CN103827305B - 草甘膦耐受性玉米事件vco‑φ1981‑5及用于其检测的试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用赋予对草甘膦的耐受性的基因的植物转化的领域。具体而言，本发明涉及用编码EPSPS的基因转化的玉蜀黍(玉米)植物，所述EPSPS在此除草剂有效杀死杂草的条件下对植物提供对草甘膦应用的耐受性。具体而言，本发明关注包含基因构建体的良种转化事件VCO‑

Description

草甘膦耐受性玉米事件VCO-Φ1981-5及用于其检测的试剂盒 和方法
本发明涉及用赋予对草甘膦(glyphosate)的耐受性的基因的植物转化的领域。具体而言，本发明涉及用编码EPSPS的基因转化的玉蜀黍(玉米)(maize(corn))植物，所述EPSPS在此除草剂有效杀死杂草的条件下对植物提供对草甘膦应用的耐受性。
特别而言，本发明关注包含基因构建体的良种转化事件及用于检测所述良种事件的存在的手段(means)、试剂盒和方法。
发明背景
草甘膦耐受性植物是本领域中已知的，并且在过去20年中充分研究。草甘膦是一种抑制EPSPS的除草剂，所述EPSPS是一种其活性在导致氨基酸酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸合成的芳香族氨基酸途径上游的酶。由于草甘膦是一种合成的总体除草剂，在常见的农艺学条件下喷雾该除草剂时植物中的耐受性仅可以通过用编码草甘膦不敏感性EPSPS酶(突变的或选自已知已经进化出此类不敏感性EPSPS酶的微生物)的异源基因对植物的所有细胞的遗传修饰实现。
草甘膦不敏感性EPSPS、基因构建体和用所述基因构建体转化的植物披露于EP507698,EP508909,US4535060,US5436389,WO92/04449,WO92/06201,WO95/06128,WO97/04103,WO2007/064828和WO2008/100353及本文引用的参考文献，等等。
EPSPS蛋白的生物物理特征对于实现良好的对草甘膦的耐受性水平是必需的。然而，在植物中提供足够的不敏感性蛋白质表达水平的调节元件的选择也是重要的，以及选择转化事件(其对应于具有植物基因组中所插入的稳定且有限数目的基因拷贝的稳定品系)及其在已经插入基因的基因座中的稳定性对于获得商业水平的草甘膦耐受性也是重要的，所述商业水平对于要用于制备种子的植物是足够的，所述种子要在田间以一定的对草甘膦的耐受性水平在农艺学条件下种植，所述农艺学条件足以容许使用有效杀死杂草而不影响用编码EPSPS蛋白的基因转化的作物的生长条件和产率的浓度使用 除草剂。
选择用于制备草甘膦耐受性玉蜀黍(玉米)的商业品种的转化事件是本领域中已知的，特别地披露于US6040497和EP1167531。
用于制备目前用于田间的商业植物的第一代的这些品种具有一些缺点。
US6040497中披露的事件GA21包含多个拷贝的基因构建体，该基因构建体包含稻肌动蛋白启动子和内含子、编码优化的转运肽的序列(如EP505909中披露的)和如WO97/04103中披露的编码包含两处突变的突变植物EPSPS的序列。转化事件中在商业上需要的耐受性水平用复杂的转运肽和多个拷贝的嵌合基因构建体获得。
EP1167531中披露的事件NK603也是一种在一个基因座中具有两个基因构建体组合的复杂事件。第一种基因构建体包含稻肌动蛋白启动子和内含子，及编码拟南芥(Arabidopsis)EPSPS转运肽的序列和编码对草甘膦实现的抑制有抗性的II型EPSPS的序列(其分离自土壤杆菌(Agrobacterium)菌株CP4。第二种基因构建体包含CaMV35S启动子和稻肌动蛋白内含子，及编码拟南芥EPSPS转运肽的序列和编码对草甘膦实现的抑制有抗性的II型EPSPS的序列(其分离自土壤杆菌菌株CP4)。
需要新一代的转化事件，其对农艺学条件下种植的在植物基因组中具有单一拷贝的外来基因构建体的玉蜀黍(玉米)植物容许高草甘膦耐受性。
发明概述
发明关注包含事件VCO-1981-5的玉蜀黍(玉米)植物，代表性种子以登录号41842保藏于NCIMB。
发明还关注包含VCO-1981-5事件的玉蜀黍(玉米)植物，其特征在于存在包含序列SEQIDNO1和/或SEQIDNO2或SEQIDNO3的基因组侧翼序列-基因构建体接合。
本发明还关注包含本发明的VCO-1981-5事件的玉米植物后代，其特征在于存在所述接合序列。
鉴定玉蜀黍(玉米)植物基因组中所述接合序列存在的探针，以及包括所述探针及其使用的用于此类鉴定的试剂盒和方法，特别是用于检测VCO-1981-5事件的方法及用于此类检测的引物、探针和试剂盒也是本发明的一部分。
发明详述
“转化事件”意指用异源DNA构建体进行植物细胞转化，源自将转基因插入植物基因组中的植物群体的再生，和选择以对特定基因组位置插入基因构建体为特征的特定植物的产物。
依照本发明，“基因构建体”意指从不同核苷酸序列(其包括控制编码序列在宿主生物体中表达和翻译的调节元件)构建的基因。特别地，本发明中的宿主生物体是玉蜀黍(玉米)、细胞、组织和全植物。基因构建体包含启动子区，与该启动子区可操作连接的编码序列和终止子区。它可以包含增强子，诸如内含子，其一般在启动子区下游且在编码区上游连接。在草甘膦耐受性的情况中，编码序列包含编码叶绿体转运肽的序列，与该序列连接的从已经形成对草甘膦的抗性的微生物突变或选择或选择且突变的编码选择其对草甘膦抑制的抗性的EPSPS酶的序列。
本发明的事件中的基因构建体包含甘蔗泛素启动子和内含子的DNA分子，与该DNA分子可操作连接的编码玉米乙酰羟基酸合酶(acetohydroxyacid synthase，AHAS)转运肽的DNA分子，与该DNA分子可操作连接的编码球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)EPSPS GRG23ACE5的DNA分子。所述基因构建体还包含终止子序列，特别是35S CaMV转录物的终止子序列。
