000)100:697-712を参考にすることができる（この文献を、参照により本明細書の一部とする）。

連鎖
ｄ６０とＧａｌについて、イネの全染色体を網羅するように選んだ３１種類の遺伝子マーカーを持つ系統とコシヒカリｄ６０系統（コシヒカリ／北陸１００号／／＊６コシヒカリ）との交雑Ｆ２を展開し、ｄ６０と第２染色体のｄ３０ならびにＧａｌと第５染色体のｄ１との密接な連鎖を検出した。さらに、コシヒカリの第２染色体および第５染色体をKasalathに部分的に置換した染色体部分断片置換型系統SL204, 00KF2-11-175, 00RS-6-234）とコシヒカリｄ６０系統との交雑Ｆ２を展開し、ｄ６０、Ｇａｌ各遺伝子の近傍にあるＳＳＲマーカーとの連鎖を明らかにした。

まず、第２染色体上のｄ３０、ｇｈ２をもつ遺伝子マーカー系統（ＦＬ２１２、遺伝子型：Ｄ６０Ｄ６０ｇａｌｇａｌ）とコシヒカリｄ６０系統（ｄ６０ｄ６０ＧａｌＧａｌ）のＦ２において、ｄ３０座の分離比が野生型：ｄ３０ホモ接合体＝２００：１１８となり、メンデル比である３：１から大きくはずれて、ｄ３０がＤ６０に完全連鎖している場合の理論比５：４に近い分離比となった。さらに、ｇｈ２遺伝子座も野生型：ｇｈ２ホモ接合体＝２１６：１０３となり、ｄ６０は第２染色体のｄ３０、とｇｈ２の間に位置することが分かった。これらＦ２のうちｇｈ２ホモ型 ５６個体からＦ３系統（５０個体／系統）を展開し、Ｆ２の遺伝子型を決定した。まず、ｇｈ２ｄ３０ホモの３２系統は、非組換型配偶子ｄ３０−Ｄ６０のホモ接合が３０系統、組換型配偶子ｄ３０−ｄ６０をヘテロで持ちｄ６０座が３：１に分離した１系統とｄ３０−ｄ６０の二重矮性１系統であった。次にｇｈ２ホモでＤ３０ｄ３０ヘテロの２０系統のうち、非組換型配偶子Ｄ６０−ｄ３０、ｄ６０−Ｄ３０のヘテロで、かつＧａｌｇａｌヘテロで部分不稔個体のＦ３ ９系統ではＦ２同様にｄ３０座が非メンデル型の５：４で過剰分離した。一方、非組換型配偶子をヘテロで持ち、かつＧａｌホモのＦ３ １０系統では、ｄ３０座がメンデル型の３：１に分離した。ｇｈ２でＤ３０ホモの４系統を含めて、組換型配偶子ｄ６０−ｄ３０をヘテロで持つのは２系統であった。以上の結果から、ｄ６０はｄ３０と３．３ｃＭで連鎖していることがわかった。

一方、第５染色体上のｄ１をもつ遺伝子マーカー系統（大黒、Ｄ６０Ｄ６０ｇａｌｇａｌ）とｄ６０コシヒカリ系統（ｄ６０ｄ６０ＧａｌＧａｌ）とのＦ２において、野生型：ｄ１ホモ接合体＝２６３：３４となり、３：１から大きくはずれて、ｄ１がｇａｌに完全連鎖している場合の理論比８：１に近い分離比となった。

続いて、コシヒカリの第２染色体および第５染色体をKasalathに部分的に置換した系統（Ｄ６０Ｄ６０ｇａｌｇａｌ）とコシヒカリｄ６０系統（ｄ６０ｄ６０ＧａｌＧａｌ）との交雑Ｆ２ ５１１〜６６３個体を展開し、日印の当該染色体間で多型を示すＳＳＲマーカーとの連鎖を検出した。ｄ６０は第２染色体のＲＭ４５２から２．８ｃＭ、ＲＭ３４１から５．８ｃＭの距離に座乗し、Ｇａｌは第５染色体のＲＭ２８９から２．３ｃＭの距離に座乗していることがわかった（図１）。

イネ科植物の選抜
コシヒカリの第２染色体または第５染色体をKasalathに部分的に置換した系統（Ｄ６０Ｄ６０ｇａｌｇａｌ）とコシヒカリｄ６０系統（ｄ６０ｄ６０ＧａｌＧａｌ）との交雑Ｆ２ ５１１から６６３個体を展開し，各個体からゲノムＤＮＡを抽出した。植物体から採葉し、−８０℃で凍結保存した。葉を液体窒素で凍結し、粉砕した。これに葉の粉末の重量と等量のＤＮＡ抽出液（２％ＣＴＡＢ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、１．４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を加えて５５℃で振盪しながら９０分間インキュベートした。この溶液をクロロホルム・イソアミルアルコール（２４：１）で抽出した。上清に１／１０量の３Ｍ 酢酸ナトリウムｐＨ５．２を加えた後、等量の−２０℃の９９．５％イソプロパノールを加えて重合沈殿した高分子ＤＮＡをスプールアウトした。スプールアウトしたＤＮＡを１．５ｍｌのＨｉｇｈ−Ｓａｌｔ ＴＥ（１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ８．０）に溶解し、エタノール沈殿後、５００μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ８．０）に溶解した。これに１／１００量のＲＮａｓｅ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を加えて３７℃で一晩インキュベートした。さらに、フェノール−クロロホルム抽出およびクロロホルム抽出を１回ずつ行った後、エタノール沈殿して５００μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ｐＨ８．０）に溶解した。

