CN108603160A - 突变丝状菌的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高效率制造突变丝状菌的方法。本发明的丝状菌制造方法包括向宿主丝状菌中导入位点特异性DNA核酸酶和单链DNA，将该宿主的基因组DNA中由该位点特异性DNA核酸酶产生的切断位点的上游区域和下游区域，使用该单链DNA通过同源重组进行取代。

Description

突变丝状菌的制造方法
技术领域
本发明涉及突变丝状菌的制造方法。
背景技术
近年来报道了使用位点特异性核酸酶(Programmable nuclease)的基因组编辑技术。基因组编辑是特异性地将基因组上的靶向基因的DNA双链切断，在切断的DNA的修复过程中通过诱导核苷酸的缺失、插入或取代，或通过插入外来多聚核苷酸，位点特异性地改变基因组的技术。这样的技术，已知包括TALEN(类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease))、ZFN(锌指核酸酶(zinc-Fingernuclease))、CRISPER(成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeat))-Cas 9、CRISPR-Cpf1、归位内切酶(Homing endonuclease)、Compact designer TALEN等。有报道指出通过使用位点特异性核酸酶进行基因组编辑，能够提高基因组DNA上靶向位点的同源重组效率，即使是原来同源重组能力低的生物，也能够发生同源重组(非专利文献1)。
基因组编辑技术提高了过去改变比较困难的哺乳动物细胞中基因的同源重组效率。非专利文献2报道使用TALEN技术通过向基因组中导入单链DNA，从而改变人的靶向基因组区域的单个碱基，由此研究单碱基多态性的手段。非专利文献3报道使用TALEN技术通过向小鼠胚细胞的基因组中导入单链DNA，由此改变基因的手段。然而，这些方法仅报道了对1个～数个碱基、长度不满300bp的基因组区域进行取代或缺失。非专利文献4报道使用CRISPR-Cas9技术通过向大鼠胚细胞的基因组中导入单链DNA，由此改变基因的手段，并且记载最大插入了约830bp的DNA，进而进行长链基因组区域的插入或取代时，必须要两个单链DNA。然而，这个方法仍然是将1个基因区域插入基因组中，将已有的基因组大区域取代为其它基因区域仍然十分困难。
根霉属菌等丝状菌是能够在有机酸等有用物质的微生物学生产中加以利用的有用微生物。期待通过遗传重组技术开发对有用物质生产适合的丝状菌突变株。
作为丝状菌的粗糙链孢霉(Neurospora crassa)是重组研究中大量使用的一种生物。但是，粗糙链孢霉野生型株的同源重组率非常低，将其通过同源重组法改变基因不容易。
在根霉属菌中的同源重组也不容易。根霉属菌中，导入细胞DNA片段通过同源重组而并入基因组DNA的概率非常低。此外，根霉属菌中，导入的DNA片段会发生自发环化，即使没有复制起点也会扩增，因此难以使用基因标记对基因重组株进行筛选。而且，根霉属菌的遗传学背景还并不明确。因此，过去对根霉属菌突变株的开发在技术上存在困难。到目前为止，在向根霉属菌基因组导入基因时，尝试了使用农杆菌法(非专利文献5)、对细胞中导入的DNA末端进行修饰的方法(非专利文献6)等的、对相同序列部分进行靶向的方法。然而这些方法效率不高。另一方面，关于根霉属菌的基因敲除株，仅有1例报道(非专利文献7)。
(非专利文献1)Science,2013,339(6121):823-826
(非专利文献2)Int J Mol Sci,2015,16:21128-21137
(非专利文献3)PNAS,2013,110(10):3782-87
(非专利文献4)Nature Commun,2016,20,doi:10.1038/ncomms10431(非专利文献5)Mol Genet Genomics,2004,271(4):499-510
(非专利文献6)Mol Genet Genomics,2005,274(4):373-383
(非专利文献7)Mol Microbiol,2010,77(3):587-604
发明内容
本发明提供了一种突变丝状菌的制造方法，其中，包括向宿主丝状菌中导入位点特异性DNA核酸酶和单链DNA，将该宿主基因组DNA中由该位点特异性DNA核酸酶产生的切断位点的上游区域和下游区域，使用该单链DNA通过同源重组进行取代。
具体实施方式
本说明书中引用的全部专利文献、非专利文献、以及其它出版物将其整体在本说明书中援引作为参考。
本说明书中除非另有限制，关于基因或DNA“上游”和“下游”是指该基因或DNA的转录方向的上游和下游。
本说明书中，基因和控制区域的“可工作地连接”是指基因与控制区域以该基因在该控制区域的控制下可表达的方式进行连接。基因与控制区域的“可工作地连接”的步骤为本领域技术人员所公知的。
“基因组编辑”是将基因组上的靶向基因座的DNA双链使用位点特异性人工DNA核酸酶特异性地切断，在切断的DNA的修复过程中诱导核苷酸的缺失或插入、取代、或者插入外来多聚核苷酸等，靶向位点特异性地将基因组进行改变的技术。这样的基因组编辑技术，已知主要使用的与位点特异性人工DNA核酸酶相关的TALEN(类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease))、ZFN(锌指核酸酶(zinc-Fingernuclease))、CRISPER(成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeat))-Cas 9、CRISPR-Cpf1、归位内切酶(Homing endonuclease)、Compact designer TALEN等(Natures Reviews Genetics,2014,15:321-334,NucleicsAcids Research,2011,39:e82,Nucleics Acids Research,2006,34:e149,Naturecommunications,2013,4:1762)。基于这些技术用于基因组编辑的试剂盒也有销售，例如能够从Life technologies公司、Cellectis公司、Transposagen Biopharmaceuticals公司等购买。
本发明的发明人将使用位点特异性DNA核酸酶的基因组编辑技术应用到丝状菌，比过去能够更有效的制备突变丝状菌。然而其重组率还并不充分，特别是对1个基因区域全体的缺失或取代等基因组的大范围的改变困难。
本发明的发明人对于丝状菌的利用基因组编辑的同源重组技术进行进一步研究，结果发现，通过使用与位点特异性DNA核酸酶一起导入至细胞的作为供体DNA的单链DNA，提高了同源重组率，进一步能够改变基因组的长链区域。
因此，本发明提供一种突变丝状菌的制造方法。该方法基于上述基因组编辑技术，包括向宿主丝状菌中导入位点特异性DNA核酸酶和单链DNA，将该宿主的基因组DNA中由该位点特异性DNA核酸酶产生的切断位点的上游区域和下游区域，使用该单链DNA通过同源重组进行取代。
根据本发明，能够高效率的制造基因组的长链区域发生改变的突变丝状菌。通过本发明得到的突变丝状菌既可以是将异种基因导入宿主得到的重组丝状菌，也可以是将同种基因导入宿主得到的突变丝状菌、或者是相对于宿主的基因具有缺失突变的突变丝状菌。
本发明中，作为宿主丝状菌，可以列举例如属于接合菌门、子囊菌门、担子菌门和壶菌门的菌。作为属于接合菌门的菌，可以列举例如根霉(Rhizopus)属、毛霉(Mucor)属、被孢霉(Mortierella)属等。作为属于子囊菌门的菌，可以列举例如枝顶孢(Acremonium)属、曲霉(Aspergillus)属、短梗霉(Aureobasidium)属、金孢子菌(Chrysosporium)属、镰刀菌(Fusarium)属、梨孢菌(Magnaporthe)属、毁丝霉(Myceliophthora)属、脉孢菌(Neurospora)属、拟青霉(Paecilomyces)属、青霉菌(Penicillium)属、踝节菌(Talaromyces)属、嗜热子囊菌(Thermoascus)属、梭孢壳霉(Thielavia)属、弯颈霉(Tolypocladium)属、木霉(Trichoderma)属等。作为属于担子菌门的菌，可以列举例如烟管霉(Bjerkandera)属、拟蜡菌(Ceriporiopsis)属、鬼伞(Coprinus)属、云芝(Coriolus)属、隐球菌(Cryptococcus)属、线黑粉酵母(Folibasidium)属、腐质霉(Humicola)属、平革菌(Phanerochaete)属、脉射菌(Phlebia)属、侧耳(Pleurotus)属、裂褶菌(Schizophyllum)属、栓菌(Trametes)属等。作为属于壶菌门的菌，可以列举例如壶菌(Chytridium)属、小诺壶菌(Nowakovskiella)属、油壶菌(Olpidium)属、异水霉(Allomyces)属、雕蚀菌(Coelomomyces)属、单毛菌(Monoblepharis)属等。其中，优选为属于接合菌门或子囊菌门的菌，更优选为属于接合菌门的菌，进一步优选为根霉属菌。作为根霉属菌，可以列举例如米根霉(Rhizopus oryzae)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、华根霉(Rhizopuschinensis)、黑根霉(Rhizopus nigricans)、东京根霉(Rhizopus tonkinensis)、小麦曲根霉(Rhizopus tritici)、戴尔根霉(Rhizopus delemar)等，其中优选为戴尔根霉(Rhizopusdelemar)和米根霉(Rhizopus oryzae)，更优选为戴尔根霉(Rhizopus delemar)。
本发明中使用的位点特异性DNA核酸酶是特异性识别需要切断的基因组DNA位点并将其切断的DNA核酸酶。优选本发明中使用的位点特异性DNA核酸酶为上述基因组编辑技术所使用的位点特异性人工DNA核酸酶，更优选为TALEN、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1、或ZFN技术中所使用的位点特异性人工DNA核酸酶，可以列举例如TALEN(transcriptionactivator-like effector nuclease)、Cas9nuclease或Cas9(D10A)nuclease、Cpf1nuclease、ZFN(zinc-Finger nuclease)。TALEN和ZFN是需要切断的基因组DNA位点附近特异性地结合的靶向识别区域与DNA核酸酶的复合体，由此，可以特异性地识别需要切断的基因组DNA位点，进行切断。另一方面，CRISPR-Cas9技术中，通过使用作为DNA核酸酶的Cas9与模仿tracrRNA-crRNA发夹结构的向导RNA(guide RNA)，诱导DNA切断。此外，CRISPR-Cpf1技术中，通过使用作为DNA核酸酶的Cpf1与模仿crRNA的向导RNA(guide RNA)，诱导DNA切断。此时，通过Cas9或Cpf1进行DNA切断的特异性由向导RNA(guide RNA)决定，能够在靶向位点进行切断。只要是本领域技术人员，取得需要切断的基因组DNA位点和其周边的DNA序列，将它们结合起来就能够设计具有靶向识别区域的人工DNA核酸酶或向导RNA(guideRNA)。
向宿主导入所述位点特异性DNA核酸酶时，可以将该核酸酶多聚核糖核苷酸或所述核酸酶多肽直接导入宿主细胞，优选是将编码该核酸酶的多聚核苷酸导入宿主细胞，在该细胞内使该核酸酶表达。
将编码位点特异性DNA核酸酶的多聚核苷酸导入宿主细胞时，优选为将包含编码该DNA核酸酶的多聚核苷酸的表达载体导入宿主细胞。表达载体只要是能够在宿主细胞内稳定地保持增殖即可，没有特别的限定，本领域技术人员能够进行适当选择。例如适合根霉属菌的表达载体有pUC18/19、pUC 118/119、pBR322、pMW218/219、pRTR 1/2(Takara)、pRI909/910(TaKaRa)、pDJB2(D.J.Ballance et al.,Gene,36,321-331,1985)、pAB4-1(VanHartingsveldt W et al.,Mol Gen Genet,206,71-75,1987)、pLeu 4(M.I.G.roncero etal.,Gene,84,335-343,1989)、pPyr 225(C.D.Skory et al.,Mol Genet Genomics,268,397-406,2002)、pFG1(Gruber,F.et al.,Curr Genet,18,447-451,1990)等。
为了在宿主细胞内高效表达位点特异性DNA核酸酶，编码该位点特异性DNA核酸酶的多聚核苷酸优选为与宿主细胞中工作的启动子可工作地连接。本领域技术人员能够根据宿主细胞对使用的启动子的种类做适当选择。使用的启动子的种类是由本领域技术人员根据宿主细胞进行适当选择。例如，作为根霉属菌中工作的启动子的例子，可以列举ldh A启动子(美国专利第6268189号)、pgk1启动子(国际公开第2001/73083号)、pgk2启动子(国际公开第2001/72967号)、pdcA启动子和amyA启动子(Archives of Microbiology,2006,186:41-50)、tef和18S rRNA启动子(美国专利申请公开第2010/112651号)、以及adh1启动子(日本专利申请2015-155759)等。
使用所述位点特异性DNA核酸酶时，通过在宿主内使外来核酸外切酶表达，促进位点特异性DNA核酸酶导致的靶向DNA的破坏等(Scientific Reports,2013,3:1253,DOI:10.1038/srep01253,Nat Methods,2012,9:973-975)。因此，在优选的实施方式中，向宿主细胞导入位点特异性DNA核酸酶或编码其的多聚核苷酸，并且导入核酸外切酶或编码其的多聚核苷酸，在该宿主细胞中使其共同表达。作为核酸外切酶，只要是来自丝状菌的核酸外切酶即可，没有特别的限定，可以列举优选为来自根霉属菌的核酸外切酶，更优选为属于核酸外切酶1或核酸外切酶2的核酸外切酶，进一步优选为来自米根霉(Rhizopus oryzae)或戴尔根霉(Rhizopus delemar)的核酸外切酶。
优选为将包含编码该核酸外切酶的多聚核苷酸的表达载体导入宿主细胞，与位点特异性DNA核酸酶共同表达。优选为编码所述核酸外切酶的多聚核苷酸在表达载体上与启动子为可工作地连接。能够使用的表达载体和启动子的种类与所述DNA核酸酶时相同。
本发明中使用的单链DNA是作为对于宿主丝状菌的基因组DNA的供体DNA来使用。本说明书中“供体DNA”是指用于通过同源重组来改变宿主的基因组DNA而使用的DNA片段。供体DNA是含有与宿主的基因组DNA相同的2个DNA序列(还分别称为上游相同序列和下游相同序列)的单链DNA。该上游相同序列和下游相同序列分别包含与该宿主的基因组DNA中被所述位点特异性DNA核酸酶切断的位点的上游区域和下游区域相同的区域。由该位点特异性DNA核酸酶产生的切断位点也可以位于该上游相同序列和下游相同序列之间的位置，或者也可以该切断位点的一部分和全部包含该上游相同序列和下游相同序列中的任意个。而且，所述供体DNA在该上游相同序列和下游相同序列之间，也可以具有需要插入宿主丝状菌的基因组DNA的插入序列。该插入序列没有特别的限定，也可以包含任意的基因区域的序列，例如该基因的编码区域、启动子等控制区域、内含子、以及其它非编码区域，而且还可以包含耐药基因等的选择标记基因。优选为所述插入序列中，该基因的编码区域与控制区域可工作地连接。
作为供体DNA的该单链DNA在导入宿主后，通过其上游相同序列和下游相同序列在该宿主的基因组DNA中切断位点的上游区域和下游区域之间发生同源重组，从该上游区域至下游区域发生序列取代。因此，根据该单链DNA中插入序列的有无，在同源重组后的宿主的基因组DNA中发生位点特异性序列的取代、插入或缺失。更具体而言，该单链DNA包含插入序列时，将插入序列取代或插入宿主的基因组DNA中。或者，该单链DNA实质上仅具有上游相同序列和下游相同序列，在不包含插入序列时，也能够引起宿主的基因组DNA的缺失。
供体DNA是通过制备上游相同序列和下游相同序列、以及根据需要导入宿主的编码插入序列的DNA，将它们进行连接，由此构建得到。对于本领域技术人员而言，只要取得宿主基因组的该切断位点周围，或者取得想与单链DNA取代的靶向区域的DNA序列，基于这些就能够设计上游相同序列和下游相同序列的DNA。编码该插入序列的DNA既可以是1个种类的基因区域的DNA，也可以是包含2个种类以上的基因区域的DNA。例如插入序列可以是编码想要导入宿主的基因的DNA片段，编码耐药基因等标记基因的DNA片段组成的序列。在优选的例子中，将上游相同序列的DNA片段、编码插入序列的DNA片段、和下游相同序列的DNA片段按照常规方法分别构建后，将它们依次连接得到供体DNA。
供体DNA可以从最开始构建为双链DNA，之后变性为单链DNA。例如通过克隆等构建包含上游相同序列、下游相同序列和插入序列的双链DNA质粒，以该质粒为模板进行PCR，得到双链DNA片段。对这些质粒或双链DNA，通过进行超声破碎、热变性后的速冻、NaOH等强碱处理等，使其变性为单链DNA。
或者，供体DNA也可以从最开始构建为单链DNA。单链DNA能够为化学合成(可以从株式会社医学生物学研究所等购入)，通过不对称PCR(asymmertric PCR)等制备。而且，也可以使用携带M13等的Ff噬菌体或Fori的pbluescript等质粒、以及携带f因子的JM109等的大肠杆菌，能够制备单链DNA。作为更进一步的单链DNA的制备法，可以列举：将一侧的引物生物素化后进行PCR，将PCR产物通过链酶亲和素磁珠回收后，使该PCR产物解离，使没有生物素化的单链DNA溶出的方法；使一侧的引物磷酸化后进行PCR，使用Lambda核酸外切酶处理的方法等。
作为单链DNA的优选的制备法，可以列举：使用携带Ff噬菌体和f因子的大肠杆菌的方法、使用生物素化引物的方法、以及使用磷酸化引物的方法等。这些中，优选使用磷酸化引物的方法。
该单链DNA中，上游相同序列和下游相同序列的长度分别优选为5bp以上、10bp以上、15bp以上、20bp以上、25bp以上、30bp以上、35bp以上、40bp以上、45bp以上、50bp以上、100bp以上、250bp以上、500bp以上、750bp以上、或1000bp以上。此外，该单链DNA在该上游和下游相同序列之间中具有插入序列时，该插入序列的链长在1bp以上即可，优选为0.3kbp以上，更优选为1kbp以上，进一步优选为3kbp以上，并且优选为50kbp以下，更优选为20kbp以下，进一步优选为10kbp以下，进一步优选为9kbp以下，进一步优选为5kbp以下。或者说，该插入序列的链长优选为1bp以上50kbp以下、0.3kbp以上50kbp以下、1kbp以上50kbp以下、或3kbp以上50kbp以下，更优选为1bp以上20kbp以下、0.3kbp以上20kbp以下、1kbp以上20kbp以下、或3kbp以上20kbp以下，进一步优选为1bp以上10kbp以下、0.3kbp以上10kbp以下、1kbp以上10kbp以下、或3kbp以上10kbp以下，进一步优选为1bp以上9kbp以下、0.3kbp以上9kbp以下、1kbp以上9kbp以下、或3kbp以上9kbp以下，进一步优选为1bp以上5kbp以下、0.3kbp以上5kbp以下、1kbp以上5kbp以下、或3kbp以上5kbp以下。
因此，本发明中使用的该单链DNA的链长优选为10bp以上、更优选为20bp以上、进一步优选为30bp以上、进一步有选为40bp以上、进一步优选为50bp以上、进一步优选为60bp以上、进一步优选为70bp以上、进一步优选为80bp以上、进一步优选为90bp以上、进一步优选为100bp以上、进一步优选为200bp以上、进一步优选为500bp以上、进一步优选为1000bp以上、进一步优选为1500bp以上、进一步优选为2000bp以上，并且优选为50kbp以下、更优选为20kbp以下、进一步优选为12kbp以下、进一步优选为11kbp以下。
或者，本发明中使用的该单链DNA的链长优选为10bp以上50kbp以下、10bp以上20kbp以下、10bp以上12kbp以下、10bp以上11kbp以下、20bp以上50kbp以下、20bp以上20kbp以下、20bp以上12kbp以下、20bp以上11kbp以下、30bp以上50kbp以下、30bp以上20kbp以下、30bp以上12kbp以下、30bp以上11kbp以下、40bp以上50kbp以下、40bp以上20kbp以下、40bp以上12kbp以下、40bp以上11kbp以下、50bp以上50kbp以下、50bp以上20kbp以下、50bp以上12kbp以下、50bp以上11kbp以下、60bp以上50kbp以下、60bp以上20kbp以下、60bp以上12kbp以下、60bp以上11kbp以下、70bp以上50kbp以下、70bp以上20kbp以下、70bp以上12kbp以下、70bp以上11kbp以下、80bp以上50kbp以下、80bp以上20kbp以下、80bp以上12kbp以下、80bp以上11kbp以下、90bp以上50kbp以下、90bp以上20kbp以下、90bp以上12kbp以下、90bp以上11kbp以下、100bp以上50kbp以下、100bp以上20kbp以下、100bp以上12kbp以下、100bp以上11kbp以下、200bp以上50kbp以下、200bp以上20kbp以下、200bp以上12kbp以下、200bp以上11kbp以下、500bp以上50kbp以下、500bp以上20kbp以下、500bp以上12kbp以下、500bp以上11kbp以下、1000bp以上50kbp以下、1000bp以上20kbp以下、1000bp以上12kbp以下、1000bp以上11kbp以下、1500bp以上50kbp以下、1500bp以上20kbp以下、1500bp以上12kbp以下、1500bp以上11kbp以下、2000bp以上50kbp以下、2000bp以上20kbp以下、2000bp以上12kbp以下、或2000bp以上11kbp以下。
编码该位点特异性DNA核酸酶的多聚核苷酸或包含其的载体以及单链DNA通过例如电穿孔法、转化法、转染法、接合法、原生质体法、基因枪(particle gun)法、农杆菌法等一般转化法导入宿主细胞。
根据本来具有的基因的缺失、导入的基因的表达、标记基因的表达等，能够对通过导入单链DNA而发生目标的同源重组的重组细胞进行筛选。
作为本发明的例示的实施方式，进一步在本说明书中公开了以下的物质、制造方法、用途、方法等。但本发明并不限于这些实施方式。
〔1〕一种突变丝状菌的制造方法，其中，包括：向宿主丝状菌中导入位点特异性DNA核酸酶和单链DNA，将该宿主的基因组DNA中由该位点特异性DNA核酸酶产生的切断位点的上游区域和下游区域，使用该单链DNA通过同源重组进行取代。