本发明的基因构建体的各种元件依照本领域技术人员已知且可用的常见分子生物学技术分离并可操作连接。
“泛素启动子和内含子”意指来自甘蔗(Saccharum officinarum L.)的泛素-4基因的5’非编码区的、来自甘蔗泛素-4基因的启动子和来自甘蔗泛素-4基因的内含子，如披露于Albert和Wei(美国专利6,638,766)及SEQ ID NO4和5中分别列出的。
“玉米AHAS叶绿素转运肽”指源自玉蜀黍(Zea mays L.,maize)乙酰羟基酸合酶(AHAS)基因的N端转运肽序列，如披露于Fang等(1992)及SEQ ID NO6中列出的。
“球形节杆菌epspsgrg23ace5”(Arthrobacter globiformis epspsgrg23ace5)意指如WO2008/100353的SEQ ID NO28中列出的核苷酸序列(SEQ ID NO7)。
“35CaMV终止子序列”指终止mRNA转录并诱导多聚腺苷酸化的来自花椰菜花叶病毒的非编码3'端，如披露于Gardner等(1981)和SEQ ID NO8中列 出的。
“植物转化”和经转化植物的选择在本领域中广泛披露，且更具体的是玉米转化。用于玉米转化和育种的技术现在是本领域中公知的，且特别披露于实验室笔记本和手册，诸如“Transgenic Plants:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)”(LeandroHumana Press Inc.,2005),“Heterosis and Hybrid Seed Productionin Agronomic Crops”(Amarjit Basra,The Harwoth Press Inc.,1999)及“The MaizeHandbook”(Michael Freeling and Virginia Walbot,Springer Lab Manuals,1994)。更具体地，用包含转化载体的土壤杆菌介导的转化(Hiei和Komari,1997,US Patent5591616)实施玉米转化。
用基因构建体转化植物一般包括下列步骤:
a)用含有包含基因构建体的转化载体的根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株接种植物细胞;
b)选择已经将本发明的基因构建体整合入其基因组中的植物细胞;
c)从选择的植物细胞再生能育植物；
d)对再生植物传粉，并
e)选择对高剂量草甘膦耐受性的后代植物，然后
f)选择已经稳定整合一个独特拷贝的本发明基因构建体的植物。
“转化载体”意指包含基因构建体和别的DNA元件的DNA分子，所述别的DNA元件容许对植物细胞导入基因构建体及所述基因构建体对植物细胞基因组的整合。转化是一种土壤杆菌介导的转化，其中转化载体包含在要插入的基因构建体侧翼的来自根癌土壤杆菌的T-DNA质粒的右侧和左侧边界。此类转化载体是本领域中完全公开且植物分子和细胞生物学及植物转化领域的技术人员容易得到的。
“来自根癌土壤杆菌的T-DNA质粒的右侧和左侧边界”是来自Ti质粒的右侧和左侧边界序列的DNA序列，并且是植物转化领域中公知且公开的。更特别地，右侧边界(RB)序列用作T-DNA从根癌土壤杆菌转移至植物基因组的启动点，特别地，它是源自质粒pTiT37的胭脂碱型T-DNA的右侧边界序列(Depicker等1982;Komari等,1996)。左侧边界(LB)序列限定T-DNA从根癌土壤杆菌转移至植物基因组的终止点，特别地，它是来自Ti质粒pTiC58的左侧边界序列(Komari等,1996;Otten等,1999)。
“经转化的植物”意指已经将基因构建体整合入其基因组中的植物，所述 基因构建体侧翼有来自根癌土壤杆菌的T-DNA质粒的右侧和左侧边界序列的全部或片段。经转化的植物的所有细胞已经将基因构建体整合入其基因组中。经转化的植物是能育植物，且更具体的是与未转化的相同植物相比农艺学特性(产量、谷物质量、干旱耐受性等)不受损害的植物。
“插入DNA”是侧翼有RB和LB序列并且在特定基因座处在植物基因组中插入的基因构建体。
事件以玉蜀黍(玉米)基因组中特定基因座处本发明的插入T-DNA的稳定整合限定。
插入限定两个独特的交接DNA序列，其中插入T-DNA序列连接侧翼玉米基因组序列。通过参照插入T-DNA，存在有插入T-DNA的5'部分中定位的5’交接DNA和插入T-DNA的3'部分中定位的3’交接DNA。事件VCO-1981-5交接DNA(或所谓的“事件VCO-1981-5DNA”)的非限制性例子在SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3中列出。
术语“事件”指包含异源DNA的初始转化植物和经转化植物的后代。术语“事件”还指在于后代包含异源DNA的通过经转化植物与另一品种之间的有性异型杂交产生的后代。
术语“事件”还指通过包含插入DNA和相邻侧翼基因组序列的供体近交系(初始转化系和后代)和不含所述插入DNA的接受近交系(或轮回系)之间的有性回交产生的后代。在重复回交后，插入DNA在接受系中存在于与在供体系中相同的基因组中基因座。
术语VCO-1981-5的“事件”或事件序列也指来自初始转化植物的插入DNA，其包含会从供体系转移至接受系的部分或整个插入DNA和相邻侧翼基因组序列。
会将最后一次回交后代自交以生成后代，其在渐渗的插入DNA方面是纯合的。
然后，这些后代会用作近交亲本系以生成杂种。