イネ各植物体から抽出したゲノムＤＮＡ２００ｎｇを鋳型にして、２００ｎＭのフォワードプライマー、リバースプライマー、４００μＭ ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１×ＰＣＲ ＢｕｆｆｅｒII（ＴＡＫＡＲＡ）、０．５Ｕ ＬＡ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）を含む全量２５μｌの反応液を作製した。サーマルサイクラーを用いて、変性９４℃３０秒間、アニーリング５８℃３０秒間、伸長７２℃１分間の一連の反応を３５回行った。また、最初の変性９４℃と最後の合成７２℃を５分間ずつ行った。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで１００Ｖで４５分間電気泳動した（図２）。

第２染色体のＳＳＲマーカーＲＭ４５２は両親間（コシヒカリの第２染色体をKasalathに部分的に置換した系統、コシヒカリｄ６０系統）でＤＮＡ多型を示し、その交雑Ｆ２における短稈個体の約９７％がコシヒカリｄ６０系統と同じＤＮＡのパターンを示し、ＳＳＲマーカーとｄ６０との極めて強い連鎖が検出された。第５染色体のＳＳＲマーカーＲＭ２８９は両親間（コシヒカリの第５染色体をKasalathに部分的に置換した系統、コシヒカリｄ６０系統）でＤＮＡ多型を示し、その交雑Ｆ２における短稈個体の約９７％がコシヒカリｄ６０系統と同じＤＮＡのパターンを示し、ＳＳＲマーカーとｄ６０との極めて強い連鎖が検出された。ｄ６０は第２染色体のＲＭ４５２から２．８ｃＭの距離に座乗し、Ｇａｌは第５染色体のＲＭ２８９から２．３ｃＭの距離に座乗している（図１）。したがって、ｄ６０を持つ短稈個体（ｄ６０ｄ６０ＧａｌＧａｌ）は第２染色体のＲＭ４５２ほかｄ３０と連鎖するＤＮＡマーカー、第５染色体のＲＭ２８９ほかｄ１と連鎖するＤＮＡマーカーによって選抜することができる。

度重なる台風の来襲でイネの倒伏による多大の損害が昨今の社会問題になっており、短稈遺伝子を導入して台風に強い新品種を開発することは緊急課題である。前述のように、品種の遺伝的多様性を維持・拡大しようとする育種の目的に鑑みれば、ｓｄ１はＧＡ生合成酵素の欠損型遺伝子であり、この遺伝子だけに頼ることなく、さらに新規の短稈遺伝子を開拓し、耐倒伏性育種への利用を推進すべきである。

本発明では、短稈品種の遺伝的多様性を拡大し、不測の気象変動に対抗するため、ｓｄ１より耐倒伏性が強く、ｓｄ１とは遺伝的にも機能的にも独立する新規の短稈遺伝子ｄ６０に密接に連鎖していて選抜効率が高いＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーを開発し、ｄ６０のマーカー選抜による短稈イネの開発法を提供する。本法を敷衍することによってさらに、ｄ６０本体の単離が可能であり、ｄ６０の機能解明による草型調節も可能になるだろう。短稈遺伝子ｄ６０のマーカー選抜によりＧＡに偏重した短稈育種のポテンシャルを広げて、全国の農業試験場や植物工場に関連する公民の試験研究機関における品種開発の一助としたい。

短稈遺伝子ｄ６０と配偶子致死遺伝子Ｇａｌ、およびそれらと近位のＤＮＡマーカーもしくは遺伝子マーカーの染色体位置を示す。 Ｆ２幼苗期におけるｄ６０を有するイネ科植物のＲＭ２８９で診断したＤＮＡバンドを示す。

Claims (1)

1. イネ科植物の第２染色体に存在するＤＮＡマーカーＲＭ４５２もしくは遺伝子マーカーｄ３０を検出することによってｄ６０遺伝子の存在を判別すること、および
   イネ科植物の第５染色体に存在するＤＮＡマーカーＲＭ２８９もしくは遺伝子マーカーｄ１を検出することによりＧａｌ遺伝子の存在を判別することを特徴とする、短稈イネ科植物の選抜法。

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