JP2003528569A

JP2003528569A - バチルス・セレアス由来のゼッターマイシンａの生合成遺伝子

Info

Publication number: JP2003528569A
Application number: JP2000608050A
Authority: JP
Inventors: ハンデルスマン，ジョー; エルミルナー，ジョセリン; エイストール，エリザベス; エイエマート，エリザベス
Original assignee: ウィスコンシンアルムニリサーチファウンデイション
Priority date: 1999-03-23
Filing date: 2000-03-22
Publication date: 2003-09-30
Also published as: EP1163347A2; AU6333700A; WO2000058351A2; WO2000058351A3

Abstract

(57)【要約】様々な細菌及び低級真核生物に対して活発であるバチルス・セレアスによって合成される独特なアミノポリオール抗生物質であるゼッターマイシンＡの生物学的合成に必要な合成領域を含んでいる酵素の分離されたＤＮＡが開示された。また、ゼッターマイシンＡを合成するＤＮＡを含み発現する形質転換された宿主及び形質転換した宿主を用いてゼッターマイシンＡを合成する方法が開示された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】引用文献に編入される１９９９年３月２３日に米国仮出願の出願番号６０／１
２５７６９に基づく優先権を主張する。

【０００２】発明の背景通常、植物は、病気を引き起こす菌類や細菌によって感染する（“植物病原体
”として引用）。多くの微生物的植物病原体の種が、異なった感染形態を利用し
て進化してきた。例えば、空気中の植物病原体が葉の表面を通しての感染、植物
同士の接触による感染、若しくは様々なベクターによる感染である。他の植物病
原体は、土壌中に存在する病原体で、好ましくは根に感染して新奇の種を発芽さ
せる。菌類や細菌の感染に加えて、多くの植物の病気は根に感染する土壌中の線
虫によって引き起こされ、たとえ同じ種類の穀類が同じ土地で豊作であっても、
感染したら通常は深刻な障害を与える。

【０００３】植物病は、憂慮すべきほどに実が稔らない年月を何年も引き起こし、農業に対
する経済的なダメージと地域的な栄養不足が世界的な規模で発生する。疾病の破
壊的な過程の重傷度は、植物病原体の攻撃性と寄主の反応に依存する。植物病原
体からの防御や植物病原体の拡散を減少させる様々な企てが図られた。多くの植
物にとっての育種プログラムの１つの企ては、疾病に対する寄主植物の耐性を高
めることである。例えば、疾病に対する植物の耐性の発展は、典型的には、耐性
遺伝子を打ち負かす植物病原体の急速な進化によって、多くの作物−病原体シス
テムにおいて成功する限られた期間を有している。さらに、特定の殺菌剤に対し
て菌類が実際に進化したいくつかの証明する事例がある。殺菌剤に対する菌類の
感受性の差は、うどん粉病（トリアジメノ−ルに対して）、小麦カビ（ｗｈｅａ
ｔｍｉｌｄｅｗ）（トリアジメノ−ルに対して）、ボトリティス（Ｂｏｔｒｙ
ｔｉｓ）（ベノミルに対して）、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）（有
機水銀化合物に対して）、シュードセルコスポレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓ
ｐｏｒｅｌｌａ）（ＭＢＣ型の殺菌剤に対して）、及びマイコスファレラ・フィ
ジエンしス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）（トリアゾ
ールに対して）において証明されている。

【０００４】線虫によって引き起こされる疾病は、殺虫剤の適用によって完全に制御される
。しかしながら、哺乳類に対して比較的害を与えないほとんどの殺菌剤とは対称
的に、殺線虫剤は、哺乳類に対して比較的高い毒性を有する。ほとんどの殺線虫
剤は、カーバメート剤、有機塩素化合物、有機リン族を用いて土壌中の線虫を制
御するために使用され、特別な注意を払って土壌中に適用されるべきである。

【０００５】ある作物においては、作物を守るためのさらなる代替策として、バイオコント
ロール生物体の使用が発達している。バイオコントロール生物体とは、病原体の
成長に影響を与えることのできる生物体であって、例えば、病原体が疾病を引き
起こす可能性を減少させ、コロニーを形成して従来の殺菌剤に接触できないよう
に植物の部分を保護する。ある土壌においては、特定の菌類の植物病原体に対し
て自然に耐性を有し、その土壌をオートクレーブすることによって自然にあった
抑制効果が失われたことが発見されてから、上記の手段が発展してきた。さらに
、ある疾病の発達を引き起こす土壌に、抑制効果のある土地からの土壌を少量加
えることによって、抑制効果が与えられることが発見された。

【０００６】研究結果として、根にコロニーを形成する細菌は、現在“生物学的疾病制御”
として知られている現象を有することが例証された（Ｂａｋｅｒｅｔａｌ．
ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆＰｌａｎｔＰａｔｈｏｇｅ
ｎｓ，ＦｒｅｅｍａｎＰｒｅｓｓ，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，１９
７４）。多くの場合において、生物学的に疾病を制御する細菌で、最も効果的な
菌株は、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｓ）である（Ｗｅｌｌｅｒｅｔａｌ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏ
ｌｏｇｙ７３：４６３−４６９（１９８３）；Ｋｌｏｅｐｐｅｒｅｔ
ａｌ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ７１：１０２０−１０２４（１
９８１））。上記細菌を種子接種することによって効果的に抑制される重要な植
物病原体は、小麦中のすべての病原体となるガウマノマイシス・グラミニス（Ｇ
ａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓ）（Ｃｏｏｋｅｔａｌ．
ＳｏｉｌＢｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ８：２６９−２７３（１９７６）
）並びに綿花の衰退中に含まれる病原体であるピチウン（Ｐｙｔｈｉｕｒｎ）及
びリゾトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）（Ｈｏｗｅｌｌｅｔａｌ．Ｐｈ
ｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ６９：４８０−４８２（１９７９））を含んで
いる。生物学的に疾病を制御するいくつかのシュードモナス菌株は、菌類の植物
病原体の成長を抑制する抗生物質を合成し（Ｈｏｗｅｌｌｅｔａｌ．Ｐｈ
ｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ６９：４８０−４８２（１９７９）；Ｈｏｗ
ｅｌｌｅｔａｌ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ７０：７１２−７１
５（１９８０））、上記抗生物質は、根圏中における菌類の植物病原体の制御
に関係する。

【０００７】当初、バイオコントロールは疾病を制御するために広く適用できることを確約
された方法だと信じていたが、土壌中で発生する植物病原体を制御して利用する
ことができ、主に温室における作物に最適に応用できることが分かった。微生物
が自然に存在する広大な土地への適用の可能性は、微生物の合成の束縛（上記微
生物はかなり成長が遅い）、分布（上記微生物はかなり短命である）、高費用（
上記微生物の低成長及び短命の結果）の理由で未だ証明されていない。加えて、
バイオコントロールが成功するための手法はまた、限られた効能範囲を有するで
あろう自然に生存している菌株の確認によりかなり制限されている。

【０００８】バイオコントロール生物体を利用して線虫植物病原体を制御するいくつかの手
法が当初行われた。しかしながら、上記手法は現在も試験中で、いくつかのスト
レプトマイセス属は、根幹線虫（メロイドジン属（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅｓ
ｐｐ．））を制御することが報告（ＲｅｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＷＯ９３／１１８１３５）され、いくつかのバチル
ス・チューリンゲンシス株（例えば、バチルス・イスラエリエンシス（Ｂ．ｉｓ
ｒａｅｌｉｅｎｓｉｓ））の毒は幅広く抗線虫活性を有することが明らかになっ
た。それゆえ、バチルスの胞子の形成期間は、適切なバイオコントロールの機会
を与えるであろう（ＭｙｃｏｇｅｎのＥＰ０３５２０５２、Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＷＯ９３／１９６０４
）。

【０００９】発明の概要耐疾病のための植物育種、殺菌剤の継続した発展、より最近ではバイオコント
ロール生物体の認定を含む疾病から作物を守る伝統的な方法はすべて限られた条
件で行われた。それゆえ、疾病から作物を守るための新しい方法の発展の必要性
が続けられる。

【００１０】定義本明細書で引用される“核酸断片”は、任意の長さのリボヌクレオチド若しく
はデオキシヌクレオチドいずれかのヌクレオチドの直線的ポリマー状の形態であ
り、２本鎖及び１本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡを含む。核酸断片はまた、自然の形態
（例えば、微生物）から直接得られるか、又は組換え若しくは合成技術の調製に
よって得られるコード及び非コード領域の両者を含むであろう。