可以如下育种草甘膦耐受性玉蜀黍(玉米)VCO-1981-5(又称作6981玉蜀黍(玉米))，即首先有性杂交由从转基因玉蜀黍(玉米)植物VCO-1981-5(又称作6981玉蜀黍(玉米))(耐受草甘膦除草剂应用的源自用本发明表达盒转化的以登录号41842保藏于NCIMB的代表性种子及其后代)种植的玉蜀黍(玉米)植物组成的供体亲本玉蜀黍(玉米)植物，和缺乏对草甘膦除草剂的耐受性的 接受亲本玉蜀黍(玉米)植物，由此生成多个第一后代植物;然后，选择对草甘膦除草剂应用有耐受性的第一后代植物;并自交第一后代植物，由此生成多个第二后代植物;然后，从第二后代植物选择草甘膦除草剂耐受性植物。这些步骤可以进一步包括第一草甘膦耐受性后代植物或第二草甘膦耐受性后代植物与接受亲本(或轮回)玉蜀黍(玉米)植物或第三亲本玉蜀黍(玉米)植物的回交，由此生成耐受草甘膦除草剂应用的玉蜀黍(玉米)植物。
用于生成杂种玉蜀黍(玉米)种子的方法是本领域中公知的。该方法包括将包含由GEMSTAR,rue Limagrain,BP-1,63720Chappes,FRANCE在2011年5月13日以登录号41842保藏于NCIMB的VCO-1981-5事件的植物，或包含VCO-1981-5事件的所述植物后代与不同玉蜀黍(玉米)植物杂交，并收获包含VCO-1981-5事件的所得杂种玉蜀黍(玉米)种子。
还应当理解，也可以杂交两种不同转基因植物以生成含有两种或更多种独立分离的添加的转基因的后代。用于生成在其遗传物质中含有两种或更多种转基因的玉蜀黍(玉米)植物的方法，其中该方法包括将包含以登录号41842保藏于NCIMB的VCO-1981-5事件的玉蜀黍(玉米)植物或包含VCO-1981-5事件的所述植物后代与包含至少一种转基因的第二玉蜀黍(玉米)植物杂交，使得源自杂交的后代的遗传物质含有与调节元件可操作连接的转基因，且其中转基因选自下组：雄性不育，雄性能育、昆虫抗性、疾病抗性和水应激耐受性和除草剂抗性(其中转基因赋予对选自下组的除草剂的抗性：咪唑啉酮(imidazolinone)、磺酰脲(sulfonylurea)、草甘膦、草丁磷(glufosinate))。
合适后代的自交可以生成在两种添加的外来基因方面都是纯合的植物。会使用包含两种或更多种转基因的所述玉蜀黍(玉米)植物来生成杂种玉蜀黍(玉米)种子，其中方法包括杂交所述玉蜀黍(玉米)植物与不用玉蜀黍(玉米)植物，并收获包含两种或更多种转基因的所得杂种玉蜀黍(玉米)种子。
也涵盖与亲本植物回交和与非转基因植物的异型杂交。通常用于不同性状和作物的其它育种方法的描述可以参见几篇参考文献之一，例如A.Hallauer and J.B.Mirandain Quantitative genetics in maize breeding.(第2版,Iowa State Universitypress)及R.Bernardo于Breeding for quantitative traits in plants(Stemmapress.com)。
术语“事件”还指通过自包含以登录号41842保藏于NCIMB的 VCO-1981-5事件的玉蜀黍(玉米)植物或包含VCO-1981-5事件的所述植物后代的营养生殖产生的玉蜀黍(玉米)植物。营养生殖可以从植物部分如例如细胞、组织诸如叶、花粉、胚、根、根尖、花药、穗丝(silk)、花、籽粒(kernel)、穗(ear)、玉米穗轴(cob)、壳(husk)、茎(stalk)、或从所述植物部分启动的组织培养物启动。
术语事件关注草甘膦耐受性玉米，该草甘膦耐受性玉米在其基因组中包含与SEQID NO1或SEQ ID NO2或SEQ ID NO3至少95%，优选至少96,97,98,或99%相同的核苷酸序列。
本发明还关注包含SEQIDNO1或SEQIDNO2或SEQIDNO3并且具有25个核苷酸至5092个核苷酸的任何长度的多核苷酸序列。
特别地，本发明关注事件VCO-1981-5特异的多核苷酸序列SEQIDNO1、SEQIDNO2和SEQIDNO3。这些多核苷酸序列适合于选择性鉴定不同生物学样品中的事件VCO-1981-5。生物学样品应当理解为植物、植物部分或植物材料，诸如细胞、组织如叶、花粉、胚、根、根尖、花药、穗丝、花、籽粒、穗、玉米穗轴、壳、茎或种子。它还应当理解为包含或源自植物部分或植物材料的加工产物。
用于检测植物基因组中特定DNA元件的存在或缺乏的方法是本领域中公知的。主要技术包括用容许扩增DNA序列的特异性引物进行的DNA序列扩增，特别是用聚合酶链式反应，及用对DNA序列特异性的探针进行的杂交。
本发明包括用于鉴定本发明的转化事件VCO-1981-5的存在或缺乏的方法，特别是用已知技术之一进行。
在本发明的一个特定的实施方案中，所述方法包括下列步骤：
a)从获自玉蜀黍(玉米)植物、组织或细胞的生物学材料提取DNA;
b)使所述提取的DNA与合适长度的第一和第二引物接触，所述合适长度选择为容许生成包含整个或部分VCO-1981-5事件序列的扩增子DNA分子;
c)实施扩增反应以生成扩增子DNA分子，并
d)检测扩增子分子中包含整个或部分VCO-1981-5事件序列的核苷酸序列的存在或缺乏。
一般地，引物包含或具有由10-30个核苷酸构成(comprised)的长度，并且依照分子生物学领域技术人员公知的技术选择和制备。
在本发明的一个具体的实施方案中，包含整个或部分VCO-1981-5事件序列的扩增子分子包含SEQ ID NO1中列出的事件交接序列和/或SEQ ID NO2中列出的事件交接序列和/或与SEQIDNO1或SEQIDNO2至少95%，优选至少96,97,98,或99%相同的序列。
有利地，第一和第二引物包含与SEQ ID NO3中列出的事件序列的序列片段同源的序列，并且选择为在事件VCO-1981-5序列侧翼且生成包含SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中列出的DNA序列的扩增子。
优选的引物包含SEQ ID NO11和SEQ ID NO12中列出的DNA序列。