〔2〕如〔1〕所述的方法，其中，所述单链DNA的长度优选为10bp以上50kbp以下、10bp以上20kbp以下、10bp以上12kbp以下、10bp以上11kbp以下、20bp以上50kbp以下、20bp以上20kbp以下、20bp以上12kbp以下、20bp以上11kbp以下、30bp以上50kbp以下、30bp以上20kbp以下、30bp以上12kbp以下、30bp以上11kbp以下、40bp以上50kbp以下、40bp以上20kbp以下、40bp以上12kbp以下、40bp以上11kbp以下、50bp以上50kbp以下、50bp以上20kbp以下、50bp以上12kbp以下、50bp以上11kbp以下、60bp以上50kbp以下、60bp以上20kbp以下、60bp以上12kbp以下、60bp以上11kbp以下、70bp以上50kbp以下、70bp以上20kbp以下、70bp以上12kbp以下、70bp以上11kbp以下、80bp以上50kbp以下、80bp以上20kbp以下、80bp以上12kbp以下、80bp以上11kbp以下、90bp以上50kbp以下、90bp以上20kbp以下、90bp以上12kbp以下、90bp以上11kbp以下、100bp以上50kbp以下、100bp以上20kbp以下、100bp以上12kbp以下、100bp以上11kbp以下、200bp以上50kbp以下、200bp以上20kbp以下、200bp以上12kbp以下、200bp以上11kbp以下、500bp以上50kbp以下、500bp以上20kbp以下、500bp以上12kbp以下、500bp以上11kbp以下、1000bp以上50kbp以下、1000bp以上20kbp以下、1000bp以上12kbp以下、1000bp以上11kbp以下、1500bp以上50kbp以下、1500bp以上20kbp以下、1500bp以上12kbp以下、1500bp以上11kbp以下、2000bp以上50kbp以下、2000bp以上20kbp以下、2000bp以上12kbp以下、或2000bp以上11kbp以下。
〔3〕如〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，优选所述单链DNA含有2个DNA序列，所述2个DNA序列分别包含与所述宿主的基因组DNA中切断位点的上游区域和下游区域相同的区域。
〔4〕如〔3〕所述的方法，其中，优选所述2个DNA序列的长度分别为5bp以上、10bp以上、15bp以上、20bp以上、25bp以上、30bp以上、35bp以上、40bp以上、45bp以上、50bp以上、100bp以上、250bp以上、500bp以上、750bp以上、或1000bp以上。
〔5〕如〔1〕～〔4〕中任一项所述的方法，其中，优选所述单链DNA包含需要插入至所述宿主的基因组DNA的插入序列。
〔6〕如〔5〕所述的方法，其中，所述插入序列的长度，
优选在1bp以上50kbp以下、0.3kbp以上50kbp以下、1kbp以上50kbp以下、或3kbp以上50kbp以下、
更优选在1bp以上20kbp以下、0.3kbp以上20kbp以下、1kbp以上20kbp以下、或3kbp以上20kbp以下、
进一步优选在1bp以上10kbp以下、0.3kbp以上10kbp以下、1kbp以上10kbp以下、或3kbp以上10kbp以下、
进一步优选在1bp以上9kbp以下、0.3kbp以上9kbp以下、1kbp以上9kbp以下、或3kbp以上9kbp以下、
进一步优选在1bp以上5kbp以下、0.3kbp以上5kbp以下、1kbp以上5kbp以下、或3kbp以上5kbp以下。
〔7〕如〔1〕～〔4〕中任一项所述的方法，其中，优选所述单链DNA为不包含需要插入至所述宿主的基因组DNA的插入序列。
〔8〕如〔1〕～〔7〕中任一项所述的方法，其中，所述位点特异性DNA核酸酶优选为TALEN、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1或基于ZFN技术的人工DNA核酸酶，更优选为TALEN。
〔9〕如〔1〕～〔8〕中任一项所述的方法，其中，所述丝状菌优选为属于接合菌门、子囊菌门或担子菌门的菌，
更优选为属于接合菌门或子囊菌门的菌，
更优选为属于接合菌门的菌。
〔10〕如〔9〕所述的方法，其中，优选属于所述接合菌门的菌为根霉属菌。
〔11〕如〔10〕所述的方法，其中，优选所述根霉属菌为戴尔根霉(Rhizopusdelemar)或米根霉(Rhizopus oryzae)。
〔12〕如〔1〕～〔11〕中任一项所述的方法，其中，优选还包括：导入所述位点特异性DNA核酸酶和单链DNA，并且在所述宿主丝状菌中使外来核酸外切酶表达。
〔13〕如〔12〕所述的方法，其中，所述外来核酸外切酶优选为，
来自丝状菌的核酸外切酶，
更优选为来自根霉属的核酸外切酶，
进一步优选为来自米根霉(Rhizopus oryzae)或戴尔根霉(Rhizopus delemar)的核酸外切酶。
实施例
以下基于实施例对本发明进行更加详细的说明，本发明并不受此限定。
本实施例所使用的PCR引物如表1～6所示。
[表1]
[表2]
[表3]
[表4]
[表5]
[表6]
实施例1突变根霉属菌的制备
(1)色氨酸营养缺陷型株的制备
将戴尔根霉(Rhizopus delemar)JCM(Japan Collection of Microorganisms/理研)5557株(之后记载为5557株)、或来自5557株的色氨酸营养缺陷型株作为同源重组体的亲本株。色氨酸营养缺陷型株是对5557株进行离子束照射得到的突变导入株中筛选获得。离子束照射在独立行政法人日本原子力研究开发机构·高崎量子应用研究所的离子照射设施(TIARA)进行。照射使用AVF回旋加速器(AVF Cyclotron)加速12C5+，以220MeV的能量照射100～1250Gray。从照射过的菌体回收孢子，从中获得了在trpC基因区域有1个碱基缺损突变、表现为色氨酸营养缺陷型的戴尔根霉(Rhizopus delemar)02T6株。下面的实施例中，使用5557株或02T6株作为用于制备根霉属菌同源重组体的亲本株。
(2)质粒载体制备
以5557株的基因组DNA为模板，使用引物oJK162(序列号10)和oJK163(序列号11)通过PCR合成trpC基因的DNA片段。接着以质粒pUC18为模板，使用引物oJK164(序列号12)和oJK165(序列号13)通过PCR扩增DNA片段。将以上2个片段使用In-Fusion HD cloning Kit(Clontech)进行连接制备质粒pUC18-trpC。
接着，以5557株的基因组DNA为模板，分别使用引物oJK202(序列号14)和oJK204(序列号15)、以及oJK205(序列号16)和oJK216(序列号17)通过PCR扩增adh1的启动子片段和终止子片段。然后以上述构建的质粒pUC18-trpC为模板，使用引物oJK210(序列号18)和oJK211(序列号19)通过PCR扩增DNA片段。将以上3个片段使用In-Fusion HD cloning Kit(Clontech)进行连接，制备质粒pUC18-trpC-Padh-Tadh。获得的质粒中，trpC基因区域的下游中adh1启动子和终止子依次排列。
进一步，从pUC18-trpC-Padh-Tadh制备去除trpC基因区域的质粒载体。即，以上述构建的pUC18-trpC-Padh-Tadh为模板使用引物trpC-lost-F(序列号20)和trpC-lost-R(序列号21)通过PCR扩增DNA片段。将该片段使用In-Fusion HD cloning Kit(Clontech)进行连接，制备质粒pUC18-Padh-Tadh。
(3)pdc1、pdc2和trpC基因破坏用TALEN的制备
将pdc1、pdc2或trpC基因座作为靶标，制备TALEN。TALEN的制备中，将pdc1基因座作为靶标的制备是委托Transposagen Biopharmaceuticals公司，将pdc2或trpC基因座作为靶标的制备是委托Life technologies公司，获得Custom XTN TALEN(TransposagenBiopharmaceuticals公司提供的TALEN的商品名)或GeneArt Precision TALs(LifeTechnologies公司提供的TALEN的商品名)。这些试剂盒对应各个靶向基因，包含Left-TALEN和Right-TALEN的2种多聚核苷酸。以pdc1基因(序列号1)作为靶标的试剂盒包含LeftTALEN-pdc1(序列号2)和RightTALEN-pdc1(序列号3)，这些分别编码以pdc1基因的正义链中的5’-TGCCTGCTATTAAAATCG-3’(序列号96)和反义链中的5’-TTGATTTCCTTAAGACGG-3’(序列号97)的序列作为靶标的TALEN。此外，以pdc2基因(序列号4)作为靶标的试剂盒包括LeftTALEN-pdc2(序列号5)和RightTALEN-pdc2(序列号6)，这些分别编码以pdc2基因的正义链中的5’-TGGTGTTGCTGGTTCTTAT-3’(序列号98)和反义链中的5’-TGCCGACAATGTGAATCAC-3’(序列号99)的序列作为靶标的TALEN。此外，以trpC基因(序列号7)作为靶标的试剂盒包括LeftTALEN-trpC(序列号8)和RightTALEN-trpC(序列号9)，这些分别编码以trpC基因的正义链中的5’-TGCCAAGGCGCCAATGTAG-3’(序列号100)和反义链中的5’-TCGGAAATGGTGATTTTGT-3’(序列号101)的序列作为靶标的TALEN。
将编码pdc1基因用的LeftTALEN的多聚核苷酸插入上述(2)制备的戴尔根霉(R.delemar)用表达载体pUC18-trpC-Padh-Tadh中，制备在adh1启动子和adh1终止子的控制下表达TALEN的载体。即，以pUC18-trpC-Padh-Tadh作为模板，使用引物adhpro-R(序列号22)和adhter-F(序列号23)通过PCR扩增载体片段。接着以LeftTALEN-pdc1作为模板，使用引物adhpro-TALEN-F(序列号24)和TALEN-adhter-R(序列号25)通过PCR扩增LeftTALEN-pdc1片段。上述2个片段存在15个碱基重叠的区域。将这些2个片段通过In-Fusion HDcloning Kit(Clontech公司)进行连接，得到包含LeftTALEN-pdc1的质粒padh-LeftTALEN-pdc1。
同样从编码pdc1基因用的LeftTALEN的多聚核苷酸中，使用上述(2)制备的戴尔根霉(R.delemar)用表达载体pUC18-Padh-Tadh，制备在adh1启动子和adh1终止子的控制下表达TALEN的载体。即，以pUC18-Padh-Tadh为模板，使用引物adhpro-R(序列号22)和adhter-F(序列号23)通过PCR扩增载体片段。接着以LeftTALEN-pdc1为模板，使用引物adhpro-TALEN-F(序列号24)和TALEN-adhter-R(序列号25)通过PCR扩增LeftTALEN-pdc1片段，与载体片段连接，得到包含LeftTALEN-pdc1的质粒padh-LeftTALEN-pdc1-2。
编码pdc1基因用的RightTALEN的多聚核苷酸是使用上述(2)制备的戴尔根霉(R.delemar)用表达载体pUC18-Padh-Tadh，制备在adh1启动子和adh1终止子的控制下表达TALEN的载体。即，以pUC18-Padh-Tadh为模板，使用引物adhpro-R(序列号22)和adhter-F(序列号23)通过PCR扩增载体片段。接着以RightTALEN-pdc1为模板，使用引物adhpro-TALEN-F(序列号24)和TALEN-adhter-R(序列号25)通过PCR扩增RightTALEN-pdc1片段，与载体片段连接，得到包含RightTALEN-pdc1的质粒padh-RightTALEN-pdc1。
编码pdc2基因用的LeftTALEN和RightTALEN的多聚核苷酸是使用上述(2)制备的戴尔根霉(R.delemar)用表达载体pUC18-Padh-Tadh，制备在adh1启动子和adh1终止子的控制下表达TALEN的载体。即，以pUC18-Padh-Tadh为模板，使用引物adhpro-R(序列号22)和adhter-F(序列号23)通过PCR扩增载体片段。接着以LeftTALEN-pdc2或RightTALEN-pdc2为模板，使用引物adhpro-LifeTALEN-F(序列号26)和LifeTALEN-adhter-R(序列号27)通过PCR扩增LeftTALEN-pdc2或RightTALEN-pdc2片段，与载体片段连接，得到包含LeftTALEN-pdc2或RightTALEN-pdc2的质粒padh-LeftTALEN-pdc2或padh-RightTALEN-pdc2。
同样，编码trpC基因用的Left和RightTALEN的多聚核苷酸是使用上述(2)制备的戴尔根霉(R.delemar)用表达载体pUC18-Padh-Tadh，制备在adh1启动子和adh1终止子的控制下表达TALEN的载体。即，以pUC18-Padh-Tadh为模板，使用引物adhpro-R(序列号22)和adhter-F(序列号23)通过PCR扩增载体片段。接着以LeftTALEN-trpC或RightTALEN-trpC为模板，使用引物adhpro-Life TALEN-F(序列号26)和Life TALEN-adhter-R(序列号27)通过PCR扩增LeftTALEN-trpC或RightTALEN-trpC片段，与载体片段连接，得到包含LeftTALEN-trpC或RightTALEN-trpC的质粒padh-LeftTALEN-trpC或padh-RightTALEN-trpC。
(4)核酸外切酶表达载体的制备
以质粒pUC18(Takara Bio)作为模板，使用引物pRTR1-sal1-F(序列号28)和pRTR1-sal1-R(序列号29)进行PCR扩增pUC18的载体片段。此外以米根霉(Rhizopusoryzae)NRBC 5384株(以下记载为5384株)的纯化基因组溶液为模板，分别地使用引物sal1-ldhpro-F3(序列号30)和ldhpro-R(序列号31)扩增ldh启动子片段，使用引物ldhpro-exo1-F2(序列号32)和exo1-pdcter-R2(序列号33)扩增核酸外切酶基因片段，使用引物pdcTer-F(序列号34)和pdcTer-sal1-R(序列号35)扩增pdc终止子片段。将扩增的所述4个片段通过In-Fusion HD cloning Kit(Clontech公司)进行连接，制备质粒pldh-exo1。
此外，以5384株的纯化基因组溶液作为模板，分别地使用引物adhpro-exo1-F(序列号36)和exo1-adhter-R(序列号37)扩增核酸外切酶基因片段，以pUC18-trpC-Padh-Tadh作为模板，使用引物adhpro-R(序列号22)和adhter-F(序列号23)通过PCR扩增载体片段。将扩增的所述2个片段使用In-Fusion HD cloning Kit(Clontech公司)进行连接，制备质粒padh-exo1。
(5)以各基因座为靶标制备trpC敲入(knock-in)用质粒
制备质粒ptrpC-knock-in(pdc1)，其用于对pdc1基因座，去除pdc1基因ORF，敲入(knock-in)trpC基因区域。即，将以pUC18为模板使用引物pUC18-Pae1-F3(序列号38)和pUC18-Hind3-R3(序列号39)扩增的pUC18载体片段、以5557株的基因组为模板使用引物PDC1-upstr-F(序列号40)和PDC1-upstr-R(序列号41)扩增的pdc1基因的启动子位点片段、以5557株的基因组为模板使用引物trpCpro-R(序列号42)和trpCter-F(序列号43)扩增的trpC基因区域片段、以5557株的基因组为模板使用引物PDC1-downstr-F(序列号44)和PDC1-downstr-R(序列号45)扩增的pdc1基因的终止子位点片段，使用In-Fusion HDcloning Kit(Clontech)进行连接，构建ptrpC-knock-in(pdc1)。
同样制备质粒ptrpC-knock-in(pdc2)，其用于对pdc2基因座去除pdc2基因ORF，敲入trpC基因区域。即，将以pUC18为模板使用引物pUC18-Pae1-F3(序列号38)和pUC18-Hind3-R3(序列号39)扩增的pUC18载体片段、以5557株的基因组为模板使用引物PDC2-upstr-F(序列号46)和PDC2-upstr-R(序列号47)扩增的pdc2基因的启动子位点片段、以5557株的基因组为模板使用引物trpCpro-R(序列号42)和trpCter-F(序列号43)扩增的trpC基因区域片段、以5557株的基因组为模板使用引物PDC2-downstr-F(序列号48)和PDC2-downstr-R(序列号49)扩增的pdc2基因的终止子位点片段，使用In-Fusion HDcloning Kit(Clontech)进行连接，构建ptrpC-knock-in(pdc2)。
接着，制备质粒ptrpC-knock-in(trpC)，其用于通过对trpC基因座将从起始密码子开始缺失500bp的trpC基因(序列号7)敲入trpC基因区域，从而进行trpC基因破坏。即，将以pUC18-trpC-Padh-Tadh为模板使用引物trpC-inactive-F(序列号50)和trpC-inactive-R(序列号51)扩增得到的片段的两端，使用In-Fusion HD cloning Kit(Clontech)进行连接、构建trpC基因序列从起始密码子开始缺失500bp的ptrpC-knock-in(trpC)。
(6)以pdc1基因座为靶标的(trpC+FT1)敲入(knock-in)用质粒的制备
制备p(trpC+FT1)-knock-in(pdc1)，其为质粒ptrpC-knock-in(pdc1)的trpC序列的5’侧导入有adh1启动子和FT1基因的质粒。即，将以ptrpC-knock-in(pdc1)为模板使用引物trpCpro-R(序列号42)和pdc1ter-F(序列号52)扩增的载体片段、以及FT1质粒(在pUC18-trpC-Padh-Tadh的adh1启动子的下游侧导入FT1基因(序列号102)的质粒)为模板使用引物trpC-adh1pro-F(序列号53)和FT1-pdc1Ter-R(序列号54)扩增的包含adh1启动子和FT1基因的片段，通过In-Fusion HD cloning Kit(Clontech)进行连接，构建了p(trpC+FT1)-knock-in(pdc1)。
(7)以pdc1基因座为靶标的(trpC+PYC)敲入(knock-in)用质粒的制备
与(6)相同，制备p(trpC+PYC)-knock-in(pdc1)。即，将以ptrpC-knock-in(pdc1)为模板使用引物trpCpro-R(序列号42)和pdc1ter-F(序列号52)扩增的载体片段、以及PYC质粒(在pUC18-trpC-Padh-Tadh的adh1启动子下游侧导入PYC基因(序列号103)的质粒)为模板使用引物trpC-adh1pro-F(序列号53)和PYC-pdc1Ter-R(序列号55)扩增的含有adh1启动子和PYC基因的片段，使用In-Fusion HD cloning Kit(Clontech)进行连接，构建了p(trpC+PYC)-knock-in(pdc1)。
(8)双链DNA的制备
按照表7的No.1制备双链DNA。即，以质粒ptrpC-knock-in(pdc1)作为模板使用引物PDC1-upstr-F2(序列号56)和PDC1-downstr-R2(序列号57)扩增DNA片段，模板使用Dpn 1(TOYOBO)处理进行分解。接着将生成物使用苯酚/氯仿/异戊醇处理、和乙醇沉淀处理进行纯化，将纯化物溶解至适量的无DNA酶水(DNase free water)，得到pdc1基因破坏用双链DNA溶液。
(9)单链DNA的制备
按照表7的No.2～No.20，制备单链DNA。即，使用表7各条件的模板、引物1和引物2，扩增具有表7的插入长度的DNA片段，将模板使用Dpn1(TOYOBO)处理使其分解。接着将生成物用苯酚/氯仿/异戊醇处理、和乙醇沉淀处理进行纯化。纯化物进一步用λ核酸外切酶(Lambda Exonuclease)(NEW ENGLAND BioLabs)处理，按照上述同样的方法纯化，得到单链DNA。λ核酸外切酶处理是在37℃下过夜进行。
(10)通过基因枪导入基因
将上述(8)或(9)制备的单链DNA或双链DNA(表7的No.1～20)与上述(3)制备的LeftTALEN表达载体和RightTALEN表达载体、以及上述(4)制备的核酸外切酶表达载体混合，制备DNA溶液。
TALEN表达载体中，No.1和No.2使用padh-LeftTALEN-pdc1和padh-RightTALEN-pdc1、No.3～18使用padh-LeftTALEN-pdc1-2和padh-RightTALEN-pdc1、No.19使用padh-LeftTALEN-pdc2和padh-RightTALEN-pdc2、No.20使用padh-LeftTALEN-trpC和padh-RightTALEN-trpC。核酸外切酶表达载体中，No.1和No.2使用pldh-exo1，其余使用padh-exo1。只有No.1和No.2的条件下使用限制性内切酶处理基因导入质粒。即，padh-LeftTALEN-pdc1、padh-LeftTALEN-pdc1-2和padh-RightTALEN-pdc1经过限制性内切酶ScaI处理，质粒pldh-exo1经过限制性内切酶Pst1处理。DNA溶液中的LeftTALEN表达载体、RightTALEN表达载体、核酸外切酶表达载体、以及单链DNA或双链DNA的浓度比为：No.1和No.2中大约2：4：2：1、No.3～20中大约1：1：1：2。
将配制的DNA溶液(约1～3μg/μL)10μL加到100μL金颗粒溶液(60mg/mL、INBIOGOLD公司、粒径1μm)中并混合。进一步加入40μL 0.1M亚精胺，使用涡旋仪充分搅拌。再加入100μL 2.5M的CaCl2，使用涡旋仪充分搅拌1分钟后，以6000rpm离心30秒，除去上清。向得到的沉淀中加入200μL 70％EtOH，使用涡旋仪搅拌30秒后，以6000rpm离心30秒，除去上清。将得到的沉淀用100μL的100％EtOH再悬浮。
