CN117866859A - 葡萄球菌属细菌的营养缺陷型菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及葡萄球菌属细菌的营养缺陷型菌株。本公开内容提供了依赖于D‑丙氨酸用于生长的重组葡萄球菌属细菌(例如表皮葡萄球菌)。在一个方面,本公开内容的特点在于重组葡萄球菌属细菌,其包含两个失活的丙氨酸消旋酶基因(Δalr1Δalr2);以及失活的D‑丙氨酸转氨酶(dat)基因。在另一个方面,本公开内容的特点在于制备重组葡萄球菌属细菌的方法。
Description
本申请是申请日为2019年01月04日,申请号为201980017381.5(PCT/US2019/012287),发明名称为“葡萄球菌属细菌的营养缺陷型菌株”的发明专利申请的分案申请。
相关申请
本申请要求于2018年1月5日提交的美国临时专利申请号62/614,096的优先权,所述美国临时专利申请的全部内容整体引入本文作为参考用于所有目的。
发明背景
许多细菌在肽聚糖层的生物合成中利用了两种氨基酸D-丙氨酸和D-谷氨酸,所述肽聚糖层对于在此类细菌中构建功能细胞壁是必需的。革兰氏阳性细菌,包括葡萄球菌属(Staphylococcus genus)中的物种,利用D-丙氨酸和D-谷氨酸用于合成在其细胞壁中的肽聚糖层。
遗传密码提供了20种蛋白原性氨基酸的密码子,其中19种具有手性,并且是L-异构体。这些被视为“天然”或“标准”氨基酸。具有相反手性,即D-异构体的氨基酸,被视为非天然的,并且一般不存在于环境中。如果生物如细菌需要D-氨基酸,则产生此类非天然氨基酸的一种或多种酶必须存在于细菌中,或者必须有意提供给细菌,否则它不能存活。
丙氨酸消旋酶是催化L-丙氨酸至D-丙氨酸的转换的酶,D-丙氨酸是细菌细胞壁中的肽聚糖层生物合成的关键构件块。丙氨酸消旋酶通常在真核生物中不存在,但在原核生物中普遍存在。
由于D-丙氨酸对于细菌细胞壁的形成并且因此对于细菌的存活是必需的,因此细菌具有可以催化D-丙氨酸产生的酶。由于D-丙氨酸对细菌的生存是非常重要的,因此它可能具有用于D-丙氨酸生物合成的冗余或多种酶。例如,细菌可以含有多个丙氨酸消旋酶基因。在具有两个基因的物种中,一个可以是组成性表达和合成代谢的,而另一个是可诱导和分解代谢的(Strych,U.等人2007.BMC Microbiol.7:40;Strych U.等人,Curr.Microbiol.41:290-294;Strych U.等人,FEMS Microbiol.Lett.196:93-98)。这些基因供应了对于细胞壁生物合成所需的D-丙氨酸,并且用这些细菌中的几种的敲除研究已确定,丙氨酸消旋酶对于在不存在外源D-丙氨酸的情况下的生长是必需的(Franklin,F.C.和W.A.Venables.1976.Mol.Gen.Genet.149:229-237;Hols,P.等人J.Bacteriol.179:3804-3807;Palumbo,E.等人FEMS Microbiol.Lett.233:131-138;Steen,A.等人J.Bacteriol.187:114-124;Wijsman,H.J.1972.Genet.Res.20:269-277)。
去除微生物产生对于生长所需的氨基酸的能力产生称为营养缺陷体的微生物。如果需要微生物的存活和生长,则必须外源提供对于生长所需的氨基酸。营养缺陷型微生物的产生是众所周知的,尤其是对于大肠杆菌(E.coli)。(可在万维网上cgsc2.biology.yale.edu/Auxotrophs.php处公开获得;Methods Enzymol.2015;565:45-66.doi:10.1016/bs.mie.2015.05.012.Epub 2015Jun 10.“Escherichia coli auxotrophhost strains for amino acid-selective isotope labeling of recombinantproteins.”Lin MT,Fukazawa R,Miyajima-Nakano Y,Matsushita S,Choi SK,Iwasaki T,Gennis RB;Nicola Casali,Methods in Molecular Biology,第235卷.www.springer.com/gp/book/9781588291516,各自的内容整体引入本文作为参考)。
已产生了金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的D-丙氨酸营养缺陷体,用于产生针对金黄色葡萄球菌的甲氧西林抗性菌株的疫苗的目的。(Moscoso M等人27thECCMID 22-25April 2017,The Congress of ESCMID(P0473);Moscoso等人,Virulence(2018)第9(1)卷:604-620,各自的内容整体引入本文作为参考)。在这种情况下,发现不仅敲除两种丙氨酸消旋酶alr1和alr2,而且还敲除第三种酶是必要的。
如果将细菌引入目标环境中,则希望能够在引入目标环境中后控制引入的细菌,例如相对于目标环境中已经存在的细菌群体的生长,控制引入的细菌的生长。
此类控制可以通过使用抗生素来施加,所述抗生素对引入的细菌具有选择性毒性,但对目标环境中存在的细菌群体无毒。然而,通常不可能找到具有此类选择性的抗生素。进一步地,通常不期望使用抗生素,因为它们可能以不期望的方式干扰目标环境,例如在现有细菌群体的成员中诱导抗生素抗性,或干扰目标环境而导致生态失调,或不希望的情况,例如腹泻。
因此,有利的是使用选择性地控制将引入目标环境中的细菌生长的方法,所述方法不依赖于抗生素的使用。将营养缺陷型引入待引入目标环境中的细菌内允许此类所需控制。这对于将细菌引入目标环境中用于加强或以其它方式改变目标环境的微生物组的目的是尤其有利的,且当目标环境是人微生物组时是最尤其有利的。
革兰氏阳性细菌表皮葡萄球菌是人微生物组的已知成员(Zhang等人,MolecularMicrobiology(2003)49(6),1577–1593,“Genome-based analysis of virulence genesin a non-biofilm-forming Staphylococcus epidermidis strain(ATCC 12228)”,其整体引入本文作为参考)。表皮葡萄球菌是兼性厌氧细菌,且是正常人菌群的一部分。尽管表皮葡萄球菌通常不是致病性的,但具有受损的免疫系统的患者处于发展感染的风险中。这些感染一般是医院获得性的(Levinson,W.(2010).Review of Medical Microbiology andImmunology(第11版),第94-99页,其整体引入本文作为参考)。表皮葡萄球菌对于具有导管或其它外科植入物的人是一种特别顾虑,因为已知它形成在这些装置上生长的生物膜。
因此,本公开内容解决了葡萄球菌属细菌(例如表皮葡萄球菌)的需要,所述葡萄球菌属细菌是营养缺陷型的,并且依赖于外源供应的营养物例如D-丙氨酸或D-谷氨酸用于存活和生长。
发明概述
本公开内容一般涉及依赖于D-丙氨酸用于生长的重组葡萄球菌属细菌(例如表皮葡萄球菌)。本公开内容的发现是无需使用抗生素,可以选择性地控制目标环境中细菌(例如重组葡萄球菌属细菌(例如表皮葡萄球菌))的生长。根据本公开内容的一些实施方案,营养缺陷型的特征可用于维持质粒的存在,所述质粒不需要抗生素抗性基因的存在。因此,在一些实施方案中,重组葡萄球菌属细菌不包含抗生素抗性基因。在一些实施方案中,将允许表达酶或其它组分的多核苷酸掺入期望在微生物中得到维持的质粒中,所述酶或其它组分恢复代谢地产生外源营养物的能力。在一些实施方案中,用基于pUBTR114的载体转化重组葡萄球菌属细菌。在进一步的实施方案中,基于pUBTR114的载体是pUBTR119*-Sal-GFP。