【００１１】 “コード領域”は、ヌクレオチドの直線状形態で、適切な環境下におけるシー
クエンス制御において、通常ｍＲＮＡを介してポリペプチドをコード化する。コ
ード領域の境界は、一般的に５´末端に位置する翻訳開始コドン及び３´末端に
位置する翻訳終了コドンによって決定される。“非コード領域”は、ヌクレオチ
ドの直線状形態で、ポリペプチドをコード化しない。

【００１２】本明細書で引用される“ポリペプチド”は、アミノ酸のポリマーで、アミノ酸
のポリマーの特定の長さは言及しない。それゆえ、例えば、用語としてのペプチ
ド、オリゴペプチド、タンパク質、及び酵素は、ポリペプチドの定義に含まれる
。ポリペプチドの定義はまた、ポリペプチドの発現後の修正を含み、例えば、グ
リコシル化、アセチル化、リン酸化及び上記と同類を含む。

【００１３】本明細書で引用される“相補”及び“相補的”は、２つの１本鎖核酸断片が、
お互いに塩基対を形成する能力で、一方の核酸断片のアデニンは、２本目の核酸
断片のチミンと塩基対を形成し、一方の核酸断片のシトシンは、２本目の核酸断
片のグアニンと塩基対を形成する。一方の核酸断片の配列が、２本目の核酸断片
の配列と塩基対を形成できる時、２つの核酸断片はお互いに相補的である。例え
ば、５´−ＡＴＧＣと５´−ＧＣＡＴは相補的である。また、定義の相補及び相
補的は、一方の核酸断片が、２本目の核酸断片に存在する少なくとも１つのヌク
レオチドと塩基対を形成しない、少なくとも１つのヌクレオチドを含む２つの核
酸断片を含む。例えば、各々の２つの核酸断片５´−ＡＴＴＧＣと５´−ＧＣＴ
ＡＴの第３のヌクレオチドは、塩基対を形成しないが、上記２つの核酸断片は、
記載された定義から相補的である。定義した標準状態の環境下において２つの核
酸断片がハイブリダイズすると、典型的に、上記２つの核酸断片は相補的である
。２つの核酸断片のうち、少なくとも配列のうち８０％が同一であれば、典型的
に、上記２つの核酸断片は相補的である。好ましくは少なくとも配列のうち９０
％が同一、より好ましくは少なくとも配列のうち９５％が同一である。

【００１４】本明細書で使用される“ハイブリダイズ”、“ハイブリダイズする”及び“ハ
イブリダイゼーション”は、１本鎖の核酸断片が２本目の核酸断片とすでに記述
したある一定の環境下において、非共有的な結合を形成することである。

【００１５】本明細書で使用される“分離された”は、核酸断片若しくはポリペプチドがそ
れらの自然環境下若しくは合成的な派生物から分離されることを意味する。好ま
しくは、核酸断片若しくはポリペプチドは精製されて、例えば、他の核酸断片及
び細胞性生成物やその他不純物から分離される。

【００１６】 “宿主細胞”は、例えば、原核細胞（例えば、細菌）や真核細胞（例えば、菌
類）を含む微生物、及び組換えベクター導入の受け取り手として使用できる植物
細胞を意味する。

【００１７】 “抗体”は、抗原に対する反応として脊椎動物の免疫システムによって合成さ
れる免疫グロブリンで、上記抗原と結合できる。典型的には、抗原はポリペプチ
ドである。抗原のエピトープは、抗体と結合する抗原の一部である。エピトープ
は、他の抗原にも存在する。

【００１８】本明細書で使用される“トランスジェニック”は、任意の細胞、細胞株、植物
の組織の一部が、外界のコード領域の存在によって変換された遺伝子型を意味す
る。典型的には、外界からのコード領域は、遺伝子工学によって改変された遺伝
子型に導入されるか、上記手段の親細胞若しくは植物の遺伝子型に導入され、結
果として性的交配若しくは無性生殖によって子孫に引き継がれる。

【００１９】発明の詳細な説明ゼッターマイシンＡ（Ｚｗｉｔｔｅｒｍｉｃｉｎ）は、唯一知られているアミ
ノポリオール抗生物質である：

【００２０】

【化１】ゼッターマイシンＡは、ペプチドとポリケチド抗生物質に共通の構造的特徴を
有している。炭素鎖上の変換したヒドロキシ基は、部分的に還元されたポリケチ
ド構造と同等であり、ゼッターマイシンＡの窒素を多く含む末端は、アミノ酸か
ら由来し、ポリケチド抗生物質と同等のおそらくシトルリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉ
ｎｅ）である。いくつかのポリペプチド抗生物質の生合成経路は、バチルス属（
Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ）により記載されている。ポリケチドな抗生物質であ
るディフェシリン（ｄｉｆｆｉｃｉｄｉｎ）及びオーランチニン（ａｕｒａｎｔ
ｉｎｉｎ）がバチルス属から確認されたにも関わらず，上記抗生物質の生合成に
必要な遺伝子については何も分かっていない。実際、ポリケチド抗生物質の生合
成の遺伝子研究のほとんどは、ストレプトマイセス属で行われている。それゆえ
、ゼッターマイシンＡの生合成経路の解明は、生物活性分子及びゼッターマイシ
ンＡを合成する機能が次第に明らかになり、抗生物質の生合成経路の多様性の基
礎的な知識の理解に貢献している。

【００２１】ポリケチド抗生物質は、生合成の共通のパターンを共有している。分子は、２
つの炭素構造の構成ブロックから構成され、上記構造のβ−炭素は、常にケト基
を所有し、それゆえ、ポリケチドと呼ばれる。ポリケチドは、多くの抗生物質、
免疫抑制薬、及び生物学的特徴を幅広く有する他の化合物を含んでいる。

【００２２】ポリケチドの驚くべき構造的多様性は、ポリケチド鎖の長さの違いから派生し
、鎖上の異なる側鎖は、２つの炭素が構成したブロックの一部分若しくはポリケ
チドの主鎖後部に導入されて形成する。ケト基はまた、ヒドロキシルに還元され
るか、すべて同時に除去される。２つの炭素を添加する各々の段階は、脂肪酸の
生合成と同様の方法におけるポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）と呼ばれる酵素の
複合体によって実行される。

【００２３】ポリケチド抗生物質が増大するための生合成遺伝子は、分離され、シークエン
スされて、ＰＫＳ遺伝子は構造的に保存されていると信じられている。コード化
されたタンパク質は、２つのタイプに分かれ：Ｉ型タンパク質は、共有的にお互
い結合する（例えば、ＰＫＳにとってのエリチロマイシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙ
ｃｉｎ）、ソラフェン（ｓｏｒａｐｈｅｎ）、及びアベルメクチン（ａｖｅｒｍ
ｅｃｔｉｎ））異なった酵素工程を実行するいくつかの触媒領域を伴う多機能で
あるが、一方でＩＩ型タンパク質は１つの機能しか有していない。

【００２４】例えば、アクチノロジン（ａｃｔｉｎｏｒｈｏｄｉｎ）（ストレプトマイセス
・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）によって
合成される）のような単純なポリケチド抗生物質にとって、２つの炭素を添加す
るいくつかの段階は、ＰＫＳコード領域の１つのセットによってコード化された
ＰＫＳ酵素で反復して実行される。それとは反対に、エリチロマイシンやソラフ
ェンのようなより複雑な化合物の合成は、各々のモジュールが２つの炭素を添加
するうちの１つの段階における実行を伴う分子に組みこまれたＰＫＳコード領域
のセットを含んでいる（参照として、Ｈｏｐｗｏｏｄｅｔａｌ．，ｉｎ：
ＩｎｄｕｓｔｕｒｉａｌＭｏｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：Ｂａｓｉｃａ
ｎｄＡｐｐｌｉｅｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，（ｅｄ，；
Ｂａｌｔｚｅｔａｌ．），ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．ｐｐ．２
６７−２７５（１９９３））。