使用上述的DNA-金颗粒溶液，向上述(1)取得的02T6株或5557株的孢子通过GDS-80(Nepa Gene公司的基因枪)导入基因。No.1～No.19的条件时使用02T6株，导入基因后的孢子在无机琼脂培养基(20g/L葡萄糖、1g/L硫酸铵、0.6g/L磷酸二氢钾、0.25g/L七水硫酸镁、0.09g/L七水硫酸锌、15g/L琼脂)上，30℃下静置培养1周左右。No.20的条件时使用5557株的孢子，导入基因后的孢子在PDB培养基(39g/L PDB)上、30℃下静置培养1周左右。
(11)pdc1基因缺陷株的筛选(No.1～No.18)
从上述(10)培养的菌体中回收孢子，用配制为pH3的无机琼脂培养基(20g/L葡萄糖、1g/L硫酸铵、0.6g/L磷酸二氢钾、0.25g/L七水硫酸镁、0.09g/L七水硫酸锌、15g/L琼脂)进行分离。使用牙签挑取一部分生长的菌株的菌丝，悬浮于10mM Tris-HCl(pH 8.5)，95℃下孵育10分钟。之后在10mM Tris-HCl(pH 8.5)进行适当稀释，制成菌落PCR用的基因组模板溶液。菌落PCR使用上述基因组模板溶液、引物pdc1-up2(序列号58)和trpC(d)-1(序列号59)、以及KOD FX Neo(TOYOBO)。使用上述引物进行菌落PCR时、在pdc1基因座中如果发生trpC基因片段或trpC基因与其它基因片段的敲入时，扩增适当长度的DNA片段。将通过菌落PCR得到DNA扩增片段的菌株作为敲入株(pdc1基因缺陷株)。
(12)pdc2基因缺陷株的选择(No.19)
从所述(10)培养的菌体中回收孢子，用配置为pH3的无机琼脂培养基(20g/L葡萄糖、1g/L硫酸铵、0.6g/L磷酸二氢钾、0.25g/L七水硫酸镁、0.09g/L七水硫酸锌、15g/L琼脂)进行分离。用牙签挑取一部分生长菌株的菌丝，悬浮至10mM Tris-HCl(pH 8.5)、95℃下孵育10分钟。之后使用10mM Tris-HCl(pH 8.5)进行适当稀释，制成菌落PCR用的基因组模板溶液。菌落PCR使用上述基因组模板溶液、引物pdc2-down1(序列号60)和trp C(d)-7(序列号61)、以及KOD FX Neo(TOYOBO)进行。使用上述引物进行菌落PCR时、pdc2基因座中如果发生trpC基因片段的敲入，扩增适当长度的DNA片段。将通过菌落PCR得到的DNA扩增片段的菌株作为敲入株(pdc2基因缺陷株)。
(13)trpC基因缺陷株的筛选(No.20)
从上述(10)培养的菌体中回收孢子，用配制为pH6的5-FAA培养基(10g/L葡萄糖、3.36g/L酵母氮源基础无氨基酸(Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids)、0.03g/L色氨酸、5g/L 5-氟代邻氨基苯甲酸、15g/L琼脂)上进行培养。生长的菌株继续在5-FAA培养基上培养。使用牙签挑取一部分生长的菌株的菌丝，悬浮于10mM Tris-HCl(pH8.5)、在95℃孵育10分钟。之后使用10mM Tris-HCl(pH 8.5)进行适当稀释，制成菌落PCR用的基因组模板溶液。菌落PCR使用上述基因组模板溶液、引物pdc1-down3(序列号62)和trpC(d)-5(序列号63)、以及KOD FX Neo(TOYOBO)进行。使用上述引物进行菌落PCR时，在trpC基因座如果发生500bp缺陷的trpC基因片段的敲入，扩增DNA片段的条带位置发生转移。将通过菌落PCR得到的DNA扩增片段的条带发生转移的菌株作为敲入株(trpC基因缺陷株)。
(14)重组率的比较
(a)单链DNA vs双链DNA
对供体DNA为双链DNA时和单链DNA时(表7的No.1和No.2)两者间进行同源重组效率的比较。结果如表8所示。使用双链DNA时，没有获得导入长链序列的同源重组株，但是使用单链DNA时，成功获得了导入长链序列的同源重组株。而且，供体DNA为单链DNA时，成功获得导入最长约8.8 kbp长链序列的同源重组株(表7的No.2～4)。
[表8]
(b)相对于宿主基因组DNA的相同区域的长度
分析了单链DNA的与宿主基因组DNA的相同区域的链长对重组效率的影响(表7的No.2、8和9)。结果如表9所示。
[表9]
(15)pdc3基因缺陷株的取得
(a)质粒载体的制备
制备将上述(2)构建的pUC18-trpC-Padh-Tadh的adh1启动子改变为cipC启动子的质粒载体。即，以该pUC18-trpC-Padh-Tadh为模板使用引物adhter-F(序列号23)和trpCter-R(序列号104)通过PCR扩增载体片段，另外以5557株的基因组DNA为模板使用引物trpCter-cicCpro-F(序列号105)和cipCpro-adhter-R(序列号106)通过PCR扩增cipC启动子区域片段。将以上的2个片段使用In-Fusion HD cloning Kit(Clontech)进行连接，制备质粒pUC18-trpC-PcipC-Tadh。
接着从上述构建的pUC18-trpC-PcipC-Tadh制备了去除trpC基因区域的质粒载体。即，以所述pUC18-trpC-PcipC-Tadh为模板，使用引物trpC-lost-F2(序列号107)和trpC-lost-R2(序列号108)通过PCR扩增DNA片段。将该片段使用In-Fusion HD cloningKit(Clontech)进行连接，制备了质粒pUC18-PcipC-Tadh。
(b)pdc3基因破坏用TALEN的制备
以pdc3基因座作为靶标，制备TALEN。TALEN的制备委托Life technologies公司，得到GeneArt PerfectMatch TALs(Life technologies公司提供的TALEN的商品名)。所述试剂盒包含针对靶基因的Left-TALEN和Right-TALEN的2种多聚核苷酸。以pdc3基因(序列号143)作为靶标的试剂盒包含LeftTALEN-pdc3(序列号144)和RightTALEN-pdc3(序列号145)，这些分别编码以pdc3基因的正义链中的5’-CCGGAATCGACACGATTTT-3’(序列号146)和反义链中的5’-CGTAACTTACCATATTGTA-3’(序列号147)的序列作为靶标的TALEN。
将编码pdc3基因用的LeftTALEN的多聚核苷酸插入上述(15)(a)制备的戴尔根霉(R.delemar)用表达载体pUC18-PcipC-Tadh中，制备在cipC启动子和adh1终止子的控制下表达TALEN的载体。即，以pUC18-PcipC-Tadh为模板，使用引物cipCpro-R(序列号109)和adhter-F(序列号23)通过PCR扩增载体片段。接着以LeftTALEN-pdc3为模板，使用引物cipCpro-Life TALEN-F(序列号110)和Life TALEN-adhter-R(序列号27)通过PCR扩增LeftTALEN-pdc3片段。上述2个片段存在15个碱基重叠的区域。将这2个片段使用In-FusionHD cloning Kit(Clontech公司)进行连接，得到包含LeftTALEN-pdc3的质粒pcipC-LeftTALEN-pdc3。
同样将编码pdc3基因用的RightTALEN的多聚核苷酸插入上述(15)(a)制备的戴尔根霉(R.delemar)用表达载体pUC18-PcipC-Tadh中，制备在cipC启动子和adh1终止子的控制下表达TALEN的载体。即，以pUC18-PcipC-Tadh为模板，使用引物cipCpro-R(序列号109)和adhter-F(序列号23)通过PCR扩增载体片段。接着以RightTALEN-pdc3为模板，使用引物cipCpro-Life TALEN-F(序列号110)和Life TALEN-adhter-R(序列号27)通过PCR扩增RightTALEN-pdc3片段。上述2个片段中存在15个碱基重叠的区域。将这2个片段通过In-Fusion HD cloning Kit(Clontech公司)进行连接，得到包含RightTALEN-pdc3的质粒pcipC-RightTALEN-pdc3。
(c)核酸外切酶表达载体的制备
分别以上述(4)制备的质粒pldh-exo1为模板，使用引物cipCpro-exo1-F(序列号111)和exo1-adhter-R2(序列号142)通过PCR扩增核酸外切酶基因片段，以上述(15)(a)制备的质粒pUC18-PcipC-Tadh为模板，使用引物cipCpro-R(序列号109)和adhter-F(序列号23)通过PCR扩增载体片段。上述2个片段存在15个碱基重叠的区域。将这2个片段使用In-Fusion HD cloning Kit(Clontech公司)进行连接，得到质粒pcipC-exo1。
(d)以pdc3基因座为靶标的trpC敲入(knock-in)用质粒的制备
制备质粒ptrpC-knock-in(pdc3)，其用于对pdc3基因座去除pdc3基因ORF，敲入trpC基因区域。即，将以pUC18为模板使用引物pUC18-Pae1-F3(序列号38)和pUC18-Hind3-R3(序列号39)扩增的pUC18载体片段、以5557株的基因组DNA为模板使用引物pdc3-upstr-F(序列号112)和pdc3-upstr-R2(序列号113)扩增的pdc3基因启动子片段、以5557株的基因组DNA为模板使用引物pdc3-downstr-F2(序列号114)和pdc3-downstr-R(序列号115)扩增的pdc3基因终止子片段进行扩增。以上3个片段使用In-Fusion HD cloning Kit(Clontech)进行连接，制备pknock-in(pdc3)。
接着，扩增以pknock-in(pdc3)为模板使用引物pdc3-upstr-R(序列号116)和pdc3-downstr-F(序列号117)扩增的DNA片段，以5557株的基因组DNA为模板使用引物trpCpro-R(序列号42)和trpCter-F(序列号43)扩增的trpC基因区域片段。以上2个片段使用In-Fusion HD cloning Kit(Clontech)进行连接，制备了ptrpC-knock-in(pdc3)。
(e)单链DNA的制备
将质粒ptrpC-knock-in(pdc3)作为PCR的模板，使用pdc3-upstr-F2(序列号118)和pdc3-downstr-R2-P(序列号119，5’侧发生磷酸化)作为引物，除此以外，与上述(9)相同的步骤得到单链DNA。
(f)通过基因枪导入基因
按照与上述(10)相同的步骤，制备含有单链DNA的DNA-金颗粒溶液，使用该溶液对02T6株的孢子导入基因，对获得的孢子进行培养。单链DNA使用上述(15)(e)制备的单链DNA。TALEN表达载体使用上述(15)(b)制备的pcipC-LeftTALEN-pdc3和pcipC-RightTALEN-pdc3。核酸外切酶表达载体使用上述(15)(c)制备的pcipC-exo1。DNA溶液中pcipC-LeftTALEN-pdc3、pcipC-RightTALEN-pdc3、pcipC-exo 1以及单链DNA的浓度比约为1：1：1：2。
(g)pdc3基因缺陷株的筛选
与上述(11)相同的步骤，从上述(15)(f)培养的菌体中回收孢子，进行菌株的分离和基因组模板溶液的制备。接着将这些作为模板通过菌落PCR筛选在pdc3基因座中被敲入trpC基因区域片段的pdc3基因缺陷株。菌落PCR使用上述基因组模板溶液、引物pdc3-up(序列号120和trpC(d)-1(序列号59)、以及KOD FX Neo(TOYOBO)进行。使用上述引物进行菌落PCR时，如果在pdc3基因座中发生trpC基因区域片段的敲入，扩增适当长度的DNA片段。将通过菌落PCR得到DNA扩增片段的菌株作为敲入株(pdc3基因缺陷株)。
(h)在pdc3基因座的同源重组效率
对获得的pdc3基因缺陷株的同源重组效率进行调查(表10)。
[表10]
实施例2突变根霉属菌(米根霉(Rhizopus oryzae))的制备
(1)腺嘌呤营养缺陷型株的制备
使用米根霉(Rhizopus oryzae)NRBC 5384株(下面记载为5384株)作为同源重组体的亲本株。腺嘌呤营养缺陷型株是对5384株的孢子UV照射后形成的突变导入株中筛选获得。UV照射使用灭菌灯GL15(Hitachi Appliances)，照射1分钟。回收照射过的孢子，从其中获得了ade 1基因区域中具有突变、表现为腺嘌呤营养缺陷型的米根霉(Rhizopus oryzae)AM002株。以后的实施例中，使用米根霉(Rhizopus oryzae)AM002株作为用于制备米根霉(Rhizopus oryzae)同源重组体的亲本株。
(2)米根霉(Rhizopus oryzae)用质粒载体的制备
以5384株的基因组DNA作为模板，使用引物pUC18-adh1pro-F(序列号121)和adh1pro-pUC18-R(序列号122)通过PCR扩增adh1的启动子片段。接着以pUC18作为模板使用引物pUC18-Pae1-F3(序列号38)和pUC18-Hind3-R3(序列号39)通过PCR扩增DNA片段。将以上的2个片段使用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)进行连接，制备质粒pUC18-Padh(RO)。
接着以5384株的基因组DNA为模板，使用引物adh1pro-adh1ter-F(序列号123)和adh1ter-pUC18-R(序列号124)通过PCR扩增adh1的终止子片段。而且以pUC18-Padh(RO)为模板，使用引物pUC18-Pae1-F3(序列号38)和adh1pro-adh1ter-R(序列号125)通过PCR扩增DNA片段。将以上的2个片段使用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)进行连接，制备质粒pUC18-Padh-Tadh(RO)。
(3)ldh A基因破坏用TALEN的制备
以ldh A基因座作为靶标，制备TALEN。TALEN的制备委托Life technologies公司，得到GeneArt Precision TALs(Life technologies公司提供的TALEN的商品名)。所述试剂盒包含对应靶标基因的Left-TALEN和Right-TALEN的2种多聚核苷酸。以ldh A基因(序列号148)作为靶标的试剂盒包含LeftTALEN-ldh A(序列号149)和RightTALEN-ldh A(序列号150)，它们分别编码以ldh A基因的正义链中的5’-TGCAGATGCTGCCAGTATA-3’(序列号151)和反义链中的5’-TCCTCTGCGCTACCTGCTC-3’(序列号152)的序列作为靶标的TALEN。
将编码ldh A基因用的LeftTALEN的多聚核苷酸插入上述(2)制备的米根霉(R.oryzae)用表达载体pUC18-Padh-Tadh(RO)中，制备在adh1启动子和adh1终止子的控制下表达TALEN的载体。即，以pUC18-Padh-Tadh(RO)作为模板使用引物adh1pro(o)-R(序列号126)和adh1ter(o)-F(序列号127)通过PCR扩增载体片段。接着以LeftTALEN-ldh A作为模板使用引物adh1pro(o)-LifeTALEN-F(序列号128)和LifeTALEN-adh1ter(o)-R(序列号129)通过PCR扩增LeftTALEN-ldh A片段。上述2个片段存在15碱基重叠的区域。将这2个片段通过In-Fusion HD cloning Kit(Clontech公司)进行连接，得到含有LeftTALEN-ldh A的质粒padh-LeftTALEN-ldhA(RO)。
同样将编码ldh A基因用的RightTALEN的多聚核苷酸插入pUC18-Padh-Tadh(RO)中，制备在adh1启动子和adh1终止子的控制下表达TALEN的载体。即，以pUC18-Padh-Tadh(RO)为模板，使用引物adh1pro(o)-R(序列号126)和adh1ter(o)-F(序列号127)通过PCR扩增载体片段。接着以RightTALEN-ldh A为模板，使用引物adh1pro(o)-LifeTALEN-F(序列号128)和LifeTALEN-adh1ter(o)-R(序列号129)通过PCR扩增得到RightTALEN-ldh A片段。上述2个片段中，存在15个碱基重叠的区域。将这2个片段使用In-Fusion HD cloning Kit(Clontech公司)进行连接，获得包含RightTALEN-ldh A的质粒padh-RightTALEN-ldh A(RO)。
(4)将ldh A基因座作为靶标的ade1敲入(knock-in)用质粒的制备
制备质粒pade1-knock-in(ldhA)，其用于对ldhA基因座去除ldh A基因ORF的一部分，敲入ade1基因区域。即，将以pUC18为模板使用引物pUC18-Pae1-F3(序列号38)和pUC18-Hind3-R3(序列号39)扩增的pUC18载体片段、以5384株的基因组DNA为模板使用引物ldhA-upstr-F(序列号130)和ldhA-upstr-R2(序列号131)扩增的、包含一部分ldhA基因的ldh A基因启动子位点片段、以及以5384株的基因组DNA为模板使用引物ldhA-downstr-F2(序列号132)和ldhA-downstr-R(序列号133)扩增的ldhA基因终止子位点片段进行扩增。将以上3个片段使用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)进行连接，制备pknock-in(ldhA)。
接着，将以pknock-in(ldhA)为模板使用引物ldhA-upstr-R(序列号134)和ldhA-downstr-F(序列号135)扩增的DNA片段，以及以5384株的基因组DNA为模板使用引物ade1pro-R(序列号136)和ade1ter-F(序列号137)扩增的ade1基因区域片段进行扩增。将以上2个片段使用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)连接，制备pade1knock-in(ldhA)。
(5)双链DNA的制备
将质粒pade1knock-in(ldhA)作为模板，使用引物ldhA-upstr-F2(序列号138)和ldhA-downstr-R2-P(序列号139，5’侧发生磷酸化)扩增DNA片段，将模板经过Dpn1(TOYOBO)处理进行分解。接着将生成物经过苯酚/氯仿/异戊醇处理、以及乙醇沉淀处理进行纯化，纯化物溶解至适量的无DNA酶水(DNase free water)，得到ldhA基因破坏用的双链DNA溶液。
(6)单链DNA的制备
接着，将上述(5)得到的双链DNA使用λ核酸外切酶(Lambda Exonuclease)(NEWENGLAND BioLabs)处理后、按照与上述同样的方法纯化，得到单链DNA。λ核酸外切酶处理是在37℃下过夜进行。
(7)通过基因枪导入基因
按照与实施例1(10)相同的步骤，制备包含单链或双链DNA的DNA-金颗粒溶液，使用所述溶液向AM002株的孢子中导入基因，培养获得的孢子。单链DNA或双链DNA使用上述(5)或(6)制备的单链DNA或双链DNA。TALEN表达载体使用上述(3)制备的padh-LeftTALEN-ldh A(RO)和padh-RightTALEN-ldh A(RO)。核酸外切酶表达载体使用实施例1(4)制备的pldh-exo1。DNA溶液中padh-LeftTALEN-ldh A(RO)、padh-Right-TALEN-ldh A(RO)、pldh-exo1以及单链DNA或双链DNA的浓度比大约为1：1：1：2。
(8)ldhA基因缺陷株的选择
从上述(7)培养的菌体中回收孢子，按照与实施例1(11)相同的步骤，进行菌株的分离和基因组模板溶液的制备。接着以这些为模板通过菌落PCR对ldhA基因座中被敲入ade1基因区域片段的ldhA基因缺陷株进行筛选。菌落PCR是使用上述基因组模板溶液、引物ldhA-up(序列号140)和ade1-15(序列号141)、以及KOD FX Neo(TOYOBO)进行。使用上述引物进行菌落PCR时，ldhA基因座中如果发生ade1基因区域片段的敲入时，会扩增适当长度的DNA片段。将通过菌落PCR获得DNA扩增片段的菌株作为敲入株(ldhA基因缺陷株)。
(9)米根霉(Rhizopus oryzae)的同源重组效率的比较
(a)单链DNA vs双链DNA
对供体DNA为双链DNA时和单链DNA时的两者间进行同源重组效率的比较。结果如表11所示。使用双链DNA时没有获得导入长链序列的同源重组株，但是使用单链DNA时能够成功获得导入长链序列的同源重组株。
[表11]
“相同序列长度”表示单链DNA和双链DNA的上游侧和下游侧的两者中存在表中长度相同的序列。
序列表
<110> 花王株式会社
<120> 突变丝状菌的制造方法
<130> KS1478
<150> JP2016-019676
<151> 2016-02-04
<150> JP2016-152972
<151> 2016-08-03
<160> 152
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1735
<212> DNA
<213> 戴尔根霉（Rhizopus delemar）
<220>
<223> pdc1
<400> 1
atgcctgcta ttaaaatcgg tcaacatctc cttaaccgtc ttaaggaaat caacattgat 60
gttgtctttg gtgttcctgg tgatttcaac atggtaagca gacaattgaa ttgaacgaga 120
gcctataaac ttattatttc tatagccctt gttggatatc attgaagatg acccagaact 180
tacctggggt aacaatgcca acgaattgaa tgcatcttat gcagctgatg gttatgctcg 240
tattcgtggt gcaggtgctg ttgtcactac ctttggtgta ggtgagctgt ctgctgtcaa 300
cggtattgct ggttcatact ctgagatgct tcccgtgatt cacatcgtcg gtactccttc 360
tactaaatcc caagctgccg gtgccatgct tcaccactct ttgggtgacg gtaactttga 420
tgtgttcttc aacatgtcct ccatgattgc ctgtgcctct gctcacctca agaaacaaac 480
ggccattgca gaaattgacc gtgtgatctc ccaagctgtt ctctccaagc gtacaggtta 540
cattggtatc cctatcgatc tgatcaagac tgaggttgaa gtacctgagc ccattcctgc 600
cctcaagacc gaattaccca aaaacccagc tgatgtccaa gcgattgcct tgagagtggt 660