在一个方面,本公开内容的特点在于重组葡萄球菌属细菌,其包含两个失活的丙氨酸消旋酶基因(Δalr1Δalr2);以及失活的D-丙氨酸转氨酶(dat)基因。在一些实施方案中,葡萄球菌属细菌依赖于D-丙氨酸用于生长。在另一个实施方案中,葡萄球菌属细菌是表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(表皮葡萄球菌(S.epidermidis))及其亚种。在一个实施方案中,葡萄球菌属细菌进一步包含一种或多种另外的突变。在一些实施方案中,另外的突变包含失活的谷氨酸消旋酶基因MurI。在一些实施方案中,葡萄球菌属细菌进一步包含编码具有治疗特性的蛋白质(例如,可溶性治疗性蛋白质)的多核苷酸。在一些实施方案中,具有治疗特性的蛋白质显示出酶促活性或生物活性。在一些实施方案中,蛋白质是生长因子。在一些实施方案中,蛋白质是激素。
在另一个方面,本发明的特点在于制备重组葡萄球菌属细菌的方法,其包括:(i)将包含D-丙氨酸转氨酶(dat)敲除的质粒转化到葡萄球菌属菌株(SEΔalr1Δalr2)的感受态细胞内;(ii)在转化的细胞中检测敲除质粒的存在;(iii)温育步骤(ii)中鉴定的转化细胞;并且(iv)纯化分离的菌落。在一些实施方案中,该方法进一步包括就D-丙氨酸营养缺陷型测试分离的菌落。在一些实施方案中,使用聚合酶链反应(PCR)检测转化体中敲除质粒的存在。在一些实施方案中,重组葡萄球菌属细菌是表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)(表皮葡萄球菌(S.Epidermidis))及其亚种。在一些实施方案中,该方法进一步包括用基于pUBTR114的载体转化重组葡萄球菌属细菌。在一些实施方案中,基于pUBTR114的载体是pUBTR119*-Sal-GFP。在一些实施方案中,重组葡萄球菌属细菌通过前述方法产生。
在另一个方面,本公开内容的特点在于试剂盒,其包含本文所述方面或实施方案中任何一个的重组葡萄球菌属细菌。在一些实施方案中,试剂盒进一步包含基于pUBTR114的载体。
附图简述
图1显示了在具有三重基因敲除的表皮葡萄球菌菌株(SEΔalr1Δalr2Δdat)中的D-丙氨酸营养缺陷型的观察。在用SE1423敲除质粒转化、质粒整合和质粒主链去除后,细胞进行铺平板用于菌落。将25个菌落点到两块不同的平板上,并且使平板在30℃下温育过夜。左:TSA平板;右:TSA+脱水四环素(2μg/mL)+D-丙氨酸(40μg/mL)。三个克隆(#7、#12和#18,以红色圆圈突出显示)只能在补充有D-丙氨酸的TSA上生长。
图2A和图2B显示了三重敲除菌株(SEΔalr1Δalr2Δdat)的PCR测试结果。来自TSA+脱水四环素(2μg/mL)+D-丙氨酸(40μg/mL)平板上的菌斑的细胞用作PCR反应中的模板:克隆#7;KO克隆#12;KO克隆#18;野生型SE;SE1423KO质粒DNA(载体,作为对照)。在图2A中,使用引物1423-5F和1423-3R执行PCR,以区分野生型SE1423基因座(2.3Kb的PCR产物)和SE1423敲除(1.5Kb的PCR产物)。在图2B中,使用引物1423-F和1423-R执行PCR,以检测对于野生型SE1423基因座特异性的0.7Kb的PCR产物。如预计的,PCR产物不从SE1423敲除质粒和推定的SE1423敲除SE克隆生成。结果确认了在克隆#7、#12和#18中成功的SE1423缺失。
图3显示了用pUBTR119*-Sal-GFP转化的表皮葡萄球菌NRRL B-4268的克隆的聚合酶链反应(PCR)结果。11个克隆(标记为1到11)的细胞在使用引物Sar-sGFP-F和Sar-sGFP-R的PCR反应中用作模板,以检测1.1-Kb PCR产物。SE NRRL B-4268的细胞以及从SCK6中分离的pUBTR119*-Sal-sGFP的质粒DNA充当阴性(-)和阳性(+)对照。确认了所有转化体克隆。
图4显示了通过抗生素选择或D-丙氨酸营养缺陷体互补,用pUBTR119*-Sal-GFP转化的表皮葡萄球菌三重基因敲除菌株(SEΔalr1Δalr2Δdat)的克隆的PCR结果。细胞在使用引物Sar-sGFP-F和Sar-sGFP-R的PCR反应中用作模板,以检测1.1-Kb PCR产物。SE NRRLB-4268的细胞以及从SCK6中分离的pUBTR119*-Sal-sGFP的质粒DNA充当阴性(-)和阳性(+)对照。克隆1到3由抗生素选择生成,而克隆4到26由D-丙氨酸营养缺陷体互补生成。确认了所有克隆。
图5显示了用于检测加上His标签的蛋白质的蛋白质印迹。泳道1到6:如表2中列出的表皮葡萄球菌培养肉汤样品;泳道7到10:分别以1/20、1/10、1/5和1/1的稀释度装载的含有加上His标签的TP蛋白(~52kDa)的样品。关于加上His标签的GFP蛋白(29kDa)的信号无法检测到。
发明详述
I.定义
除非另有定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有由本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。
下述参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义:Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版,1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker编辑,1988);TheGlossary of Genetics,第5版,R.Rieger等人(编辑),Springer Verlag(1991);以及Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。如本文使用的,除非另有说明,否则下述术语具有下文归于其的含义。
冠词“a”和“an”在本文中用于指一个或多于一个(即,至少一个)该冠词的语法对象。例如,“元件”意指一个元件或多于一个元件。
术语“包括”在本文中用于意指短语“包括但不限于”,并且可与该短语互换使用。
除非上下文另有明确说明,否则术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”,并且可与其互换使用。
术语“例如”在本文中用于意指短语“例如但不限于”,并且可与该短语互换使用。
如本文使用的,术语“营养缺陷型的”或“营养缺陷型”指生物不能合成对于其生长所需的特定化合物。营养缺陷体是展示这种特征的生物。
如本文使用的,术语“alrA”和“alr”指D-丙氨酸消旋酶基因,包括alrA基因的正常等位基因。在一些实施方案中,来自表皮葡萄球菌的alr基因(UniProtKB-Q8CNK7(ALR_STAES))编码D-丙氨酸消旋酶蛋白(EC 5.1.1.1)。在一些实施方案中,基因座标识符SE1674(alr1)和SE1079(alr2)指特定的表皮葡萄球菌D-丙氨酸消旋酶基因。
如本文使用的,术语“dat”指D-丙氨酸转氨酶基因,包括dat基因的正常等位基因。在一些实施方案中,来自表皮葡萄球菌的dat基因(UniProtKB-Q8CS41(DAAA_STAES))编码D-丙氨酸转氨酶蛋白(EC:2.6.1.21)。在一些实施方案中,基因座标识符SE1423(dat)指特定的表皮葡萄球菌D-丙氨酸转氨酶基因。如本文使用的,术语“murI”指谷氨酸消旋酶基因,包括murI基因的正常等位基因。在一些实施方案中,来自表皮葡萄球菌的murI基因(UniProtKB-Q8CPL0(MURI_STAES))编码谷氨酸消旋酶蛋白(EC:5.1.1.3)。在一些实施方案中,基因座标识符SE0843(murI)指特定的表皮葡萄球菌谷氨酸消旋酶基因。