【００２５】放線菌類については、２次代謝産物の生合成の各々の段階に含まれるコード領
域は、通常、細菌の染色体の中でコード領域の房状になって組織されていること
が早い段階の調査から知られていた。大きな多機能ペプチドシンターゼ酵素は、
チオテンプレートを通してアミノ酸の配列の縮合を触媒すると信じられている。
シークエンスの配列は、アクリルアデニレーションとしてのアミノ酸の活性活動
、酵素部位にチオエステルとしてのアミノ酸の付加、及びペプチド転移とペプチ
ド結合の形成を含むタンパク質の触媒領域の空間的な調整によって主に決定づけ
られているとさらに信じられている。反応が完結すると、ペプチド鎖は環化され
、チオエスタラ−ゼの活動によって放出される。Ｋｌｅｉｎｋａｕｆ，Ｈ．，
ｅｔａｌ．，Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３６，３３５−３５
１（１９９６）；Ｍａｒａｈｉｅｌ，Ｍ．Ａ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒ
ｓ，３０７，４０−４３（１９９２）；ａｎｄＴｕｒｇａｙ，Ｋ，ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ．，６，５２９−５４６（１９９２）を参照。

【００２６】ハイブリッドなポリケチド／ポリペプチド生合成経路を介して合成された生物
活性分子の具体例がいくつか上げられる。推定されるポリペプチド／ポリケチド
機能をコード化する遺伝子座は、群がることを欠いているプロテウス・ミラビリ
ス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）の菌株において突然変異を起こした
（Ｇａｉｓｓｅｒ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．
２５３，４１５−４２７（１９９７））。Ｌ−ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅを組み
込み、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）の環化の機能があると信じられてい
るポリペプチドシンターゼ酵素と相同性なポリペプチドは、ラパマイシンの生合
成を担うためにＰＫＳと共同する（Ｓｃｈｗｅｃｋｅ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：７８３９−７８４
３（１９９５））。おそらく最も良いハイブリッドなポリケチド／ポリペプチ
ド生合成の仕組みの具体例は、ポリケチド由来の成分（Ｒａｎｇａｓｗａｍｙ，
Ｖ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０，３３３０
−３３３８（１９９８））を含む植物の植物毒素コロナチン（ｃｏｒｏｎａｔｉ
ｎｅ）及びアミノ結合によって連結された環状アミノ酸成分（Ｕｌｌｒｉｃｈ，
Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６，７５７４−
７５８６（１９９４））である。

【００２７】本発明は、アミノポリオール抗生物質の生合成を含むポリペプチドをコード化
している核酸断片及び上記核酸断片の発現を少なくとも構成し、これらを含む核
酸分子の分離に直接結びつく。本発明と一致する核酸分子は、様々な技術によっ
てクローン化できる。最終的に、本発明は、分離したアミノポリオール抗生物質
の生合成に必要な少なくとも１つのポリペプチドをコード化する核酸断片を供給
し、上記核酸断片は、少なくとも下記のｏｒｆ１、ｏｒｆ２、及びｏｒｆ３を含
む。好ましくは、核酸断片はゼッターマイシンＡの生合成に必要な少なくとも１
つのポリペプチドをコード化する。より好ましくは、核酸断片は、配列ＳＥＱ．
ＩＤ．ＮＯ：１を有する。さらに好ましくは、核酸断片は、アミノポリオール抗
生物質の生合成に必要な少なくとも１つのポリペプチドをコード化し、配列ＳＥ
Ｑ．ＩＤ．ＮＯ：１にハイブリダイズする核酸断片に相補的である。

【００２８】用語“ｏｒｆ”は、コード領域を意味する。“Ｏｒｆ”は、ｏｒｆによってコ
ード化されたポリペプチドを意味する。ｏｒｆとＯｒｆの両者は、オープンリー
ディングフレームの頭字語を示す。配列ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１は、ｏｒｆ１、
ｏｒｆ２、及びｏｒｆ３として引用される本発明の３つのコード領域を含む。各
々のｏｒｆは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯＳ：４２（ｏｒｆ１）、４４（ｏｒｆ２）、
及び４６（ｏｒｆ３）におけるシークエンスリストにおいて分離して示す。上記
コード領域によってコード化されているポリペプチドは、それぞれＯｒｆ１、Ｏ
ｒｆ２、及びＯｒｆ３である。Ｏｒｆ１、Ｏｒｆ２、及びＯｒｆ３のアミノ酸配
列は、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯＳ：４３、４５、及び４７にそれぞれ描写される。上
記のポリペプチドは、それぞれａｃｙｌ−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ポリケチド
シンターゼ、及びポリペプチドシンセターゼに類似な表示が見られる。

【００２９】本発明の核酸断片をクローニングする１つの方法は、アミノポリオール抗生物
質の生合成に含まれるポリペプチドをコード化して“ノックアウト”変異体を創
り出すトランスポゾン突然変異生成に使用する核酸断片のクローニングに使用可
能な標準な技術を含んでいる。上記において、突然変異生成後のアミノポリオー
ル抗生物質を合成する生物は、アミノポリオール抗生物質の合成ができるように
なる。例えば、１つの好ましいトランスポゾンは、バチルス属から分離してクラ
スＩＩトランスポゾンに分類できる。もう１つの好ましいトランスポゾンは、Ｔ
ｎ５４０１としてデザインされ、Ｂａｃｔｅｒ．，１７６，２８３５−２８
４５（１９９４）のＢａｕｍ，Ｊ．，Ｊ．によって記述されている。一般
的には、アミノポリオール抗生物質を合成するためのゲノムの領域は、トランス
ポゾンによって付加され、容易く回復することができ、プローブとして突然変異
が起こらなかった菌株からコード領域を分離するために使用される。

【００３０】個々の野生型微生物は、本発明のコード領域と同類のヌクレオチドの配列を有
することによってスクリーニングできる。スクリーニング方法は、例えば、核酸
断片に検出可能な標識プローブのハイブリダイゼーションを含む。ハイブリダイ
ゼーションの条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，
９．４７−９．５５（２^ｎｄｅｄＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ１９８９）によって記載されているように
、当業者によって吟味される。一般的には、プローブは、上記の標準状態におい
てハイブリダイゼーションをする限り、核酸断片のヌクレオチドすべてと相補的
である必要はない。

【００３１】好ましいプローブは、コード領域若しくはアミノポリオール抗生物質の合成の
一部を担う他のヌクレオチドの配列に相補的な核酸断片である。例えば、プロー
ブは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１の部分に相補的なヌクレオチドの配列の連続から
成る。検出可能な標識プローブの方法は、当業者によって知られている。プロー
ブによって認識された核酸断片は、さらに解析されて、アミノポリオール抗生物
質の合成に関係があるポリペプチドのコード化の有無を確認するために、例えば
、ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）技術を用いて行う。

【００３２】アミノポリオール抗生物質の合成に関係があるポリペプチドをコード化する個
々の野生型微生物はまた、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体を用いて
識別される。好ましくは、抗体はゼッターマイシンＡの生合成を含むペプチドに
直接関係し、上記ポリペプチドは、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１にハイブリダイズす
る相補的な核酸断片によってコード化している。好ましくは、抗体は、ゼッター
マイシンＡの生合成を含むペプチドに直接関係し、上記ポリペプチドは、Ｏｒｆ
１（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４３）、Ｏｒｆ２（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４５）、及
びＯｒｆ３（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４７）である。

【００３３】個々の野生型微生物に存在しているコード領域へのプローブのハイブリダイゼ
ーションは、同一のコード領域を認識する方法若しくはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１
に存在するコード領域と同等なコード領域を認識する方法が使用可能である。コ
ード領域は、次いで分離され、下記に記載のようにベクターに連結される。もし
、２つの核酸の配列が整列して直線状になることができ、対応する残基の率が同
一であるならば、２つの核酸配列は“同等”であると言える。整列した直線状の
配列において、ギャップが認められない場合、好ましくは、２つの核酸の配列は
少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少
なくとも８０％の同一性を有する。“ギャップ”は、２本鎖核酸のある領域で、
整列した直線状を保ったまま、いくつかのヌクレオチドが一方の鎖で欠けている
場合、その隙間を意味する。整列した直線状の配列において、ギャップが許容さ
れる場合、２つの核酸の配列は、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは
少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。

【００３４】上述のように、本発明の核酸断片は、ベクターに組み込むことができる。本発
明の核酸断片を含むベクターの作成は、当業者によって知られている標準的な連
結技術を用いる。Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）若
しくはＡｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃ
ｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（１９９４）を参照。ベ
クターは、さらなるクローニング（核酸断片の増幅）、例えば、クローニングベ
クター、若しくは、コード領域によってコード化されているポリペプチドの発現
をする発現ベクターによって供給できる。定義としてのベクターには、プラスミ
ドベクター、ウィルスベクター、コスミドベクター、若しくは人工的な染色体ベ
クターが含まれるが、この限りではない。典型的には、ベクターは、細菌の宿主
において複製可能なベクターで、例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はＢ．セ
レアス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）である。好ましくは、ベクターはプラスミドであ
る。

