CN104894165B - 一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明所提供的方法是以土曲霉Aspergillus terreus为出发菌，先通过敲除ku80基因或lig4基因提高菌株的外源DNA同源重组概率，再构建pyrG基因缺失的尿嘧啶营养缺陷型菌株，建立基于pyrG基因作为筛选标签的遗传转化系统，最后应用Cre/LoxP特异性结合位点重组系统切除筛选标签，重新获得尿嘧啶营养缺陷型菌株，可再次被用于遗传改造。本发明所提供的方法可构建高效的土曲霉基因打靶平台，具有同源重组效率高、转化体系可进行双向筛选、筛选标签切除方法简单易行、筛选标签可循环利用等优点，可以为在土曲霉中高效应用基因打靶技术进行遗传改造提供基础支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
土曲霉是一种重要的丝状真菌，能够产生多种有价值的化合物，包括有机酸、酶类、脂类以及具有生物活性的次级代谢产物。其中衣康酸和洛伐他汀已经实现工业化生产，具有很大的市场。随着分子生物学的不断发展，通过代谢工程对生产菌株进行改造，提高目标产物的生产水平，具有非常重要的意义。
基因打靶技术是现代分子生物学的一个重要研究手段，通常是指含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组发生同源重组，整合至细胞受体基因组中，在特异性靶位点上增加外源 DNA片段，或者删除靶位点之间DNA片段的技术。它可以实现基因敲除、目的基因定点过表达、基因替换和启动子替换等多种遗传改造策略。因此，基因打靶技术在功能基因组学以及菌株的基因工程改造研究中发挥着至关重要的作用。随着大量组学数据的不断公布，功能基因组学研究以及基因工程改造往往涉及到多基因、多位点，而且还会用到多种研究策略。因此一种高效的遗传操作平台将可以为土曲霉功能基因组学研究以及菌株基因工程改造提供很大的便利。
在丝状真菌中DNA双链断裂修复主要依靠非同源末端连接途径(Non-homologousEnd Joining，NHEJ)，从而导致外源DNA主要以随机插入方式整合到基因组上，同源重组效率低下，使得基因打靶技术的应用受到了严重制约。
筛选标签是遗传操作过程中所需要的一种重要元件，外源DNA需要与筛选标签一起整合到基因组上，然后再通过筛选标签的表型被筛选出来。而在土曲霉中可用的筛选标签非常少，无法满足对多基因、多位点进行遗传改造的需求。位点特异性重组系统是一种重要的分子遗传操作工具，在多种原核生物和真核生物中都成功应用于筛选标签的切除。其原理是重组酶识别并结合到具有特殊DNA序列的靶位点上，催化重组反应，使得位于靶位点之间的 DNA片段被剔除。常用的位点特异性重组系统有Cre/loxP系统、β-rec/six系统和Flp/FRT系统，但在传统应用过程中需要以穿梭质粒形式或基因组整合形式向细胞中导入重组酶表达元件，通过在细胞内表达出重组酶作用于识别位点对筛选标签进行切除。pyrG(乳清苷-5-磷酸脱羧酶基因)是一种与尿嘧啶营养缺陷型菌株搭配使用的营养选择型标签，基于pryG作为筛选标签的转化系统具有双向筛选功能的特征，筛选标签存在与否都可以通过相应的筛选培养基进行筛选。因此搭配位点特异性重组系统使用，会使得筛选标签的剔除更加高效、易行。
发明内容
为解决土曲霉菌种的同源重组能力低，筛选标签数量少导致基因打靶技术在土曲霉遗传改造领域中应用受到限制的技术问题，本发明提供了一种用于提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法，所采取的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种用于提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法，该方法是以土曲霉Aspergillus terreus为出发菌，先通过敲除ku80基因或lig4基因提高外源DNA的同源重组概率，再通过构建尿嘧啶营养缺陷型菌株建立基于pyrG基因作为筛选标签的遗传转化系统，最后以直接向细胞中导入Cre重组酶的方式利用位点特异性重组系统切除两侧带有同向 loxP序列的筛选标签，使菌株重新获得尿嘧啶营养缺陷的特征，能再次用于基于pyrG基因作为筛选标签的遗传转化，以该方式实现筛选标签的循环利用。
所述方法的步骤如下：
1)以土曲霉为出发菌，通过敲除ku80基因或lig4基因，构建外源DNA同源重组概率提高的重组菌；
2)在步骤1)所得重组菌的基础上敲除pyrG基因构建尿嘧啶营养缺陷型菌株，再以所得的尿嘧啶营养缺陷型菌株为受体菌，以两端带有loxP位点的pyrG基因表达元件(loxP-pyrG1-loxP)作为筛选标记进行回补实验验证，建立基于pyrG筛选标记和尿嘧啶营养缺陷菌株的遗传转化系统，同时获得整合有loxP-pyrG1-loxP筛选标签的重组菌；
3)利用步骤2)所得的整合有loxP-pyrG1-loxP筛选标签的重组菌，结合改良的位点特异性重组系统切除筛选标记，获得的loxP-pyrG1-loxP筛选标签被切除的尿嘧啶营养缺陷型重组菌，在该重组菌中loxP-pyrG1-loxP可以再次作为筛选标签进行再次的基因工程改造。该方式使得loxP-pyrG1-loxP筛选标签可以多次、重复被应用于菌株的基因工程改造，从而使遗传改造工作不受筛选标签数量所限制。
所述方法的步骤如下：
1)以土曲霉CICC 40205为出发菌，敲除ku80基因(或lig4基因)，构建外源DNA同源重组概率提高的重组菌At-Δku80(或At-Δlig4)；
2)构建pyrG基因的打靶元件pyrG-KO，敲除步骤1)所得重组菌At-Δku80的pyrG基因，获得pyrG基因被敲除的尿嘧啶营养缺陷型重组菌At-Δku80-ΔpyrG；
3)以曲霉的pyrG基因的表达框元件pyrG1为筛选标签构建以ku80基因上下游序列作为同源臂的打靶元件ku80-pyrG1-gfp，将打靶元件ku80-pyrG1-gfp转化入步骤2)所得的尿嘧啶营养缺陷型菌株At-Δku80-ΔpyrG中进行回补实验验证，经过培养筛选以及验证后，获得基于尿嘧啶营养缺陷型重组菌At-Δku80-ΔpyrG和pyrG1的遗传转化系统，获得整合有loxP-pyrG1-loxP筛选标记的的重组菌At-Δku80-pyrG1-loxP；
4)制备步骤3)所得重组菌At-Δku80-pyrG1-loxP的原生质体，向所得的原生质体内导入 Cre重组酶切除筛选标签pyrG1，通过筛选pyrG基因缺失菌株的方式获得pyrG1筛选标签被切除的尿嘧啶营养缺陷型土曲霉重组菌At-Δku80-ΔpyrG1-loxP。
重组菌At-Δku80-ΔpyrG1-loxP恢复了步骤2)所获得重组菌At-Δku80-ΔpyrG的尿嘧啶营养缺陷的特征，可再次作为受体菌用于基于pyrG1筛选标签的遗传转化。
优选地，步骤1)所述敲除ku80基因，是通过PCR扩增出基因ku80的上游序列U-ku80和下游序列D-ku80，通过PCR扩增ptrA筛选标记片段，通过融合PCR技术将ptrA片段分别与上游 U-ku80和下游序列D-ku80进行融合，再以融合产物为模板通过PCR分别扩增出打靶元件 ku80-A和打靶元件ku80-B，再将打靶元件ku80-A和打靶元件ku80-B转化到制备好的土曲霉原生质体中培养，最后筛选敲除ku80基因的转化子。
优选地，步骤1)所述敲除lig4基因，是通过PCR扩增出基因lig4的上游序列U-lig4和下游序列D-lig4，通过PCR扩增ptrA筛选标记片段，通过融合PCR技术将ptrA片段分别与上游U-lig4 和下游序列D-lig4进行融合，再以融合产物为模板通过PCR分别扩增出打靶元件lig4-A和打靶元件lig4-B，再将打靶元件lig4-A和打靶元件lig4-B转化到制备好的土曲霉原生质体中培养，最后筛选敲除lig4基因的转化子。