如本文使用的,术语“遗传元件”意指包含编码多肽的区域,或者调节对于多肽在宿主细胞中的表达重要的复制、转录或翻译或其它过程的多核苷酸区域的多核苷酸;或者既包含编码多肽的区域,又包含与其可操作地连接的调节表达的区域的多核苷酸。遗传元件可以包含在作为附加体元件复制的载体内;即,作为物理上不依赖于宿主细胞基因组的分子。它们可以包含在质粒内。遗传元件也可以包含在宿主细胞基因组内;并非以其天然状态,而是在操作如分离、克隆以及引入宿主细胞内之后尤其以纯化DNA的形式或在载体中。
如本文使用的,术语“宿主细胞”意指已进行转化或转染,或者能够通过外源多核苷酸序列转化或转染的细胞。
为了本发明的目的,术语“分离的”指示已从其原始环境(它天然存在于其中的环境)中取出的生物材料(细胞、核酸或蛋白质)。例如,以天然状态存在于植物或动物中的多核苷酸并非分离的,然而,与它天然存在于其中的相邻核酸分开的相同多核苷酸被视为“分离的”。
“分离的核酸分子”(例如,分离的启动子)是与存在于核酸的天然来源中的其它核酸分子分开的核酸分子。例如,关于基因组DNA,术语“分离的”包括与染色体分开的核酸分子,基因组DNA与所述染色体天然缔合。优选地,“分离的”核酸分子不含天然地位于生物的基因组DNA中的核酸分子侧翼的序列,所述核酸分子衍生自所述生物。
如本文使用的,术语“敲除”指通过以下禁止基因产物(例如,和酶)的有用表达:基因的全部或部分去除,对于基因产物的有用表达必需的非编码控制区的部分或全部去除,核苷酸插入编码基因的多核苷酸内,或用于防止基因产物的有用表达的其它方法。
如本文使用的,术语“多肽”或“蛋白质”指由在链中键合在一起的氨基酸残基组成的生物分子或大分子。本文使用的多肽的定义预期涵盖由氨基酸残基的一个或多个长链组成的蛋白质(一般较高分子量)、以及几个氨基酸的小肽(一般较低分子量)。在其它实施方案中,单个氨基酸,尽管在技术上不是多肽,但也被视为在本发明的范围内。
如本文使用的,“启动子”指的是指导结构基因的转录的DNA序列。通常,启动子位于基因的5'区域中,邻近结构基因的转录起始位点。如果启动子是诱导型启动子,则转录速率响应诱导剂而增加。例如,启动子可以以组织特异性方式进行调节,使得它仅在转录特异性组织类型中的相关编码区时才是活性的。
如本文使用的,术语“多核苷酸”一般指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸,其可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。因此,例如,如本文使用的,多核苷酸尤其指单链和双链DNA;其为单链和双链区域或单链、双链和三链区域的混合物的DNA;单链和双链RNA;以及其为单链和双链区域的混合物的RNA;包含DNA和RNA的杂合分子,其可以是单链的,或更通常地,双链或三链的,或者是单链和双链区域的混合物。另外,如本文使用的,多核苷酸指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区域。在此类区域中的链可以来自相同分子或不同分子。该区域可以包括一种或多种分子的全部,但更通常地仅涉及一些分子的区域。三螺旋区域的分子之一经常是寡核苷酸。如本文使用的,术语多核苷酸包括如上所述的DNA或RNA,其含有一个或多个修饰的碱基。因此,具有出于稳定性或出于其它原因而修饰的主链的DNA或RNA是“多核苷酸”,如该术语在本文中预期的。此外,仅举两个例子,包含稀有碱基例如肌苷或修饰碱基例如三苯甲基化碱基的DNA或RNA是多核苷酸,如该术语在本文中使用的。应了解,已对DNA和RNA进行广泛多样的修饰,所述修饰发挥本领域技术人员已知的许多有用目的。如它在本文中采用的,术语多核苷酸尤其包括多核苷酸的此类化学、酶促或代谢修饰形式,以及病毒和细胞(包括简单和复杂细胞)特有的DNA和RNA的化学形式。术语多核苷酸还包括经常被称为寡核苷酸的短多核苷酸。“多核苷酸”和“核酸”在本文中经常可互换使用。
如本文使用的,术语“治疗性蛋白质”意指这样的蛋白质、肽、糖蛋白或糖肽,其施用于受试者以治疗疾病或功能障碍或改善受试者的健康。在一些实施方案中,受试者是人。在一些实施方案中,治疗性蛋白质是人蛋白质。使用本文公开的方法,治疗性蛋白质在葡萄球菌属细菌例如表皮葡萄球菌中产生,所述细菌在遗传上改变为具有双重丙氨酸消旋酶基因(例如,alr1和alr2)敲除和丙氨酸转氨酶基因(dat,SE1423)敲除。
II.组合物
本公开内容描述了三重敲除葡萄球菌属细菌,其是D-丙氨酸营养缺陷体。本公开内容提供了改造的葡萄球菌属细菌,例如表皮葡萄球菌,其在遗传上改变为具有双重丙氨酸消旋酶基因(例如,alr1和alr2)敲除和丙氨酸转氨酶基因(dat,SE1423)敲除。本公开内容提供了具有所需D-丙氨酸营养缺陷型的三重敲除表皮葡萄球菌菌株(SEΔalr1Δalr2Δdat)。
D-丙氨酸是具有肽聚糖层结构的细菌的必需组分。D-丙氨酸的必要性源于二肽D-丙氨酰-D-丙氨酸在肽聚糖链的交联中的关键作用。如本公开内容中所述,先前开发了双重丙氨酸消旋酶基因敲除表皮葡萄球菌菌株(SEΔalr1Δalr2)。然而,与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌和一些其它细菌物种相比,所述双重敲除菌株未显示出D-丙氨酸营养缺陷型。认为表皮葡萄球菌中谷氨酸消旋酶(使L-谷氨酸和D-谷氨酸相互转换)和D-丙氨酸转氨酶(使D-丙氨酸和D-谷氨酸相互转换)的存在可以提供关于丙氨酸消旋酶的旁路。因此,本公开内容提供了显示D-丙氨酸营养缺陷型的双重敲除菌株(SEΔalr1Δalr2)中的丙氨酸转氨酶基因(dat,SE1423)的敲除。
本公开内容提供了遗传改造为在dat基因或其同系物中具有缺失的细菌宿主细胞,使得D-丙氨酸转氨酶的活性降低,从而致使细胞成为D-丙氨酸营养缺陷体。在一些实施方案中,细菌细胞进行遗传改造,以包含在另一个基因或操纵子中的缺失,所述基因或操纵子影响dat操纵子,使得D-丙氨酸转氨酶的活性降低,从而致使细胞成为D-丙氨酸营养缺陷体。
在一些实施方案中,本文所述的D-丙氨酸营养缺陷型细菌,例如改造的葡萄球菌属细菌,例如三重敲除表皮葡萄球菌菌株(SEΔalr1Δalr2Δdat),进一步包含关于另一种氨基酸、维生素和/或核苷酸的营养缺陷型。例如,在一些实施方案中,本文所述的D-丙氨酸营养缺陷型细菌可以进一步包含关于下述氨基酸中的一种或多种的营养缺陷型:丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中,本文所述的D-丙氨酸营养缺陷型细菌可以进一步包含关于维生素,例如维生素A、维生素B(例如B-1-B-12)、维生素C、维生素D、维生素E和维生素K的营养缺陷型。在一些实施方案中,本文所述的D-丙氨酸营养缺陷型细菌可以进一步包含关于核苷酸的营养缺陷型。
细菌菌株
