CN104395469B - 缩短禾本科植物的秆的基因及产生短秆禾本科植物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是鉴定除sd1以外的短秆基因，并通过利用除sd1基因以外的短秆基因产生短秆禾本科植物。本发明提供利用基因d60来缩短禾本科植物的秆以产生短秆禾本科植物的方法，其中产生短秆禾本科植物的方法的特征在于抑制Os02g0280200的表达。本发明还提供其中抑制Os02g0280200的表达的短秆禾本科植物等。

Description

缩短禾本科植物的秆的基因及产生短秆禾本科植物的方法
技术领域
本发明涉及缩短禾本科植物高度的基因、产生短秆禾本科植物的方法、和短秆禾本科植物。
背景技术
禾本科植物是农业上非常重要的植物，包括稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、黍（prosomillet）、粟（foxtail millet）、日本粟（Japanese millet）、玉米、龙爪稷（fingermillet）、高粱等。具有长秆的禾本科植物由于强风诸如台风趋于倒伏，并由此作物产量严重降低。
在通过寻找短秆基因开发具有抗倒伏（loading resistance）的品种中，具有短秆禾本科植物的育种已进行许多年。然而，当植物高度缩短时，植物的穗（panicle）和籽粒常常变得大小降低。这样的短秆基因从生产力的观点看不是期望的。因此，存在对不影响穗和籽粒但仅适当地缩短植物高度的的短秆基因的需求。
在已发现的短秆基因中，仅sd1已被进行实际应用。sd1基因产生称为“半矮化”的特征，其中穗长度正常，并且整个植株高度缩短。sd1基因是赤霉素（GA）生物合成的C20-氧化酶基因的缺损形式。目前种植于世界许多地方的短秆稻的品种包括美国开发的Calrose76、东南亚开发的IR 36、日本开发的Hikari-Shinseiki等。这些短秆品种的遗传分析显示所有品种具有与半矮化基因sd1的基因座相同的基因座。换言之，目前短秆禾本科植物的栽培仅由一个特定基因所主导，并且该仅仅一个特定基因被广泛使用。考虑到维持并扩展品种的遗传多样性的育种目的，在培育来开发具有抗倒伏的品种中使用除sd1基因之外的短秆基因应该被鼓励，并且需要新的短秆基因。
近期，半矮化基因d60刚刚发现（非专利文献1和2）。d60基因是相比于不具有d60基因的植物高度缩短植物高度约20 cm的基因。
半矮化基因d60与gal（其是配子致死基因并广泛存在于稻中）共存对于雄配子和雌配子都是致死的。因此，Koshihikari d60株系或具有d60的品种或株系诸如Hokuriku100 (基因型: d60d60GalGal)与另一品种或株系(D60D60galgal)之间的F1杂交种（cross）(D60d60Galgal)显示75％的花粉和种子育性，并且F2后代显示特定的遗传模式，其中它以六株可育长秆植株(4 D60D60 : 2 D60d60GalGal) : 两株部分不育长秆植株(D60d60Galgal = F1型) : 一株短秆植株(d60d60GalGal)的比例分离。因此，Gal对于d60的遗传是必需的。d60基因是有价值的短秆基因，其在无Gal的同时人工突变的情况下无法在自然界中获得。
已发现半矮化基因d60位于稻植物的二号染色体上，并显示为遗传上和功能上独立于sd1的基因，sd1位于一号染色体上（专利文献1）。也已经开发了选择具有d60基因和Gal基因的禾本科植物的方法，其中所述方法包括使用DNA标记物或基因标记物确定d60基因在二号染色体上的存在和/或Gal基因在五号染色体上的存在（这对于d60基因的遗传是必需的）（专利文献1）。
然而，d60基因从未被鉴定到并且d60的缩短功能从未被阐明。d60基因也从未投入实际使用。
引用列表
专利文献
专利文献1：JP-A 2008-237138
非专利文献
。
发明概述
本发明待解决的问题
本发明的目标是鉴定除sd1以外的短秆基因并使用除sd1以外的短秆基因产生短秆禾本科植物。
问题的解决办法