cacggatgcg atcgccaaag cccaattccc tgtgattgtt gtcgatggct gtgtgcttcg 720
ccagagatgc caaaaggcag tacaagcctt tatcgaacgt actggtttcc ctacttatgt 780
tgctcctatg ggtaagggtg ccgttgacga atcctctgtg agttaccgtg gctgctactc 840
gggtaatgtc acattggaag cagtgaatga agagatcaag caagccgatt tgatcatcga 900
agtgggctcc atcaagtctg atttcaacac gggtaacttt tcatactctc tcgaccgttc 960
caagacgatc accttgcact cctttgccac catcgtgttt tgtgctgaat accaaaaggt 1020
ctccatgctc gaattcattc ctctcttgac ccaagccctt cccgaacaac cccgtcaatt 1080
caacctgggt ccccgcccaa gacccgtacc tatccaaccc ggtaccgaaa tcacccacaa 1140
ctacttttgg cacaaggtac ccgaattcat ggatgagaac gccattgtct gtgccgagac 1200
cggtacagct gaatttgctt cactcaacat ggacggaccc aagggaacga cttatatcac 1260
ccaattcctc tggggctcta tcggtttctc agtaggtgcc gctgtgggtg ctgcgatcgc 1320
cgctcgtgat cgtcgtgtgt atctctttgt cggtgatggt tccttccaat tgacctgtca 1380
agaaatctct ggcttccttc gccatggttt gacacctgtg atcttcttgc tgaacaatga 1440
cggttacttg atcgaaaaac tcattcacgg tcccgaacgt gcctataata actttcaaat 1500
gtgggaatac agcaagacgc ttgattattt cggtgctcat cttgaacaca acaagtccat 1560
gggtgttcct cccgttggct tcgaaggcaa ggtagccaca cgcgatgaat ttgaatccgc 1620
catgagacag gttcaagcca atcctgacaa gattcatttc cttgaagtca ttatgcctca 1680
atttgactct cctcgtgaac ttgaactctt ggttgccaac tctgaaaacc gttaa 1735
<210> 2
<211> 3006
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LeftTALEN-pdc1
<400> 2
atggactaca aagaccatga cggtgattat aaagatcatg acatcgatta caaggatgac 60
gatgacaaga tggcccccaa gaagaagagg aaggtgggca ttcaccgcgg ggtacctatg 120
gtggacttga ggacactcgg ttattcgcaa cagcaacagg agaaaatcaa gcctaaggtc 180
aggagcaccg tcgcgcaaca ccacgaggcg cttgtggggc atggcttcac tcatgcgcat 240
attgtcgcgc tttcacagca ccctgcggcg cttgggacgg tggctgtcaa ataccaagat 300
atgattgcgg ccctgcccga agccacgcac gaggcaattg taggggtcgg taaacagtgg 360
tcgggagcgc gagcacttga ggcgctgctg actgtggcgg gtgagcttag ggggcctccg 420
ctccagctcg acaccgggca gctgctgaag atcgcgaaga gagggggagt aacagcggta 480
gaggcagtgc acgcctggcg caatgcgctc accggggccc ccttgaactt gaccccagac 540
caggtagtcg caatcgcgaa caataatggg ggaaagcaag ccctggaaac cgtgcaaagg 600
ttgttgccgg tcctttgtca agaccacggc ctgactcccg atcaagttgt agcgattgcg 660
tcgcatgacg gagggaaaca agcattggag actgtccaac ggctccttcc cgtgttgtgt 720
caagcccacg gtttgacgcc tgcacaagtg gtcgccatcg ccagccatga tggcggtaag 780
caggcgctgg aaacagtaca gcgcctgctg cctgtactgt gccaggatca tggactgacc 840
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caaaggttgt tgccggtcct ttgtcaagac cacggcctga ccccagacca ggtagtcgca 960
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gggaaacaag cattggagac tgtccaacgg ctccttcccg tgttgtgtca agcccacggt 1140
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caggtagtcg caatcgcgtc aaacattggg ggaaagcaag ccctggaaac cgtgcaaagg 1620
ttgttgccgg tcctttgtca agaccacggc ctgactcccg atcaagttgt agcgattgcg 1680
tcgaacattg gagggaaaca agcattggag actgtccaac ggctccttcc cgtgttgtgt 1740
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cataaattga aatatgtgcc tcatgaatat attgaattaa ttgaaattgc cagaaattcc 2520
actcaggata gaattcttga aatgaaggta atggaatttt ttatgaaagt ttatggatat 2580
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actaattgta atggagctgt tcttagtgta gaagagcttt taattggtgg agaaatgatt 2940
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ttttaa 3006
<210> 3
<211> 3006
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RightTALEN-pdc1
<400> 3
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cctcatgctc ccgcattgat caaaagaacc aaccggcgga ttcccgagag aacttcccat 2400
cgagtcgcgg gatcccaact agtcaaaagt gaactggagg agaagaaatc tgaacttcgt 2460
cataaattga aatatgtgcc tcatgaatat attgaattaa ttgaaattgc cagaaattcc 2520
actcaggata gaattcttga aatgaaggta atggaatttt ttatgaaagt ttatggatat 2580
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ttttaa 3006
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<211> 1733
<212> DNA
<213> 戴尔根霉（Rhizopus delemar）
<220>
<223> pdc2
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<213> 戴尔根霉（Rhizopus delemar）
<220>
<223> trpC
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agctgccaag gcgccaatgt agttgtctac agaaacgaca aaatcaccat ttccgaaatt 120
gagcaattgg ctcctcgcaa tattgtcatc tcacctggcc ctggccaccc ttccaccgat 180
gccggtgtct ctcgagaggc cattcgagct tttgcaggaa agattcccat cttgggtatt 240
tgtatgggtc agcaatgtat gtatgaagtg tacggtggta aagtgtcata tgcaggtgat 300
attgtgcatg gcaaggcatc cagcatcaag catgacagtc gaggtatctt caagggcgtt 360
cctcaaaaca acatggtcac tcgttaccat tcccttgctg gcatgccttc tactttacct 420
gaaacattag aagtcactgc gactaccgac gatggtatca tcatgggcat tcgacacaag 480
gaatacactg tcgaaggtgt tcagttccat cctgaaagta tcctttgtga acacggacat 540
acgatgatca acaacttctt aagcttgcgt ggtggcacct gggaagagaa tcctgcagcc 600
ggtgttgtct ttaagaaagc tcgttccgaa acacccaaaa tcagtgctag tgaatcccaa 660
ctcgatctct ctcagcaaca acctgccgca gcaccttcca tcttgacccg catttactct 720
caacgactca aggatgttca ggcagccaag gagattcccg gccagacatt tgaagattta 780
gaaaaacttt taaagttgca cgtcgcccca cctcttcaag acgtcgtcgc tcgcgtgcgt 840
caaagcaagc ccgccttgat ggccgaagtc aagcgtgcct ctccctcgaa aggaaacatt 900
gatgtttcgg ccaacgcggc tgagcaggca cttcaatatg ctttagcagg tgcaagcgtc 960
gtctctgttc tgactgaacc caaatggttc cgcggtacga ttcatgatat gcatcaggtc 1020
cgagaggcct tgagccatct gcccaaccgt ccttgtgtgt tgagaaagga ttttattgtc 1080
gatcgctatc aaatcttgga aggtcgtctg tacggtgctg atactatctt gttgatcgtg 1140
gccatgctga atgatgaaca actgcacgaa ttgtatcact atgcgaaatc attaggtatg 1200
gaacccttgg tcgaagtcaa taatacggaa gagatggccc gtgccaatgc tttgggcgca 1260
cgtctggtgg gtgttaataa tcgcaacttg cacagctttg atgttgatat ggaaaccacg 1320
agtcgattgg tagagatggt gcctgaagga acgatcttgt gtgcactttc tggtattact 1380
ggacgagctg atgttgaaat gtacgtcaaa cagggtgtgc acgctgtctt ggtgggtgaa 1440
gccctgatgc gtgcttggaa tttgaaggag tttgtgtctg atttgttggg tcatgaaaag 1500
aaggatcctg tgcctgtgtc caaggaatca aaatcttcac tagtcaaggt atgtggtatc 1560
tctagtgtgg atgcagcagt tgaagcagcc aagtcagggg ctgacttgat tggtcttatc 1620
tttgctgaaa agtccaaacg aaaagtgtct ttggaaagag ctcaagaaat cgtgtcctca 1680
gtgcgtgcgt tggatattca agtcaaacga acgttatcaa atgatgattc tcaactggat 1740
tggttccaga tgcacaagcg tctcttggaa aagcgagcaa gaaaaccttt ggtagttggc 1800
gtgtttgtga atcaatcgat tgaatacatg actgaggtgg caacgacagt cggactggac 1860
cttattcagc tgcatggaac cgaatcaacg gagcttgcac gctatttacc cgtgcctgtc 1920
atcaaagctt tccatatcga cagtggtgag ttcaatgaag ctcagatacc aaacctaaat 1980
caaccaggct cttatcatta tgtcttactg gacgctaaag tgcccagctt accatcggat 2040
caacaaggtg gacgtggtgt caagtttgat tggtcaattg ctaccaaaat cgtgaaacat 2100
aggcactttg agtttttggg taatcaagat ttccctgtca tcttggctgg tgggttggat 2160
cctaccaatg tggcatctgc cattcaacag gtgaaaccct ggattgtgga tgtgtcgagt 2220
ggtgttgaaa cagatggagt gaaggattta gaaaagattc gtgcctttgt taaaactgtc 2280
cagtcaacac aattttaa 2298
<210> 8
<211> 3075
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LeftTALEN-trpC
<400> 8
atgggaaaac ctattcctaa tcctctgctg ggcctggatt ctaccggagg catggcccct 60
aagaaaaagc ggaaggtgga cggcggagtg gacctgagaa cactgggata ttctcagcag 120
cagcaggaga agatcaagcc caaggtgaga tctacagtgg cccagcacca cgaagccctg 180
gtgggacacg gatttacaca cgcccacatt gtggccctgt ctcagcaccc tgccgccctg 240
ggaacagtgg ccgtgaaata tcaggatatg attgccgccc tgcctgaggc cacacacgaa 300
gccattgtgg gagtgggaaa acagtggtct ggagccagag ccctggaagc cctgctgaca 360
gtggccggag aactgagagg acctcctctg cagctggata caggacagct gctgaagatt 420
gccaaaaggg gcggagtgac cgcggtggaa gccgtgcacg cctggagaaa tgccctgaca 480
ggagcccctc tgaacctgac ccccgaacag gtggtggcca ttgccagcaa caacggcggc 540
aagcaggccc tggaaaccgt gcagagactg ctgcccgtgc tgtgccaggc ccatggcctg 600
acacctgaac aggtggtggc tatcgcctct cacgacggag gaaaacaggc tctggaaaca 660
gtgcagcggc tgctgcctgt gctgtgtcag gctcacggct tgactccaga acaggtggtg 720
gctattgctt cccacgacgg ggggaaacag gccctggaaa ctgtgcagcg cctgctgcca 780
gtgctgtgcc aggctcacgg actgaccccc gaacaggtgg tggccattgc cagcaacatc 840
ggcggcaagc aggccctgga aaccgtgcag agactgctgc ccgtgctgtg ccaggcccat 900
ggcctgacac ctgaacaggt ggtggctatc gcctctaata tcggaggaaa acaggctctg 960
gaaacagtgc agcggctgct gcctgtgctg tgtcaggctc acggcttgac tccagaacag 1020
gtggtggcta ttgcttccaa caacgggggg aaacaggccc tggaaactgt gcagcgcctg 1080
ctgccagtgc tgtgccaggc tcacgggctg acccccgaac aggtggtggc cattgccagc 1140
aacaacggcg gcaagcaggc cctggaaacc gtgcagagac tgctgcccgt gctgtgccag 1200
gcccatggcc tgacacctga acaggtggtg gctatcgcct ctcacgacgg aggaaaacag 1260
gctctggaaa cagtgcagcg gctgctgcct gtgctgtgtc aggctcacgg cttgactcca 1320
gaacaggtgg tggctattgc ttccaacaac ggggggaaac aggccctgga aactgtgcag 1380
cgcctgctgc cagtgctgtg ccaggctcac ggcctcactc ccgaacaggt ggtggccatt 1440
gccagccacg acggcggcaa gcaggccctg gaaaccgtgc agagactgct gcccgtgctg 1500
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aaacaggctc tggaaacagt gcagcggctg ctgcctgtgc tgtgtcaggc tcacggcttg 1620
actccagaac aggtggtggc tattgcttcc aatattgggg ggaaacaggc cctggaaact 1680
gtgcagcgcc tgctgccagt gctgtgccag gctcacggac tgacccccga acaggtggtg 1740
gccattgcca gcaacatcgg cggcaagcag gccctggaaa ccgtgcagag actgctgccc 1800
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ggaggaaaac aagcactcga gacagtgcag cggctgctgc ctgtgctgtg tcaggctcac 1920
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gaaactgtgc agcgcctgct gccagtgctg tgccaggctc acgggctgac ccccgaacag 2040
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ctgcccgtgc tgtgccaggc ccatggcctg acacctgaac aggtggtggc tatcgcctct 2160
aatatcggag gaaaacaggc tctggaaaca gtgcagcggc tgctgcctgt gctgtgtcag 2220
gctcacggct tgactccaca gcaggtcgtg gcaattgcta gcaacaacgg cggacggccc 2280
gccctggaga gcattgtggc ccagctgtct agacctgatc ctgccctggc cgccctgaca 2340
aatgatcacc tggtggccct ggcctgtctg ggaggcagac ctgccctgga tgccgtgaaa 2400
aaaggactgc ctcacgcccc tgccctgatc aagagaacaa atagaagaat ccccgagcgg 2460
acctctcaca gagtggccgg atcccagctg gtgaaatctg agctggagga gaagaagtct 2520
gagctgagac acaagctgaa gtacgtgcct cacgagtaca tcgagctgat cgagatcgcc 2580
agaaatagca cccaggatag aatcctggag atgaaggtga tggagttctt catgaaggtg 2640
tacggctaca gaggaaagca cctgggagga agcagaaaac ctgacggagc catttataca 2700
gtgggcagcc ctatcgatta tggcgtgatc gtggatacaa aggcctacag cggaggctac 2760