在本发明的另一个实施方案中，所述方法包括下列步骤：
a)从获自玉蜀黍(玉米)植物、组织或细胞的生物学材料提取DNA;
b)使所述提取的DNA与探针接触，所述探针具有足以在严格条件下与特异性检测至少一种VCO-1981-5交接序列的核苷酸序列杂交的长度;
c)使提取的DNA和探针受到严格杂交条件处理，并
d)检测所述探针与提取的DNA的杂交，其中检出指示事件VCO-1981-5序列的存在。
本发明还关注用于生成草甘膦耐受性植物的方法，其包括育种包含事件VCO-1981-5序列的本发明植物，并通过检测事件VCO-1981-5序列的存在(特别是用本发明的检测方法)来选择后代。
“扩增子”指通过用核苷酸模板序列中包含的靶核苷酸序列的特异性引物对扩增获得的产物。
用于鉴定玉米基因组中特定DNA或扩增子序列的存在或缺乏的引物、探针和方法是本领域中公知的，特别是披露于EP1167531的段落[0027]至[0043](其通过提及并入本文)，及本文中引用的出版物。
严格条件定义如下。对于包含超过30个碱基的序列，Tm通过以如下的等式限定：Tm=81.5+0.41(%G+C)+16.6Log(阳离子浓度)–0.63(%甲酰胺)–(600/碱基数目)(Sambrook等,1989)。
对于短于30个碱基的序列，Tm以如下的等式限定：Tm=4(G+C)+2(A+T)。
在非特异性(无特异性)序列不杂交的合适严格性条件下，杂交温度是比Tm低约5-30℃，优选地5-10℃，并且使用的杂交缓冲液优选是较高离子力的溶液，如例如溶液6倍SSC。
本发明还关注用于检测生物学样品中本发明的VCO-1981-5事件的存在或缺乏的试剂盒，其中其包含扩增包含事件VCO-1981-5DNA序列的多核苷酸序列或与该多核苷酸序列杂交的引物和/或探针。
特别地，本发明包括10至30个核苷酸的第一引物和10至30个核苷酸的第二引物，所述第一引物包含与SEQ ID NO3的序列片段同源的序列，所述第二引物包含与SEQ ID NO3的序列片段具有互补性的序列，所述第一和第二引物在事件VCO-1981-5DNA序列侧翼，并且声称包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的扩增子分子。
特别地，所述第一和第二引物包含SEQ ID NO11和SEQ ID NO12中分别列出的序列。
本发明还关注分离的核苷酸序列，其包含SEQ ID NO11和/或SEQ ID NO12中列出的序列，或基本上由该序列组成。
本发明还关注分离的核苷酸序列，其包含SEQ ID NO1和/或SEQ ID NO2中列出的序列，特别地包含SEQ ID NO3中列出的序列或其片段和/或与SEQIDNO1或SEQIDNO2或SEQIDNO3至少95%，优选地至少96,97,98,或99%相同的序列,或者基本上由SEQ ID NO3中列出的序列或其片段和/或与SEQIDNO1或SEQIDNO2或SEQIDNO3至少95%，优选地至少96,97,98,或99%相同的序列组成。
用于基因构建的技术及使用扩增技术诸如PCR或杂交技术进行基因鉴定的技术是本领域中公知的，且具体披露于实验室笔记本和手册，诸如Sambrook和Russel(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.)。
附图简述
图1代表转化载体pAG3541。
图2代表选择事件VCO-1981-5的示意图。
图3描绘了事件VCO-1981-5的育种图示。
图4代表T-DNA区内的EPSPS GRG23ACE5表达盒。
图5代表后续世代(following generation)(对于B110和B109杂交)和接着的4个世代(对于品系AAX3)中实施的分离分析。
实施例
缩写、首字母缩略词、和定义
I.草甘膦耐受性事件VCO-1981-5的生成
使用标准土壤杆菌介导的转化方案(Hiei和Komari,1997)生成玉米事件VCO-1981-5。土壤杆菌含有肿瘤诱导(Ti)质粒，其包括毒力(vir)基因和转移-DNA(T-DNA)区。可以将感兴趣的基因插入T-DNA区中，然后转移至植物核基因组中。肿瘤诱导基因缺失的Ti质粒的使用通常称为解除的(disarmed)土壤杆菌介导的植物转化。受伤的植物细胞生成酚防御化合物，其触发土壤杆菌vir基因的表达。编码的毒力(Vir)蛋白加工来自Ti质粒的T-DNA区，生成“T-链”。在细菌附着于植物细胞后，T-链和几类Vir蛋白经由转运通道转移至植物。在植物细胞内部，Vir蛋白与T-链相互作用，形成T-复合物。此复合物靶向细胞核，容许T-DNA整合入植物基因组中并表达编码的基因(Gelvin,2005)。
接受生物体是dent型的玉蜀黍，其属于科禾本科(Gramineae)的属玉蜀黍属(Hi-II原液材料)。此材料以两种分开的品系Hi-IIA和Hi-IIB形式供应。然后，将这些品系杂交，并使用所得的胚作为转化用的靶组织。Hi-IIA和Hi-IIB是对玉米近交系A188和B73之间的杂交选择的部分近交系。作为接受生物体，通过杂交从Maize Genetics COOP StockCenter(Urbana,IL,USA)获得的部分近交系Hi-IIA和Hi-IIB生成玉蜀黍的杂种Hi-II。通过与未成熟的玉米胚共培养(在黑暗中于22℃持续约72小时)使用土壤杆菌对杂种Hi-II导入转化载体pAG3541中的T-DNA区。在作为选择剂的含有草甘膦的培养基上选择经转化的愈伤组织。组织培养基中包含抗生素特美汀(timentin)(200ppm)以从转化后的愈伤组织消除土壤杆菌细胞(Cheng等,1998)。
使用转化载体pAG3541(图1)将epsps grg23ace5表达盒转移至玉蜀黍。仅分别存在于右侧和左侧边界(RB和LB)序列之间的T-DNA被整合入玉米基因组中。T-DNA边界外部的DNA区没有转移。在这些边界外部，细菌抗生素抗性标志物基因是土壤杆菌细胞中载体的引入和维持需要的。vir基因是生成T-DNA转移复合物需要的(De la Riva等,1998)。