【００３５】ベクターの選択性は、最終的に作り上げる所望の特徴である多様性に依存して
、例えば、選択マーカーやベクターの複製率などである。細菌の宿主において発
現する適切なプラスミドは、例えば、ｐＵＣ（Ｘ）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ
２３３−２、ｐＴｒｃ９９Ａ、及びｐＥＴ−（Ｘ）などを含んでおり、上記（Ｘ
）は、ベクターの系統を表し、多くの種類が考えられる。ｐＵＣ（Ｘ）ベクター
は、ＰｈａｒｍａｃａＢｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＨ）若
しくはＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
から得られる。ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−２、及びｐＴｒｃ９９Ａは、
ＰｈａｒｍａｃａＢｉｏｔｅｃｈから得られる。ｐＥＴ−（Ｘ）ベクターは、
Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏ
ｌｌａ，ＣＡ）及びＮｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から得られる。
宿主細胞内での複製を容易にするためには、ベクターは好ましくは複製のオリジ
ン（“ｏｒｉ”として知られている）若しくはリプリコンを含んでいる。例えば
、ＣｏｌＥ１及びＰ１５Ａリプリコンは、プラスミドにおいて、Ｅ．コリ内で増
殖するために共通に使用される。

【００３６】発現ベクターは、任意に調節領域を含んでおり、機能的にコード領域に関連し
ている。“調節領域”は、調節領域に機能的に関連しているコード領域の発現を
調節する核酸断片を意味する。調節領域の数多くの具体例のうち、いくつかは、
プロモーター、転写開始部位、翻訳開始部位、翻訳終了部位、及びターミネ−タ
ーである。“機能的に関連する”は、並置を意味し、構成は、機能的に関係を許
容する意図された方法において記載されている。調節要素は、コード領域の発現
が調節領域との互換性を有する状況において達成される方法で連結した時、コー
ド領域に機能的に関連している。本発明は、特定のプロモーターによって制限さ
れているわけではなく、幅広く知られているプロモーターも含む。プロモーター
は、細胞中にてＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３´の方向）のコード領域
から転写を開始する調節シグナルのように活動する。本発明で使用されるプロモ
ーターは、構成若しくは誘導プロモーターである。上記プロモーターは、宿主細
胞に関して相同性でありえるが、必ずしも必要ではない。細菌の形質転換におけ
る好ましいプロモーターは、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｔｒｃ、Ｔ７、Ｓ
Ｐ６、及びａｒａを含む。

【００３７】発現ベクターは、任意にシャイン・ダルガルノ部位（例えば、リボソーム結合
部位）、及び酵素を合成する転写された記録の翻訳を始める開始部位（例えば、
コドンＡＴＧ）を含む。上記ベクターはまた、翻訳を終了するターミネ−ション
配列を含む。ターミネ−ション配列は、典型的にはアミノアセチル−ｔＲＮＡと
は一致しないが存在するコドンであり、それゆえにポリペプチドの合成を終了す
る。宿主細胞に形質転換するために使用される核酸断片は、さらに任意に転写終
了配列を含むことができる。２つのターミネ−ターＴ１及びＴ２を含む引き伸ば
されたＤＮＡのｒｒｎＢターミネ−ターは、細菌の発現システムに組み込まれる
ターミネ−ターで、頻繁に使用されるターミネ−ターである（Ｊ．ｂｒｏｓｉ
ｕｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，１４８：１０７−１２７
（１９８１））。

【００３８】宿主細胞の形質転換に使用される核酸断片は、任意に１つ以上の選択マーカー
を含み、上記選択マーカーは、典型的には不活性、若しくは他の検出するポリペ
プチドをコード化して、培養液中の化合物によって検出される。例えば、マーカ
ー配列の含有配列は、形質転換細胞に抗生物質耐性を提供したり、若しくは形質
転換細胞において、化合物に特異的な代謝を与えることができる。具体例として
のマーカー配列の配列は、カナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール
、及びテトラサイクリンに対する耐性を与える。

【００３９】アミノポリオール抗生物質の生合成に含まれている複数のコード領域をコード
化しているオペロンの発現にとって、オペロンはベクターに挿入されることがで
き、上記ベクターは転写段階におけるｐＫＫ２２３−３で、相同性なコード領域
の野生型リボソーム結合部位の使用を可能にする。バチルスのようなグラム陽性
菌株における過剰発現技術は、当業者によって知られており、本発明において使
用されることが出来る（Ｑｕａｘｅｔａｌ．，Ｉｎ：Ｉｎｄｕｓｔｒｉ
ａｌＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：ＢａｓｉｃａｎｄＡｐｐｌｉｅｄ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂａｌｔｚｅｔａｌ．（ｅ
ｄｓ．），ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（１９９３））。過剰発現の代替システムは
、酵母ベクターに依存し、ピチア属、サッカロミセス属及びクルベノミセス属（
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の使用を含んでいる（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ，
Ｉｎ：ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：Ｂａｓｉ
ｃａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂａ
ｌｔｚｅｔａｌ．（ｅｄｓ．），ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙ
ｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（１９９３）；
Ｄｅｑｕｉｎ＆Ｂａｒｒｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：１
７３−１７７（１９９４）；ｖａｎｄｅｎＢｅｒｇｅｔａｌ．，
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：１３５−１３９（１９９０））。

【００４０】本発明はまた、アミノポリオール抗生物質の生合成に含まれているポリペプチ
ドを提供する。好ましくは、抗生物質は、ゼッターマイシンＡである。好ましく
は、ポリペプチドはアミノ酸配列を含み、上記アミノ酸配列の少なくとも一部分
が核酸断片によってコード化され、上記核酸断片の相補鎖はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ
：１にハイブリダイズする。最も好ましくは、ポリペプチドが、ＳＥＱ．ＩＤ．
ＮＯ：４３、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４５、及びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４７から成
るグループから選択される。

【００４１】結合的生化学による斬新な分子の生成ポリケチド抗生物質の分野における多くの研究は、領域交換による新しいポリ
ケチドの生成に集中している（Ｋａｔｚ，Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ａｎｎｕ
．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７：８７５−９１２（１９９３）；Ｋｈ
ｏｓｌａ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１４，３３５−３４１（１９９６）；Ｒｕａｎ，Ｘ．，ｅｔａｌ．
，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９，６４１６−６４２５（１９９７）
）；新奇なポリペプチド抗生物質の合成における同様の試験が始められた（Ｓｔ
ａｃｈｅｌｈａｕｓ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６９：６
９−７２（１９９５））。ゼッターマイシンＡの生合成経路によって提供される
２つの構造的に異なる生合成経路の融合は、結合的生化学によって生成する分子
の可能な数を著しく増大するであろう。

【００４２】本発明の分離された核酸断片は、アミノポリオール抗生物質の合成が形質転換
される以前の宿主よりも高い効率で可能な非相同な細菌若しくは菌類の宿主にお
いて発現することができ、上記宿主は微生物におけるバイオコントロールの効率
を上げることができるであろう。“非相同な細菌若しくは菌類の宿主”はアミノ
ポリオール抗生物質の生合成に含まれるポリペプチドをコード化する核酸断片を
含んだ宿主細胞であり、上記宿主細胞は核酸断片が分離された生物ではない。

【００４３】分離されたアミノポリオール生合成のコード領域は、細菌及び菌類の宿主にお
けるバイオコントロールの効率を増大させる目的を有して非相同な細菌若しくは
菌類の宿主において発現することができる。“バイオコントロール菌株”“バイ
オコントロール剤”若しくは“バイオコントロール生物体”は、病原体の成長に
影響を与えることができる生物体であり、疾病を引き起こす病原体の能力を減少
させる。“病原体”は適切な環境下において、２次的な生物に影響を及ぼす生物
体である。２次的な生物が植物の場合、病原体は通常、“植物病原体”と呼ばれ
る。本発明の範囲において、定義としての病原体は、菌類、細菌、線虫、ウィル
ス、ウィルス様体、及び虫を含んでいる。植物のバイオコントロール剤は、植物
若しくは根圏にコロニーを形成できる微生物を含む。生物体は、その環境下にお
いてバイオコントロール剤のように活動するか若しくはアミノポリオール抗生物
質、好ましくはゼッターマイシンＡを発現するために修正される。