优选地，步骤2)所述构建pyrG基因的打靶元件pyrG-KO，是以土曲霉的基因组为模板，设计引物通过PCR分别扩增出pyrG基因的上游序列U-pryG和下游序列D-pyrG，通过融合PCR 将U-pryG和D-pyrG进行融合，再以融合片段为模板，通过巢式PCR扩增出pyrG基因的打靶元件pyrG-KO；
优选地，步骤3)所述构建打靶元件ku80-pyrG1-gfp，是人工合成带有两个同向loxP序列位点的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，再将该DNA片段克隆到载体pUC57simple上，获得载体PalcA-syn；以黑曲霉Co827基因组为模板，设计引物通过PCR扩增获得黑曲霉pyrG基因的表达元件，作为筛选标签pyrG1，将筛选标签pyrG1克隆到载体PalcA-syn上的两个同向loxP位点之间，获得质粒pXH103；再以pSGF957为模板，设计引物进行PCR扩增gfp-TtrpC片段，再将gfp-TtrpC表达元件连接到质粒pXH103上，获得质粒pXH104；再以土曲霉基因组为模板，设计引物通过PCR分别扩增ku80基因的下游和上游同源臂，并先后克隆到质粒pXH104上，获得质粒pXH106，再以质粒pXH106为模板，通过PCR扩增获得打靶元件ku80-pyrG1-gfp；
优选地，步骤4)所述导入Cre重组酶切除筛选标签pyrG1，是向已制备好的100μL重组菌At-Δku80-pyrG1-loxP的原生质体溶液中加入2U Cre重组酶、1μg pyrG1片段和10μL40％的 PEG4000，混合均匀后冰浴30min，加入1ml STC溶液后于30℃下孵育30min，孵育结束后与含有1.2M山梨醇，4g/L琼脂糖和2mM尿嘧啶核苷的顶层琼脂培养基混合后倾注于含有1.2 M山梨醇，1g/L 5-氟乳清酸和10mM尿嘧啶核苷的CD再生筛选培养基平板上，在30℃、黑暗条件下培养6-10天，培养结束后挑取转化子传代纯化3-5次，筛选验证后获得筛选标签pyrG1被切除的尿嘧啶营养缺陷重组菌At-Δku80-ΔpyrG1-loxP，该重组菌在CD平板上无法生长，可再次作为受体菌用于基于pyrG1筛选标签的遗传转化。
优选地，所述方法的具体步骤如下：
1)以土曲霉CICC 40205为出发菌，以质粒pPTR II为模板，以SEQ ID NO.2-SEQ IDNO.3 所示核苷酸序列为引物通过PCR扩增出ptrA片段；以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以 SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.5所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出上游序列U-ku80；以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.7所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出上游序列D-ku80；通过融合PCR将ptrA片段、上游序列U-ku80和下游序列D-ku80 进行融合，再以融合产物为模板，以如SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.9所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出打靶元件ku80-A，再以如SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.11所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出打靶元件ku80-B；再将打靶元件ku80-A和打靶元件ku80-B转化到制备好的土曲霉原生质体中培养，最后吡啶硫胺抗性筛选及基因组验证获得敲除ku80基因的重组菌 At-Δku80；
2)以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以如SEQ ID NO.12-SEQ ID NO.13所示核苷酸序列为引物，扩增pyrG基因的上游序列U-pyrG；再以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以如SEQ ID NO.14-SEQ ID NO.15所示核苷酸序列为引物，扩增pyrG基因的下游序列D-pyrG；再利用融合PCR融合上游序列U-pyrG和下游序列D-pyrG，以融合产物的序列为模板，以如SEQ ID NO.16-SEQ ID NO.17所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出pyrG基因的打靶元件 pyrG-KO，再制备步骤1)所得重组菌At-Δku80的原生质体，再将pyrG基因的打靶元件pyrG-KO 转化到原生质体内，经培养筛选后获得pyrG基因被敲除的尿嘧啶营养缺陷型菌株At-Δku80-ΔpyrG；
3)通过人工合成带有两个同向loxP序列位点的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1 所示，再将该DNA片段克隆到载体PUC57simple上，获得载体PalcA-syn；以黑曲霉Co827基因组为模板，以如SEQ ID NO.18-SEQ ID NO.19所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出黑曲霉pyrG基因的表达元件，作为筛选标签pyrG1，再将筛选标签pyrG1克隆到载体PalcA-syn上，获得质粒pXH103，获得如SEQ ID NO.26所示的两侧带有同向loxP位点序列的pyrG1筛选标签 loxP-pyrG-loxP；再以pSGF957为模板，以如SEQ ID NO.20-SEQ ID NO.21所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出NDA片段gfp-TtrpC片段，再将gfp-TtrpC片段连接到质粒pXH103上，获得质粒pXH104；再以土曲霉CICC40205基因组为模板，以如SEQ IDNO.22-SEQ ID NO.23所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80基因下游同源臂片段，再将扩增的出ku80基因下游同源臂片段连接到质粒pXH104上，获得质粒pXH105；再以土曲霉CICC40205基因组为模板，以如SEQ ID NO.24-SEQ ID NO.25所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80基因上游同源臂片段，再将扩增的出ku80基因上游同源臂片段连接到质粒pXH105上，获得质粒 pXH106；最后再以质粒pXH106为模板，以SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示序列为引物扩增出打靶元件ku80-pyrG1-gfp；再将打靶元件ku80-pyrG1-gfp转化入步骤2)所得的尿嘧啶营养缺陷型菌株At-Δku80-ΔpyrG中，经过培养筛选后获得带有loxP-pyrG1-loxP的重组菌 At-Δku80-pyrG1-loxP；从而证明成功建立了基于尿嘧啶营养缺陷重组菌和pyrG基因作为筛选标签的遗传转化系统。