在T0中生成的100个事件中，经由草甘膦耐受性和农艺学性能，如萌发、营养特征(诸如植物高度、谷粒重量)和生殖特征(诸如50%花粉脱落前天数、50%吐丝(silking)前天数、产量)的多项评估田间试验选择VCO-1981-5事件。
图2上提供了选择事件VCO-1981-5的示意图。
还基于插入物的唯一性和完整性及基因组插入基因座的稳定性及其遗传力对事件VCO-1981-5选择良好分子特征。
更具体地，对事件VCO-1981-5选择其低变应原性风险水平。已经在T-DNA和玉米基因组之间的交接处鉴定12个通过在基因组中插入T-DNA创建的可读框(ORF)。对于此分析，我们认为ORF是两个终止密码子间的任何潜在的编码区，如由欧洲食品安全局(European Food safety Authority，EFSA)限定的。首先实施ORF的生物分析，接着使用80个氨基酸(AA)滑动窗和8AA精确匹配分析确定的ORF中的推定变应原性基序。依照CodexAlimentarius(2003)并使用2011年2月的AllergenOnline数据库第11版(http://www.allergenonline.org/databasefasta.shtml)实施分析。使用80AA滑动窗鉴定两个潜在的命中，但是高度不可能的是鉴定的遗传序列会生成可翻译的mRNA序列，且由于这些序列从天然玉蜀黍基因组鉴定，对变应原性风险 评估没有影响。最后，事件VCO-1981-5由于其在含有良好重组率的基因组区域中的有利位置而选择。此特征对于会进一步使用所述事件的转化程序是尤其重要的。
图3描绘了事件VCO-1981-5的育种图示。
II.供体基因和调节序列
A.转化载体图谱
使用质粒pAG3541通过解除的土壤杆菌介导的转化生成事件VCO-1981-5。此转化载体含有T-DNA区内的epsps grg23ace5表达盒(图4)。
B.关于基因和调节序列的描述
生成包含玉米叶绿体转运肽(乙酰羟基酸合酶)(Fang等,1992)和编码EPSPSGRG23ACE5酶的基因的合成编码区序列。将合成基因在来自甘蔗的泛素-4启动子(Albert和Wei,2003)下游且在花椰菜花叶病毒的终止子35S(Gardneret等,1981)上游亚克隆以创建质粒pAX3541。使用三亲本杂交及在含有壮观霉素、链霉素、四环素和利福平的培养基上铺板将来自此中间质粒(基于pSB11,Japan Tobacco,Inc.(Hiei and Komari,1997))的启动子::基因::终止子片段移入根癌土壤杆菌菌株LBA4404(其也含有质粒pSB1)中，以形成最终质粒pAG3541。包括利福平作为土壤杆菌的额外选择，因为利福平抗性标志物基因存在于土壤杆菌染色体DNA中。通过Southern杂交确认pSB1和pAX3541-质粒pAG3541的共整合产物的完整性。
使用产生本文中描述且在事件VCO-1981-5中表达的EPSPS GRG23ACE5蛋白的定向进化技术改变自球形节杆菌分离的野生型EPSPS的氨基酸序列。下文显示了EPSPSGRG23ACE5蛋白的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO23)。
metdrlvipg sksitnrall laaaakgtsv lvrplvsadt safktaiqal ganvsadgdd
wvveglgqap nldadiwced agtvarflpp fvaagqgkft vdgseqlrrr plrpvvdgir
hlgarvsseq lpltieasgl aggeyeieah qssqfasgli maapyarqgl rvkipnpvsq
pyltmtlrmm rdfgietstd gatvsvppgr ytarryeiep dastasyfaa asavsgrrfe
fqglgtdsiq gdtsffnvlg rlgaevhwas nsvtirgper ltgdievdmg eisdtfmtla
aiapladgpi titnigharl kesdrisame snlrtlgvqt dvghdwmriy pstphggrvn
chrdhriama fsilglrvdg itlddpqcvg ktfpgffdyl grlfpekalt lpg
III.转基因拷贝数分析
将玉米基因组DNA分离(Dellaporta等,1983)，并通过荧光法(fluorimetry)量化。依照标准规程(Sambrook等,1989)实施DNA限制、凝胶电泳、Southern印迹和与放射性标记的探针杂交。将总基因组DNA从事件VCO-1981-5纯化，并用合适的限制性内切核酸酶消化以测定插入物拷贝数目和插入物完整性两者。
使用标准PCR方法制备用于放射性探针合成的模板。使用对T-DNA中的启动子和终止子序列特异性的寡核苷酸引物来生成对T-DNA插入物特异性的DNA探针。使用Ready-To-Go DNA标记珠(GE Health)用32Pα-dCTP标记DNA探针。在Micro Bio-Spin P-30Tris-层析柱(BioRad)里纯化经标记的探针。于65℃实施杂交(Church,1984)。在杂交后，将印迹于65℃清洗，最终清洗含有1%(w/v)十二烷基硫酸钠(pH7.0)。于-80℃使用Kodak增光屏将印迹暴露于Kodak AR X-OMAT胶片。
将来自事件VCO-1981-5玉米、BC1阴性分离子(segregant)玉米、和B110近交玉米的基因组DNA用限制酶HindIII和NdeI(New England Biolabs,Ipswich,MA)独立消化。这些限制酶之每种在T-DNA区内切割一次。在与epsps grg23ace5基因探针杂交时，杂交产物的所得数目会指示玉米基因组内的插入物拷贝数。这两种消化物都生成单一条带，其指示存在单一拷贝的插入物。