在上述情况下，本发明人集中于使用d60基因并深入研究以鉴定该基因并阐明其缩短秆的功能。作为d60基因精细作图的结果，本发明人发现d60候选基因的区域位于距二号染色体的短臂端约10.2-10.5 Mb处。随后，本发明人进行d60候选基因的测序并最终鉴定到作为Os02g0280200基因的功能缺损形式的d60基因。因此，本发明得到完成。
具体而言，本发明提供：
[1] 产生短秆禾本科植物的方法，其包括在禾本科植物中抑制Os02g0280200基因的表达，
[2] 根据[1]的方法，其中通过反义方法或诱变方法抑制Os02g0280200基因的表达，
[3] 根据[2]的方法，其中用含有Os02g0280200基因的全长cDNA的反义序列的载体转化所述禾本科植物，
[4] 根据[2]的方法，其中用含有Os02g0280200基因的第二外显子的反义序列的载体转化所述禾本科植物，
[5] 根据[2]的方法，其中在Os02g0280200基因的核苷酸序列的479位引入胸腺嘧啶向胞嘧啶的突变，
[6] 根据[5]的方法，其中用含有SEQ ID NO:2中显示的核苷酸序列的载体转化所述禾本科植物，
[7] 根据[5]的方法，其中用含有编码包含SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列的载体转化所述禾本科植物，
[8] 根据[5]的方法，其中用含有SEQ ID NO:6中显示的核苷酸序列的载体转化所述禾本科植物，
[9] 根据[5]的方法，其中用含有编码包含SEQ ID NO:8中显示的氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列的载体转化所述禾本科植物，
[10] 短秆禾本科植物，其中Os02g0280200基因的表达被抑制，
[11] 短秆基因，其包含SEQ ID NO:2中显示的核苷酸序列，
[12] 短秆基因，其编码包含SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的蛋白，
[13] DNA，其由Os02g0280200基因的全长cDNA的反义序列组成，
[14] DNA，其由Os02g0280200基因的第二外显子的反义序列组成，
[15] DNA，其由编码包含SEQ ID NO:3中显示的氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列的反义序列组成，和
[16] DNA，其由编码包含SEQ ID NO:7中显示的氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列的反义序列组成。
发明效果
根据本发明，仅有其高度被合适地缩短且其穗和籽粒未受影响的禾本科植物可以通过抑制禾本科植物中的Os02g0280200基因的表达来获得，而不需依赖于常规的基因sd1。因此，根据本发明，可以获得同时满足抗倒伏和生产力两者的有用的禾本科植物。
附图简述
图1显示了基因d60的精细作图结果。
图2显示了用Os02g0280200基因的反义序列转化的稻植物。
图3显示了用Os02g0280200基因的反义序列转化的稻植物的籽粒。
实施本发明的模式
在本发明中，基因d60如下鉴定。
将其中Koshihiraki的二号染色体部分地由籼稻品种Kasalath的二号染色体替代的株系(D60D60galgal)与Koshihikari d60株系(d60d60GalGal)杂交，并随后，获得后代F2。从F2选择短秆纯合(d60d60GalGal)植物，并通过使用二号染色体上的SSR（简单序列重复）标记物（其显示粳稻品种和籼稻品种之间的差异）进行精细作图。SSR标记物和基因d60之间的连锁通过DNA多态性来研究，并随后，确定了显示0％的重组值的位置。重组值通过以下方程计算：
重组值＝（重组配子数目/配子总数）x 100，
其中完全连锁显示0％的重组值。
本发明人的前期研究发现基因d60存在于距SSR标记物RM452 2.8 cM的基因座上（专利文献1）。因此，在本发明中，使用RM452和位于RM452附近的各个SSR标记物进行精细作图。结果是，RM12970和基因d60之间的重组值为0％。因此，发现基因d60的候选区域位于距稻的二号染色体短臂端约10.2-10.5 Mb处。