【００４４】バイオコントロール剤は、アミノポリオール抗生物質を発現するために修正さ
れ、上記バイオコントロール剤は、植物若しくは根圏にコロニーを形成できる微
生物である。上記の微生物は、植物病原性菌類、植物病原性細菌、植物病原性線
虫に接触して運んで行かれる。好ましくは、バイオコントロール剤への接触は、
植物病原体の成長を抑制する。修正され得る適切なバイオコントロール剤は、シ
ュードモナス属、エンテロバクター属、及びセラチア属のようなグラム陰性微生
物、グラム陽性微生物のバチルス、並びに菌類であるトリコダーマ（Ｔｒｉｃｈ
ｏｄｅｒｍａ）及びグリオクラジウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）を含む。

【００４５】例えば、突然変異を含み、好ましくは１つの塩基が挿入された突然変異で、ア
ミノポリオール抗生物質の経路を有するバチルス属は、直接、バイオコントロー
ル剤として活動できる栽培領域に適用できる。好ましくは、変異型バチルス属（
ｍｕｔａｎｔＢａｃｉｌｌｕｓｓｓｐ）のような突然変異を含むバチルス属
は、野生型のバチルス属（例えば、同じバチルス属は突然変異を含んでいない）
よりも多量のアミノポリオールを合成することがエルウィニア・ヘルビコラ（Ｅ
ｒｗｉｎｉａｈｅｒｂｉｃｏｌａ）を基にした抑制アッセイの範囲により分か
った（実施例にて詳細に説明）。好ましくは、微生物はアミノポリオールを野生
型の微生物よりも１．１倍多く合成し、より好ましくは２倍多く合成する。より
好ましくは変異型バチルス属であるＢ．セレアスは、１つの塩基が挿入された突
然変異を転写調節をコードするゲノムの一部内に含み、好ましくは、ＳＥＱ．Ｉ
Ｄ．ＮＯ：２９を含む核酸断片を含んでいる。この場合、バイオコントロール剤
は、所望の影響をコード化する核酸断片に関して相同性の宿主であり、例えば、
バチルス由来の核酸断片である。例えば、突然変異を含む核酸断片は、バチルス
・セレアス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｃｅｒｅｕｓ）由来であるだろうし、バイオコ
ントロール剤は、変異型核酸断片を含むバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）若しくはバチルス・セレアスであるかもしれない。

【００４６】しかしながら、非相同性の宿主はまた、使用可能で、適切な宿主は、シュード
モナス・フルオレセンス、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａ），シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅ
ｐａｃｉａ），シュードモナス・オーレオファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ），シュードモナス・オーランチアカ（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓａｕｒａｎｔｉａｃａ），エンテロバクター・クロアカエ（Ｅ
ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ），セラチア・マルセンシス（Ｓｅｒ
ｒａｔｉａｍａｒｓｃｅｓｅｎｓ），トリコダーマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄ
ｅｒｍａｖｉｒｉｄｅ），トリコダーマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒ
ｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ），及びグリオクラジウム・ビレン（Ｇｌｉｏｃｌａ
ｄｉｕｍｖｉｒｅｎｓ）である。本発明の好ましい実施態様は、本発明の核酸
断片が上記に記載した好ましい非相同な宿主へ転換される。特に好ましい実施態
様は、ゼッターマイシンＡの生合成のコード領域が、ピロールニトリン（ｐｙｒ
ｒｏｌｎｉｔｒｉｎ）の合成によるバイオコントロールの利用性を有するシュー
ドモナス・フルオレセンスＣＧＡ２６７３５６株（米国特許出願番号５、３４８
、７４２で開示）に転換され、発現される。他の好ましい実施態様としては、核
酸断片がフェナジン（ｐｈｅｎａｚｉｎｅ）の合成によるバイオコントロールの
特徴を有する，シュードモナス・オーレオファシエンス３０−８４株に転換され
る。非相同な細菌若しくは菌類の宿主における発現は、選択された宿主及び適切
に選択されたプロモーターにおける複製に適切なベクターの選択を必要とする。
グラム陰性及びグラム陽性並びに菌類における発現の技術は、当業者によって十
分に知られており、以下に記載する。

【００４７】本発明の核酸断片は、植物で発現でき、好ましくは、トランスジェニック植物
で発現できるので、それゆえにゼッターマイシンＡのようなアミノポリオール抗
生物質の生合成を引き起こす。上記方法にて、植物病原体菌類、植物病原体細菌
、及び植物病原体線虫に対して耐性を増幅させたトランスジェニック植物が合成
される。本発明の核酸断片は、トランスジェニック植物における発現を最適化す
るために当業者によって知られている技術によって修正されるであろう。例えば
、当業者に知られている技術であるが、すべての生物体は、コドンの利用に対し
て特別な選択性を有し、本発明のコード領域のコドンは、植物の選択性によって
変化したことが確認でき、一方でポリペプチドをコード化するアミノ酸配列を維
持する。植物におけるトランスジェニックコード領域の高い発現は、少なくとも
３５％のＧＣ含有のコード領域において最も達成され、より好ましくは４５％以
上である。ここで記載されている核酸断片及びコード領域の変化は、既知の技術
として知られている部位特異的突然変異、ＰＣＲ、遺伝子合成技術が使用できる
。例えば、米国特許出願番号５、７１６、８４９（Ｌｉｇｏｎｅｔａｌ．）
は、コード領域の発現を増大させるために、単子葉若しくは双子葉の特定のコド
ン及び／又はＧＣ含有量の好ましいヌクレオチドの配列に修正された記載である
。

【００４８】遺伝子的に操作ができる双子葉植物及びに単子葉植物は、本発明において使用
することができる。遺伝子的に操作ができる植物は、外界からのコード領域を導
き入れ、発現し、安定的に維持し、後世に引き継ぐことのできる植物である。

【００４９】トランスジェニック植物は、親世代トランスジェニック植物によるトランスジ
ェニック種から得られるであろう。本発明のトランスジェニック植物の合成方法
は、典型的には、アミノポリオールの生合成を含むポリペプチドをコード化した
コード領域からなる核酸断片を伴った植物の細胞の形質転換を含んでいる。核酸
断片は、通常、ベクター上に存在する。植物細胞において、ベクターは自発的に
、染色体外で複製することができ、多くのベクターが維持できるように多くのポ
リペプチドが合成され、若しくはゲノムＤＮＡに統合されることができる。好ま
しくは、ベクターは、植物細胞のゲノミックＤＮＡに統合される。ベクターは、
好ましくは円形であるが、直線状ではない。

【００５０】本発明の核酸断片に存在するコード領域は、典型的には、形質転換した植物細
胞のコード領域の発現を調節する調節領域に機能的に関連している。コード領域
に機能的に関連する典型的な調節領域は、プロモーターを含んでいる。本発明は
、特別なプロモーターの使用によって制限されておらず、様々な種類のプロモー
ターの使用も知られている。植物に特異的なプロモーターが好ましく、構造的プ
ロモーター、誘発プロモーター、及び組織に特異的なプロモーターがあるが、こ
れに限ったことではない。宿主に関して非相同性でありえるが、必ずしも必要と
しない。プロモーターが植物内で機能的である場合、Ｔｉ−、Ｒｉ−プラスミド
、植物細胞、植物ウィルス、若しくは他の宿主からプロモーターが得られる。例
証されるプロモーターは、植物において細菌のオリジンの機能を有する例証され
たプロモーターであるオクトピン（ｏｃｔｏｐｉｎｅ）シンセターゼプロモータ
ー、ノパリン（ｎｏｐａｌｉｎｅ）シンセターゼプロモーター、モノピン（ｍｏ
ｎｏｐｉｎｅ）シンセターゼプロモーター等を含む。ウィルスのプロモーターは
、カリフラワーモザイクウィルスの全長（ＣａＭＶ３５Ｓ）及び領域ＶＩプロモ
ーター等を含む。内因性の植物プロモーターは、リボース−１，６−ビフォスフ
ェイト（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）プロモーター、
ｂ−コングリシニン（ｃｏｎｇｌｙｃｉｎｉｎ）プロモーター、ファスオリン（
ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）プロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＧＰＡＬ２プロモー
ター、ヒートショックプロモーター、組織に特異的なプロモーターで例えば、果
実熟成に関連するプロモーター等を含む。