4)制备步骤3)所得重组菌At-Δku80-pyrG1-loxP的原生质体，向已制备好的100μL浓度为108个/mL的原生质体溶液中加入2U Cre重组酶、1μg pyrG1片段和10μL 40％的PEG4000，混合均匀后冰浴30min，加入1ml PSTC溶液后于30℃下孵育30min，孵育结束后与含有1.2M 山梨醇，4g/L琼脂糖和2mM尿嘧啶核苷的顶层琼脂培养基混合后倾注于含有1.2M山梨醇， 1g/L 5-氟乳清酸和10mM尿嘧啶核苷的CD再生筛选培养基平板中，在30℃、黑暗条件下培养 6-10天，培养结束后挑取转化子接种到CDFU平板上于32℃下培养5-7天进行传代纯化，传代纯化3-5次后，获得pyrG1筛选标签被切除的尿嘧啶营养缺陷型重组菌At-Δku80-ΔpyrG1-loxP；从而实现筛选标签的循环利用，突破遗传改造受筛选标签数量的限制；
所述任一方法用于制备土曲霉重组菌。
所述任一方法制备的土曲霉重组菌重组菌。
表达元件：能在细胞内有效驱动目的基因转录表达的DNA片段，包括启动子、基因和终止子。
本发明有益效果：
通过本发明提供的方法进行基因打靶技术的应用，具有基因打靶效率高、筛选标签可反复使用的优点，包括同源重组效率高、转化体系可进行双向筛选、筛选标签切除方法简单易行、筛选标签可循环利用等，可以为在土曲霉中高效应用基因打靶技术进行多基因、多位点、多策略的遗传改造提供基础支持。
本发明通过在土曲霉内敲除ku80基因或lig4基因的方式提高了外源DNA与基因组发生同源重组的概率，基于尿嘧啶营养缺陷型突变株和pyrG筛选标记建立可双向筛选遗传转化系统，通过直接向细胞中导入Cre重组酶的方式利用Cre/loxP位点特异性重组系统实现特定筛选标签的高效切除，从而建立了一个同源重组高效的、改造不受筛选标签数量限制的高效基因打靶平台。
本发明首次在土曲霉中通过敲除ku80或lig4的方式提高外源DNA同源重组效率，针对野生型菌株中基因敲除效率低(只有约10％)，本发明采用split-marker方法对ku80或lig4进行敲除，敲除成功率达到50％。采用位点特异性重组系统切除筛选标签的传统方法主要有两种：一种是将重组酶基因的表达元件克隆到可在宿主中自主复制的质粒上，并转化到宿主中，通过在宿主体内表达重组酶对位于特异性识别位点间的筛选标签进行切除，随后再通过反复传代筛选使质粒随机丢失；第二种方法是将重组酶基因的诱导型表达元件与筛选标签串联并在两侧加上同向特异性识别位点，然后转化、整合到宿主菌染色体上，通过合适的诱导条件诱导重组酶在体内表达，对位于特异性识别位点内的筛选标签及重组酶表达元件进行切除。这两种传统方法实施过程复杂，条件苛刻，例如异源的重组酶基因是否表达以及表达活性都是未知的。第一种方法需要一种在曲霉中非常少见的自主复制质粒以及一个额外的抗性筛选标签，而且后期的质粒丢失偶然因素大；第二种方法则需要一种优秀的诱导型启动子，而这种启动子在曲霉中很少见，上述因素限制了通过位点特异性重组系统切除曲霉内的筛选标签。
本发明首次在土曲霉中通过位点特异性重组系统实现筛选标签的切除，而且是通过将Cre 重组酶直接导入至细胞内进行筛选标签的切除，使用的筛选标签是可双向筛选的pyrG基因，过程相对简单，不需要构建重组酶基因表达元件，不需要土曲霉自主复制质粒和诱导型启动子，不需要经历质粒丢失过程。本发明实施例涉及的基于pyrG基因的转化体系中，尿嘧啶营养缺陷型菌株是通过pyrG完全敲除的方式获得，相对于诱变方法获得的菌株而言遗传稳定性更好。Sc筛选标签的筛选体系中需要硒酸盐作为筛选药物，而硒酸盐在使用过程中对实验人员有安全隐患，作为剧毒药品受到管制，购买十分困难，丝状真菌中目前只有在米曲霉中成功建立了基于sC的遗传转化系统；硝酸还原酶niaD筛选标签的筛选体系中也要使用高浓度的氯酸盐，制备过程麻烦，而且niaD营养缺陷型菌株的自发回复概率高，筛选过程中假阳性高；相对而言，pyrG筛选标记筛选过程简单，涉及的药品5-氟乳清酸、尿嘧啶或尿苷酸容易购买且价格便宜。但是并非是所有物种中都成功建立了基于pyrG筛选标签的转化系统，而且同一物种中的不同菌株在建立该遗传转化系统时也难度不一，例如研究人员发现很多米曲霉菌株无法获得pyrG基因失活缺陷型菌株，因而只在少数几株米曲霉菌株中成功建立了该遗传转化系统。
附图说明
图1为实施例1提供的土曲霉pdc基因敲除原理示意图。
图2为敲除土曲霉CICC40205菌株pdc基因所得转化子的基因组PCR验证；
(图A为引物hph-F/hph-R验证结果，图B为引物Updc-F/hph-R验证结果，图C为引物hph-F/Dpdc-R验证结果，图D为引物pdc-F/pdc-R验证结果；M为1kb DNA ladder(TAKARA),M2为200bp DNA ladder(TAKARA)，C是CICC40205野生型菌株作为对照，1-20为所获得转化子)。
图3为敲除ku80基因的打靶元件及其发生同源重组敲除ku80基因的示意图；
(F1是引物Uku80-F，F2是引物Cku80-F，F3是引物PtrA-F，F4是引物ptrA-F171，R1是引物Dku80-R，R2是引物Cku80-R，R3是引物ptrA-R，R4是引物ptrA-R744，F5是引物 ku80-probe-F，R5是引物ku80-probe-R)。
图4为敲除ku80基因所获转化子的基因组PCR验证结果图；
(图A为引物ptrA-F/ptrA-R(F3/R3)验证结果，图B为引物Uku80-F/ptrA-R(F1/R3)验证结果，图C为引物ptrA-F/Dku80-R(F3/R1)验证结果，图D为引物ku80-probe-F/ku80-probe-R(F5/R5) 验证结果；M为1kb DNA ladder(TAKARA),M2为200bp DNA ladder(TAKARA),C是 CICC40205野生型菌株作为对照，1-4为所获得转化子)。
图5为敲除lig4基因的打靶元件及其发生同源重组敲除lig4基因的示意图。
图6为本发明实施例提供的敲除lig4基因工程菌株的基因组PCR验证结果；
(图A为引物ptrA-F/ptrA-R验证结果，图B为引物Ulig4-F/ptrA-R验证结果，图C为引物ptrA-F/Dlig4-R验证结果，图D为引物lig4-F/lig4-R验证结果；M为1kb DNA ladder(TAKARA),M2为200bp DNA ladder(TAKARA),C是CICC40205野生型菌株作为对照，Δlig4为敲除了lig4的转化子At-Δlig4)。
图7为在工程菌株At-Δku80中敲除pdc基因所得转化子的基因组PCR验证结果；
(其中，图A为引物hph-F/hph-R验证结果，图B为引物Updc-F/hph-R验证结果，图C为引物hph-F/Dpdc-R验证结果，图D为引物pdc-F/pdc-R验证结果；M为1kb DNA ladder(TAKARA),M2为200bp DNA ladder(TAKARA)，C是工程菌株At-Δku80作为对照，1-19 为所获得转化子)。
图8为在工程菌株At-Δlig4中敲除pdc基因所得转化子的基因组PCR验证结果；
(其中，图A为引物hph-F/hph-R验证结果，图B为引物Updc-F/hph-R验证结果，图C为引物hph-F/Dpdc-R验证结果，图D为引物pdc-F/pdc-R验证结果；M为1kb DNA ladder(TAKARA),M2为DL2000DNA ladder(TAKARA)，C是工程菌株At-Δlig4作为对照，1-19 为所获得转化子)。
图9为敲除土曲霉pyrG基因原理示意图；
(其中，pdc为待敲除基因，Up是上游同源臂U-pyrG，Down是下游同源臂D-pyrG,箭头为引物设计位点)。
图10为敲除土曲霉pyrG基因所得转化子的基因组PCR验证结果；
(其中，图A为引物hph-F/DpyrG-R验证结果，图B为引物C-F4/C-R验证结果，图C为引物S-pyrG-F/S-pyrG-R验证结果；M为200bp DNA ladder(TAKARA)，Δku80是工程菌株At-Δku80作为对照，1#、2#为敲除pyrG基因的得转化子)。
