JP2008237138A - イネの第2染色体にある新規の短稈遺伝子のdnaマーカー選抜法 - Google Patents
イネの第2染色体にある新規の短稈遺伝子のdnaマーカー選抜法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】第2染色体に存在するd60遺伝子と近位に座乗しかつ連鎖する遺伝子、そして第5染色体に存在するGal遺伝子と近位に座乗しかつ連鎖する遺伝子をそれぞれDNAマーカーもしくは遺伝子マーカーとして検出することによって、d60遺伝子およびGal遺伝子の存在を間接的に判別し、短稈イネ科植物を選抜する。
【選択図】図1
Description
Tomita, M.: The gametic lethal gene gal: activated only in the presence of the semidwarfing gene d60 in rice. In Rice Genetics III (Ed. G.S. Khush, ISBN 971-22-0087-6), International Rice Research Institute, pp. 396-403 (1996) Tomita, M., Yamagata, H. and Tanisaka, T.: Developmental cytology on gametic abortion caused by induced complementary genes gal and d60 in japonica rice. In Advances in Rice Genetics (Eds. G.S. Khush, D.S. Brar and B. Hardy, ISBN 971-22-0199-6), International Rice Research Institute, pp. 178-181 (2003)
〔DNA抽出〕
植物体(またはその一部)を液体窒素で凍結粉砕し、DNA抽出液を加え、振盪しながらインキュベートする。この溶液をから、抽出および重合沈殿によって、高分子DNAをスプールアウトする。スプールアウトしたDNAを精製し、DNA溶液を製造する。
〔PCR〕
各イネ科植物体から抽出したゲノムDNAを鋳型にして、プライマーおよびDNAポリメラーゼ等を含む反応液を調製する。サーマルサイクラー等を用いて、変性・アニーリング・伸長の一連の反応を繰り返し行う。PCR産物を電気泳動する。PCRの反応条件およびプライマーは、例えばTheor Appl Genet (2000)100:697-712を参考にすることができる(この文献を、参照により本明細書の一部とする)。
d60とGalについて、イネの全染色体を網羅するように選んだ31種類の遺伝子マーカーを持つ系統とコシヒカリd60系統(コシヒカリ/北陸100号//*6コシヒカリ)との交雑F2を展開し、d60と第2染色体のd30ならびにGalと第5染色体のd1との密接な連鎖を検出した。さらに、コシヒカリの第2染色体および第5染色体をKasalathに部分的に置換した染色体部分断片置換型系統SL204, 00KF2-11-175, 00RS-6-234)とコシヒカリd60系統との交雑F2を展開し、d60、Gal各遺伝子の近傍にあるSSRマーカーとの連鎖を明らかにした。
コシヒカリの第2染色体または第5染色体をKasalathに部分的に置換した系統(D60D60galgal)とコシヒカリd60系統(d60d60GalGal)との交雑F2 511から663個体を展開し,各個体からゲノムDNAを抽出した。植物体から採葉し、−80℃で凍結保存した。葉を液体窒素で凍結し、粉砕した。これに葉の粉末の重量と等量のDNA抽出液(2%CTAB、100mM Tris−HCl、20mM EDTA・2Na、1.4M NaCl、pH8.0)を加えて55℃で振盪しながら90分間インキュベートした。この溶液をクロロホルム・イソアミルアルコール(24:1)で抽出した。上清に1/10量の3M 酢酸ナトリウムpH5.2を加えた後、等量の−20℃の99.5%イソプロパノールを加えて重合沈殿した高分子DNAをスプールアウトした。スプールアウトしたDNAを1.5mlのHigh−Salt TE(1M NaCl、10mM Tris・HCl、1mM EDTA・2Na、pH8.0)に溶解し、エタノール沈殿後、500μlのTE(10mM Tris−HCl、1mM EDTA・2Na、pH8.0)に溶解した。これに1/100量のRNase溶液(1mg/ml)を加えて37℃で一晩インキュベートした。さらに、フェノール−クロロホルム抽出およびクロロホルム抽出を1回ずつ行った後、エタノール沈殿して500μlのTE(10mM Tris−HCl、1mM EDTA・2Na、pH8.0)に溶解した。
Claims (5)
- イネ科植物の第2染色体に存在する第1のDNAマーカーもしくは遺伝子マーカーであって、d60遺伝子と90%以上連鎖しているDNAマーカーもしくは遺伝子マーカーを検出することによってd60遺伝子の存在を判別すること、および/または
イネ科植物の第5染色体に存在する第2のDNAマーカーもしくは遺伝子マーカーであって、Gal遺伝子と90%以上連鎖しているDNAマーカーもしくは遺伝子マーカーを検出することによりGal遺伝子の存在を判別することを特徴とする、短稈イネ科植物の選抜法。 - 第1のDNAマーカーもしくは遺伝子マーカーがd60遺伝子と95%以上連鎖しており、そして/あるいは第2のDNAマーカーもしくは遺伝子マーカーがGal遺伝子と95%以上連鎖している、請求項1に記載の方法。
- 第1のDNAマーカーおよび/または第2のDNAマーカーがRFLP、AFLP、SSR、STS、SNP、RAPDである、請求項1または2に記載の方法。
- 第1のDNAマーカーがRM452、RM438、RM521、RM550、RM324、RM27、RM290、RM301、RM29、RM300、RM424、RM561、RM341、RM492、RM6203、RM5699、RM12853、RM12856、RM12885、RM12937、RM12924、RM12967、RM12988、RM13043、RM12963、RM5619、RM13028、RM13069、RM13081、RM13110、RM13065、RM13008、RM13002、RM1358、RM1081、RM3178、RM7426、RM5101、RG171、R3191、RZ324、S14115、E61832、R1989、S1917、S2577、S2525、M162B、S1412、C106、RZ386、RG157、RG144、G1314B、XNpb132、C196、XNpb199、E25M60.078−P2、E25M48.116−P1、E23M50.582−P1、E25M48.325−P1、PC180MB、PC73M14、PC17M3、PC41M2からなる群から選択されるか、あるいは第1の遺伝子マーカーがd30またはgh2である、請求項1に記載の方法。
- 第2のDNAマーカーがRM267、RM289、RM169、RM516、RM509、RM598、RM465、RM18103、RM27877、RM18152、RM18159、RM18120、RM18080、RM18115、RM18073、RM18177、RM249、RM18196、RM7293、RM3381、RM2676、RM6645、RM3838、RM5140、RM8014、RM6229、RG403、R569、E300665、S2351、C1388、C1004、S12928、R566、P169、S1129、S5933、S2801S、TP1K1B、RRF08−2、RZ291、XNpb255、E24M50.386−P1、E25M59.196−P2、E13M59.092−P1、EM15−5、PC173M9からなる群から選択されるか、あるいは第2の遺伝子マーカーがd1である、請求項1または4に記載の方法。
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