【００５１】プロモーターの選択性は、一時的で空間的な様々な発現の要求性及び標的にす
る種に依存する。葉からの病原体に対する植物の防衛にとって、葉における発現
が好まれ、穂からの病原体に対する植物の防衛にとって、花序（例えば、穂、小
片、穂軸等）での発現が好まれ、根圏からの病原体に対する植物の防衛にとって
、根における発現が好ましく、土壌の病原体に対する育種の防衛は、根及びに／
若しくは種における発現が好ましい。しかしながら、多くの場合において、１つ
以上のタイプの病原体に対する防衛が考えられ、複数の組織における発現が望ま
しく、米国特許出願番号５、７１６、８４９（Ｌｉｇｏｎｅｔａｌ）に記載
されている。好ましくは、適切なプロモーターは、損傷を誘発するプロモーター
、緑色の組織に特異的なプロモーター、根に特異的なプロモーター、幹に特異的
なプロモーター及び花に特異的なプロモーターから成るグループから選択される
。

【００５２】コード領域に機能的に関連する他の典型的な調節領域は、ターミネ−ターを含
み、上記ターミネ−ターは、外因性コード領域に３´を有する外因性コード領域
の転写の停止を引き起こすことができる核酸断片である。本発明は、特に限定さ
れたターミネ−ターの使用に限られておらず、様々な種類のターミネ−ターにお
いても知られている。植物に特異的なターミネ−ターが好ましく、アグロバクテ
リウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ）Ｔｉｐｌａｓｍｉｄ（ｎｏｓｔｅｒ）由来のノパリンシンターゼター
ミネ−ターが含まれるが、この限りではない。

【００５３】効果的な翻訳の開始のためには、コード領域によってコード化されたポリペプ
チドの開始コードである５´ヌクレオチドの配列が、発現を増大するために修正
されることができる。修正は、植物にとって効果的であると知られている配列の
含有を含んでいる。例えば、配列ＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＴＣ（ＳＥＱ．ＩＤ．
ＮＯ：３７）（Ｊｏｓｈｉ，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄＲｅｓ．，１５：６６４３
−６６５３（１９８７））が植物のＥ．コリ−ｕｉｄＡコード領域の発現に一致
した翻訳開始として提案される。他に可能性のある開始コドンの調節に使用され
ることが出来る翻訳開始配列は、ＡＡＡＣＡＡＴＧＧＣＴである（ＳＥＱ．ＩＤ
．ＮＯ：３７）（Ｊｏｓｈｉ，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄＲｅｓ．，１５：６６４
３−６６５３（１９８７））。上記の翻訳開始配列は、本発明のコード領域と共
に使用されるであろう。上記配列は、開始コドンの核酸断片の上流に組み込まれ
るであろう。

【００５４】トランスジェニック植物におけるゼッターマイシンＡのようなアミノポリオー
ル抗生物質の合成は、同時に起こるアミノポリオール抗生物質の生合成酵素の複
数の遺伝子の過剰発現をしばしば要求される。個々のアミノポリオールを生合成
するコード領域を異なる植物の系統にそれぞれ形質転換し、次いで交配すること
によって達成される。複数のコード領域を有する系統の選択と維持は、もし各々
の形質転換種が異なった選択マーカーを使用することが出来れば容易である。ア
ミノポリオールを生合成するコード領域をすべて必要として存在する系統は、ア
ミノポリオール抗生物質を合成するが、一方で他の系統では合成は起こらない。
上記方法は、例えば、最終的な雑種が親世代の交配を必要とするとうもろこしの
ようなハイブリッド作物に適切である。

【００５５】植物細胞へ核酸断片を導入する様々な技術が可能である。しかしながら、宿主
細胞への核酸断片導入の特定の方法は、本発明の技術にとっては重要ではなく、
形質転換に効果的な任意の方法が採用される。植物細胞への核酸断片の導入にと
って、形質転換に加えて、アグロバクテリウムの腫瘍を誘発する（Ｔｉ）若しく
は根に誘発する（Ｒｉ）プラスミド由来の植物形質転換ベクターの方法が使用す
ることができる。上記の従来の方法は、例えば、リポゾームの使用、ウィルス若
しくは花粉を用いた形質転換、ＤＮＡの直接的な取り込みを増大させる化学物質
、微注射、エレクトロポレーション、又は高速度微推進を含んでいる。

【００５６】形質転換にとっての植物組織供給源若しくは培養された植物細胞の選択は、宿
主植物の形態及び形質転換のプロトコールに依存する。利用可能な組織は、カル
ス、培養細胞の懸濁、プロトプラスト、葉の断片、幹の断片、雄穂、花粉、胎芽
、胚軸、管の断片、分裂組織等を含む。組織供給源は、再生可能で、果実熟成か
ら形質転換までを含む全体を再生する能力を有するであろう。

【００５７】形質転換は、選択された植物組織の状況によって実行される。バッファー及び
培養液もまた、植物組織の供給源及び形質転換のプロトコールによって変更され
る。

【００５８】適切な条件下における核酸断片の露出は、植物細胞若しくは組織は選択に先だ
って異なる期間栽培されるか、若しくは直ちに前述された選択剤に露出されるで
あろう。アグロバクテリウムへの露出を含んだプロトコールはまた、アグロバク
テリウム細胞の成長を抑制する作用剤を含むかもしれない。共通に使用される化
合物は、セフォタキシン（ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ）及びカルベニシリン（ｃａｒ
ｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）のような抗生物質である。選択に使用される培養液は、
形質転換した組織や均一状態の培養液の懸濁を維持する形状若しくは、組織、葉
や幹の断片、管等からの芽の形成を可能にさせる。

【００５９】選択剤の通常阻害濃度の存在下における成長が観察された細胞や組織は、形質
転換され、同じ培地に更なる時間を追加して培養され、非耐性を除去されるであ
ろう。細胞若しくは組織は、核酸断片の有無を測定されることができるか、若し
くは知られている植物再生プロトコールにしたがって行われるであろう。直接的
な芽の合成、上記芽の選択倍地での発芽を含むプロトコールは、形質転換され、
根の合成に適切な選択培地若しくは根を誘発する化合物中に単に切り株を侵して
直接バーミキュライトに植え付け、切除され、根付くであろう。

【００６０】アミノポリオール抗生物質の合成本発明はまた、適切なアミノポリオールの生合成コード領域を形質転換した非
相同性宿主からゼッターマイシンＡのようなアミノポリオール抗生物質を得る方
法を供給する。上記アミノポリオール抗生物質は、微生物の成長の阻害に効果的
であり、特に病原体微生物に対して効果的である。アミノポリオール抗生物質は
、アミノポリオールの生合成コード領域を過剰発現する生物から合成され、植物
と同様に、グラム陰性及びグラム陽性微生物や酵母を含む適切な生物である。ア
ミノポリオール抗生物質合成の目的のために、宿主生物を選択する重要な基準は
、簡単な操作、早い成長（例えば、この場合は発酵）、及び過剰に生産されてい
る抗生物質への感受性の欠如である。アミノポリオール抗生物質の合成の上記方
法は、通常の化学物質を用いて行う抗生物質の調製に対して多大な利点を有して
いる。上記利点は、製造における低コスト、有機合成によって必然的に生成され
たラセミ化合物の混合に対立するものとして好ましい生物的対掌体の化合物を合
成する能力である。立体化学的に適切な化合物を合成する能力は、キラル的に活
発な炭素原子を有する分子にとって非常に重要である。非相同性な宿主によって
合成される抗生物質は、農業分野での適用と同様に、医学分野（例えば、病原体
の制御及び／若しくは感染病）へも適用することができる。

【００６１】本発明はまた、活性成分がアミノポリオール抗生物質である耐病原体構成物を
提供する。アミノポリオール抗生物質は、典型的には、本発明のバイオコントロ
ール剤によって合成される。代替として、構成物は、バイオコントロール剤の懸
濁若しくは濃縮である。活性成分は、均一的に混合され、１つ以上の化合物若し
くは化合物の基は、下記に記載されるものである。本発明はまた、植物へ適用す
る構成物を成す植物を処置する方法に関連している。