将来自事件VCO-1981-5玉米、BC1阴性分离子玉米、和B110近交玉米的基因组DNA用HindIII和EcoRI的组合，及独立用MfeI(New England Biolabs,Ipswich,MA)消化。使用一组四种独立探针(ScUbi4启动子、ScUbi4内含子、epsps grg23ace5基因、和35S终止子)来确认表达盒结构的完整性。分析结果指示epsps grg23ace5表达盒是完整的，并且在插入DNA中以预期的次序找到并确认功能性组分。
进行Southern印迹分析以确认转移T-DNA区外部的转化质粒组分的缺乏。将玉米基因组DNA(VCO-1981-5事件和合适的阴性对照)用HindIII和EcoRI的组合，及独立地用MfeI(New England Biolabs,Ipswich,MA)消化。包括土壤杆菌质粒pAG3541作为转化质粒组分杂交的阳性对照。使用的探针设计为与质粒的功能性组分，包括aad,tetR,tetA,oriT,virC,virG,和virB的序列杂交。
Southern印迹分析结果指示载体探针无一与VCO-1981-5基因组DNA杂交，确认事件VCO-1981-5中质粒的功能性组分序列的缺乏。然而，这些相同的探针在每个印迹上确实显示与质粒载体对照的杂交，指示若载体序列转移至事件VCO-1981-5玉米是非有意的，则它们将已经在此分析中检出。
对事件VCO-1981-5后代的多个世代进行Southern印迹分析以评估T-DNA序列插入的稳定性。将自来自4个连续育种世代(BC0,BC1,BC3,和BC4)和阴性对照的VCO-1981-5植物的叶材料分离的基因组DNA用限制酶HindIII(New England Biolabs,Ipswich,MA)(如较早记录的，其在T-DNA区内切割一次)消化。在与对epsps grg23ace5基因特异性的探针杂交时，VCO-1981-5生成大小约4.0kb的单一条带。包括转化质粒pAG3541作为杂交对照。分析的所有四个世代显示了生成相同的4.0kb条带的相同杂交样式。若遗传插入物经由事件的连续育种在玉米基因组内是不稳定的，则会预期检出产生的显带样式的变化。数据指示事件VCO-1981-5中稳定的插入位点。
IV.插入物和侧翼基因组DNA的测序
Southern印迹分析已经证明了事件VCO-1981-5含有单一完整的T-DNA插入物，其含有单一表达盒。已经测定转基因基因座的序列，其包含5’和3’FST(侧翼序列标签)和插入前基因座的序列(玉米基因组中插入转基因的基因座)。
通过Genome WalkerTM(Clontech)(5’FST)和直接PCR(3’FST)获得事件VCO-1981-5中T-DNA插入侧翼的玉米基因组序列。使用生成的DNA序列，针对玉米遗传学和基因组学数据库(Lawrence等,2004)实施BLAST搜索(Altschul等,1997)。将5’和3’FST序列两者定位至染色体1。
对5’FST获得700bp且对3’FST获得700bp。酶SspI用于生成文库。使用的T-DNA特异性探针列于下文表1。
表1
引物 5'-->3'序列SEQ ID
3'FST Ace5-1 ACAGGATCGCTATGGCGTTTTCAATCC17
Ace5-2 ATGCGTCGGGAAGACCTTTCCTGGCTTC18
O39 CACCAGGGAGGAGGCAACAACAAGTAG19
5'FST Scubi-NewR AGAAAGAGTCCCGTGAGGCTACGGCAC20
Scubi2-Rev CTGGGATTTGGATGGATGAGGCAAGGAG21
Scubi1-Rev AGAGGTCGCCGCGGAGATATCGAGGAG22
可以针对玉米遗传学和基因组学数据库(http://www.maizegdb.org/)使用BLAST搜索定位插入位点。它位于染色体1中，更精确地在BAC:AC185611上。
为了确认FST结果，从通过Genome Walker策略获得的序列推出引物，并用于从Hi-II和VCO-1981-5(6981)直接扩增5’和3’FST序列。将预期的PCR产物获得并测序。发现获得的序列与从Genome Walker获得的序列相同，如此认为这是精确的。
图4上描绘了插入T-DNA、侧翼有右侧和左侧边界的本发明基因构建体和侧翼序列(SEQ ID NO9和SEQ ID NO10)的图谱。
3’侧翼序列(SEQ ID NO9)具有以下序列：
gttctcagagggagatgggcggcaagggcggcgggggtggtggcaagggcggcggcgggggtggtggcaa
gggcggaggaggttttggtggcaagagcggcggcgggggtggtggcaagggcggaggaggtgttggtggc
aagagcggcggcggcaagtcaggcggcggcggcggtgggggctatggtggtggagggaagtcaggctccg
gcggcagtggcggcgacggaatgatgaaggcgcccggcggcagtggcgagtacatctcccgctctgtctt
cgaggccagcccgcaggtgttcttccatggcctccaccagggaggaggcaacaacaagtagatccatcta
gctagactgctgctgctacttcacaagcttgggacgatgtgtgatcatgcatgcttggactggcatcagt
ctctatgtagcttctgaataaaataaaatgtaacgatgctcgattgtgtttcacttgctcgcttgtttca