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aagttcctgt ttgtgagcgg ccacttcaag ggcaattata aggcccagct gaccaggctg 2940
aaccacatca caaattgtaa tggcgccgtg ctgtctgtgg aggaactgct gattggagga 3000
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<210> 9
<211> 3075
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> RightTALEN-trpC
<400> 9
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gtgggacacg gatttacaca cgcccacatt gtggccctgt ctcagcaccc tgccgccctg 240
ggaacagtgg ccgtgaaata tcaggatatg attgccgccc tgcctgaggc cacacacgaa 300
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> oJK164
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> oJK211
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<212> DNA
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<220>
<223> trpC-lost-F
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tttaaattag agggaaaaag agagaattga aatag 35
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> trpC-lost-R
<400> 21
tccctctaat ttaaatgaat tcgagctcgg taccc 35
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> adhpro-R
<400> 22
ttttgttatt taattgtatt aattgataat g 31
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> adhter-F
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> adhpro-TALEN-F
<400> 24
aattaaataa caaaaatgga ctacaaagac catgacggtg 40
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> TAELN-adhter-R
<400> 25
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<210> 26
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> adhpro-LifeTALEN-F
<400> 26
aattaaataa caaaaatggg aaaacctatt cctaatcctc tgctg 45
<210> 27
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LifeTALEN-adhter-R
<400> 27
gcgtaattaa aatgatcaga agttgatctc gccgttgttg aactttc 47
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<211> 19
<212> DNA
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<220>
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<400> 28
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pPTR1-sal1-R
<400> 29
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
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<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> ldhpro-R
<400> 31
gagaattata ttgtaaagaa aaataaag 28
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<220>
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atgaattcta agattttatc ttctttcatg agaaacacta aacttgataa c 51
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
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ctgcaggtcg actctagagg atccccgggt accg 34
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<211> 35
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<213> 人工
<220>
<223> pUC18-Hind3-R3
<400> 39
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<210> 40
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<220>
<223> PDC1-upstr-F
<400> 40
cggccagtgc caagcgcaga cttcaacagt tggctttttt aagta 45
<210> 41
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PDC1-upstr-R
<400> 41
cattttgcct ctcatgtttt taaatttgtt ttgtagagta ttgaata 47
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> trpCpro-R
<400> 42
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<211> 29
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<213> 人工
<220>
<223> trpCter-F
<400> 43
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<210> 44
<211> 49
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<213> 人工
<220>
<223> PDC1-downstr-F
<400> 44
attaacttgc tgttcaatct tagaattcat tttttttttg tatcattcg 49
<210> 45
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工
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<223> PDC1-downstr-R
<400> 45
agagtcgacc tgcaggcgtc aataagagct tgaaggttgg tgccggatc 49
<210> 46
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PDC2-upstr-F
<400> 46
cggccagtgc caagcttatg ggaaaaatgt gaaaatcatc ccact 45
<210> 47
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PDC2-upstr-R
<400> 47
cattttgcct ctcatgttta gttcaaataa tatttttttt tgtga 45
<210> 48
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PDC2-downstr-F
<400> 48
attaacttgc tgttcagttc tctttctgta ataatccttg atttc 45
<210> 49
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PDC2-downstr-R
<400> 49
agagtcgacc tgcagccttt ttacagaaaa caagcacatc tttac 45
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> trpC-inactive-F
<400> 50
taacgcatca gttccatcct gaaagtatcc 30
<210> 51
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> trpC-inactive-R
<400> 51
ggaactgatg cgttaaaaag aggggaaa 28
<210> 52
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1ter-F
<400> 52
aatcttagaa ttcatttttt ttttgtatc 29
<210> 53
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> trpC-adh1pro-F
<400> 53
attaacttgc tgttctagag ggaaaaagag agaattgaaa tagg 44
<210> 54
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> FT1-pdc1Ter-R
<400> 54
atgaattcta agattttaat agaaaccctg cttaaatgca agacc 45
<210> 55
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PYC-pdc1Ter-R
<400> 55
atgaattcta agattttagg cttcctcttt gacaaccttg gccac 45
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PDC1-upstr-F2
<400> 56
gcagacttca acagttggct tttttaagta 30
<210> 57
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PDC1-downstr-R2
<400> 57
gcgtcaataa gagcttgaag gttggtgccg gatc 34
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1-up2
<400> 58
cattcccaca ggatttgtgc 20
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> trpC(d)-1
<400> 59
gtgagatgtt gatcatttgt acatg 25
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc2-down1
<400> 60
agaagacaac ctagaccctc 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> trpC(d)-7
<400> 61
atagctcttg gtgggattcg 20
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1-down3
<400> 62
gctgctcgag atcctccaag gtatc 25
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> trpC(d)-5
<400> 63
ttcgaccaag ggttccatac 20
<210> 64
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PDC1-downstr-R-P
<400> 64
gcgtcaataa gagcttgaag gttggtgccg gatc 34
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_750-F
<400> 65
tagattcaat ttgattggat aaagttcatc 30
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_750-R-P
<400> 66
ataacaaaca atggctaaaa gtggaccccc 30
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_500-F
<400> 67
tttactagtt taaagcaaaa aacatgagca 30
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_500-R-P
<400> 68
ttcaatttac atttctttat gaatatgcct 30
<210> 69
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_250-F
<400> 69
gtgtttatct gttcacaagt actggtaagc 30
<210> 70
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_250-R-P
<400> 70
ttcaatataa accaagtccc taaaagaaat 30
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_100-F
<400> 71
gctgatatga cattgcgacg aaaatagtat 30
<210> 72
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_100-R-P
<400> 72
aaaaaaaaag cttattttca aaaatatgat 30
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_50-F
<400> 73
tcgttcaaaa aaaatcatta ttcaatactc 30
<210> 74
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_50-R-P
<400> 74
gtaatgaagt atagaacgaa tgatacaaaa 30
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_45-F
<400> 75
caaaaaaaat cattattcaa tactctacaa 30
<210> 76
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_45-R-P
<400> 76
gaagtataga acgaatgata caaaaaaaaa at 32
<210> 77
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_40-F
<400> 77
aaaatcatta ttcaatactc tacaaaacaa 30
<210> 78
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_40-R-P
<400> 78
atagaacgaa tgatacaaaa aaaaaatgaa 30
<210> 79
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_35-F
<400> 79
cattattcaa tactctacaa aacaaattta 30
<210> 80
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_35-R-P
<400> 80
acgaatgata caaaaaaaaa atgaattcta 30
<210> 81
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_30-F
<400> 81
ttcaatactc tacaaaacaa atttaaaaac 30
<210> 82
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_30-R-P
<400> 82
tgatacaaaa aaaaaatgaa ttctaagatt 30
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_25-F
<400> 83
tactctacaa aacaaattta aaaacatgag 30
<210> 84
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_25-R-P
<400> 84
caaaaaaaaa atgaattcta agattgaaca 30
<210> 85
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_20-F
<400> 85
tacaaaacaa atttaaaaac atgagaggca 30
<210> 86
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_20-R-P
<400> 86
aaaaaatgaa ttctaagatt gaacagcaag 30
<210> 87
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_15-F
<400> 87
aacaaattta aaaacatgag aggcaaaatg 30
<210> 88
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_15-R-P
<400> 88
atgaattcta agattgaaca gcaagttaat 30
<210> 89
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_10-F
<400> 89
atttaaaaac atgagaggca aaatgaagcg 30
<210> 90
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_10-R-P
<400> 90
ttctaagatt gaacagcaag ttaataatct 30
<210> 91
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_5-F
<400> 91
aaaacatgag aggcaaaatg aagcgtacaa 30
<210> 92
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc1_5-R-P
<400> 92
agattgaaca gcaagttaat aatctagagg 30
<210> 93
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PDC2-upstr-F2
<400> 93
ttatgggaaa aatgtgaaaa tcatcccact 30
<210> 94
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> PDC2-downstr-R2-P
<400> 94
cctttttaca gaaaacaagc acatctttac 30
<210> 95
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> trpC-ki-F2-P
<400> 95
cttttcatga cccaacaaat cagacac 27
<210> 96
<211> 18
<212> DNA
<213> 戴尔根霉（Rhizopus delemar）
<220>
<223> LeftTALEN-pdc1的靶标
<400> 96
tgcctgctat taaaatcg 18
<210> 97
<211> 18
<212> DNA
<213> 戴尔根霉（Rhizopus delemar）
<220>
<223> RightTALEN-pdc1的靶标
<400> 97
ttgatttcct taagacgg 18
<210> 98
<211> 19
<212> DNA
<213> 戴尔根霉（Rhizopus delemar）
<220>
<223> LeftTALEN-pdc2的靶标
<400> 98
tggtgttgct ggttcttat 19
<210> 99
<211> 19
<212> DNA
<213> 戴尔根霉（Rhizopus delemar）
<220>
<223> RightTALEN-pdc2的靶标
<400> 99
tgccgacaat gtgaatcac 19