图11为质粒PalcA-syn的结构示意图。
图12为回补元件ku80-pyrG1-gfp及其与ku80位点定点整合原理示意图；
(其中，ku80-UP、ku80-Dw分别为ku80基因的上下游同源臂，pyrG1为作为筛选标记的来自黑曲霉pyrG基因表达元件(包括启动子、pyrG基因编码区和终止子)，箭头为引物设计位点)。
图13为ku80-pyrG1-gfp元件回补尿嘧啶营养缺陷型菌株At-Δku80-ΔpyrG所获得转化子的基因组PCR验证结果；
(其中，图A为引物Uku80-F/pyrG1-R验证结果，图B为引物pyrG1-F/pyrG1-R验证结果，图C为引物pyrG1-F/TtrpC-R验证结果，图D为引物pyrG1-F/Dku80-R验证结果；M为1kbDNA ladder(TAKARA)，M2为200bp DNA ladder(TAKARA)，C是工程菌株At-Δku80-ΔpyrG作为对照，1-6为回补实验所获得转化子)。
图14为直接导入Cre重组酶切除pyrG1筛选标记所得转化子的基因组PCR验证图；
(M为1kb DNA ladder(TAKARA)，C是工程菌株At-Δku80-pyrG1-loxP作为对照，1-8为回补实验所获得转化子)。
图15为切除了pyrG1筛选标签工程菌株At-Δku80-ΔpyrG1-loxP的DNA测序结果；
(其中，ku80-UP为ku80基因上游同源臂，loxP为Cre重组酶特异性识别的loxP序列，PalcA 为PalcA启动子序列，在工程菌株At-Δku80-pyrG1-loxP中pyrG1本位于ku80-UP和PalcA序列之间)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
本发明中质粒提取采用OMEGA公司Plasmid Mini Kit I试剂盒(D6942-01),DNA片段回收是采用OMEGA公司Cycle-Pure Kit试剂盒(D6492-01),凝胶回收是采用OMEGA公司Gel Extraction Kit试剂盒(D2500-01)。
CD平板的组成为：3g/L NaNO3，2g/L KCl，1g/L KH2PO4，0.5g/L MgSO4·7H2O，0.02g/L FeSO4·7H2O，10g/L葡萄糖，琼脂糖。
IPM液体培养基：60g/L葡萄糖，2g/L NH4NO3，20mg/L NH4HPO4，20mg/L FeSO4，0.4g/L MgSO4，4.4mg/L ZnSO4，0.5g/L玉米浆，pH 3.5。
实施例1分析土曲霉CICC40205野生型菌株中外源DNA同源重组整合概率
1.1构建土曲霉丙酮酸脱羧酶基因pdc(ATET_04633)打靶元件
根据土曲霉NIH2624基因组数据库公布的信息设计引物Updc-F(5’-agagggtggtatcattccgttg-3’)、Updc-R(5’-ctttacgcttgcgatcccgaacccctgagtgagaaggaacatg-3’)、 Dpdc-F(5’-cctgggttcgcaaagataattgatccgaaacaacctcaacccg-3’)、Dpdc-R(5’- cgaggtgtgcgcaacaggcatgaatg-3’)，以土曲霉菌株CICC40205的基因组为模板，采用pfu DNA 聚合酶(Fermentas,Catalog No.:EP0501)进行PCR扩增，用引物Updc-F/Updc-R可以扩增获得大小约为1.9kb的pdc基因的上游序列U-pdc，用引物Dpdc-F/Dpdc-R可以扩增获得大小为2.1kb的pdc基因下游序列D-pdc。以pSGF957为模板，用引物hph-F (5’-TTCGGGATCGCAAGCGTAAAG-3’)和hph-R(5’-CAATTATCTTTGCGAACCCAGG-3’) 进行PCR扩增，获得大小约为2.2kb的潮霉素抗性筛选标记hph。将所有PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回收纯化。用融合PCR的方法将U-pdc片段、D-pdc片段和 hph片段进行融合，并以该融合PCR的产物作为模板，以Cpdc-F(5’-tcgcttccaacaacactcattcc-3’) 和Cpdc-R(5’-tgtcgttggccgtccatcctag-3’)作为引物扩增获得大小约为6.1kb的pdc基因敲除元件pdc-KO片段(如图1，其中hph是筛选标记潮霉素抗性基因，pdc为待敲除基因，Up 是上游同源臂U-pdc，Down是下游同源臂D-pdc；箭头为引物设计位点)。
1.2原生质体制备
将土曲霉CICC40205的孢子接种至50mL液体IPM培养基中，使孢子浓度约为107个/mL，在200rmp、32℃培养12-18h。用无菌单层500目尼龙布过滤收集长出的菌丝，并用灭菌的0.6M MgSO4溶液冲洗三次，压干后置于无菌的50ml三角瓶中；按称取1g菌丝，加入10ml酶解液，在30℃、60rpm处理1-3h。酶解液成分为：0.8％纤维素酶(Sigma， Catalog No.：C1184)、0.8％裂解酶(Sigma，Catalog NO.：L1412)、0.4％蜗牛酶(上海生工， Catalog No.：SB0870)、0.6M MgSO4，经由0.22μm的无菌过滤器过滤除菌。将上述酶解后的混合液先用8层擦镜纸过滤，收集滤液。4℃、4000rpm离心收集原生质体，用预冷1.0M 山梨醇溶液洗涤一次，再用预冷的STC(STC为1.0M山梨醇，50mM Tris·HCl-pH 8.0，50mM CaCl2)洗涤一次，最后把原生质体重悬于预冷的STC中，并用STC将原生质体浓度调整为 5×107个/mL，得到原生质体悬液。
1.3原生质体转化及筛选验证
向150μl上述原生质体悬液中同时加入10μl的pdc-KO(约3μg)，再加入50μl PSTC(PSTC为40％PEG4000，1.2M山梨醇，50mM Tris-HCl-pH8.0，50mM CaCl2)，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL PSTC，混匀后室温放置20min；然后与15mL上层琼脂(PDB+1.2 M山梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后48℃保温)混合后倾注于5块再生筛选培养基平板PDA-SH 上(PDA平板+1.2M山梨醇+100mg/L潮霉素B)，在30℃、黑暗条件下培养5天。
从转化筛选平板上挑取具有潮霉素抗性转化子转接至筛选平板PDA-H上(PDA平板+100 mg/L潮霉素B)，在32℃培养5天进行传代纯化，连续传代4次。选取20个转化子的孢子接种于IPM液体培养基中，30℃、200rpm培养48小时，收集菌丝提取基因组，参照图2中所示引物进行基因组PCR验证。如图2A所示所有转化子中都整合了潮霉素抗性筛选标记hph；如图2B、2C所示，只有10#和17#转化子中pdc-LKO元件是通过同源重组方式整合到了pdc 基因位点上。如图2D所示，除10#和17#之外的其他转化子都和对照菌株土曲霉CICC40205 一样扩增出了1.5kb的pdc基因内部片段，这说明这些转化子的pdc基因未被敲除。由此可知只有10#和17#转化子是外源DNA发生了同源重组，土曲霉CICC40205菌株中外源DNA 的同源重组概率为2/20，即10％。
实施例2构建敲除ku80基因的NHEJ途径缺失基因工程菌株At-Δku80
2.1构建敲除ku80的打靶元件