本公开内容提供了遗传改变的微生物,例如细菌。考虑本文所述的方法可以通过以下在任何葡萄球菌属细菌细胞中进行:使该细胞中编码dat的蛋白质同系物的基因失活或敲除,或者以其它方式使这种蛋白质的表达或活性失活。将菌株分配至葡萄球菌属要求其为革兰氏阳性球菌,所述球菌形成聚簇,产生过氧化氢酶,具有适当的细胞壁结构(包括肽聚糖类型和磷壁酸的存在),以及在30–40摩尔%范围内的DNA的G+C含量。实例包括但不限于金黄色葡萄球菌群,包括银色葡萄球菌(S.argenteus)、金黄色葡萄球菌、施维策葡萄球菌(S.schweitzeri)、猿猴葡萄球菌(S.simiae);耳葡萄球菌(S.auricularis)群,包括耳葡萄球菌;肉葡萄球菌(S.carnosus)群,包括肉葡萄球菌、S.condimenti、马赛葡萄球菌(S.massiliensis)、S.piscifermentans、模仿葡萄球菌(S.simulans);表皮葡萄球菌群,包括头状葡萄球菌(S.capitis)、山羊葡萄球菌(S.caprae)、表皮葡萄球菌、解糖葡萄球菌(S.saccharolyticus);溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)群,包括德氏葡萄球菌(S.devriesei)、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌(S.hominis);猪葡萄球菌(S.hyicus)-中间葡萄球菌(S.intermedius)群,包括S.agnetis、产色葡萄球菌(S.chromogenes)、猫葡萄球菌(S.felis)、海豚葡萄球菌(S.delphini)、猪葡萄球菌(S.hyicus)、中间葡萄球菌(S.intermedius)、S.lutrae、S.microti、蝇葡萄球菌(S.muscae)、假中间葡萄球菌(S.pseudintermedius)、S.rostri、施氏葡萄球菌(S.schleiferi);路邓葡萄球菌(S.lugdunensis)群,包括路邓葡萄球菌;腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)群,包括阿莱塔葡萄球菌(S.arlettae)、科氏葡萄球菌(S.cohnii)、马胃葡萄球菌(S.equorum)、鸡葡萄球菌(S.gallinarum)、克氏葡萄球菌(S.kloosii)、S.leei、尼泊尔葡萄球菌(S.nepalensis)、腐生葡萄球菌、琥珀葡萄球菌(S.succinus)、木糖葡萄球菌(S.xylosus);松鼠葡萄球菌(S.sciuri)群,包括S.fleurettii、缓慢葡萄球菌(S.lentus)、松鼠葡萄球菌、S.stepanovicii、小牛葡萄球菌(S.vitulinus);模仿葡萄球菌群;包括模仿葡萄球菌;沃氏葡萄球菌(S.warneri)群;包括巴氏葡萄球菌(S.pasteuri)、沃氏葡萄球菌。在一个实施方案中,葡萄球菌属细菌是表皮葡萄球菌。
遗传构建体
本公开内容利用标准分子生物学技术,例如在(Sambrook等人,2001)中描述的那些。pJB38(Boss等人,2013)用作敲除载体的质粒主链,所述载体基于pJB38,一种等位基因交换大肠杆菌-葡萄球菌穿梭载体,在质粒上进一步包含另外的设计特点,以改善功能性(Bose,J.L.等人Applied and environmental microbiology.2013;79(7):2218-2224)。设计特异性引物用于进行SE1423敲除(在下文的实施例1中如表1所述)。
在一些实施方案中,使用标准分子生物学技术,使用Top10大肠杆菌作为克隆宿主,通过在pJB38中的EcoRI-SalI位点处克隆重叠的PCR产物来构建质粒。然后通过使用引物1423-5F和1423-3R(表1)的PCR以检测PCR产物,来选择和筛选克隆。将正确的SE1423敲除质粒(pJB-1423KO)的克隆转化到dam-/dcm-大肠杆菌菌株Gm2163内。通过使用Qiagen MidiPrep Kit,从两个Gm2163转化体克隆中分离质粒DNA,并且如上文通过用EcoRI和SalI的限制性消化进行检查。
重组葡萄球菌属细菌的用途
在一些实施方案中,本文所述的葡萄球菌属细菌(例如,表皮葡萄球菌,其在遗传上改变为具有双重丙氨酸消旋酶基因(例如,alr1和alr2)敲除和丙氨酸转氨酶基因(dat,SE1423)敲除)进一步包含编码具有治疗特性的蛋白质的多核苷酸。在一些实施方案中,蛋白质是可溶性治疗性蛋白质。可溶性治疗性蛋白质指在水溶液中溶解的治疗性蛋白质。在一些实施方案中,所有表达的治疗性蛋白质、大多数表达的治疗性蛋白质、或表达的治疗性蛋白质的一些部分可以在本文所述的葡萄球菌属细菌中是溶解的。在一些实施方案中,可溶性治疗性蛋白质是活性蛋白,例如具有酶促活性或生物活性,例如与配体或受体的结合活性、激活细胞内信号转导途径的能力、或在哺乳动物例如人中引发免疫应答的能力。在一些实施方案中,治疗性蛋白质在体外通过一种或多种糖基转移酶进行糖基化或以其它方式进行修饰,或者进行修饰以增加对蛋白酶的抗性。
在一些实施方案中,本发明的葡萄球菌属细菌可以照原样使用,或进行修饰以表达治疗疾病的治疗性多肽。在一个实例中,本发明的葡萄球菌属细菌可以用于治疗皮肤疾病或病症。在另一个实施方案中,本发明的葡萄球菌属细菌可以进行修饰,以表达治疗皮肤疾病或病症的治疗性多肽或其片段。
制剂
进一步显而易见的是,用于根据本发明使用的制剂可以包含任何药学有效量的重组葡萄球菌属细菌,以产生治疗有效量的所需多肽,例如至少约0.01%、约0.05%、约0.1%、约0.2%、约0.3%、约0.4%、约0.5%、约0.6%、约0.7%、约0.8%、约0.9%、约1.0%、约1.5%、约2.0%、约3.0%、约4.0%、约5.0%、约6.0%、约7.0%、约8.0%、约9.0%、约10.0%、约11.0%、约12.0%、约13.0%、约14.0%、约15.0%、约16.0%、约17.0%、约18.0%、约19.0%、约20.0%、约25.0%、约30.0%、约35.0%、约40.0%、约45.0%、约50.0%或更多重量的遗传改造的微生物例如细菌,其上限为约90.0%重量的遗传改造的微生物例如细菌。
在一个替代实施方案中,用于根据本发明使用的制剂可以包含例如至少约0.01%至约30%、约0.01%至约20%、约0.01%至约5%、约0.1%至约30%、约0.1%至约20%、约0.1%至约15%、约0.1%至约10%、约0.1%至约5%、约0.2%至约5%、约0.3%至约5%、约0.4%至约5%、约0.5%至约5%、约1%至约5%或更多重量的重组葡萄球菌属细菌。
III.方法
本公开内容的特点在于制备重组葡萄球菌属细菌的方法,其包括:(i)将包含D-丙氨酸转氨酶(dat)敲除的质粒转化到葡萄球菌属菌株(SEΔalr1Δalr2)的感受态细胞内;(ii)在转化细胞中检测敲除质粒的存在;(iii)温育步骤(ii)中鉴定的转化细胞;并且(iv)纯化分离的菌落。在优选的实施方案中,使用聚合酶链反应(PCR)检测转化体中敲除质粒的存在。在某些实施方案中,该方法进一步包括就D-丙氨酸营养缺陷型测试分离的菌落。
IV.试剂盒
本发明还提供了试剂盒。在一个方面,本发明的试剂盒包含(a)本发明的重组葡萄球菌属细菌和(b)其使用说明书。本发明的组合物在上文描述。在一些实施方案中,本发明的组合物包含依赖于D-丙氨酸用于生长的重组葡萄球菌属细菌。
在本说明书中引用的所有出版物和专利申请都整体引入本文作为参考用于所有目的,如同每个个别出版物或专利申请特别地且个别地指出引入作为参考用于所有目的。提供本文讨论的出版物仅由于其公开内容在本申请的提交日期前。本文的任何内容均不应解释为承认由于先前的公开内容或由于任何其他原因,本文所述的本发明人没有资格先于此类公开内容。
本发明通过下述实施例进一步说明,所述实施例不应解释为进一步的限制。所有附图以及本申请自始至终引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容,以及附图都明确地整体引入本文作为参考。
实施例