<210> 100
<211> 19
<212> DNA
<213> 戴尔根霉（Rhizopus delemar）
<220>
<223> LeftTALEN-trpC的靶标
<400> 100
tgccaaggcg ccaatgtag 19
<210> 101
<211> 19
<212> DNA
<213> 戴尔根霉（Rhizopus delemar）
<220>
<223> RightTALEN-trpC的靶标
<400> 101
tcggaaatgg tgattttgt 19
<210> 102
<211> 513
<212> DNA
<213> 戴尔根霉（Rhizopus delemar）
<220>
<223> FT1
<400> 102
atgtcttcta tcgaaacctc caaaatctca agttttatga tcaacaatat tgatgacttt 60
gttgcagatt ggcatgttcg cgttacttgg atcgcattca tgacactctg ggtcttttgg 120
ggattggttt gggttttccg caacttcttt gtttcaaact ctcctgcatt gactcctgct 180
cctgaagcaa atgctgctga tgatacggaa gcatcaaaga aaaaactctt tagcgttacc 240
agtgacagtt ttgctcttcg tctagatcgt gctcatcaag ttgtaaaaga tgccttgttc 300
tctcttctct gtcttctttc catgaactcc tttgctcgtg cttcaactcg tgctgtcatg 360
atcctcgctt ggttcttcac tgcctttgct gtctgttggt ttgctgtcgt attccttgtt 420
gataaccgct ttgttcgttt gacgtattca cttgtctttt acgctcttgg tcttgctatt 480
gccggtcttg catttaagca gggtttctat taa 513
<210> 103
<211> 3540
<212> DNA
<213> 戴尔根霉（Rhizopus delemar）
<220>
<223> PYC
<400> 103
atgcctgctg caccagtacg tgaacactct gtggatacca ttcgtagaaa tagcgaagtg 60
atgggtaacc tgagaaaatt gatggtggtt aatcgtggtg aaattgctat ccgtgtcttt 120
cgtacagctc atgaactctc tatgaagaca gtagctattt tctctcatga agatagatta 180
tccatgcaca gatataaggc tgatgaatcc tatcaactcg gtcgtattgg tcaatacaca 240
cctgtaggtg cttatctggc acaagatgaa gtcgttcgaa tcgcaaagga acgtggtgtg 300
agcatgattc atcctggtta tggtttcttg tctgaaaatg ctgaattcgc tcgcaaggtg 360
gaagctgcag gaatcacttt cattggtccc tctcctgatg tcattgaaag tttaggcgat 420
aagacaaaag ccagaacgat tgccatgaag tgtgaagtcc ctgttgtccc tggcacacct 480
ggacccgtca gtgaatacaa agatgccctg aactttatca aagaatatgg ttttcctatc 540
atcatcaagg ctgccatggg tggtggtggt cgtggtatgc gtgtggttcg tgacgaagcc 600
agtctagagg acgcgtttac ccgtgcgaaa tctgaagctt tggctgcctt tggtgatggc 660
actgtcttta tcgaacgttt ccttgataag cctcgtcata tcgaggttca attgttggca 720
gatcgtgcag gtaacgtggt ccatctcttt gaacgtgatt gctctgttca gcgtcgtcac 780
caaaaggtcg ttgaaatcgc acctgccaaa aacttggata acaaggtacg tgaggccatc 840
ttgaacgatg cgatcaagat tgccaaggct gtaaagtaca agaatgcggg tactgcagaa 900
ttcttggtgg ataaccaaaa ccgtcactac tttatcgaaa tcaatcctcg tatccaagtc 960
gaacatacca tcacagaaga aatcacgggt atcgatatcg ttgccgctca aattcagatt 1020
gctgccggtg ccctcttgcc tcaattgggt cttacccaac aacgtatccg tcaacgtggg 1080
ttcgcgatcc agtgtcgtgt gacaaccgag gaccccgaaa agaatttcca gcctgacacg 1140
ggtaagatcg aagtttaccg ttcctctggt ggtaacggtg ttcgtctgga tggtggtgct 1200
ggttacgcag gtgctatcat tacccctcac tatgattcac ttttggtcaa agtctcttgt 1260
tctggatcca cctacgaagt cgctcgtcga aagatcgtcc gtgccttggt cgaattcaga 1320
atccgtggtg tcaagaccaa tatccccttc ttacaacgtc tcttgaccca tgataccttc 1380
atcaacggta actgctggac aactttcatt gatgatactc ccgatctttt ccgtcttgtt 1440
caattccaaa accgtgctca aagactcttg ggttacctgg gtgatgtcgt cgtcaatggt 1500
tctcaaatca agggtcaaat gggtgatccc attctgaagc aagagatcga aatccccgtg 1560
ttgcgtgaaa gtggtagtga caagacggtc gatgtctctg ctcctgctac ggaaggctgg 1620
agaaagatca ttgtggaaca aggacctgaa gctttcgcaa aagctgtccg tgcttaccct 1680
ggtgtcttga tcaccgatac cacctggaga gacgctcatc agagtttatt ggccactcgt 1740
gtgagaactg tcgatctctt gcgtatcgcc cctgctacct ctcacgcttt ggccaacgcc 1800
ttttcattgg aatgttgggg aggtgctacg tttgatgttg ccatgcgttt ccttcatgaa 1860
gatccttggg accgtcttgc tgctttgcga aagttggtac ccaatgtacc cttccaaatg 1920
cttttgcgtg gtgccaatgc ggtaggttac acctcttacc ctgataatgt tatctatgaa 1980
ttctgtgaca aggcagtcaa gtgtggtatg gatgtcttcc gtatctttga ctctctcaat 2040
tatgttgaga acatgagatt gggtattgac gctgtcaaga aggccggtgg tgttgttgaa 2100
gccaccatct gttacacggg tgatgtctcc aaccctaacc gcaagaagta cgacttgaag 2160
tactaccttg accttacaca atccttggtg aacgaaggta ttcacatctt gggtatcaag 2220
gacatggctg gtcttctcaa acccgaggca gccaagttac tggtctccag tatccgtgcc 2280
aagttccccg acttgcccat ccacgttcac acacacgata ccgcaggtac gggtgttgct 2340
agcatgatgg ccgctgccgc tgctggtgct gacattgttg atgttgccgt ggacgccatg 2400
tccggcatga cctctcaacc agcgatgggt gccattgtcg ctggactgga acagaccaat 2460
ttgggtaccg gtatccgcat ggaagacatt catgccatca attcttactg ggagcaatgc 2520
cgtttgcttt actcttgctt cgaagccaac gtgcgttcgg ccgattcggg tgtctatgaa 2580
catgaaatgc ctggtggaca atataccaac ttgatgttcc aagcccaaca actcggtttg 2640
ggaactcagt ggaagcaaat caagaaggct tacaaggagg ccaacgaact ctgtggtgac 2700
ctggtcaagg tcacgccttc gtccaaggtc gtgggtgatc ttgctcaatt catggtttcc 2760
aaccaactct ctgccaaaga atttgaagaa cgcgcctcga gtctctctct gcccacctct 2820
gtcatcgagt tcttccaagg ttatctcggt caaccctatg gcggtttccc cgagcccttg 2880
cgctccaaca tccttcgtga tctccctcgc ctcgacggtc gccctggtgc tagcctgcct 2940
ccgttggaca tggctaaact caaggaagag ttggttgaaa agtacggttc gagcatccgt 3000
gattacgacg tgatctcggc tgctctttac cccaaggtct ttgccgacta ccgtgatacc 3060
gtcagtcaat acggtgatct ctccgttttg cctacacgct actttttgtc caagcccgag 3120
atcaatgaag aattccatgt ggagattgaa gaaggaaaga cgttgatcat caagttattg 3180
gccgtcggtc ctctgaacaa tgacggtaaa cgtgatgttt actttgaatt gaacggtgaa 3240
gctcgtgtgg tgggcattgt ggatcgcaat tctgctattg aaatcgtcac acgtgaaaag 3300
gccaacccct ctaaccccgg tgacattggt gctcctatgt cgggtgtggt tgtcgagatc 3360
cgtgccaagg aaggtagcca tgtcaaggcc ggtgatcctc ttgctgttct ctctgctatg 3420
aagatggaaa cagtggtcac tgctcccgtg gctggtagag ttgagcgtgt tgctatccaa 3480
gaaggtgatt cattatccgc tggtgatttg gtggccaagg ttgtcaaaga ggaagcctaa 3540
<210> 104
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> trpCter-R
<400> 104
atgagaggca aaatgaagcg tacaaagag 29
<210> 105
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> trpCter-cicCpro-F
<400> 105
cattttgcct ctcatcttac gcaggttgat agtagccgcc 40
<210> 106
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> cipCpro-adhter-R
<400> 106
gcgtaattaa aatgaggtta gagtatgaag aaaaaaaaaa 40
<210> 107
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> trpC-lost-F2
<400> 107
tttaaatctt acgcaggttg atagtagccg c 31
<210> 108
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> trpC-lost-R2
<400> 108
tgcgtaagat ttaaatgaat tcgagctcgg tac 33
<210> 109
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> cipCpro-R
<400> 109
ggttagagta tgaagaaaaa aaaaaaacg 29
<210> 110
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> cipCpro-LifeTALEN-F
<400> 110
cttcatactc taaccatggg aaaacctatt cctaatcctc tgctg 45
<210> 111
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> cipCpro-exo1-F
<400> 111
cttcatactc taaccatgaa aatccaagtt gcttctccta 40
<210> 112
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc3-upstr-F
<400> 112
cggccagtgc caagcccgtc aggggtgaat gagatatttt 40
<210> 113
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc3-upstr-R2
<400> 113
aaaagatgtg agttataaaa ggatgatgca agc 33
<210> 114
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc3-downstr-F2
<400> 114
taactcacat cttttattct ttttctatcc ctc 33
<210> 115
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc3-downstr-R
<400> 115
agagtcgacc tgcagacctg ttagaaaggt acatgcattc 40
<210> 116
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc3-upstr-R
<400> 116
cattttgcct ctcatgtgag ttataaaagg atgatgcaag 40
<210> 117
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc3-downstr-F
<400> 117
attaacttgc tgttcatctt ttattctttt tctatccctc 40
<210> 118
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc3-upstr-F2
<400> 118
ccgtcagggg tgaatgagat att 23
<210> 119
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc3-downstr-R2-P
<400> 119
acctgttaga aaggtacatg cattc 25
<210> 120
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pdc3-up
<400> 120
gacctcaatc actatccttg g 21
<210> 121
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pUC18-adh1pro-F
<400> 121
cggccagtgc caagcattat tattagaggg aaaaaaaaga aaga 44
<210> 122
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> adh1pro-pUC18-R
<400> 122
agagtcgacc tgcagttttg ttatttattt gtattaattg ataa 44
<210> 123
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> adh1pro-adh1ter-F
<400> 123
aacaaaatca ttttaattac gcattttcat tttttactaa 40
<210> 124
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> adh1ter-pUC18-R
<400> 124
agagtcgacc tgcagagcag aacatgagtc tggaagcgag acac 44
<210> 125
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> adh1pro-adh1ter-R
<400> 125
taaaatgatt ttgttattta tttgtattaa ttgataatga 40
<210> 126
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> adh1pro(o)-R
<400> 126
ttttgttatt tatttgtatt aattgataat g 31
<210> 127
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> adh1ter(o)-F
<400> 127
tcattttaat tacgcatttt cattttttac 30
<210> 128
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> adh1pro(o)-LifeTALEN-F
<400> 128
aaataaataa caaaaatggg aaaacctatt cctaatcctc tgct 44
<210> 129
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LifeTALEN-adh1ter(o)-R
<400> 129
gcgtaattaa aatgatcaga agttgatctc gccgttgttg aact 44
<210> 130
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> ldhA-upstr-F
<400> 130
cggccagtgc caagcaaaag aataagaaaa gatgtgtcag 40
<210> 131
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> ldhA-upstr-R2
<400> 131
taaattaagg acttgagctt gaacgatgtc ag 32
<210> 132
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> ldhA-downstr-F2
<400> 132
caagtcctta atttacaaat aataaatcat gtt 33
<210> 133
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> ldhA-downstr-R
<400> 133
agagtcgacc tgcagaacga caaacatggc tatcaaggga 40
<210> 134
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> ldhA-upstr-R
<400> 134
tgtgcaagtg aacaaaggac ttgagcttga acgatgtcag 40
<210> 135
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> ldhA-downstr-F
<400> 135
gctcttgaca atgcataatt tacaaataat aaatcatgtt 40
<210> 136
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> ade1pro-R
<400> 136
tgcattgtca agagcgtgtc gcaac 25
<210> 137
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> ade1ter-F
<400> 137
ttgttcactt gcacagcgtg atatgcaag 29
<210> 138
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> ldhA-upstr-F2
<400> 138
aaaagaataa gaaaagatgt gtcaggac 28
<210> 139
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> ldhA-downstr-R2-P
<400> 139
aacgacaaac atggctatca agggaac 27
<210> 140