在位于距稻的二号染色体短臂端约10.2-10.5 Mb处的假定基因中，将Os02g0280200和Os02g0280300在Koshihikari和Kosihikari d60株系之间进行测序分析。结果是，在Os02g0280200基因的第二外显子的核苷酸序列中479位发现由胸腺嘧啶（T）向胞嘧啶（C）的核苷酸突变。此外，作为Koshihikari和Kosihikari d60株系之间氨基酸序列分析的结果，在对应于核苷酸序列中的上述突变的位置处发现由苯丙氨酸（F）向丝氨酸（S）的氨基酸突变。
将Os02g0280200基因的全长cDNA的反义序列或Os02g0280200基因的第二外显子的反义序列引入Koshihikari中以获得短秆植物。因此，基因d60被鉴定为Os02g0280200基因的功能缺损形式。
Koshihirari的Os02g0280200基因的全长核苷酸序列的实例显示于SEQ ID NO:1中。Koshihirari d60株系的Os02g0280200基因的全长核苷酸序列的实例显示于SEQ IDNO:2中。Koshihirari的Os02g0280200基因的第二外显子的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:5中。Koshihirari d60株系的Os02g0280200基因的第二外显子的核苷酸序列显示于SEQ IDNO:6中。由Koshihirari的Os02g0280200基因的全长核苷酸序列编码的氨基酸序列的实例显示于SEQ ID NO:3中。由Koshihirari d60株系的Os02g0280200基因的全长核苷酸序列编码的氨基酸序列的实例显示于SEQ ID NO:4中。由Koshihirari的Os02g0280200基因的第二外显子编码的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:7中。由Koshihirari d60株系的Os02g0280200基因的第二外显子编码的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:8中。
因此，本发明的第一方面提供产生短秆禾本科植物的方法，其包括抑制Os02g0280200基因的表达。Os02g0280200表示稻的二号染色体上的基因座，并公开于RiceAnnotation Project Database (RAP-DB)等中。如本文所用，将存在于Os02g0280200上的基因称为“Os02g0280200基因”。本发明人鉴定基因d60为Os02g0280200基因的功能缺损形式，并随后发现禾本科植物的秆可以通过抑制该基因的表达来缩短。因此，Os02g0280200基因具有与木葡聚糖内糖基转移酶（xyloglucan transglycosylase (XTH)）基因的序列相似的序列，并且D60可能催化细胞壁中木葡聚糖分子之间的交联以参与形态发生。或许d60缺乏如上所述的催化功能并因而产生了短秆。
在本发明中，“Os02g0280200基因”包括稻的Os02g0280200基因和其他禾本科植物的对应基因。例如，Os02g0280200基因包括公开于Rice Annotation Project Database(RAP-DB) Build4中位于距稻的二号染色体的短臂端10388558-10390067个核苷酸处的基因，及其他禾本科植物的对应基因。稻的Os02g0280200基因具有公开于NCBI参考序列检索号NM_001053089中的mRNA序列。由稻的Os02g0280200基因编码的蛋白的氨基酸序列公开于NCBI参考序列检索号NP_001046554中。对应于Os02g0280200基因的除稻以外的禾本科植物的基因可以通过常规方法鉴定，例如，使用含有目的植物的基因组信息的数据库和稻的Os02g0280200基因的核苷酸序列或由所述核苷酸序列编码的氨基酸序列的信息来同源性检索。
在本发明中，“短秆禾本科植物”表示其高度缩短的禾本科植物。短秆禾本科植物优选为其中穗长度和籽粒大小正常且仅整个植株的高度缩短的禾本科植物。在本发明中，“短秆基因”表示缩短禾本科植物的秆的基因。短秆基因优选为导致上述“短秆禾本科植物”的基因。