下述实施例进一步描述且证实了在本发明的范围内的实施方案。实施例仅给出用于说明的目的,而不应解释为本发明的限制,因为其许多变化是可能的,而不脱离本发明的精神和范围。
在一些实施方案中,本公开内容提供了表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)(表皮葡萄球菌(S.epidermidis))表达系统的生成,由此无需使用抗生素可以维持表达质粒。本实验记录了开发D-丙氨酸营养缺陷体表皮葡萄球菌菌株的扩展努力。最初产生了双重丙氨酸消旋酶基因敲除表皮葡萄球菌菌株(SEΔalr1Δalr2),但并未显示出D-丙氨酸营养缺陷型。认为表皮葡萄球菌中谷氨酸消旋酶(使L-谷氨酸和D-谷氨酸相互转换)和D-丙氨酸转氨酶(使D-丙氨酸和D-谷氨酸相互转换)的存在可以提供关于丙氨酸消旋酶的旁路,如金黄色葡萄球菌和单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)中报告的。因此,本发明描述了丙氨酸转氨酶基因(dat,SE1423)的敲除,加上初始菌株(SEΔalr1Δalr2)中的丙氨酸消旋酶基因的双重敲除,以开发显示出D-丙氨酸营养缺陷型的三重敲除表皮葡萄球菌菌株(SEΔalr1Δalr2Δdat)。
实施例1:用于缺失SE1423(D-丙氨酸转氨酶)的载体
如下简要地描述了用于进行SE1423敲除(KO)的方法。首先,使用pJB38(Boss等人,2013)制备SE1423 KO质粒。
引物
基于表皮葡萄球菌菌株12228的基因组序列,设计寡核苷酸引物用于PCR,以开发SE1423敲除(KO)载体。引物序列、其特定用途和PCR产物大小如下文所示在表1中列出。
表1.用于SE1423敲除的引物
●使用引物1423-5F/1423-3R的重叠PCR:1.5Kb
●使用引物1423-5F/1423-3R来自野生型的PCR产物:2.3Kb
●F:正向引物
●R:反向引物
●添加的用于克隆的限制性位点以加下划线的粗体字母显示
生成了分别为0.5Kb和1.0Kb的5'和3'侧翼区域的PCR产物。它们然后用作重叠PCR中的模板,以生成涵盖5'和3'侧翼区域两者的大PCR产物(1.5Kb)。使用Top10大肠杆菌作为克隆宿主,在pJB38中的EcoRI-SalI位点处克隆重叠的PCR产物。通过使用引物1423-5F和1423-3R的PCR以检测1.5Kb的PCR产物,来选择和筛选克隆。还分离质粒DNA,并且通过EcoRI和SalI消化,以检测载体主链(7.0Kb)和插入物(1.5Kb)的两个片段。将正确的SE1423敲除质粒(pJB-1423KO)的克隆转化到dam-/dcm-大肠杆菌菌株Gm2163内。通过使用Qiagen MidiPrep Kit,从两个Gm2163转化体克隆中分离质粒DNA,并且如上文通过用EcoRI和SalI的限制性消化进行检查。
实施例2.三重敲除菌株(SEΔalr1Δalr2Δdat)的生成
使用TAS+氯霉素(10μg/mL)的平板,将从Gm2163中分离的pJB-1423KO质粒转化到表皮葡萄球菌菌株(SEΔalr1Δalr2)的感受态细胞内。通过使用引物1423-5F(EcoRI)和1423-3R(SalI)检测1.5Kb的PCR产物,确认了转化体中pJB-1423KO质粒的存在。在测试的所有26个克隆中,观察到1.5Kb的PCR产物,而在含有来自SE宿主细胞的细胞裂解产物的反应物中观察到2.3Kb的PCR产物。两个确认克隆的细胞在TSA+Cm(10μg/mL)+D-丙氨酸(40μg/mL)的新鲜平板上进行划线培养。使平板在43℃下温育24小时,用于经由同源重组的质粒整合。将分离的菌落在43℃下再次划线培养,用于纯化。将四个分离的菌落接种到250-mL三角振荡培养瓶中的50mL TSB+D-丙氨酸(40μg/mL)中,以便经由第二轮同源重组使质粒主链成环出来。使培养物在30℃下振荡24小时。将0.5mL培养物的等分试样转移至含有50mL新鲜培养基的培养瓶。转移重复三次。来自培养瓶的细胞在TSA+脱水四环素(ATC 2μg/mL)+D-丙氨酸(DA,40μg/mL)上铺平板。在30℃下温育2天后,在用以10-5稀释度的100μl培养物铺平板的平板上形成约100-200个菌落。菌落的进一步分析在下文描述。
实施例3.在三重敲除菌株(SEΔalr1Δalr2Δdat)中测试D-丙氨酸营养缺陷型将来自TSA+ATC+DA平板的总共25个分离的菌落点到TAS平板和TSA+ATC+DA平板上。使平板在30℃下温育过夜。所有克隆在补充D-丙氨酸的平板(TSA+ATC+DA)上都良好生长。如图1中所示,如果没有D-丙氨酸补充,三个克隆(#7、#12和#18)未能在TSA上生长,指示D-丙氨酸营养缺陷型。当将来自TSA+ATC+DA平板上的菌斑的细胞再次点在TSA平板上时,再次观察到营养缺陷型表型。注意,由于第二轮同源重组可以导致质粒主链的去除而不敲除SE1423,因此预计来自TSA+ATC+DA平板的一些克隆将保留野生型SE1423基因座。
进一步分析了其为D-丙氨酸营养缺陷体的克隆。当将这些1423KO SE克隆点到TSA+Cm(10μg/mL)上时,它们并未生长,指示在第二轮同源重组的过程中质粒主链(包括氯霉素选择标记物)的去除。使用引物JB-Cm-F和JB-Cm-R(表1)的PCR也确认了抗生素抗性标记物的丧失(数据未显示)。如预计的,使用引物1423-5F和1423-3R的PCR检测到这些KO克隆中1.5Kb的PCR产物,而来自SE宿主的PCR产物为2.3Kb(图2A)。野生型SE细胞使用引物1423-F和1423-R(两者均对SE1423编码序列特异性)产生0.7Kb的PCR产物;从KO质粒DNA和推定的KO克隆中未检测到这种PCR产物(图2B)。
因此,基于所有实验数据,可以得出结论:在双重丙氨酸消旋酶基因敲除菌株中成功地缺失了SE1423(dat,D-丙氨酸转氨酶),生成了三重敲除表皮葡萄球菌菌株(SEΔalr1Δalr2Δdat)。此外,在三重敲除菌株中观察到所需的D-丙氨酸营养缺陷型。
D-丙氨酸是细菌细胞肽聚糖合成所必需的。缺失丙氨酸消旋酶基因对于枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中的D-丙氨酸营养缺陷型是足够的。然而,为了在表皮葡萄球菌中开发这种表型,必须敲除两个丙氨酸消旋酶基因(alr1、alr2)和D-丙氨酸转氨酶基因dat(SE1423)。显而易见的是,如金黄色葡萄球菌MRSA132(Moscoso等人,2017和2018)和单核细胞增多性李斯特菌(Thompson等人,1998)中报告的,谷氨酸消旋酶和D-丙氨酸转氨酶的组合提供了丙氨酸消旋酶的可行旁路。尽管表皮葡萄球菌基因组含有第三个推定的丙氨酸消旋酶同系物(SE1769),但在本研究使用的实验条件下,无需敲除这个基因用于D-丙氨酸营养缺陷型。
随着D-丙氨酸营养缺陷型表皮葡萄球菌菌株的成功开发,下一步是使用含有丙氨酸消旋酶基因作为选择标记物的表达载体转化该菌株。通过D-丙氨酸宿主营养缺陷型的质粒互补来选择转化体。
实施例4.具有非抗生素选择标记物的表皮葡萄球菌表达载体的开发该实施例描述了表皮葡萄球菌表达系统的开发,由此无需使用抗生素可以维持表达质粒。
用pJB38转化克隆宿主枯草芽孢杆菌SCK6
pJB38,一种大肠杆菌/金黄色葡萄球穿梭载体(Bose等人,2013),用于表皮葡萄球菌中的蛋白质生产。开发非ABR(抗生素抗性)蛋白质表达系统的一种可能方法是修饰pJB38。为了探索这个选项,测试了pJB38是否可以转化到克隆宿主枯草芽孢杆菌SCK6内。使用Qiagen HiSpeed Plasmid Midi Kit试剂和方案,从大肠杆菌菌株DH5α中分离的pJB38DNA使用BTR的用于感受态细胞制备和转化的方案(下文描述)转化到SCK6ΔalrA内。转化的细胞在LB琼脂+D-丙氨酸(DA,40μg/mL)+氯霉素(Cm,10μg/mL)上铺平板。在30℃下温育两天后,小菌落开始出现。在30℃下温育3天后,对菌落进行计数。当用0.6μg pJB38DNA(5μL)转化250μL感受态细胞时,在用50μL细胞铺平板的平板上观察到61个可变大小的菌落。基于这点,转化效率为5.2x 102cfu/μg DNA。