根据土曲霉NIH2624基因组数据库公布的信息设计引物Uku80-F(5’-gtcgtagctcttcttgccatc -3’)、Uku80-R(5’-aatgggatcccgtaatcaattgccctcaatcaccatctcccttatc-3’)、Dku80-F(5’- caagagcggctcatcgtcaccccattccggcctcgatgtggatgc-3’)、Dku80-R(5’-tccacgcggccatcaccgagc-3’)，以土曲霉菌株CICC40205的基因组为模板，采用pfu DNA聚合酶(Fermentas,Catalog No.: EP0501)进行PCR扩增，用引物Uku80-F/Uku80-R可以扩增获得大小约为1.5kb的ku80 的上游序列U-ku80，用引物Dku80-F/Dku80-R可以扩增获得大小为1.5kb的ku80的下游序列D-ku80。以质粒pPTR II(TAKARA,Catalog No.:3621)为模板，以ptrA-F(5’- gggcaattgattacgggatc-3’)和ptrA-R(5’-atggggtgacgatgagccgc-3’)作为引物扩增获得大小约为2.0kb的ptrA片段，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回收纯化。用融合PCR的方法将U-ku80片段、D-ku80与ptrA片段进行融合，并以该融合PCR的产物作为模板，以Cku80-F (5’-gggtttctagaagtcacatc-3’)和ptrA-R744(5’-atggcccatcgtgaccagtggtac-3’)作为引物扩增获得大小约为3.0kb的ku80敲除元件ku80-A，以Cku80-R(5’-atcaccgaccctacgctgtg-3’)和 ptrA-F171(5’-ggtctctcgtgccatgaccagacg-3’)作为引物扩增获得大小约为2.6kb的ku80敲除元件ku80-B，如图3。
2.2原生质体转化
将土曲霉CICC40205的孢子接种至50mL液体培养基IPM中，如实施例1中描述制备原生质体溶液，向150μl上述原生质体悬液中同时加入5μl的ku80-A片段(约2μg)和5μl 的ku80-B片段(约1.5μg)，再加入50μl PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL PSTC，混匀后室温放置20min；然后与15mL上层琼脂(CD+1.2M山梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后 48℃保温)混合后倾注于5块再生筛选培养基平板CDSP上(CD平板+1.2M山梨醇+0.1mg/L 吡啶硫胺)，在30℃、黑暗条件下培养5天。
2.3转化子的筛选验证
从平板上将具有吡啶硫胺抗性转化子转接至筛选平板CDP上(CD平板+0.1mg/L吡啶硫胺)，在32℃培养5天进行传代纯化，此传代纯化实验重复两次。随机挑取4株转化子于IPM液体培养基中进行培养，收集菌丝提取基因组，参照图3所示引物位点进行了基因组PCR验证。如图4A所示，以F3/R3为引物对进行PCR检测，转化子都扩增出了大小约2kb的ptrA 目的条带，而出发菌株土曲霉CICC40205未有该条带，这说明这4个转化子中整合了完整的ptrA筛选标记。如图4B、4C所示，用引物对F1/R3和引物对F3/R1分别进行PCR检测，结果2#、3#转化子都分别扩增出了大小约为3.5kb的目的条带，其他转化子则无条带，这说明 2#、3#转化子是打靶元件在ku80位点上发生了同源重组。如图4D所示，用设计在ku80基因内部的引物对ku80-probe-F(5’-gcactctcgaacaggcagtgtc-3’)和ku80-probe-R(5’-atcagtcgtgtcgatgtgaactgc-3’)进行PCR验证，2#、3#转化子未能和野生型菌株WT一样扩增出600bp大小的条带，这说明2#、3#转化子的ku80基因被成功敲除，阳性率为50％，由此可见本发明所采用的方法进行基因敲除的成功率达到50％，高于普通方法的10％。将该3# 转化子定义为NHEJ途径缺失的土曲霉基因工程菌株At-Δku80。
实施例3构建敲除lig4基因的NHEJ途径缺失基因工程菌株At-Δlig4
3.1构建split-marker方法敲除lig4的打靶元件
根据土曲霉NIH2624基因组数据库公布的信息设计引物Ulig4-F(5’-cggctattctcacgcagctc -3’)、Ulig4-R(5’-aatgggatcccgtaatcaattgcccatacagggtcatcctcggtc-3’)、Dlig4-F(5’- caagagcggctcatcgtcaccccatAtataatgatagctttgctC-3’)、Dlig4-R(5’-cgtttgactgtcgcgacgtttcg-3’)，以土曲霉菌株CICC40205的基因组为模板，采用pfu DNA聚合酶(Fermentas,Catalog No.: EP0501)进行PCR扩增，用引物Ulig4-F/Ulig4-R可以扩增获得大小约为1.5kb的ku80的上游序列U-lig4，用引物Dlig4-F/Dlig4-R可以扩增获得大小为1.5kb的lig4的下游序列D- lig4，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回收纯化。用融合PCR的方法将U-lig4片段、 D-lig4与ptrA片段(实施例2中所述)进行融合，并以该融合PCR的产物作为模板，以Clig4-F (5’-gaggtcacagccgagactgc-3’)和ptrA-R744(5’-atggcccatcgtgaccagtggtac-3’)作为引物扩增获得大小约为3.0kb的lig4敲除元件lig4-A，以Clig4-R(5’-ctttccttggcttcctttcg-3’)和ptrA-F171 (5’-ggtctctcgtgccatgaccagacg-3’)作为引物扩增获得大小约为2.6kb的lig4敲除元件lig4-B。 3.2原生质体转化及筛选
如实施例1中所述制备土曲霉CICC40205的原生质体溶液，向150μl该原生质体悬液中同时加入5μl的lig4-A片段(约2μg)和5μl的lig4-B片段(约1.5μg)，再加入50μl PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL PSTC，混匀后室温放置20min；然后与15mL上层琼脂 (CD+1.2M山梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后48℃保温)混合后倾注于5块再生筛选培养基平板CDSP上(CD平板+1.2M山梨醇+0.1mg/L吡啶硫胺)，在30℃、黑暗条件下培养5天。 3.3lig4基因缺失菌株的验证
从平板上将具有吡啶硫胺抗性转化子转接至筛选平板CDP上(CD平板+0.1mg/L吡啶硫胺)，在32℃培养5天进行传代纯化，此传代纯化实验重复两次。提取基因组进行PCR验证后，参照图5(箭头代表引物设计位点)所示引物位点进行了基因组PCR验证，获得lig4 被完全敲除的工程菌株At-Δlig4。如图6A所示，以ptrA-F/ptrA-R为引物对进行PCR检测，工程菌株At-Δlig4扩增出了大小约2kb的ptrA目的条带，而作为对照的出发菌株土曲霉CICC40205未有该条带，这说明该菌株中整合了完整的ptrA筛选标记。如图6B、6C所示，用引物对Ulig4-F/ptrA-R和引物对ptrA-F/Dlig4-R分别进行PCR检测，工程菌株At-Δlig4分别扩增出了大小约为3.5kb的目的条带，而作为对照的出发菌株土曲霉CICC40205未有该条带，这说明该菌株是打靶元件在lig4位点上发生了同源重组。如图6D所示，用设计在lig4基因内部的引物对lig4-F(5’-tgcaactccacatgcagtctgac-3’)和lig4-R(5’-cggacacaatcaaggatccacg-3’)进行PCR验证，工程菌株At-Δlig4未能和野生型菌株WT一样扩增出大小约为1.5kb的条带，这说明工程菌株At-Δlig4的lig4基因被成功敲除。