在本发明中，“禾本科植物”包括稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、黍（proso millet）、粟（foxtail millet）、日本粟（Japanese millet）、玉米、龙爪稷（finger millet）、高粱等。优选地，可以使用稻。属于水稻（Oryza sativa L.）的各种品种和株系均可以用作稻。例如，粳稻品种诸如Koshihikari、Nipponbare、Hitomebore、Hinohikari、Akitakomachi、Kinuhikari、Nanatsuboshi、Haenuki、Kirara397、Tsugaru Roman、Masshigura等和籼稻品种诸如Kasalath等可以使用。
在本发明中，Os02g0280200基因表达的“抑制”表示所述基因未表达，或者所述基因的表达量相比于其中该基因的表达未被抑制的对照降低。
在本发明中，Os02g0280200基因表达的抑制可以通过本领域中常规使用的任何方法来进行。抑制Os02g0280200基因表达的方法并无具体限制，并且例如，包括反义方法、诱变方法、和RNA干扰方法。在反义方法的情况下，例如，将Os02g0280200基因的全长cDNA的反义序列或Os02g0280200基因的第二外显子的反义序列引入禾本科植物中。在诱变方法的情况下，将抑制Os02g0280200基因表达的突变引入其核苷酸序列中。例如，尽管不限于此，但可以将T（胸腺嘧啶）向C（胞嘧啶）的突变在Os02g0280200基因的第二外显子的44位引入，例如，在Os02g0280200基因的全长核苷酸序列的479位。例如，可以将显示于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6中的核苷酸序列或编码显示于SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8中的氨基酸序列的核苷酸序列引入禾本科植物中。
在本发明中，将期望的基因序列引入到禾本科植物中可以通过本领域中常规使用的任何方法来进行。此类常规基因引入方法的实例包括但不限于农杆菌介导的转化方法、基因枪介导的转化方法、电穿孔法、和聚乙二醇（PEG）介导的转化方法。
在本发明中，禾本科植物的转化可以使用设计用于抑制Os02g0280200基因表达或改变Os02g0280200基因结构的多种核酸分子进行。此类核酸分子的实例包括Os02g0280200基因全长cDNA的反义序列，例如显示于SEQ ID NO:9中的序列；Os02g0280200基因的第二外显子的反义序列，例如显示于SEQ ID NO:10中的序列；含有在479位的突变T→C的Os02g0280200基因的核苷酸序列，例如显示于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6中的序列；和编码显示于SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8中的氨基酸序列的核苷酸序列。
对于转化，可以优选使用禾本科植物的细胞例如原生质体、愈伤组织或胚、组织块、或植物体。
在本发明的方法中，禾本科植物可以例如通过使用含有期望的核酸分子的载体来转化。载体可以含有能够表达期望的基因的多种启动子序列。启动子的实例包括但限于稻肌动蛋白1启动子和35S启动子。载体可以含有允许选择已整合入载体的经转化的细胞的多种可选择标记物。可选择标记物的实例包括但限于抗生素抗性基因和除草剂抗性基因，例如，新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、双丙氨磷(bialaphos)抗性基因、和链霉素抗性基因。载体还可以含有终止子。此类终止子并无具体限制，只要它在植物体内有功能。终止子的实例包括花椰菜花叶病毒终止子、和来源自胭脂碱合成酶基因终止子的终止子（Nos终止子）。
例如，当通过使用本发明方法中的农杆菌方法转化禾本科植物时，多种质粒载体包括商购质粒载体例如pSTARA R-5、pRI201-ON等可以使用。
转化后，细胞在选择培养基中生长某一时期，并随后，选择经转化的植物细胞。从由此获得的经转化的细胞中，可以再生完整的植物体来获得短秆禾本科植物。