【００６２】本発明の活性物質は、通常は化合物の形態で、更なる化合物を伴って、同時若
しくは連続的に処置される作物エリアや植物に適用される。上記化合物は、肥料
若しくは微量養素のドナー、選択性除草剤、殺虫剤、殺菌剤、殺細菌剤、殺線虫
剤、軟体動物駆除剤若しくは上記の薬剤のいくつかを含んだ混合物を含んでいる
。上記化合物は、さらにキャリアー、界面活性剤、アジュバントを含んでいる。
耐病原体化合物の形態の詳細は、米国特許出願番号５、７１６、８４９にて見ら
れる。

【００６３】実施例本発明は、下記の実施例にて例証される。本発明の範囲及び目的に一致して、
特定の実施例、物質、量、及び操作が広く解釈されることが理解される。下記の
実施例は、ゼッターマイシンＡの合成に必要な遺伝子領域の認定を例証する。Ｄ
ＮＡ配列の解析は、抗生物質の生合成のポリケチド及びポリペプチドを含む酵素
と同様の配列のオープンリーディングフレームを確認した。Ｂ．セレアスＵＷ８
５（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓＵＷ８５）の研究におけるコード領域の不活性化は、ゼ
ッターマイシンＡの合成及び耐性に必要なコード領域を確認し、ゼッターマイシ
ンＡの合成は、ポリペプチド及びポリケチド生合成酵素のハイブリッドによって
導かれることが推測される。

【００６４】実施例１：ｏｒｆ１、ｏｒｆ２及びｏｒｆ３のヌクレオチド配列並びに推定される機能。

【００６５】細菌株、プラスミド、及び培養状態。本実験で使用された菌株及びプラスミド
は、表１に記載されている。示されてはいるが、Ｅ．コリ株は３７℃のＬｕｒｉ
ａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）肉汁若しくは寒天で培養された。バチルス株は、２
８℃の５０％のトリプチカーゼソイ肉汁（ＴＳＢ）若しくは寒天（ＴＳＡ）
で培養された（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，
ＭＩ）。培地の１００ＭＨ８．１は、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地（Ｄｉ
ｆｃｏ）に４０ｍＭの３−（モルホリン）プロパン−スルホン酸（ＭＯＰＳ）及
び４０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）を加え、水酸
化ナトリウムでｐＨを８．１に調製された。抗生物質が、下記の量にてＥ．コリ
に、アンピシリンが５０ｍｇ／Ｌ；スペクチノマイシンが１００ｍｇ／Ｌ；クロ
ラムフェニコールが１２ｍｇ／Ｌ、また下記の量にてバチルス株に添加された、
スペクチノマイシンが１５０若しくは２００ｍｇ／Ｌ；エリスロマイシンが１０
ｍｇ／Ｌ；クロラムフェニコールが５ｍｇ／Ｌ。

【００６６】

【表１】（表１続き）ＤＮＡの操作及び分析。プラスミドＤＮＡがＥ．コリ株からＷｉｚａｒｄｍ
ｉｎｉｐｒｅｐ（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）若
しくはＱｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して分離された。プ
ラスミドＤＮＡが、バチルス株から、記載されるアルカリ溶菌抽出を修正した方
法によって分離された（Ｍｉｌｎｅｒｅｔａｌ，１９９６）。全ゲノムＤ
ＮＡは、Ｂ．セレアスからＥａｓｙ−ＤＮＡｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて分離された。制限酵素及び
修正酵素は、マニュアル（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．；ＮｅｗＥｎｇｌａ
ｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｒ
ｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）に添って使用された。サザンブロッティング解析が、
ＧｅｎｉｕｓＫｉｔ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、マニュアル
に記載に状態で行われた。しかしながら、Ｂ．セレアスのゲノミックＤＮＡをタ
ーゲットにしたサザンブロッティングで、プローブは、高いストリンジェンシー
においてハイブリダイゼーションにしばしば失敗したが、これは、Ｂ．セレアス
ＤＮＡのＡＴリッチ（３６％ＧＣ）によるものと考えられる。ブロッティングの
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを下げるために、ハイブリダイゼ
ーションの温度を４２℃から４０℃に下げ、過剰なプローブを０．１ＸＳＳＣの
６８℃の条件ではなく、０．５ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウ
ム、０．０１５Ｍクエン酸水素ナトリウム）にて洗浄した。前述のエレクトロポ
レ−ション（Ｍｉｌｎｅｒｅｔａｌ．，１９９６）によって、プラスミド
をＥ．コリ及びバチルスに導入した。Ｂ．セレアスの形質転換の効率を増大させ
るために、Ｂ．セレアスのエレクトロポレ−ションに先だって、高い形質転換可
能な菌株であるＢ．チューリンゲンシスＥＧ１０３６８株（表１）由来のプラス
ミドＤＮＡに導入し、精製することが必要であることが分かった。

【００６７】ＤＮＡシークエンシング及び解析。Ｂ．セレアスのＤＮＡ断片をｐＬＡ２９１
７、ｐＨＴ３０４、若しくはｐＧＥＭ（表１）にクローニングして、Ｅ．コリか
ら分離し、シークエンシングの鋳型として使用した。２．７ｋｂの両鎖は、ＳＥ
Ｑ．ＩＤ．ＮＯ：１のＤＮＡ配列によりＭ１３／ｐＵＣフォワード及びリバース
プライマー（表２）を用いてプライマーウォーキング法によってシークエンスを
行った。シークエンシング反応は、ＰＲＩＺＭｃｙｃｌｅｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇｋｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏ
ｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を用いて行った。プライマーの合成及びシークエン
シング産物の分離は、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎ−Ｍａ
ｄｉｓｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒ（Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩ）にて行われた。

【００６８】

【表２】ＤＮＡの部分的な配列は、統合され、編集し、オープンリーディングフレーム
が確認され、コドンがＳｅａｍａｎａｎｄＥｄｉｔＳｅｑｓｏｆｔｗａｒ
ｅ（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｉｎｃ．）及びＣｏｄｏｎＵｓｅ３．３（Ｃｏｎｒａ
ｄＨａｌｌｉｎｇ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｃａｇｏ）によっ
て解析された。ＤＮＡ及びタンパク質の比較がＮＣＢＩＢＬＡＳＴＥ−ｍａｉ
ｌサーバー及びＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓ
ｉｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅ
ｒＧｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）を介したＢＬＡＳＴａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ（Ａ
ｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，１９９０）を使用して行われた。

【００６９】ｚｍａＲフランキング領域の配列の解析。ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１は、３、９
３４のヌクレオチドの配列を示すｚｍａＲフランキング領域で、すでに発表され
た１．２ｋｂのＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片（塩基数１４３８−２６６５）のヌク
レオチドの配列を含む。配列の分析は、典型的にはバチルス属のコドンを適用し
て、ｚｍａＲとして同じ転写開始を有する３つのオープンリーディングフレーム
（ｏｒｆｓ）を確認した。２つのｏｒｆは、ｚｍａＲの上流に確認され、１つの
ｏｒｆは、下流に確認された。３つのオープンリーディングフレーム、ｏｒｆ１
（３３８から１４８６塩基までのＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１）、ｏｒｆ２（２６３
０から３８４７塩基までのＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１）、及びｏｒｆ３（７８から
３４１塩基までのＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１）は、翻訳開始が可能な部位ＡＴＧの
７から９塩基数上流に推論されるリボソーム結合部位を有する。Ｏｒｆ１、ｏｒ
ｆ３及びｚｍａＲは、ＴＧＡ停止コドンを伴い終了する。Ｏｒｆ２は、ＴＡＧ停
止コドンを伴い終了する。ｏｒｆ３のＴＧＡ停止コドンは、ｏｒｆ１のＡＴＧ開
始コドンと重なり、ｏｒｆ１に関して１つのリーディングフレームが移動する。
同様のオーバーラッピング構造は、ｏｒｆ１のＴＧＡ停止コドンとｚｍａＲのＡ
ＴＧ開始コドンの関係でも明らかである。ｏｒｆ２のＡＴＧ開始コドンは、ｚｍ
ａＲのＴＧＡ停止コドンの２０塩基下流に位置している。プロモーター配列の欠
損、開始及び終了コドンのオーバーラッピング構造、及び転写開始の共有は、ｏ
ｒｆ１、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３及びｚｍａＲがオペロン中に構成されていることを
示唆する。上記すべてのｏｒｆがタンパク質をコード化しるコード領域であるこ
とをデータが示している。それゆえ、オープンリーディングフレームをｏｒｆ１
、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３として設計し、ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３のオープン
リーディングフレームとしてそれぞれコード化されたタンパク質であると推定さ
れた。