为了确认转化体是真实的,挑出40个菌落且点到LB琼脂+DA+Cm的新鲜平板上,并且在30℃下温育过夜。所有菌落都生长良好。将六个克隆各自接种到LB+DA+Cm的3mL肉汤中。细胞用于制备微量制备质粒DNA。用EcoRI+HindIII和SalI+SnaBI消化质粒。来自EcoRI+HindIII消化的预计DNA条带为5Kb和2Kb。SalI+SnaBI消化的条带为4.7Kb和2.3Kb。对于三个大菌落克隆(#2、#3和#4)和两个小菌落克隆(#6和#7),观察到预计的消化模式。小菌落克隆#5显示在琼脂糖凝胶上较大尺寸的条带,而小条带的密度非常弱。根据这个数据,可以得出结论,pJB38成功地转化到枯草芽孢杆菌SCK6内。
为了将pJB38转化到表皮葡萄球菌内,需要从dam-/dcm-大肠杆菌宿主中分离质粒,以使宿主限制和修饰对转化效率的影响降到最低。努力主要集中于用基于pUBTR114的载体的工作。
用载体pUBTR14-TP转化表皮葡萄球菌
制备并转化了表皮葡萄球菌菌株NRRL B-4268的转化感受态细胞。使用QiagenMidi Prep Kit(参见附录II),从枯草芽孢杆菌SCK6中分离pUBTR114-TP(携带测试蛋白基因的pUBTR114载体)。转化的表皮葡萄球菌细胞在含有10μg/mL的卡那霉素的胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)平板上铺平板。使平板在37℃下温育过夜。从使用~950ng质粒DNA的转化观察到五个菌落。在点到新鲜的卡那霉素平板上之后,所有五个菌落都在37℃下继续生长。用牙签挑选细胞,并且悬浮于100μL Tris缓冲液(100mM,pH 8.0)中。在使用Taq聚合酶和引物对s.p.amyQ-Nde-F2/Sbf-TP-R(表2)的25-μL PCR反应中,将裂解产物的等分试样(0.5μL)用作模板。未转化的表皮葡萄球菌的细胞裂解产物和从SCK6中分离的质粒DNA分别用作阴性和阳性对照。来自所有五个克隆的细胞裂解产物都生成1.5Kb的预计PCR产物。因此,这些实验证实,使用卡那霉素选择,可以将基于pUBTR114的载体转化到表皮葡萄球菌内并且在其中维持。
表2.引物序列
●F:正向引物
●R:反向引物
●添加的限制性位点以红色加下划线的粗体字母显示
pUBTR119-GFP的构建
在用pJB38-sGFP转化的表皮葡萄球菌中可检测的GFP表达和分泌已得到证实。因此,决定将表达盒“SarAP1-SsaA-His-sGFP”克隆到pUBTR119-TP内用于评估。这种质粒类似于pUBTR114-TP。两种质粒之间的差异是第二启动子序列,以及pUBTR119-TP中TP编码序列上游更方便的克隆位点的存在。
设计正向引物Sar-GFP-F和反向引物Sar-GFP-R(表2),以通过PCR从质粒pJB38-sGFP扩增sGFP表达盒的1.1-Kb片段。正向和反向引物分别含有限制性位点PaeR7I和SbfI。使用标准PCR条件与来自Agilent的PfuUltra DNA聚合酶。PCR产物通过琼脂糖凝胶运行,切除并使用Qiagen QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。该片段然后用PaeR71-SbfI进行消化,并且再一次进行凝胶纯化。使用Qiagen Midi Prep Kit,从枯草芽孢杆菌SCK6中分离pUBTR119-TP,并且用限制性酶PaeR7I和SbfI进行消化,以去除1.5-Kb测试蛋白(TP)编码序列。剩余的4.1-Kb载体主链进行凝胶纯化。使用NEB的Quick Ligation Kit,将sGFP表达盒连接到pUBT119主链的PaeR71-SbfI位点处,并且转化到枯草芽孢杆菌SCK6ΔalrA感受态细胞内。转化混合物在LB平板以及LB+10μg/mL卡那霉素+40μg/mL D-丙氨酸上铺平板,并且在37℃下温育过夜。在两种类型的平板上均观察到约100个菌落,提示通过卡那霉素抗性或D-丙氨酸营养缺陷体互补的有效选择。将来自LB平板的100个菌落和来自LB+Kan+DA平板的150个菌落分别点到LB和LB+Kan+DA平板上。所有菌落都显示良好生长。通过使用引物Sar-GFP-F/Sar-GFP-R的PCR筛选了各自来自LB+Kan+DA平板的10个菌落的15个库(克隆#1-150)和来自LB平板的10个库(#151-250),以确认1.1-Kb插入物的存在。pJB38-sGFP和SCK6ΔalrA细胞的质粒DNA充当阳性和阴性对照。所有库都是PCR阳性的。如上文通过PCR筛选来自一个库(库#5)的各个克隆,并且所有克隆都是阳性的。来自LB+Kan+DA的这些克隆在液体LB+Kan+DA中在37℃下生长过夜。细胞用于质粒微量制备。当在琼脂糖凝胶上检查时,所有十个克隆都含有质粒。通过三组限制性消化来分析来自克隆#3和#4的质粒DNA:PaeR71+SbfI、EcoRV和KpnI。对于两个克隆观察到预计的消化模式。Midi制备DNA由两个克隆制备。测序确认了成功的克隆,并且并未揭示任何突变。如上所述,使用卡那霉素选择,将构建体转化到SE NRRL B-4268内。在3天的长时间温育后,观察到9个菌落。通过PCR测试了两个克隆。然而,使用引物Sar-GFP-F/Sar-GFP-R的PCR未能检测到sGFP表达盒。
尚不明确为何pUBTR114-TP可以转化到表皮葡萄球菌内并通过PCR确认,同时无法确认来自pUBTR119-GFP的推定转化体。pUBTR114-TP菌落在37℃下温育过夜后观察到,而pUBTR119-GFP菌落仅在37℃下温育2-3天后观察到。两种质粒之间的一个区别是pUBTR119-GFP中XhoI限制性位点的存在。枯草芽孢杆菌具有XhoI甲基化系统(Jentsch,1983)。pUBTR119-TP中的XhoI位点不能通过限制性酶XhoI进行消化,并且为此,其同裂酶PaeR71用于克隆GFP表达盒。怀疑由于甲基化的XhoI位点,表皮葡萄球菌中的限制/修饰系统可能以某种方式靶向pUBTR119-GFP。因此,通过用不同的限制性位点SalI替换XhoI位点来修饰载体。
开发新GFP表达载体:pUBTR119*-SAL-GFP
重叠PCR策略用于将pUBTR119-GFP中的Xho位点替换为不同的限制性位点(SalI)。在这种质粒中,存在MluI-XhoI片段(840bp)和XhoI-KpnI片段(251bp)。设计了新的引物,其含有5’-CTCGAG-3’至5’-GTCGAC-3’的核苷酸变化,用于两个片段的PCR扩增和重叠PCR。重叠PCR产物(1.1Kb)用MluI和KpnI进行消化,并且与用MluI-KpnI预消化的pUBTR119-GFP连接。使用如上的卡那霉素选择,将连接反应物转化到SCK6感受态细胞内。形成了大量的菌落。将菌落点到新鲜的平板LB+Kan(10μg/mL)上。通过使用引物Mlu-F2和Sal-R2(表2)的PCR分析了十二个克隆。引物Sal-R2对于SalI位点是特异性的。0.84Kb的预计PCR产物条带很弱,但它在对于8个克隆的反应物中明确存在。所有12个克隆都在液体培养基(LB+Kan)中生长,用于质粒DNA微量制备。所有这些克隆都显示正确大小的质粒条带,并且它们通过SalI消化进行线性化。克隆#4生长用于midi制备。通过以下限制性消化分析DNA:MluI+KpnI;和SalI。如预计的,从MluI+KpnI消化观察到两个条带(4.5Kb和1.1Kb),并且SalI使质粒线性化。新质粒命名为pUBTR119*-Sal-GFP。