因此，本发明的第二方面提供短秆禾本科植物，其中Os02g0280200基因的表达被抑制。本发明优选提供其中穗长度和籽粒大小正常且仅整个植株的高度缩短的短秆禾本科植物。
本发明的第三方面提供短秆基因，其为Os02g0280200基因的功能缺损形式。本发明优选提供包含显示于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6中的核苷酸序列的短秆基因、或编码包含显示于SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8中的氨基酸序列的蛋白的短秆基因。本发明更优选提供由显示于SEQ ID NO:2中的核苷酸序列组成的短秆基因或编码由显示于SEQ ID NO:4中的氨基酸序列组成的蛋白的短秆基因。
本发明进一步提供由Os02g0280200基因的全长cDNA的反义序列组成的DNA、或由Os02g0280200基因的第二外显子的反义序列组成的DNA，优选为由SEQ ID NO:9中显示的核苷酸序列组成的DNA、或由SEQ ID NO:10中显示的核苷酸序列组成的DNA，其用于产生短秆禾本科植物。本发明还提供由以下组成的DNA：编码由SEQ ID NO:3中显示的氨基酸序列组成的蛋白的核苷酸序列的反义序列、或编码由SEQ ID NO:7中显示的氨基酸序列组成的蛋白的核苷酸序列的反义序列，其用于产生短秆禾本科植物。
本发明通过参考以下实施例进一步详细阐述，但本发明并不限于所述实施例。
实施例1
基因d60的精细作图
将其中Koshihiraki的二号染色体部分地由籼稻品种Kasalath的二号染色体替代的株系(D60D60galgal)与Koshihikari d60株系(d60d60GalGal)杂交以获得F1(D60d60Galgal)。将F1自花受精以获得F2。具体而言，将其中Koshihikari的二号染色体（d60位于其上）部分地由籼稻品种Kasalath的二号染色体替代的株系SL204（D60D60galgal，其中从短臂端延伸至60.3 cM的二号染色体的部分被Kasalath的部分所替代）与Koshihikarid60株系(d60d60GalGal)杂交。随后，播种5122粒后代F2的种子。在三叶期，选择532株具有短且圆形叶片的d60纯合短秆植株(d60d60GalGal)，并随后栽种于Field Science Centerof the Tottori University。从所有短秆纯合F2植株取叶片作为样品。从叶片中提取DNA。
从每一F2植株提取基因组DNA如下进行。将叶片从植株取下，并随后置于-80℃下冷冻。将叶片在液氮中冷冻并随后研磨。向因此获得的叶片粉末中，以等于粉末的量的量加入DNA提取溶液(2% CTAB, 100 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA·2Na, 1.4 M NaCl, pH 8.0)，并随后在55℃下摇动孵育90分钟。随后，将因此获得的溶液用氯仿/异戊醇(24:1)萃取。将1/10体积的3 M乙酸钠pH 5.2和随后等量的99.5%的异丙醇在-20℃下加入到上清液中。将聚合且沉淀的DNA缠绕卷出(spooled out)。将缠绕卷出的DNA溶解在1.5 ml的高盐TE (1 MNaCl, 10 mM Tris·HCl, 1 mM EDTA·2Na, pH8.0)中，进行乙醇沉淀，并随后溶解在500μl的TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA·2Na, pH8.0)中。向溶液中加入1/100体积的RNase溶液(1 mg/ml)，并随后在37℃下孵育过夜。将混合物进行苯酚/氯仿萃取，氯仿萃取，并随后乙醇沉淀。随后，将沉淀物溶解在500 μl的TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA·2Na,pH8.0)中。
随后，将展示Kasalath和Koshihikari之间多态性的二号染色体短臂上的48个SSR标记物用于测定d60或Gal与SSR标记物之间的重组值，由此将基因d60位于其上的基因座候选范围缩小。