实施例4分析NHEJ途径缺失基因工程菌株中外源DNA同源重组概率
4.1分析ku80缺失菌株At-Δku80中外源DNA同源重组概率
接种上述基因工程菌株At-Δku80的孢子于50mL的IPM液体培养基中进行菌丝培养，参照上述实施例1.2所描述的方法制备原生质体，向150μl原生质体悬液中同时加入10μl敲除元件pdc-KO片段(约3μg)，再加入50μl PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL PSTC，混匀后室温放置20min，然后与15mL上层琼脂(PDB+1.2M山梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后 48℃保温)混合后倾注于5块再生筛选培养基平板PDASU上(PDA平板+1.2M山梨醇+100 mg/L潮霉素B)，在30℃、黑暗条件下培养5天。
从转化筛选平板上挑取具有潮霉素抗性转化子转接至筛选平板PDA-H上(PDA平板+100 mg/L潮霉素B)，在32℃培养5天进行传代纯化，连续传代4次。选取19个转化子的孢子接种于IPM液体培养基中，30℃、200rpm培养48小时，收集菌丝提取基因组，参照图1中所示引物进行基因组PCR验证。如图7A所示19个转化子中都整合了潮霉素抗性筛选标记hph；如图4B、4C所示,除8#转化子外其他转化子都分别扩增到了大小为4.1kb和4.3kb的条带，这说明这些转化子中pdc-KO元件是通过同源重组方式整合到了pdc基因位点上。如图4D所示,只有8#转化子和对照菌株土曲霉CICC40205一样扩增出了1.5kb的pdc基因内部片段，这说明除8#转化子之外其他18个转化子中pdc基因都被敲除，由此可知只有8#转化子中的外源DNA没有发生同源重组。ku80缺失菌株At-Δku80中外源DNA的同源重组概率为18/19，即94.7％。这说明敲除土曲霉CICC40205的ku80基因使外源DNA的同源重组概率从10％提高到了94.7％。
4.1分析lig4缺失菌株At-Δlig4中外源DNA同源重组概率
接种上述基因工程菌株At-Δlig4的孢子于50mL的IPM液体培养基中进行菌丝培养，参照上述实施例1.2所描述的方法制备原生质体，向150μl原生质体悬液中同时加入10μl敲除元件pdc-KO片段(约3μg)，再加入50μl PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL PSTC，混匀后室温放置20min，然后与15mL上层琼脂(PDB+1.2M山梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后 48℃保温)混合后倾注于5块再生筛选培养基平板PDASU上(PDA平板+1.2M山梨醇+100 mg/L潮霉素B)，在30℃、黑暗条件下培养5天。
从转化筛选平板上挑取具有潮霉素抗性转化子转接至筛选平板PDA-H上(PDA平板+100 mg/L潮霉素B)，在32℃培养5天进行传代纯化，连续传代4次。选取19个转化子的孢子接种于IPM液体培养基中，30℃、200rpm培养48小时，收集菌丝提取基因组，参照图1中所示引物进行基因组PCR验证。如图8A所示所有转化子中都整合了潮霉素抗性筛选标记hph；如图4B、4C所示,所有19个转化子都分别扩增到了大小约为4.1kb和4.3kb的条带，这说明所有转化子中pdc-LKO元件都是通过同源重组方式整合到了pdc基因位点上。如图4D所示, 没有转化子和对照菌株土曲霉CICC40205一样扩增出了1.5kb的pdc基因内部片段，这说明 19个转化子中pdc基因都被敲除。由此可知19个转化子中的外源DNA都发生了同源重组， lig4缺失菌株At-Δlig4中外源DNA的同源重组概率为19/19，即100％。这说明敲除lig4使土曲霉CICC40205中外源DNA的同源重组概率从10％提高到了100％。
实施例5构建尿嘧啶营养缺陷型土曲霉基因工程菌株
5.1构建pyrG打靶元件
根据土曲霉NIH2624基因组数据库公布的信息设计引物UpyrG-F(5’-tccatccgatggccattcgtggc-3’)、UpyrG-R(5’-ctttacgcttgcgatcccgaaaaggtcaattgagacttggacgac-3’)、 DpyrG-F1(5’-tttcgggatcgcaagcgtaaagatgatgagcatgaagaattatgc-3’)、DpyrG-R(5’- cgaggtcctaccgatgatgttgc-3’)，以土曲霉菌株CICC40205的基因组为模板，采用pfu DNA聚合酶(Fermentas,Catalog No.:EP0501)进行PCR扩增，用引物UpyrG-F/UpyrG-R可以扩增获得大小约为2.5kb的pyrG的上游序列U-pyrG，用引物DpyrG-F1/DpyrG-R可以扩增获得大小为2.5kb的pyrG下游序列D-pyrG，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回收纯化。用融合PCR的方法将U-pyrG片段与D-pyrG片段进行融合，并以该融合PCR的产物作为模板，以CpyrG-F(5’-gtcgtaaatcgttctttgtactg-3’)和CpyrG-R(5’-ggaaccccagataatgatacatgc-3’)作为引物扩增获得大小约为3kb的pyrG敲除元件pyrG-KO片段(图9)。
5.2原生质体转化及筛选验证
接种上述基因工程菌株At-Δku80的孢子于50mL的IPM液体培养基中进行菌丝培养，参照上述实施例1.2所描述的方法制备原生质体，向上述原生质体悬液中同时加入10μl敲除元件pyrG-KO片段(约3μg)，再加入50μl PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL PSTC，混匀后室温放置20min，然后与15mL上层琼脂(CD+1.2M山梨醇+4g/L琼脂糖+2mM尿嘧啶核苷，灭菌后48℃保温)混合后倾注于5块再生筛选培养基平板CDSFU上(CD平板 +1.2M山梨醇+1g/L 5-氟乳清酸+10mM尿嘧啶核苷)，在30℃、黑暗条件下培养7天。
从平板上将具有5-氟乳清酸抗性转化子转接至筛选平板CDFU上(CD平板+1g/L 5-氟乳清酸+10mM尿嘧啶核苷)，在32℃培养7天进行传代纯化，此传代纯化实验重复两次。挑取在CDFU平板上生长的转化子接种于CD平板上，32℃培养7天。随机选取2株转化子在CDFU平板上正常生长而在CD平板上不能正常生长的转化子接种于IPMU液体培养基 (IPM培养液+10mM尿嘧啶核苷)中进行培养，收集菌丝提取基因组,参照图9所示引物位点进行基因组PCR验证。用引物打靶元件上特有的引物hph-F与同源臂之外染色体上的引物 DpyrG-R搭配进行PCR检测，如图10A所示，两个转化子都扩增得到了大小约为2.5kb的条带，而出发菌株At-Δku80则无此条带，这说明打靶元件在pyrG位点上发生了同源重组。如图10B所示，以C-F4(5’-cggatacgtctactccggtaaggc-3’)/C-R(5’-agaaactagcgtggagactttgcc-3’) 为引物对进行PCR检测，转化子都扩增出了大小约1.2kb的条带，而出发菌株At-Δku80扩增得到的条带大小为2.1kb，这说明大小约为0.9kb的pyrG条带被敲除了。如图10C所示，用位于pyrG基因内部的引物对S-pyrG-F(5’-actcgcgcccgcacgcacccgaac-3’)/S-pyrG-R(5’-tccttctggtaccgctggacagc-3’)进行PCR检测，结果出发菌株At-Δku80扩增到了大小约为0.8kb 的pyrG条带，而两个转化子都未能扩增出该条带，这说明在这两个转化子中pyrG基因被完全敲除。该尿嘧啶营养缺陷型土曲霉基因工程菌株记为At-Δku80-ΔpyrG。