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> ldhA-up
<400> 140
gaaactacag tattccctcg tg 22
<210> 141
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> ade1-15
<400> 141
tgcttccata tgtcaatagg c 21
<210> 142
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> exo1-adhter-R2
<400> 142
gcgtaattaa aatgattatc ttctttcatg agaaacacta 40
<210> 143
<211> 1749
<212> DNA
<213> 戴尔根霉（Rhizopus delemar）
<220>
<223> pdc3
<400> 143
atggttagta tcaaaattgg agattatctc attcaacgtc ttaaagaaac cggaatcgac 60
acgatttttg gtgttccagg tgattacaat atggtaagtt acgaagtgga tacagattta 120
tttgaatgtg tgtatatcct gaaaaacttt gcaatgtagc cgctattgga tttaattgaa 180
gatgattctg agctcatatg gggtaataat gcaaacgaac tcaatgcttc ctatgctgct 240
gatggctatg ctcgtatcag aggctttggt gctgtagtta ccacgtttgg tgtaggggaa 300
ctttctgctg cagcaggtat tgctggatct tattctgaaa aagtcccagt acttcatatt 360
gtcggcactc ctaatactaa atcccaggaa gctggagcta ttcttcatca cacgcttggt 420
aatggcaatt ttcaggtgtt tgttgaaatg ttttccatga tcacgtgtgc ttctactcat 480
ttaaactttg acaatgccat ccgagaaatt gatcgcgtca tccagcagac tatgattcga 540
aagcgacctg gttatatcgg catccccatt gatctgatta atgctgaggt tgctcttcct 600
agttctgaac ctctcaattt ttttgtcccc aaaaatccta ctcaaactca agatgtggct 660
cttaaggttg ttttggacgc tatttcacag gctaagcatc cgattatagt tgttgatgca 720
tgtgttcagc gacacaattt agttcaagag gctattgaat tcgtgaaacg taccggtttt 780
cccacttacg ttgcacctat gggtaaaggt attgttcccg aggatcttgt caattatcgt 840
ggttgctatg ctggtaatat taccatcgag ggtatcgcca gggaacttga gcaagctgat 900
ctggtcattg aacttggtgc gattaaatcc gatttcaaca ctggtggctt cacctataaa 960
ctggatcctg ctagaacgat ctctcttcac tcatttggta cccagatatt ttatgccgac 1020
tatgacaaag tgggaatgac ggaatttctt cctcttttga ccaagtctct tcctcaaagg 1080
cctcgtgtat ttgatctagg ccctcgtcat gagccagatc caattcaatc aggaactgaa 1140
ataacgcaca attatttctg gaataaggta ccagaataca tggatcctcg cgctgttgtt 1200
gttgctgaaa caggcacagc tgaatttgcc tcttttaatt taagagctcc caaagacgct 1260
ctctttattt ctcaagtact ctggggatcc atcggttttg ctgtcggatg tgctgtcggt 1320
gctgcgttcg ctgatcgaga tcgacgagtt tatctttttg tgggtgatgg ctctttccag 1380
gttacttgtc aagaaatttc agtctttttg catcaagggt tgacacctgt cattttcttg 1440
ttgaacaatg atggatacct tatcgaaaaa ctcattcatg ggcctcaccg ctcttataat 1500
aactttcaga tgtggaacta cagcaaaact cttgactata tgggtggaca tcttcagcgc 1560
aatctgtctg atgtttcgcc agctcaagtt ggtgttgaag ctcaagtccg tacgcgagat 1620
gagtttgaga gggcaatgaa gacagtcaag gaggaacgta acaaaattca ttttattgaa 1680
gttgtcatgc ctcaatttga tgctcctcgc gaattgatac tccaagttca aacttctgaa 1740
aatcgttaa 1749
<210> 144
<211> 3075
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LeftTALEN-pdc3
<400> 144
atgggaaaac ctattcctaa tcctctgctg ggcctggatt ctaccggagg catggcccct 60
aagaaaaagc ggaaggtgga cggcggagtg gacctgagaa cactgggata ttctcagcag 120
cagcaggaga agatcaagcc caaggtgaga tctacagtgg cccagcacca cgaagccctg 180
gtgggacacg gatttacaca cgcccacatt gtggccctgt ctcagcaccc tgccgccctg 240
ggaacagtgg ccgtgaaata tcaggatatg attgccgccc tgcctgaggc cacacacgaa 300
gccattgtgg gagtgggaaa acgaggcgct ggagccagag ccctggaagc cctgctgaca 360
gtggccggag aactgagagg acctcctctg cagctggata caggacagct gctgaagatt 420
gccaaaaggg gcggagtgac cgcggtggaa gccgtgcacg cctggagaaa tgccctgaca 480
ggagcccctc tgaacctgac ccccgaacag gtggtggcca ttgccagcca cgacggcggc 540
aagcaggccc tggaaaccgt gcagagactg ctgcccgtgc tgtgccaggc ccatggcctg 600
acacctgaac aggtggtggc tatcgcctct aacaacggag gaaaacaggc tctggaaaca 660
gtgcagcggc tgctgcctgt gctgtgtcag gctcacggct tgactccaga acaggtggtg 720
gctattgctt ccaacaacgg ggggaaacag gccctggaaa ctgtgcagcg cctgctgcca 780
gtgctgtgcc aggctcacgg actgaccccc gaacaggtgg tggccattgc cagcaacatc 840
ggcggcaagc aggccctgga aaccgtgcag agactgctgc ccgtgctgtg ccaggcccat 900
ggcctgacac ctgaacaggt ggtggctatc gcctctaata tcggaggaaa acaggctctg 960
gaaacagtgc agcggctgct gcctgtgctg tgtcaggctc acggcttgac tccagaacag 1020
gtggtggcta ttgcttccaa cggcgggggg aaacaggccc tggaaactgt gcagcgcctg 1080
ctgccagtgc tgtgccaggc tcacgggctg acccccgaac aggtggtggc cattgccagc 1140
cacgacggcg gcaagcaggc cctggaaacc gtgcagagac tgctgcccgt gctgtgccag 1200
gcccatggcc tgacacctga acaggtggtg gctatcgcct ctaacaacgg aggaaaacag 1260
gctctggaaa cagtgcagcg gctgctgcct gtgctgtgtc aggctcacgg cttgactcca 1320
gaacaggtgg tggctattgc ttccaatatt ggggggaaac aggccctgga aactgtgcag 1380
cgcctgctgc cagtgctgtg ccaggctcac ggcctcactc ccgaacaggt ggtggccatt 1440
gccagccacg acggcggcaa gcaggccctg gaaaccgtgc agagactgct gcccgtgctg 1500
tgccaggccc atggcctgac acctgaacag gtggtggcta tcgcctctaa tatcggagga 1560
aaacaggctc tggaaacagt gcagcggctg ctgcctgtgc tgtgtcaggc tcacggcttg 1620
actccagaac aggtggtggc tattgcttcc cacgacgggg ggaaacaggc cctggaaact 1680
gtgcagcgcc tgctgccagt gctgtgccag gctcacggac tgacccccga acaggtggtg 1740
gccattgcca gcaacaacgg cggcaagcag gccctggaaa ccgtgcagag actgctgccc 1800
gtgctgtgcc aggcccatgg cctgacacct gaacaggtgg tggctatcgc ctctaatatc 1860
ggaggaaaac aagcactcga gacagtgcag cggctgctgc ctgtgctgtg tcaggctcac 1920
ggcttgactc cagaacaggt ggtggctatt gcttccaacg gcggggggaa acaggccctg 1980
gaaactgtgc agcgcctgct gccagtgctg tgccaggctc acgggctgac ccccgaacag 2040
gtggtggcca ttgccagcaa cggcggcggc aagcaggccc tggaaaccgt gcagagactg 2100
ctgcccgtgc tgtgccaggc ccatggcctg acacctgaac aggtggtggc tatcgcctct 2160
aacggcggag gaaaacaggc tctggaaaca gtgcagcggc tgctgcctgt gctgtgtcag 2220
gctcacggct tgactccaca gcaggtcgtg gcaattgcta gcaacggcgg cggacggccc 2280
gccctggaga gcattgtggc ccagctgtct agacctgatc ctgccctggc cgccctgaca 2340
aatgatcacc tggtggccct ggcctgtctg ggaggcagac ctgccctgga tgccgtgaaa 2400
aaaggactgc ctcacgcccc tgccctgatc aagagaacaa atagaagaat ccccgagcgg 2460
acctctcaca gagtggccgg atcccagctg gtgaaatctg agctggagga gaagaagtct 2520
gagctgagac acaagctgaa gtacgtgcct cacgagtaca tcgagctgat cgagatcgcc 2580
agaaatagca cccaggatag aatcctggag atgaaggtga tggagttctt catgaaggtg 2640
tacggctaca gaggaaagca cctgggagga agcagaaaac ctgacggagc catttataca 2700
gtgggcagcc ctatcgatta tggcgtgatc gtggatacaa aggcctacag cggaggctac 2760
aatctgccta ttggacaggc cgatgagatg cagagatacg tggaggagaa ccagaccagg 2820
aacaagcaca tcaaccctaa cgagtggtgg aaggtgtacc cttctagcgt gaccgagttc 2880
aagttcctgt ttgtgagcgg ccacttcaag ggcaattata aggcccagct gaccaggctg 2940
aaccacatca caaattgtaa tggcgccgtg ctgtctgtgg aggaactgct gattggagga 3000
gagatgatta aggccggaac actgacactg gaggaggtga gaagaaagtt caacaacggc 3060
gagatcaact tctga 3075
<210> 145
<211> 3075
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RightTALEN-pdc3
<400> 145
atgggaaaac ctattcctaa tcctctgctg ggcctggatt ctaccggagg catggcccct 60
aagaaaaagc ggaaggtgga cggcggagtg gacctgagaa cactgggata ttctcagcag 120
cagcaggaga agatcaagcc caaggtgaga tctacagtgg cccagcacca cgaagccctg 180
gtgggacacg gatttacaca cgcccacatt gtggccctgt ctcagcaccc tgccgccctg 240
ggaacagtgg ccgtgaaata tcaggatatg attgccgccc tgcctgaggc cacacacgaa 300
gccattgtgg gagtgggaaa acgaggcgct ggagccagag ccctggaagc cctgctgaca 360
gtggccggag aactgagagg acctcctctg cagctggata caggacagct gctgaagatt 420
gccaaaaggg gcggagtgac cgcggtggaa gccgtgcacg cctggagaaa tgccctgaca 480
ggagcccctc tgaacctgac ccccgaacag gtggtggcca ttgccagcaa caacggcggc 540
aagcaggccc tggaaaccgt gcagagactg ctgcccgtgc tgtgccaggc ccatggcctg 600
acacctgaac aggtggtggc tatcgcctct aacggcggag gaaaacaggc tctggaaaca 660
gtgcagcggc tgctgcctgt gctgtgtcag gctcacggct tgactccaga acaggtggtg 720
gctattgctt ccaatattgg ggggaaacag gccctggaaa ctgtgcagcg cctgctgcca 780
gtgctgtgcc aggctcacgg actgaccccc gaacaggtgg tggccattgc cagcaacatc 840
ggcggcaagc aggccctgga aaccgtgcag agactgctgc ccgtgctgtg ccaggcccat 900
ggcctgacac ctgaacaggt ggtggctatc gcctctcacg acggaggaaa acaggctctg 960
gaaacagtgc agcggctgct gcctgtgctg tgtcaggctc acggcttgac tccagaacag 1020
gtggtggcta ttgcttccaa cggcgggggg aaacaggccc tggaaactgt gcagcgcctg 1080
ctgccagtgc tgtgccaggc tcacgggctg acccccgaac aggtggtggc cattgccagc 1140
aacggcggcg gcaagcaggc cctggaaacc gtgcagagac tgctgcccgt gctgtgccag 1200
gcccatggcc tgacacctga acaggtggtg gctatcgcct ctaatatcgg aggaaaacag 1260
gctctggaaa cagtgcagcg gctgctgcct gtgctgtgtc aggctcacgg cttgactcca 1320
gaacaggtgg tggctattgc ttcccacgac ggggggaaac aggccctgga aactgtgcag 1380
cgcctgctgc cagtgctgtg ccaggctcac ggcctcactc ccgaacaggt ggtggccatt 1440
gccagccacg acggcggcaa gcaggccctg gaaaccgtgc agagactgct gcccgtgctg 1500
tgccaggccc atggcctgac acctgaacag gtggtggcta tcgcctctaa tatcggagga 1560
aaacaggctc tggaaacagt gcagcggctg ctgcctgtgc tgtgtcaggc tcacggcttg 1620
actccagaac aggtggtggc tattgcttcc aacggcgggg ggaaacaggc cctggaaact 1680
gtgcagcgcc tgctgccagt gctgtgccag gctcacggac tgacccccga acaggtggtg 1740
gccattgcca gcaacatcgg cggcaagcag gccctggaaa ccgtgcagag actgctgccc 1800
gtgctgtgcc aggcccatgg cctgacacct gaacaggtgg tggctatcgc ctctaacggc 1860
ggaggaaaac aagcactcga gacagtgcag cggctgctgc ctgtgctgtg tcaggctcac 1920
ggcttgactc cagaacaggt ggtggctatt gcttccaacg gcggggggaa acaggccctg 1980
gaaactgtgc agcgcctgct gccagtgctg tgccaggctc acgggctgac ccccgaacag 2040
gtggtggcca ttgccagcaa caacggcggc aagcaggccc tggaaaccgt gcagagactg 2100
ctgcccgtgc tgtgccaggc ccatggcctg acacctgaac aggtggtggc tatcgcctct 2160
aacggcggag gaaaacaggc tctggaaaca gtgcagcggc tgctgcctgt gctgtgtcag 2220
gctcacggct tgactccaca gcaggtcgtg gcaattgcta gcaatatcgg cggacggccc 2280
gccctggaga gcattgtggc ccagctgtct agacctgatc ctgccctggc cgccctgaca 2340
aatgatcacc tggtggccct ggcctgtctg ggaggcagac ctgccctgga tgccgtgaaa 2400
aaaggactgc ctcacgcccc tgccctgatc aagagaacaa atagaagaat ccccgagcgg 2460
acctctcaca gagtggccgg atcccagctg gtgaaatctg agctggagga gaagaagtct 2520
gagctgagac acaagctgaa gtacgtgcct cacgagtaca tcgagctgat cgagatcgcc 2580
agaaatagca cccaggatag aatcctggag atgaaggtga tggagttctt catgaaggtg 2640
tacggctaca gaggaaagca cctgggagga agcagaaaac ctgacggagc catttataca 2700
gtgggcagcc ctatcgatta tggcgtgatc gtggatacaa aggcctacag cggaggctac 2760
aatctgccta ttggacaggc cgatgagatg cagagatacg tggaggagaa ccagaccagg 2820
aacaagcaca tcaaccctaa cgagtggtgg aaggtgtacc cttctagcgt gaccgagttc 2880
aagttcctgt ttgtgagcgg ccacttcaag ggcaattata aggcccagct gaccaggctg 2940
aaccacatca caaattgtaa tggcgccgtg ctgtctgtgg aggaactgct gattggagga 3000
gagatgatta aggccggaac actgacactg gaggaggtga gaagaaagtt caacaacggc 3060
gagatcaact tctga 3075
<210> 146
<211> 19
<212> DNA