具体而言，将作为模板的如上所述从每一F2植株提取的200 ng基因组DNA、200 nM的每一SSR标记物的正向引物和反向引物、400 μM dNTPs、2.5 mM MgCl2、1 x LA PCRBufferII (TAKARA)、和0.5 U LA Taq DNA聚合酶(TAKARA)用于制备总计25 μl的反应溶液。PCR使用热循环仪进行35个循环，其中每一循环由以下组成：在94℃变性1分钟，在55℃退火1分钟，并在72℃延伸1分钟。PCR后，使用电泳仪器QIAxel进行电泳。作为电泳盒(electrophoresis cartridge)，使用QIAxel DNA screening Kit (2400)。将样品在5 kV下注入10秒钟，并且电泳在5 kV下进行420秒。
通过电泳结果上的DNA多态性来研究基因d60和每一SSR标记物之间的连锁，来确定每一SSR标记物和基因d60之间的重组值。结果是，发现在48个SSR标记物中，位于距二号染色体短臂端9.2-11.0 Mb的区域内的8个标记物，即RM12918、RM452、RM12938、RM12949、RM12964、RM12970、Os02ssr0104100和RM13002与基因d60具有紧密连锁。这些标记物与基因d60之间的重组值如下：位于9.5 Mb的RM12918为5.7，位于9.6 Mb的RM452为5.1，位于9.9Mb的RM12938为3.9，位于10.1 Mb的RM12949为2.1，位于10.2 Mb的RM12964为3.2，位于10.2Mb的RM 12970为0.0，位于10.5 Mb的Os02ssr0104100为0.7，和位于10.9 Mb的RM13002为4.5。基于这些重组值，发现d60位于距二号染色体短臂端10.2-10.5 Mb的区域内（图1）。
实施例2
基因d60的序列分析
将位于距稻的二号染色体短臂端约10.2-10.5 Mb的假定基因Os02g0280200和Os02g0280300进行序列分析作为d60的候选基因。
Koshihikari和Koshihikari d60株系的Os02g0280200基因和Os02g0280300基因通过PCR扩增，连接至pUC载体pUC119，通过用所述载体转化源自大肠杆菌（Escherichia coli (E. coli)）K12菌株的HST08来克隆，并随后通过常规方法测序。具体而言，将作为模板的Koshihikari和Koshihikari d60株系的每一200 ng基因组DNA、每一200 nM的正向引物和反向引物、400 μM dNTPs、2.5 mM MgCl2、1x LA PCR BufferII (TAKARA)、和0.5 U LA Taq DNA聚合酶(TAKARA)用于制备总计25 μl的反应溶液。PCR使用热循环仪进行35个循环，其中每一循环由以下组成：在94℃变性1分钟，在58℃退火1分钟，并在72℃延伸2分钟。此外，在PCR开始时进行在94℃变性5分钟，并在PCR结束时进行在72℃合成5分钟。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上在100 V下进行电泳35分钟。使用SUPRECR-PCR (TAKARA)纯化DNA。首先，将400 μl的无菌水加入到样品储器(samplereservoir)中。将样品储器盖上盖并随后在3,500 rpm下离心15分钟。随后，将样品储器从滤器管中移除，并置于新管中。随后，将20 μl的TE加入到样品储器中。轻柔吸打后，将样品储器进行倒置并在3,500 rpm下离心2分钟。将1 μl经纯化的PCR产物置于新的微量管中，与1 μl的pMD 20-T载体(TAKARA)和3 μl无菌水混合，并连接30分钟。即将使用前将大肠杆菌HST08 Premium感受态细胞(TAKARA)在冰上融化，并随后轻柔混合并均化。将100 μl的感受态细胞转移至14 ml圆底管中后，将连接溶液加入管中。将管在冰上放置30分钟，并随后在42℃下孵育45秒。随后，将管置于冰上1-2分钟，并将之前置于37℃的SOC培养基加入管中，随后在37℃下摇动1小时。将细胞(50-100 μl)涂布在固体LB培养基上并随后置于37℃下过夜。从培养基上，选择白色菌落并转移至3 ml的液体LB培养基中，随后在37℃下摇动16小时。从保留有重组质粒的大肠杆菌的培养基（3 ml）中，通过碱法纯化质粒DNA。将因此获得的质粒用作经双脱氧法测序的模板。