实施例6建立基于尿嘧啶营养缺陷型的遗传转化系统
6.1构建以pyrG1作为筛选标记的的打靶元件
通过基因合成方式合成SEQ ID NO.1，该序列包括两个同向的loxP位点、PalcA启动子以及限制性内切酶位点，该合成的序列最终克隆在pUC57simple载体上，获得载体PalcA-syn(图11)。用pyrG1-F(5’-ctaat gctagc cagcagggaatacgagctcca-3’)/pyrG-R(5’-ctaat gctagc gcatcaaatcgtcgtaccgc-3’)作为引物，以黑曲霉Co827基因组为模板进行PCR扩增，获得大小约为1.5kb黑曲霉的pyrG基因的表达元件，作为筛选标记pyrG1，通过Nhe I限制性内切酶将pyrG1片段克隆至PalcA-syn载体内，得到质粒pXH103。用引物Sgfp-F1(5’-gat ccatggtgagcaagggcgaggagc-3’)/TtrpC-R1(5’-gag ctcgagttactattgtatacccatcttag-3’)，以pSGF957 (参见Jeong-Gu Kim，Yang Do Choi，Yung-JinChang，Soo-Un Kim，Genetic transformation of Monascus purpureus DSM1379，Biotechnology Letters，2003，25:1509–1514)为模板进行PCR 扩增gfp-TtrpC片段，将大小约为1.3kb的条带通过NcoI和XhoI限制性内切酶克隆至质粒 pXH103中，得到质粒pXH104。用Dw2-ku80-F(5’-cat ctcgag tccggcctcgatgtggatgc-3’)/ Dw2-ku80-R(5’-ctagaattc tccacgcggccatcaccgagc-3’)作为引物，以土曲霉CICC40205基因组为模板进行PCR扩增，将得到的大小约为1.5kb的ku80下游同源臂片段通过限制性内切酶Xho I和EcoR I克隆至质粒pXH104中，得到质粒pXH105。用Up2-ku80-F(5’-tca gcggccgcgtcgtagctcttcttgccatc-3’)/Up2-ku80-R(5’-ctaat gctagc tcaatcaccatctcccttatc-3’)作为引物，以土曲霉CICC40205基因组为模板进行PCR扩增，将得到的大小约为1.5kb的ku80上游同源臂片段，用限制性内切酶Not I和Nhe I进行酶切并回收后，克隆至经Not I和Spe I酶切后的 pXH105载体中，得到质粒pXH106。Cku80-F/Cku80-R为引物，pXH106作为模板，扩增得到大小约为6.3kb的DNA片段作为打靶元件ku80-pyrG1-gfp，如图12。
6.2尿嘧啶营养缺陷型At-Δku80-ΔpyrG作为宿主菌的回补实验
接种上述基因工程菌株At-Δku80-ΔpyrG的孢子于50mL的IPMU液体培养基(IPM培养基中补充了20mM尿嘧啶核苷)中，30℃、200rpm进行菌丝培养，参照上述实施例1.2描述的方法制备原生质体，向上述原生质体悬液中同时加入10μl敲除元件ku80-pyrG1-gfp片段(约3μg)，再加入50μl PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL PSTC，混匀后室温放置20min，然后与上层琼脂(CD+1.2M山梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后48℃保温)混合后倾注于再生筛选培养基平板CDS上(CD平板+1.2M山梨醇)，在30℃、黑暗条件下培养7天。
选取26个在CDS平板上生长的转化子转接至筛选平板CD上，在32℃培养5-7天进行传代纯化，此传代纯化实验重复5次，这些能在CD平板上稳定生长的转化子都是重新获得了尿嘧啶合成能力。将所有转化子都转接到CDP上(CD平板+0.1mg/L吡啶硫胺)上，32℃培养5-7天,发现有24个转化子不能生长，这说明该24个转化子是在ku80基因位置上发生了同源重组，将上下游同源臂之间的ptrA筛选标签敲除了，从而使菌株失去了吡啶硫胺抗性，据此可计算出ku80敲除后菌株的同源重组效率为92.3％。挑取6个在CD平板上生长但在CDP 平板上不能生长的转化子的孢子，接种于IPM液体培养基中进行培养，收集菌丝提取基因组, 参照图12所示引物位点进行基因组PCR验证。如图13中的电泳检测结果所示，所有转化子中都有pyrG1筛选标记，并在ku80位点发生了同源重组，这说明pyrG1筛选标记与尿嘧啶营养缺陷型土曲霉菌株At-Δku80-ΔpyrG搭配，可以建立一个高同源重组效率的遗传转化系统。其中1#转化子记为At-Δku80-pyrG1-loxP。
实施例7应用位点特异性重组系统进行筛选标记的切除
7.1工程菌At-Δku80-pyrG1-loxP的原生质体制备
挑取工程菌At-Δku80-pyrG1-loxP的孢子接种于IPM培养基中，32℃培养14-20小时，收集菌丝后参照实施例1.2所描述方法进行原生质体制备，最终原生质体重悬于STC中，并调整原生质体浓度为108个/ml。
7.2直接导入Cre重组酶进行筛选标记的切除
取100ul原生质体溶液，加入2U Cre重组酶(NEB,Catalog No.:M0298L)、1μgpyrG1 片段和10μl 40％的PEG4000，混匀后冰浴30min。加入1ml PSTC溶液，30℃孵育30min。然后与上层琼脂(CD+1.2M山梨醇+4g/L琼脂糖+2mM尿嘧啶核苷，灭菌后48℃保温)混合后倾注于再生筛选培养基平板CDSFU上(CD平板+1.2M山梨醇+1g/L 5-氟乳清酸+10mMUrdine)，在30℃、黑暗条件下培养6-10天。挑取27个生长出来的转化子转接于CDFU上，在32℃培养5-7天进行传代纯化，此传代纯化实验重复3-5次。挑取在CDFU平板上生长的转化子接种于CD平板上，32℃培养5-7天。随机选取8株在CDFU平板上正常生长而在CD 平板上不能正常生长的转化子接种于IPMU液体培养基(IPM培养液+10mM尿嘧啶核苷) 中进行培养，收集菌丝提取基因组，参照图10所示引物U-ku80-F和TtrpC-R进行基因组PCR 验证。如果pyrG1标签被切除则能扩增出大小为3.3kb的片段，如果pyrG1未能切除，则可以扩增出大小为4.8kb的片段。如图14所示，转化子1#、3#、4#、6#、7#、8#的pyrG1标签都被完全切除了，将1#转化子的验证PCR产物中3.3kb条带回收纯化后送基因测序，测序引物为S-ku80-F(5’-ctcctaaacagatataccactc-3’)，结果显示ku80-UP与PalcA之间只留下一个 loxP位点(图15)，pyrG1标签已被切除，该工程菌株被记为At-Δku80-ΔpyrG1-loxP。实施过程中发现，使用10U和2U Cre重组酶都能实现筛选标记的高效切除并获得足够的阳性转化子，鉴于成本考虑优先选择使用少量Cre重组酶进行筛选标记切除。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (1)