gccaagttattatatatcatcaggctcgtacgtcagctatatatatatatatatatatatatatatatat
atatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatacacacacacacatat
gcaggtgcatggattgtgcaacgcgaatgtgtgattgtgctaatccgttagttgatgccgtttgttgctt
5’侧翼序列(SEQ ID NO10)具有以下序列：
tttcctcattttctttttcccgcttttgtttcaatttttcttgggtaatgtacagtgagtatattttttcttgttctttttctcatggcca
aaatccacaatggatcgatgaattagctgtcgttgttgccaacaacaacaacagaacaaaatcacgtgacgtactagc
acaatgcaagtagccaaactgagcttccgggcaccgacgaacggttgcacgccatcggcgggaaggaacaggc
cgggctgtcaatggacaaacgggccgccaagctggagggagtgtcatgggctttgagaaccatcgtcagggtcca
gtttattcttttgtttttattaaaggcggtaaactcggggaacgaatatactaggaaaaacactagccagtcagagtcag
tcaaagtggactgagttaaaattgcaacgacacacacgcagcagtcagggcgtcgggaatgaacaatggatgaatt
tattataatctgaagaaaacgaagggacacagccactacgaacactggggagtggggagtgaatgaatgaatgcat
tccactggaccgttccagcgcttcgtgtgcctcgctagatgcgctgaacactcgaacgccatggacctcgctccgct
ctctatatatagagggaaggccttcagtctactcctcgggatataccactgaacgtcaccaagaagatcagtac
另外，将事件VCO-1981-5中的整个T-DNA插入物测序并确认为与转化载体pAG3541中的T-DNA插入物相同。在转化整合过程期间，右侧和左侧边界序列通常不保持完整，并且在事件VCO-1981-5中鉴定出两者中的少量缺失。
包含整个T-DNA插入物序列和侧翼基因组序列的完整序列以SEQ ID NO3列出。
V.草甘膦耐受性性状的遗传力
在事件VCO-1981-5的性能评估期间，将含有epsps grg23ace5的基因座与3种近交系(B110,B109,AAX3)杂交。然后，用草甘膦喷雾每个品系的后代植物以鉴定遗传并表达epsps grg23ace5的植物，并评估对每个品系的分离率。如下生成测试的祖先品系，即用事件VCO-1981-5的亲本T0植物对品系B110传粉，这产生BC0品系B110x VCO-1981-5)。将这些BC0种子萌发，并将植物同时与品系B110，B109和AAX3杂交。在后续世代(对于B110和B109杂交)，及在接着的4个世代(对于品系AAX3)中实施分离分析(图5)。
在户外田间样地中以1倍、4倍或8倍喷雾率实施所有草甘膦喷雾(1倍为540g草甘膦，酸性形式/ha)。幸免于喷雾的阳性隔离子评分为“耐受的”，而阴性隔离子没有幸免于喷雾，并且评分为“敏感的”。
表2
缩写：Gen.：世代；No：植物数目；Gly.S.R.：草甘膦喷雾率；Obs.Tol：观察到的耐受性；Obs.Sens.：观察到的敏感性；Exp.Tol.：预期的耐受性；Obs.Tol：预期的敏感性；%Tol.：%耐受性。
在喷雾后2周评估所有植物。每个世代中预期分离率为1:1，因为epsps grg23ace5以单一且半合子拷贝存在于与品系B109，B110或AAX3杂交的供体亲本系中。
将观察到的分离样式与预期的样式比较，并且使用卡方(Χ2)分布如下分析比较这些数据:
Χ2=Σ[(|o–e|)2/e]，其中o=观察到的耐受性频率，而e=预期的耐受性频率。
卡方数值≥0.05在每个世代中以1:1分离的统计学支持的截留处理，并且对于每个分离分析组，超出此数值。此分析的结果与单一拷贝的epsps grg23ace5对测试的每个近交系(B110，B109，AAX3)的遗传力一致。
转化事件VCO-1981-5含有epsps grg23ace5基因的单一遗传插入，并且所述基因经由连续育种世代以可预测的孟德尔方式遗传。
VI.检测VCO-1981-5事件的方法:
本实施例描述了用于测定生物学样品中事件VCO-1981-5DNA与总玉米(玉蜀黍)DNA的相对含量的事件特异性实时定量 PCR方法。
已经优化PCR测定法以用于ABI7900序列检测系统。
对于事件VCO-1981-5基因组DNA的特异性检测，使用两种特异性引物扩增跨越玉米事件VCO-1981-5中的5’TDNA插入物和侧翼基因组交接的区域的85-bp片段。依靠用荧光染料：在其5’端的FAM作为报告染料和在其3’端的MGB分子作为淬灭剂标记的靶物特异性寡核苷酸探针在每个周期(实时)期间测量PCR产物。利用Taq DNA聚合酶的5’-核酸酶活性，其导致对探针的特异性切割，这导致升高的荧光，然后对其进行监测。
对于事件VCO-1981-5DNA的相对量化，使用一对醛缩酶基因特异性引物和用VIC和TAMRA标记的醛缩酶基因特异性探针，玉米特异性参照系统扩增醛缩酶(Kelley等，1986)(一种玉米内源序列)的70-bp片段。
在此方法中同时实施两类量化：一种用于内源基因醛缩酶，而一种用于事件VCO-1981-DNA区。 使用下列引物和探针组。
表3
醛缩酶参照基因系统的主混合物如下在表4中制备：
表4
VCO-1981-5事件的主混合物如下在表5中制备：