用pUBTR119*-SAL-GFP转化表皮葡萄球菌菌株
野生型SE NRRL B-4268感受态细胞用pUBTR119*-Sal-GFP质粒DNA进行转化,并且在TSA+Kan(10μg/mL)的平板上铺平板。在37℃下温育过夜后,从分别使用~440ng和~880ng质粒DNA的转化,观察到2个和9个菌落。将所有11个克隆点到新鲜的TSA+Kan平板上,并且通过使用引物Sar-GFP-F和Sar-GFP-R的PCR测试细胞。表皮葡萄球菌细胞和pUBTR119*-Sal-GFP质粒DNA分别用作阴性和阳性对照。除了阴性对照之外,所有反应中都生成了1.1Kb的PCR产物(图3)。
除了向TSB培养基中添加D-丙氨酸(40μg/mL)之外,使用与NRRL B-4268相同的方案,生长D-丙氨酸营养缺陷体三重敲除菌株(SEΔalr1Δalr2Δdat),以制备转化感受态细胞。pUBTR119*-Sal-GFP含有卡那霉素抗性基因和丙氨酸消旋酶基因两者作为选择标记物。通过在TSA+Kan(10μg/mL)上的卡那霉素选择、以及通过在TSA上的D-丙氨酸营养缺陷体互补,将质粒转化到三重基因敲除突变体内。使平板在37℃下温育。在过夜温育后观察到菌落:在卡那霉素选择平板上来自880ng质粒DNA的转化的3个菌落,以及在TSA平板上来自相同量的质粒DNA的25个菌落。看起来使用D-丙氨酸营养缺陷体互补的表皮葡萄球菌转化比使用卡那霉素选择更有效地工作。所有28个菌落在点到新鲜平板上之后都能够生长。它们还全部通过使用对于gfp基因特异性的引物的PCR进行确认(图4)。
用于GFP表达的细胞培养
建立摇瓶实验,以评估在用pUBTR119*Sal-GFP构建体转化的SE三重敲除菌株中的蛋白质表达。表3中列出了这个实验中使用的菌株和培养基。下文提供了摇瓶培养方案,用于枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌中的生长和蛋白质表达。将菌株接种到5mL所列出的减去葡萄糖的培养基中,并且在37℃、225rpm下生长过夜。过夜培养物(0.5mL)用于接种在250-mL三角培养瓶中的50mL所列出的培养基加上2%葡萄糖。培养物在37℃、225rpm下生长24小时。所有菌株都显示良好的生长。通过在Eppendorf Centrifuge 5417C中以13,000rpm(17,900x g)将1.5mL培养物离心3分钟,来收集培养肉汤。图5显示了用于检测加上His标签的蛋白质的蛋白质印迹。
表3.用于细胞生长和蛋白质表达实验中的菌株和培养基
遵循SDS-PAGE和蛋白质印迹方案(下文描述),用于检测具有C末端His标签的GFP。分泌的加上His标签的GFP蛋白含有252个氨基酸残基,并且它的分子量为29kDa。运行4-12%的蛋白质凝胶并染色,但无法观察到预计大小的蛋白质条带(数据未显示)。样品在16%的蛋白质凝胶上运行,并且转移到膜上,用于使用抗His抗体的检测。用pUBTR114-TP转化的枯草芽孢杆菌SCK6先前显示表达且分泌含有N末端His标签的测试蛋白质(52kDa)。贮存于-20℃下的培养肉汤样品以各种稀释度作为阳性对照装载:1/1(与其它样品一样)、1/5、1/10和1/20倍稀释。观察到的唯一可见条带来自阳性对照。信号在1/20倍稀释的对照中是微弱的。在印迹上未检测到关于GFP蛋白的信号。因此,GFP在这些培养物中并未活跃表达。在实验上测试为适合于在枯草芽孢杆菌中的蛋白质表达的培养基TSB加上2%葡萄糖,可能对于由SarAP1启动子控制的蛋白质表达和/或由信号肽SsaA驱动的蛋白质分泌不是最佳的。
基于pUBTR114的载体成功地转化到表皮葡萄球菌内。克隆GFP表达盒,以构建pUBTR119*-Sal-GFP。该载体含有卡那霉素抗性基因和丙氨酸消旋酶基因两者作为选择标记物。需要时,卡那霉素基因可以容易地去除。使用卡那霉素选择,将pUBTR119*-Sal-GFP成功地转化到SE NRRL B-4268内。通过卡那霉素选择以及通过D-丙氨酸营养缺陷体互补,它也转化到三重基因敲除D-丙氨酸营养缺陷体突变体内。所有克隆通过使用对于gfp基因特异性的引物的PCR进行确认。
这些实验描述了用于表皮葡萄球菌中的蛋白质生产的非抗生素表达系统的开发。首先,通过相继敲除两个丙氨酸消旋酶基因(alr1和alr2)和D-丙氨酸转氨酶基因(dat),开发了D-丙氨酸营养缺陷体表皮葡萄球菌菌株。然后,验证了BTR革兰氏阳性细菌表达载体可以转化到表皮葡萄球菌内,并且补充宿主的D-丙氨酸营养缺陷体。发现表达载体含有在枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌两者中均有功能的复制起点和选择标记物。高度可转化的枯草芽孢杆菌SCK6ΔalrA充当克隆宿主,以促进载体构建。一旦载体被构建并且在芽孢杆菌属中确认后,它就转化到D-丙氨酸营养缺陷体表皮葡萄球菌菌株(SEΔalr1Δalr2Δdat)内,用于蛋白质表达。
上述实验用但不限于下述方法执行。
来自枯草芽孢杆菌的质粒制备
Qiagen QIAprep Spin Miniprep试剂盒(目录#27106)用于微量制备;QiagenHiSpeed Plasmid Midi Kit(目录#12643)用于Midi制备。要点是向P1缓冲液中添加溶菌酶。
微量制备:
1.将分离的菌落接种到5mL LB+所需抗生素内,并且在37℃、225rpm下生长过夜。
2.将3mL每种过夜培养物取出到1.5-mL Eppendorf管中,在EppendorfCentrifuge5417C中以13,000rpm离心1分钟。弃去上清液。
3.将团块重悬浮于250μL P1缓冲液中。加入溶菌酶至200μg/mL的最终浓度;加入5μL新鲜的10mg/mL溶菌酶水溶液。将样品涡旋并在37℃下温育30分钟。
4.遵循如制造商的手册中指示的剩余方案。
枯草芽孢杆菌菌株SCK6的感受态细胞的制备和转化
SCK6感受态细胞制备
1.从-80℃的甘油原种小瓶中,将SCK6在LB平板上划线培养用于分离。在37℃下温育过夜。
2.将分离的菌落接种到18x150 mm玻璃管中的5mL LB内。在37℃下以225rpm振荡过夜。
3.制备1:100稀释度的过夜培养物,以测定OD600。
4.将培养物在125-mL三角培养瓶中的15mL LB+1%木糖中稀释至1.0的起始OD600。在225rpm、37℃下振荡2小时。
5.在-80℃下在10%甘油中冷冻培养物:向培养瓶中加入3.6mL 50%甘油,并且在-80℃下在1.5-mL eppendorf管中冷冻450μL等分试样。
SCK6在染色体上具有红霉素抗性标记物。需要时,可以在所有步骤中添加1.0μg/mL红霉素。对于SCK6ΔalrA,将D-丙氨酸以40μg/mL加入培养基中。
转化方案
1.在RT下解冻感受态细胞,对于每次转化使用200μL。
2.将转化DNA(质粒或连接反应物)直接加入含有200μL感受态细胞的1.5-mLeppendorf管中。
3.将Eppendorf管放入18x150 mm玻璃管中,并且在37℃、225rpm下放置90分钟。
4.将样品在1-4个LB平板+所需抗生素上铺平板。使平板在37℃下温育过夜。
用于蛋白质表达的枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的生长及制备