1.一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法，其特征在于，是以土曲霉(Aspergillus terreus)为出发菌，先通过敲除ku80基因或lig4基因提高外源DNA同源重组概率，再通过构建尿嘧啶营养缺陷型菌株建立基于pyrG基因作为筛选标签的遗传转化系统，最后以直接向原生质体细胞中导入Cre重组酶的方式利用位点特异性重组系统切除两侧带有同向loxP序列的pyrG筛选标签，使菌株重新获得尿嘧啶营养缺陷的特征，能再次用于基于pyrG基因作为筛选标签的遗传转化；步骤如下：
1)以土曲霉CICC 40205为出发菌，敲除ku80基因，构建外源DNA同源重组概率提高的重组菌At-Δku80；
2)构建pyrG基因的打靶元件pyrG-KO，敲除步骤1)所得重组菌At-Δku80的pyrG基因，获得pyrG基因被敲除的尿嘧啶营养缺陷型重组菌At-Δku80-ΔpyrG；
3)以两端带有同向loxP序列的曲霉pyrG基因表达元件pyrG1为筛选标签构建以ku80基因上下游序列作为同源臂的打靶元件ku80-pyrG1-gfp，将打靶元件ku80-pyrG1-gfp转化入步骤2)所得的尿嘧啶营养缺陷型菌株At-Δku80-ΔpyrG中进行回补实验验证，经过培养筛选以及验证后，建立基于尿嘧啶营养缺陷型重组菌At-Δku80-ΔpyrG和pyrG1的遗传转化系统，获得整合有loxP-pyrG1-loxP筛选标记的的重组菌At-Δku80-pyrG1-loxP；
4)制备步骤3)所得重组菌At-Δku80-pyrG1-loxP的原生质体，以DNA为辅助载体向所得的原生质体内导入Cre重组酶切除两侧带有同向loxP序列的筛选标签pyrG1，通过筛选pyrG基因缺失菌株的方式获得pyrG1筛选标签被切除的尿嘧啶营养缺陷型土曲霉重组菌At-Δku80-ΔpyrG1-loxP；所述辅助载体为筛选标签pyrG1的双链DNA；具体步骤如下：
1)以土曲霉CICC 40205为出发菌，以质粒pPTR II为模板，以SEQ ID NO.2-SEQ IDNO.3所示核苷酸序列为引物通过PCR扩增出ptrA片段；以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.5所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80上游序列U-ku80；以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.7所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80下游序列D-ku80；通过融合PCR将ptrA片段、上游序列U-ku80和下游序列D-ku80进行融合，再以融合产物为模板，以如SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.9所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出打靶元件ku80-A，再以如SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.11所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出打靶元件ku80-B；再将打靶元件ku80-A和打靶元件ku80-B同时转化到制备好的土曲霉原生质体中，最后吡啶硫胺抗性筛选及基因组验证获得敲除ku80基因的重组菌At-Δku80；
2)以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以如SEQ ID NO.12-SEQ ID NO.13所示核苷酸序列为引物，扩增pyrG基因的上游序列U-pyrG；再以土曲霉CICC40205的基因组为模板，以如SEQ ID NO.14-SEQ ID NO.15所示核苷酸序列为引物，扩增pyrG基因的下游序列D-pyrG；再利用融合PCR融合上游序列U-pyrG和下游序列D-pyrG，以融合产物的序列为模板，以如SEQ ID NO.16-SEQ ID NO.17所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出pyrG基因的打靶元件pyrG-KO，再制备步骤1)所得重组菌At-Δku80的原生质体，再将pyrG基因的打靶元件pyrG-KO转化到原生质体内，经培养筛选后获得pyrG基因被敲除的尿嘧啶营养缺陷型菌株At-Δku80-ΔpyrG；
3)通过人工合成带有两个同向loxP位点的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该DNA片段克隆在载体pUC57simple上，获得载体PalcA-syn；以黑曲霉Co827基因组为模板，以如SEQ ID NO.18-SEQ ID NO.19所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出黑曲霉pyrG基因的表达元件，作为筛选标签pyrG1，再将筛选标签pyrG1克隆到载体PalcA-syn上，获得质粒pXH103，获得如SEQ ID NO.26所示的两侧带有同向loxP位点序列的pyrG1筛选标签loxP-pyrG-loxP；再以pSGF957为模板，以如SEQ ID NO.20-SEQ ID NO.21所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出NDA片段gfp-TtrpC，再将gfp-TtrpC片段连接到质粒pXH103上，获得质粒pXH104；再以土曲霉CICC40205基因组为模板，以如SEQ ID NO.22-SEQ ID NO.23所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80基因下游同源臂片段，再将扩增的出ku80基因下游同源臂片段连接到质粒pXH104上，获得质粒pXH105；再以土曲霉CICC40205基因组为模板，以如SEQ ID NO.24-SEQ ID NO.25所示核苷酸序列为引物，通过PCR扩增出ku80基因上游同源臂片段，再将扩增的出ku80基因上游同源臂片段连接到质粒pXH105上，获得质粒pXH106；最后再以质粒pXH106为模板，以SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示序列为引物扩增出打靶元件ku80-pyrG1-gfp；再将打靶元件ku80-pyrG1-gfp转化入步骤2)所得的尿嘧啶营养缺陷型菌株At-Δku80-ΔpyrG中，经过培养筛选后获得带有loxP-pyrG1-loxP的重组菌At-Δku80-pyrG1-loxP；从而证明成功建立了基于尿嘧啶营养缺陷重组菌和pyrG基因作为筛选标签的遗传转化系统；
4)制备步骤3)所得重组菌At-Δku80-pyrG1-loxP的原生质体，向已制备好的100μL浓度为108个/mL的原生质体溶液中加入2U Cre重组酶、1μgpyrG1片段和10μL40％的PEG4000，混合均匀后冰浴30min，加入1ml PSTC溶液后于30℃下孵育30min，孵育结束后与含有1.2M山梨醇、4g/L琼脂糖和2mM尿嘧啶核苷的顶层琼脂培养基混合后倾注于含有1.2M山梨醇，1g/L 5-氟乳清酸和10mM尿嘧啶核苷的CD再生筛选培养基平板中，在30℃、黑暗条件下培养6-10天，培养结束后挑取转化子接种到CDFU平板上于32℃下培养5-7天进行传代纯化，传代纯化3-5次后，再挑取转化子接种到CD平板上，在32℃下培养5-7天后获得同源重组能力提高，且不受筛选标签数量限制的用于基因打靶的土曲霉重组菌At-Δku80-ΔpyrG1-loxP；所述pyrG1片段为黑曲霉的pyrG基因的表达元件。
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