表5
在Applied Biosystems 7900系统中以下文对VCO-1981-5事件和醛缩酶 测定法两者列出的循环条件运行PCR。
表6
VII.评估事件VCO-1981-5的农艺学性能
为了与合适的阴性等值线相比评估事件VCO-1981-5的农艺学性能特征，生成两种实验用品种，并使用种子进行多位置评估。实验用品种是通过杂交事件VCO-1981-5(BC2S2)与两种不同品系(B116和CH01)获得的杂种玉米。使用与品系B116和CH01杂交的阴性分离子作为比较者(参见表5及关于育种图示的图3)。
表7：在农艺学评估中测试的育种杂种
在与玉米生产中使用的那些环境和生长条件相似的多种多样的环境和生长条件下表征这些杂种。使用每个位置每个条目的三个重复(样地)的随机化完全区组设计进行研究。每个样地由4个30英寸行X17.5至20英尺长组成。在达到V8叶阶段前使植物变稀，导致每行中一致的植物数目。样地外部的杂草(在通道和边界中)管理为不混淆农艺学特征的测量。通过常规除草剂的栽培实践(手动锄地)管理样地内的杂草。没有对研究或边界行应用广谱除草剂，除了作为种植前或出土前应用。在每个四行样地的中间两行收集关于所有性状的数据。表8和9中汇总了季节里收集的数据。
表8：农艺学性能结果：营养特征
表9：农艺学性能结果：生殖参数
参考文献
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由受理局填写
由国际局填写
0-5国际局收到本表格日期
0-5-1受理官员

Claims (13)

1.用于检测生物学样品中代表性种子以登录号41842保藏于NCIMB的玉蜀黍(玉米)植物事件的存在或缺乏的分离的核苷酸序列，其包含SEQ ID NO 1和/或SEQ ID NO 2和/或SEQ ID NO 3的序列。
2.权利要求1的分离的核苷酸序列，用于检测生物学样品中代表性种子以登录号41842保藏于NCIMB的玉蜀黍(玉米)植物事件的存在或缺乏，所述分离的核苷酸序列包含SEQ IDNO 1和/或SEQ ID NO 2中所列的序列。
3.权利要求1的分离的核苷酸序列，其中它由SEQ ID NO 3中所列的序列组成。
4.用于检测生物学样品中代表性种子以登录号41842保藏于NCIMB的玉蜀黍(玉米)植物事件的存在或缺乏的试剂盒，其中它包含
-引物，用10至30个核苷酸的第一引物和10至30个核苷酸的第二引物扩增包含SEQ IDNO 3的事件DNA序列的多核苷酸序列，所述第一引物包含与SEQ ID NO 3的序列片段同源的序列，所述第二引物包含与SEQ ID NO 3的序列片段具有互补性的序列片段，所述第一和所述第二引物在事件DNA序列侧翼，并且能够生成包含SEQID NO 1和/或SEQ ID NO 2的扩增子分子；或
-序列SEQ ID NO 13的探针，其与包含SEQ ID NO 3的事件DNA序列的多核苷酸杂交。
5.权利要求4的试剂盒，其中它包含10至30个核苷酸的第一引物和10至30个核苷酸的第二引物，所述第一引物包含与SEQ ID NO 3的序列片段同源的序列，所述第二引物包含与SEQ ID NO 3的序列片段具有互补性的序列片段，所述第一和所述第二引物在事件DNA序列侧翼，并且能够生成包含SEQ ID NO 1和/或SEQ ID NO 2的扩增子分子。
6.权利要求4或5中任一项的试剂盒，其中所述第一和第二引物分别由SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 12中列出的序列组成。
7.用于检测生物学样品中代表性种子以登录号41842保藏于NCIMB的玉蜀黍(玉米)植物事件的存在或缺乏的方法，其包括：
a)从生物学样品提取DNA；
b)使所述提取的DNA与包含10-30个核苷酸的长度的第一和第二引物接触，其中所述第一引物包含与SEQ ID NO 3的序列片段同源的序列，且所述第二引物包含与SEQ ID NO 3的序列片段具有互补性的序列，所述第一和所述第二引物在事件DNA序列侧翼，以生成包含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2的扩增子分子；
c)实施扩增反应以生成包含SEQ ID NO 3的事件DNA序列的扩增子分子，和
d)检测所述扩增子分子中包含事件DNA序列的核苷酸序列的存在或缺乏。
8.权利要求7的方法，其中包含事件DNA序列的所述扩增子分子包含SEQ ID NO 1。
9.权利要求7的方法，其中包含事件DNA序列的所述扩增子分子包含SEQ ID NO 2。
10.权利要求7的方法，其中所述第一和第二引物分别由SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 12中所列的序列组成。
11.用于检测生物学样品中代表性种子以登录号41842保藏于NCIMB的玉蜀黍(玉米)植物事件的存在或缺乏的方法，其包括：
a)从生物学样品提取DNA；
b)使所述提取的DNA与序列SEQ ID NO 13的探针接触以在严格条件下与特异性检测事件接合序列的核苷酸序列杂交；
c)使所述提取的DNA和探针经受严格杂交条件，和
d)检测所述探针与所述提取的DNA的杂交，其中检出指示SEQ ID NO 3的事件DNA序列的存在。
12.生成草甘膦耐受性植物的方法，其包括将包含代表性种子以登录号41842保藏于NCIMB的事件的植物育种，并通过检测包含SEQ ID NO 3的事件DNA序列的多核苷酸序列的存在来选择后代。
13.权利要求12的方法，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2和/或SEQID NO 3所列的序列。
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