结果是，发现在Os02g0280200基因区域中，在Koshihikari和Kosihikari d60株系的核苷酸序列之间存在在479位的T (胸腺嘧啶) → C (胞嘧啶)突变。Os02g0280200基因的核苷酸序列中的479位在第二外显子中。还发现在氨基酸序列中的112位存在F (苯丙氨酸) → S (丝氨酸)突变。
另一方面，关于Os02g0280300基因区域，在Koshihikari和Kosihikari d60株系的序列之间未发现突变。
因此，推断基因d60为Os02g0280200基因的功能缺损形式。Koshihikari的Os02g0280200基因的全长核苷酸序列的实例显示于SEQ ID NO:1中。Koshihikari d60株系的Os02g0280200基因的全长核苷酸序列的实例显示于SEQ ID NO:2中。由Koshihikari的Os02g0280200基因编码的氨基酸序列的实例显示于SEQ ID NO:3中。由Koshihikari d60株系的Os02g0280200基因编码的氨基酸序列的实例显示于SEQ ID NO:4中。
实施例3
使用基因d60产生短秆稻
将Os02g0280200基因的全长cDNA的反义序列或Os02g0280200基因的第二外显子的反义序列引入Koshihikari中。引入反义序列(sntisense sequence)如下所述进行。最终，获得再分化的植株。
1.将双元载体引入农杆菌
在含有稻肌动蛋白1启动子、Nos终止子、和作为选择标记物的稻来源的W548L/S627I两点突变的乙酰乳酸合酶基因的pSTARA双元载体R-5 (产品名: pSTARA R-5, 由KUMIAI CHEMICAL INDUSTRIES CO., LTD.制造)用限制酶XbaI和KpnI消化后，将全长cDNA反义序列(SEQ ID NO:9)或第二外显子反义序列(SEQ ID NO:10)插入载体中。通过电穿孔将载体引入农杆菌（根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacience)）EHA105。将转化子在含有100 ppm的壮观霉素的LB培养基上选择。
2.从盾片诱导愈伤组织
将灭菌的Koshihikari种子(25至35粒种子)置于N6D培养基上且将胚朝上，并随后在光照条件（光周期：16小时）下在30℃下培养5天。
3.农杆菌的预培养
在感染前一天将引入有双元载体的农杆菌EHA105（从甘油储存液）在LB液体培养基（含有100 ppm的壮观霉素）中培养。
4.与农杆菌感染物共培养
1）从培养5天的盾片来源的愈伤组织上去除幼苗和胚乳部分。将愈伤组织暂时置于N6D培养基上。
2）向50 ml falcon管中加入40 ml的AAM溶液和随后16 μl的100 mg/ml的乙酰丁香酮。
3）收集如在上文部分3中所述进行培养的农杆菌，在AAM溶液中悬浮并稀释。
4）将在1）中获得的愈伤组织置于新的50 ml falcon管中。将在3）中获得的农杆菌悬浮液加入愈伤组织，并通过缓慢颠倒1.5分钟混合。
5）将在4）中获得的混合物倒入灭菌的滤茶器上。将保留有愈伤组织的滤茶器置于灭菌的Kimtowel（纸巾）上以去除过量的流体。
6）将愈伤组织置于2N6-AS培养基上（约每块平板25个愈伤组织），同时使愈伤组织彼此之间不接触。
7）将愈伤组织在黑暗条件下在24℃下共培养3天。
5.农杆菌的去除和选择
1）将共培养的愈伤组织转移至50 ml falcon管并随后用含有羧苄青霉素(500mg/L)的无菌水洗涤7-8次。
2）洗涤后，当洗涤后的液体变得透明时，将愈伤组织置于无菌水中10分钟。
3）使用新的移液器，洗涤愈伤组织直至500 ml的无菌水用尽，并随后转移至灭菌的Kimtowel (注册商标)上以去除过量水。
4）将愈伤组织置于含有400 mg/L羧苄青霉素和适量的选择剂的选择培养基（N6D培养基）上（每块平板14个愈伤组织）。
5）将愈伤组织在光照条件（光周期：16小时；同样应用于后续中）下在30℃下培养1个月。（在第二周过程中，将愈伤组织继代培养。）。