<213> 戴尔根霉（Rhizopus delemar）
<220>
<223> LeftTALEN-pdc3的靶标
<400> 146
ccggaatcga cacgatttt 19
<210> 147
<211> 19
<212> DNA
<213> 戴尔根霉（Rhizopus delemar）
<220>
<223> RightTALEN-pdc3的靶标
<400> 147
cgtaacttac catattgta 19
<210> 148
<211> 963
<212> DNA
<213> 米根霉（Rhizopus oryzae）
<220>
<223> ldhA
<400> 148
atggtattac actcaaaggt cgccatcgtt ggagctggtg cagtaggagc ctccactgct 60
tatgcactta tgtttaaaaa catttgtaca gaaatcatta ttgttgatgt taatcctgac 120
atcgttcaag ctcaagtcct tgaccttgca gatgctgcca gtataagtca cacgcccatc 180
cgagcaggta gcgcagagga ggcagggcag gcagatattg ttgtcatcac ggccggtgcg 240
aaacaaaggg aaggtgagcc tcggacaaag ctcattgaac gaaacttcag agtgttgcaa 300
agtatcattg gtggcatgca acccattcga ccagacgcag tcatcttggt ggtagcaaat 360
ccagtcgata tcttgacaca cattgcaaag accctctctg gactgcctcc aaaccaggtc 420
attggctccg gtacctacct tgacacgacc cgtcttcgcg tccatcttgg cgatgtcttt 480
gatgtcaatc ctcaatcggt ccatgctttt gtcttgggtg aacatgggga ttcccagatg 540
atcgcttggg aggctgcttc gattggtggc cagccgttga caagtttccc ggaattcgca 600
aagctggata aaacagcaat ttcaaaagcg atatcaggta aagcgatgga gatcattcgt 660
ttgaaaggag ccacgtttta tggaattggt gcctgtgcag cggatttagt gcacactatc 720
atgttgaata ggaaatcagt acatccagtt tctgtttatg ttgaaaagta tggagccact 780
ttttctatgc ctgctaaact tggatggaga ggtgttgaac agatctatga agtaccactg 840
acggaagaag aagaagcgtt gcttgtaaaa tctgtagagg cattgaaatc agttgaatat 900
tcatctacaa aagttccaga aaaaaaggtt catgctactt ccttttctaa aagtagctgt 960
tga 963
<210> 149
<211> 3075
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LeftTALEN-ldhA
<400> 149
atgggaaaac ctattcctaa tcctctgctg ggcctggatt ctaccggagg catggcccct 60
aagaaaaagc ggaaggtgga cggcggagtg gacctgagaa cactgggata ttctcagcag 120
cagcaggaga agatcaagcc caaggtgaga tctacagtgg cccagcacca cgaagccctg 180
gtgggacacg gatttacaca cgcccacatt gtggccctgt ctcagcaccc tgccgccctg 240
ggaacagtgg ccgtgaaata tcaggatatg attgccgccc tgcctgaggc cacacacgaa 300
gccattgtgg gagtgggaaa acagtggtct ggagccagag ccctggaagc cctgctgaca 360
gtggccggag aactgagagg acctcctctg cagctggata caggacagct gctgaagatt 420
gccaaaaggg gcggagtgac cgcggtggaa gccgtgcacg cctggagaaa tgccctgaca 480
ggagcccctc tgaacctgac ccccgaacag gtggtggcca ttgccagcaa caacggcggc 540
aagcaggccc tggaaaccgt gcagagactg ctgcccgtgc tgtgccaggc ccatggcctg 600
acacctgaac aggtggtggc tatcgcctct cacgacggag gaaaacaggc tctggaaaca 660
gtgcagcggc tgctgcctgt gctgtgtcag gctcacggct tgactccaga acaggtggtg 720
gctattgctt ccaatattgg ggggaaacag gccctggaaa ctgtgcagcg cctgctgcca 780
gtgctgtgcc aggctcacgg actgaccccc gaacaggtgg tggccattgc cagcaacaac 840
ggcggcaagc aggccctgga aaccgtgcag agactgctgc ccgtgctgtg ccaggcccat 900
ggcctgacac ctgaacaggt ggtggctatc gcctctaata tcggaggaaa acaggctctg 960
gaaacagtgc agcggctgct gcctgtgctg tgtcaggctc acggcttgac tccagaacag 1020
gtggtggcta ttgcttccaa cggcgggggg aaacaggccc tggaaactgt gcagcgcctg 1080
ctgccagtgc tgtgccaggc tcacgggctg acccccgaac aggtggtggc cattgccagc 1140
aacaacggcg gcaagcaggc cctggaaacc gtgcagagac tgctgcccgt gctgtgccag 1200
gcccatggcc tgacacctga acaggtggtg gctatcgcct ctcacgacgg aggaaaacag 1260
gctctggaaa cagtgcagcg gctgctgcct gtgctgtgtc aggctcacgg cttgactcca 1320
gaacaggtgg tggctattgc ttccaacggc ggggggaaac aggccctgga aactgtgcag 1380
cgcctgctgc cagtgctgtg ccaggctcac ggcctcactc ccgaacaggt ggtggccatt 1440
gccagcaaca acggcggcaa gcaggccctg gaaaccgtgc agagactgct gcccgtgctg 1500
tgccaggccc atggcctgac acctgaacag gtggtggcta tcgcctctca cgacggagga 1560
aaacaggctc tggaaacagt gcagcggctg ctgcctgtgc tgtgtcaggc tcacggcttg 1620
actccagaac aggtggtggc tattgcttcc cacgacgggg ggaaacaggc cctggaaact 1680
gtgcagcgcc tgctgccagt gctgtgccag gctcacggac tgacccccga acaggtggtg 1740
gccattgcca gcaacatcgg cggcaagcag gccctggaaa ccgtgcagag actgctgccc 1800
gtgctgtgcc aggcccatgg cctgacacct gaacaggtgg tggctatcgc ctctaacaac 1860
ggaggaaaac aagcactcga gacagtgcag cggctgctgc ctgtgctgtg tcaggctcac 1920
ggcttgactc cagaacaggt ggtggctatt gcttccaacg gcggggggaa acaggccctg 1980
gaaactgtgc agcgcctgct gccagtgctg tgccaggctc acgggctgac ccccgaacag 2040
gtggtggcca ttgccagcaa catcggcggc aagcaggccc tggaaaccgt gcagagactg 2100
ctgcccgtgc tgtgccaggc ccatggcctg acacctgaac aggtggtggc tatcgcctct 2160
aacggcggag gaaaacaggc tctggaaaca gtgcagcggc tgctgcctgt gctgtgtcag 2220
gctcacggct tgactccaca gcaggtcgtg gcaattgcta gcaatatcgg cggacggccc 2280
gccctggaga gcattgtggc ccagctgtct agacctgatc ctgccctggc cgccctgaca 2340
aatgatcacc tggtggccct ggcctgtctg ggaggcagac ctgccctgga tgccgtgaaa 2400
aaaggactgc ctcacgcccc tgccctgatc aagagaacaa atagaagaat ccccgagcgg 2460
acctctcaca gagtggccgg atcccagctg gtgaaatctg agctggagga gaagaagtct 2520
gagctgagac acaagctgaa gtacgtgcct cacgagtaca tcgagctgat cgagatcgcc 2580
agaaatagca cccaggatag aatcctggag atgaaggtga tggagttctt catgaaggtg 2640
tacggctaca gaggaaagca cctgggagga agcagaaaac ctgacggagc catttataca 2700
gtgggcagcc ctatcgatta tggcgtgatc gtggatacaa aggcctacag cggaggctac 2760
aatctgccta ttggacaggc cgatgagatg cagagatacg tggaggagaa ccagaccagg 2820
aacaagcaca tcaaccctaa cgagtggtgg aaggtgtacc cttctagcgt gaccgagttc 2880
aagttcctgt ttgtgagcgg ccacttcaag ggcaattata aggcccagct gaccaggctg 2940
aaccacatca caaattgtaa tggcgccgtg ctgtctgtgg aggaactgct gattggagga 3000
gagatgatta aggccggaac actgacactg gaggaggtga gaagaaagtt caacaacggc 3060
gagatcaact tctga 3075
<210> 150
<211> 3075
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RightTALEN-ldhA
<400> 150
atgggaaaac ctattcctaa tcctctgctg ggcctggatt ctaccggagg catggcccct 60
aagaaaaagc ggaaggtgga cggcggagtg gacctgagaa cactgggata ttctcagcag 120
cagcaggaga agatcaagcc caaggtgaga tctacagtgg cccagcacca cgaagccctg 180
gtgggacacg gatttacaca cgcccacatt gtggccctgt ctcagcaccc tgccgccctg 240
ggaacagtgg ccgtgaaata tcaggatatg attgccgccc tgcctgaggc cacacacgaa 300
gccattgtgg gagtgggaaa acagtggtct ggagccagag ccctggaagc cctgctgaca 360
gtggccggag aactgagagg acctcctctg cagctggata caggacagct gctgaagatt 420
gccaaaaggg gcggagtgac cgcggtggaa gccgtgcacg cctggagaaa tgccctgaca 480
ggagcccctc tgaacctgac ccccgaacag gtggtggcca ttgccagcca cgacggcggc 540
aagcaggccc tggaaaccgt gcagagactg ctgcccgtgc tgtgccaggc ccatggcctg 600
acacctgaac aggtggtggc tatcgcctct cacgacggag gaaaacaggc tctggaaaca 660
gtgcagcggc tgctgcctgt gctgtgtcag gctcacggct tgactccaga acaggtggtg 720
gctattgctt ccaacggcgg ggggaaacag gccctggaaa ctgtgcagcg cctgctgcca 780
gtgctgtgcc aggctcacgg actgaccccc gaacaggtgg tggccattgc cagccacgac 840
ggcggcaagc aggccctgga aaccgtgcag agactgctgc ccgtgctgtg ccaggcccat 900
ggcctgacac ctgaacaggt ggtggctatc gcctctaacg gcggaggaaa acaggctctg 960
gaaacagtgc agcggctgct gcctgtgctg tgtcaggctc acggcttgac tccagaacag 1020
gtggtggcta ttgcttccaa caacgggggg aaacaggccc tggaaactgt gcagcgcctg 1080
ctgccagtgc tgtgccaggc tcacgggctg acccccgaac aggtggtggc cattgccagc 1140
cacgacggcg gcaagcaggc cctggaaacc gtgcagagac tgctgcccgt gctgtgccag 1200
gcccatggcc tgacacctga acaggtggtg gctatcgcct ctaacaacgg aggaaaacag 1260
gctctggaaa cagtgcagcg gctgctgcct gtgctgtgtc aggctcacgg cttgactcca 1320
gaacaggtgg tggctattgc ttcccacgac ggggggaaac aggccctgga aactgtgcag 1380
cgcctgctgc cagtgctgtg ccaggctcac ggcctcactc ccgaacaggt ggtggccatt 1440
gccagcaacg gcggcggcaa gcaggccctg gaaaccgtgc agagactgct gcccgtgctg 1500
tgccaggccc atggcctgac acctgaacag gtggtggcta tcgcctctaa tatcggagga 1560
aaacaggctc tggaaacagt gcagcggctg ctgcctgtgc tgtgtcaggc tcacggcttg 1620
actccagaac aggtggtggc tattgcttcc cacgacgggg ggaaacaggc cctggaaact 1680
gtgcagcgcc tgctgccagt gctgtgccag gctcacggac tgacccccga acaggtggtg 1740
gccattgcca gccacgacgg cggcaagcag gccctggaaa ccgtgcagag actgctgccc 1800
gtgctgtgcc aggcccatgg cctgacacct gaacaggtgg tggctatcgc ctctaacggc 1860
ggaggaaaac aagcactcga gacagtgcag cggctgctgc ctgtgctgtg tcaggctcac 1920
ggcttgactc cagaacaggt ggtggctatt gcttccaaca acggggggaa acaggccctg 1980
gaaactgtgc agcgcctgct gccagtgctg tgccaggctc acgggctgac ccccgaacag 2040
gtggtggcca ttgccagcca cgacggcggc aagcaggccc tggaaaccgt gcagagactg 2100
ctgcccgtgc tgtgccaggc ccatggcctg acacctgaac aggtggtggc tatcgcctct 2160
aacggcggag gaaaacaggc tctggaaaca gtgcagcggc tgctgcctgt gctgtgtcag 2220
gctcacggct tgactccaca gcaggtcgtg gcaattgcta gccacgacgg cggacggccc 2280
gccctggaga gcattgtggc ccagctgtct agacctgatc ctgccctggc cgccctgaca 2340
aatgatcacc tggtggccct ggcctgtctg ggaggcagac ctgccctgga tgccgtgaaa 2400
aaaggactgc ctcacgcccc tgccctgatc aagagaacaa atagaagaat ccccgagcgg 2460
acctctcaca gagtggccgg atcccagctg gtgaaatctg agctggagga gaagaagtct 2520
gagctgagac acaagctgaa gtacgtgcct cacgagtaca tcgagctgat cgagatcgcc 2580
agaaatagca cccaggatag aatcctggag atgaaggtga tggagttctt catgaaggtg 2640
tacggctaca gaggaaagca cctgggagga agcagaaaac ctgacggagc catttataca 2700
gtgggcagcc ctatcgatta tggcgtgatc gtggatacaa aggcctacag cggaggctac 2760
aatctgccta ttggacaggc cgatgagatg cagagatacg tggaggagaa ccagaccagg 2820
aacaagcaca tcaaccctaa cgagtggtgg aaggtgtacc cttctagcgt gaccgagttc 2880
aagttcctgt ttgtgagcgg ccacttcaag ggcaattata aggcccagct gaccaggctg 2940
aaccacatca caaattgtaa tggcgccgtg ctgtctgtgg aggaactgct gattggagga 3000
gagatgatta aggccggaac actgacactg gaggaggtga gaagaaagtt caacaacggc 3060
gagatcaact tctga 3075
<210> 151
<211> 19
<212> DNA
<213> 米根霉（Rhizopus oryzae）
<220>
<223> LeftTALEN-ldhA的靶标
<400> 151
tgcagatgct gccagtata 19
<210> 152
<211> 19
<212> DNA
<213> 米根霉（Rhizopus oryzae）
<220>
<223> RightTALEN-ldhA的靶标
<400> 152
tcctctgcgc tacctgctc 19

Claims (10)

1.一种突变丝状菌的制造方法，其中，
包括：
向宿主丝状菌中导入位点特异性DNA核酸酶和单链DNA，并且，
将该宿主的基因组DNA中由该位点特异性DNA核酸酶产生的切断位点的上游区域和下游区域，使用该单链DNA通过同源重组进行取代。
2.如权利要求1所述的方法，其中，
所述单链DNA的长度在10bp以上50kbp以下。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，
所述单链DNA含有2个DNA序列，所述2个DNA序列分别包含与所述宿主的基因组DNA中切断位点的上游区域和下游区域相同的区域。
4.如权利要求3所述的方法，其中，
所述2个DNA序列的长度分别在5bp以上。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，
所述单链DNA还包含需要插入至所述宿主基因组DNA的序列。
6.如权利要求5所述的方法，其中，
所述需要插入的序列长度在1bp以上50kbp以下。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，
所述位点特异性DNA核酸酶为TALEN、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1或基于ZFN技术的人工DNA核酸酶。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，
所述丝状菌属于接合菌门。
9.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，
所述丝状菌为根霉属菌。
10.如权利要求9所述的方法，其中，
所述根霉属菌为戴尔根霉或米根霉。
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