·生长培养基:用于表皮葡萄球菌和枯草芽孢杆菌SCK6野生型宿主的TSB+20g/L葡萄糖,以及用于pUBTR114或pUBTR119构建体的转化体的TSB+20g/L葡萄糖+10μg/mL卡那霉素。
·在18X150 mm玻璃管中,使用-80℃甘油刮屑,以接种在上文对于每种菌株列出的5mL生长培养基。在37℃、225rpm下生长过夜。
·使用0.5mL过夜培养物接种250-mL三角培养瓶,其含有50mL与上文关于每种菌株相同的生长培养基。在37℃、225rpm下生长24小时。
·通过取出每个24小时培养物的2x1.5-mL等分试样来取样培养瓶。在EppendorfCentrifuge 5417C中以13,000rpm(17,900x g)离心3分钟。将上清液取出至新的Eppendorf管中,以用于SDS-PAGE分析和抗His蛋白质印迹。还贮存团块。所有样品都贮存于-20℃下。
·读取剩余的24小时培养物的A600读数。
用于含有HIS标签的蛋白质的SDSPage和蛋白质印迹转移方案
使用的组分/试剂:来自Expedeon
·20X Teo-Tricine-SDS运行缓冲液#B50500
·RunBlue SDS凝胶4-12%,12孔,10cm x 10cm#NXG41212
·10X DTT还原剂#A32001
·4X LDS样品缓冲液#B31010
·Invitrogen Novex mini cell XCELL Surelock电泳室
·转移缓冲液:20X Tris-甘氨酸印迹缓冲液#B86500
·BioRadPlus Protein western Standard#161-0376
·Genscript One-HourWestern Kit#L00204T
·Genscript His-标签抗体pAB,兔#A00174;在-20℃下贮存的10ul等分试样
样品制备:
·样品混合物:
○XμL样品
○5μL4X LDS样品缓冲液
○2μL 10X DTT还原剂
○YμL去离子水
○总体积=20μL
·制备步骤:
○通过涡旋混合样品
○煮沸3分钟
○短暂离心并冷却至RT
○再次涡旋
凝胶的设置和运行:
·将40mL的20X运行缓冲液加入760mL的Milli Q H2O中。
·从小袋中取出凝胶,并且用去离子水冲洗。然后将它们放置在电泳单元中,使得平板的较短侧面向内。一旦它们锁定在适当的位置,就将运行缓冲液加入内部腔室中(大约200mL)。在继续之前检查泄漏。剩余的运行缓冲液加入外部腔室中。
·用运行缓冲液冲洗孔。
·从上方装载所需量的制备样品连同5μL的BioRadWestern标准。
·凝胶在RT、150伏特下运行大约1小时(运行足够长的时间,使得染料前沿到达凝胶的底部)。
转移设置:
·构成1,000mL转移缓冲液:50mL 20X Tris-甘氨酸印迹缓冲液+200mL甲醇+770mL MQH2O。冷却缓冲液以保持转移冷却。
·将海绵在转移缓冲液中浸泡。
·在设置夹心之前,在转移缓冲液中平衡凝胶7分钟,并且在转移缓冲液中平衡硝酸纤维素(NC)膜/印迹膜10分钟。
·设置夹心:在一片Parafilm上放一张预浸泡的Whatman纸。将预浸泡的凝胶放置在Whatman纸之上。将预浸泡的NC膜放在凝胶之上。使用玻璃巴氏吸管,在膜上轻轻滚动,以去除任何气泡。将一张预浸泡的Whatman纸放置在NC膜之上。再次在上面轻轻滚动,以去除气泡。拿起夹心并且放置在位于印迹模块中的2块海绵(其已挤压以去除所有转移缓冲液)之上。如果只运行一块凝胶,则用挤压的海绵填充剩余的印迹模块,使得它们在单元上方大约0.5cm处固定。如果运行两块凝胶,则将一块挤压的海绵放置在第一个夹心之上。确切地如上文设置第2个夹心。将其放置在海绵之上。如上文用海绵填充剩余的印迹模块。
·使用足够的转移缓冲液,以覆盖印迹模块中的凝胶/膜夹心。在外部缓冲液腔室中使用大约550mLMQH2O。
·在室温、30伏特下运行90分钟。
蛋白质印迹:
·GenScript One-Hour Western Kit方案;用TMB底物进行信号显色。
·10μL抗His Ab+100μLWB-1;使用50μL/凝胶。
等价方案
本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等价方案。此类等价方案预期由随附权利要求涵盖。
参考文献
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Moscoso M等人,2017.Protective efficacy of a D-alanine auxotrophStaphylococcus aureus as avaccine candidate against staphylococcaldisease.27th ECCMID,April 22,2017,Vienna,Austria.Pucci M.J.等人,1992.JofBacteriology.p.336-342.
Thompson R等人,1998.Pathogenicity and immunogenicity of a Listeriamonocytogenes strain that requires D-alanine for growth.Infection andImmunity 66:3552-3561.
Claims (16)
1.一种重组葡萄球菌属细菌,其包含:
两个失活的丙氨酸消旋酶基因(alr1和alr2);和
失活的D-丙氨酸转氨酶基因(dat)。
2.权利要求1的重组葡萄球菌属细菌,其中所述葡萄球菌属细菌依赖于D-丙氨酸用于生长。
3.权利要求1的重组葡萄球菌属细菌,其中所述葡萄球菌属细菌是表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(表皮葡萄球菌(S.epidermidis))及其亚种。
4.权利要求1的重组葡萄球菌属细菌,其中所述葡萄球菌属细菌进一步包含一种或多种另外的突变。
5.权利要求4的重组葡萄球菌属细菌,其中所述另外的突变包含失活的谷氨酸消旋酶基因MurI。
6.权利要求1-5中任一项的重组葡萄球菌属细菌,其中所述细菌用基于pUBTR114的载体进行转化。
7.权利要求6的重组葡萄球菌属细菌,其中所述基于pUBTR114的载体是pUBTR119*-Sal-GFP。
8.一种制备重组葡萄球菌属细菌的方法,其包括:
(i)将包含D-丙氨酸转氨酶(dat)敲除的质粒转化到葡萄球菌属菌株的感受态细胞内,其中所述葡萄球菌属菌株包含失活的丙氨酸消旋酶基因alr1和alr2(SEΔalr1Δalr2);
(ii)在转化细胞中检测所述敲除质粒的存在;
(iii)温育步骤(ii)中鉴定的转化细胞;和
(iv)纯化分离的菌落。
9.权利要求8的方法,其进一步包括就D-丙氨酸营养缺陷型测试所述分离的菌落。
10.权利要求8的方法,其中使用聚合酶链反应(PCR)检测所述转化体中敲除质粒的存在。
11.权利要求8的方法,其中所述重组葡萄球菌属细菌是表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(表皮葡萄球菌(S.Epidermis))及其亚种。
12.权利要求8的方法,其进一步包括用基于pUBTR114的载体转化所述重组葡萄球菌属细菌。
13.权利要求12的方法,其中所述基于pUBTR114的载体是pUBTR119*-Sal-GFP。
14.一种重组葡萄球菌属细菌,其通过权利要求8的方法产生。
15.一种试剂盒,其包含权利要求1-8或14中任一项的重组葡萄球菌属细菌。
16.权利要求15的试剂盒,其进一步包含基于pUBTR114的载体。
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