6.再分化为植物体
1）当新的愈伤组织生长时，将它们转移至含有羧苄青霉素(200 mg/L)和0.25 μM双草醚的再生培养基（RE-III）上。
2）将愈伤组织置于在光照条件下在30℃下1个月。（在第二周过程中，将愈伤组织继代培养。）
3）在从愈伤组织中再分化出幼苗和根后，将愈伤组织转移至无激素（HF）培养基上。
结果显示于图2中。如图2中所见，具有Os02g0280200基因的全长cDNA反义序列的转化体和具有Os02g0280200基因的第二外显子反义序列的转化体都具有比对照高度缩短约20 cm的高度。当测量穗长度时，对照具有14.13 cm的穗，全长cDNA反义基因转化体具有14.10 cm的穗，并且第二外显子反义基因转化体具有13.40 cm的穗。两种转化体均具有与对照的相同的穗长度。此外，两种转化体均具有与对照的相同的籽粒大小（图3）。
基于以上结果，证实基因d60的功能互补。确定了基因d60为Os02g0280200基因的功能缺损形式。此外，证实通过抑制Os02g0280200基因表达获得短秆禾本科植物。
实施例4
在转化体中确定整合的序列
从实施例3中获得的每一转化体，如实施例1中所述提取基因组DNA。使用下文描述的引物将基因组DNA进行PCR扩增，并进行电泳，并检测经扩增的条带。使用未转化的Koshihikari作为对照。
用于全长cDNA反义基因转化体的引物：3303F和3303R
正向引物序列：
反向引物序列： 。
用于第二外显子反义基因转化体的引物：3309F和3309R
正向引物序列：
反向引物序列： 。
结果是，在具有全长cDNA反义基因的转化体中，检测到了891 bp的条带。在具有第二外显子反义基因的转化体中，检测到了194 bp的条带。相反，对于对照，并未检测到这些条带。基于这些结果，确定期望的DNA的确整合入实施例3中获得的转化体中。因此，证实实施例3中观察到的稻转化体的缩短是由抑制Os02g0280200基因表达引起的。
产业实用性
根据本发明，短秆禾本科植物可以通过抑制禾本科植物的Os02g0280200基因的表达来产生，而无需依赖常规基因sd1。由于本发明的短秆禾本科植物具有正常大小的穗和籽粒，并仅具有缩短的高度，因此短秆禾本科植物不仅具有抗倒伏而且还保持生产力。因此，本发明可以用于产生农田中的稻，和多种禾本科植物的育种和遗传改进。

Claims (14)

1.产生矮秆稻植物的方法，其包括在稻植物中抑制Os02g0280200基因的第二外显子的表达。
2.根据权利要求1的方法，其中用含有Os02g0280200基因的全长cDNA的反义序列的载体转化所述稻植物。
3.根据权利要求1的方法，其中用含有Os02g0280200基因的第二外显子的反义序列的载体转化所述稻植物。
4.根据权利要求1的方法，其中在Os02g0280200基因的核苷酸序列的479位引入胸腺嘧啶向胞嘧啶的突变。
5.根据权利要求4的方法，其中用含有SEQ ID NO:2中显示的核苷酸序列的载体转化所述稻植物。
6.根据权利要求4的方法，其中用含有编码SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列组成的蛋白的核苷酸序列的载体转化所述稻植物。
7.根据权利要求4的方法，其中用含有SEQ ID NO:6中显示的核苷酸序列的载体转化所述稻植物。
8.根据权利要求4的方法，其中用含有编码SEQ ID NO:8中显示的氨基酸序列组成的蛋白的核苷酸序列的载体转化所述稻植物。
9.根据权利要求2的方法，其中所述反义序列如SEQ ID NO:9所示。
10. 根据权利要求3的方法，其中所述反义序列如SEQ ID NO:10所示。
11.一种矮秆基因，其由SEQ ID NO:2中显示的核苷酸序列组成。
12.一种矮秆基因，其编码由SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列组成的蛋白。
13.一种矮秆基因，其由SEQ ID NO:6中显示的核苷酸序列组成。
14.一种矮秆基因，其编码SEQ ID NO:8中显示的氨基酸序列组成的蛋白。
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