【００７０】Ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３の推定された機能。ＢＬＡＳＴａｌｇｏｒｉ
ｔｈｍｓ（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，１９９０）を使用して仮定され
た３つのタンパク質の推定されるアミノ酸配列が比較され、各々のＯｒｆは、既
知の機能を有するタンパク質と相同性を有することが明らかにされた。Ｏｒｆ１
（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４３）は、４２．１ｋＤａと予想される分子量のタンパ
ク質で、６．７の等電点を有すると推測される。Ｏｒｆ１は、Ｂ．サブチリス（
５４％のアミノ酸配列が同様で、３４％が同一である）及びラタス・ノルベジカ
ス（Ｒａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（５３％のアミノ酸配列が同様で、
３１％が同一である）を含む生物由来のａｃｙｌ−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素
とのかなり高い配列の相同性を有し、全長鎖３８２アミノ酸配列が同等である。
ａｃｙｌ−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、脂肪酸の酸化分解を含んでいる。デヒド
ロゲナーゼ（Ｂｒｏｗｎｅｔａｌ．，１９９６）及びトランスフェラーゼ
（Ｍｏｌｎａｒｅｔａｌ．，１９９６）のような非ポリケチドシンターゼ
に関連する酵素的活性は、ポリケチドの合成のために関係している。それゆえ、
ａｃｙｌ−ＣｏＡデヒドロゲナーゼと配列が同等のｏｒｆ１はまた、ゼッターマ
イシンＡの生合成を含んでいる。

【００７１】Ｏｒｆ２（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４５）は、４５．６ｋＤａと予想される分子
量のタンパク質で、５．３の等電点を有すると推測される。Ｏｒｆ２は、ポリケ
チドと脂肪酸シンターゼ酵素の予想されるタンパク質配列の一部分と同等である
。Ｏｒｆ２は、ポリケチドシンターゼ酵素と３６％から６０％のヌクレオチドの
同一性を有し、５１％から７５％のアミノ酸配列の類似性を有する（ｓｃｈｗｅ
ｃｋｅｅｔａｌ．，１９９５）。また、Ｏｒｆ２は、脂肪酸シンターゼ酵素
と３７％から４８％のヌクレオチドの同一性を有し、５５％から７４％のアミノ
酸配列の類似性を有し、特にポリケチドシンターゼのアクリルトランスフェラー
ゼ部位及び脂肪酸シンターゼのトランスアクラーゼである。相同性の領域は、ア
クリルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、トランスアクラーゼ、及びチオエスタラ−
ゼ（Ｃｏｒｔｅｓｅｔａｌ．，１９９０）と同一な活性部位配列（ＳＥＱ
．ＩＤ．ＮＯ：１の２８９７から２９１１塩基まで）を含んでいる。予期せぬこ
ととして、ｏｒｆ２タンパク質は唯一タイプＩ型ＰＫＳのアクリルトランスフェ
ラーゼ部位と高い相同性を有するが、ｏｒｆ２遺伝子は、単機能タイプＩＩ型Ｐ
ＫＳ酵素により共通な単一のポリペプチドをコード化することを示している。

【００７２】Ｏｒｆ３（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４７）は、１０．２ｋＤａと予想される分子
量のタンパク質で、４．３の等電点を有すると推測される。Ｏｒｆ３は、グラミ
シジン（ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ）Ｓシンセターゼ（Ｔｕｒｇａｙｅｔａｌ．
，１９９２）及びサーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）シンセターゼ（Ｃｏ
ｓｍｉｎａｅｔａｌ．，１９９３）を含むポリペプチドシンセターゼ酵素
と類似の配列領域を有する。上記酵素の既知の活性部位は、相同性領域を含んで
いない。ポリペプチドシンセターゼ酵素は、チオテンプレート機構（Ｍａｒａｈ
ｉｅｌ，１９９２）を経由した連続したアミノ酸間のペプチド結合の形成を活
性化し、触媒する。ポリペプチドシンセターゼ酵素は、通常大きいため、ｏｒｆ
３が小さいタンパク質をコード化しているという予測は驚きである。Ｏｒｆ３タ
ンパク質がポリペプチドシンセターゼ酵素の特別な形状（ペプチドシンテターゼ
が一般に大きな多機能酵素である場合、ポリケチド・シンセターゼのタイプＩ型
対ＩＩ型の比較で観察されるものに似ている）である可能性がある。

【００７３】実施例２：Ｂ．セレアスＵＷ８５におけるｚｍａＲ及びｏｒｆ２の挿入不活性効果。

【００７４】ｚｍａＲ及びｏｒｆ２の挿入不活性効果のためのプラスミドの製造。ＰＧＥＭ
ｄＳＨは、ＳｍａＩ及びＨｉｎｄＩＩで消化されたｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）（Ｐ
ｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．）によって構成され、クレノー酵素で平滑末端を作り
、ＤＮＡはセルフライゲーションしている。ｏｒｆ１、ｚｍａＲ、及びｏｒｆ２
を含んでいるＨＭＩＩから分離した５．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片は、ｐＧＥＭｄ
ＳＨにサブクローニングされ、ｐＺＭＥ５．５を創り出す。ＨＭＩＩは、配列の
分析によると、挿入の末端が生合成経路の配列を含むことを示しているため，完
全な生合成経路を含んでいないと信じられている。

【００７５】ｚｍａＲの挿入不活性のためのプラスミド建設を創り出す戦略は、ｚｍａＲへ
のＤＮＡ挿入の７５４ｂａを除去し、プラスミドｐＤＧ１７２６（表１）由来の
１．２ｋｂのスペクチノマイシン耐性（Ｓｐ^ｒ）をｚｍａＲの削除部位としての
同じ転写開始部位に挿入することである。ｐＺＭＧ６は、ＢｇｌＩＩ及びＢｌｐ
Ｉによって消化され、クレノー酵素で平滑末端化され、（Ｓｐ^ｒ）を有する１．
２ｋｂの平滑末端ＰｓｔＩ断片と連結し、ｐＺＭＧ６Ｓ＋を創り出す。クローン
は、プライマー６７７を用いてシークエンスされ、ｚｍａＲとして同じ転写開始
部位にＳｐ^ｒを有することを確認する。ｐＺＭＧ６Ｓ＋由来の１．７ｋｂのＳｐ
ｈＩ−ＢａｍＨＩ断片がＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩで消化されてＣＩＰで処理され
たｐＺＭＥ５．５へクローンされ、ゲル精製により、ｚｍａＲを含む１．２ｋｂ
のＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片を精製して、ｐＺＭＥ５．５ΔｚｍａＲを合成する
。ｐＺＭＥ５．５ΔｚｍａＲ由来のＥｃｏＲＩ断片がｐ１４Ｂ’にクローンされ
、ｐΔｚｍａＲ（図２）を創り出す。ｐ１４Ｂ’は、Ｅ．コリ−Ｂ．セレアスの
シャトルベクターで、温度に感受性な複製のオリジンを有し、Ｂ．セレアスにお
ける突然変異の変換マーカーとして使用される。

【００７６】プラスミドｐΔｏｒｆ２は、ｐＺＭＥ６ＲをＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで
消化することによって構築し、ｏｒｆ２を含む１．７ｋｂ断片をゲル精製し、Ｂ
ａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した上記ベクターに連結し、ＣＩＰ処理ベクタ
ーｐＨＴ３０４（表１）を創り出す。ｏｒｆ２の挿入不活性のためのプラスミド
建設を創り出す戦略は、ｏｒｆ２への挿入ＤＮＡの８８１ｂｐを削除し、除去部
分であるｏｒｆ２としての転写開始と同じ部位にＳｐ^ｒを挿入する。ｐＺＭＥ５
．５は、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＶにより消化し、Ｓｐ^ｒと連結して、前述のよ
うに調製することにより、ｐＺＭＥ５．５Δｏｒｆ２を創り出す。クローンは、
プライマー１７２１によってシークエンスされ、ｏｒｆ２として同じ転写開始部
位にＳｐ^ｒを含むことを確認する。ｐＺＭＥ５．５Δｏｒｆ２由来のＥｃｏＲＩ
断片は、ｐ１４Ｂ’に連結され、ｐΔｏｒｆ２を創り出す（図３）。

【００７７】ｚｍａＲ及びｏｒｆ２の挿入不活性。プラスミドｐΔｐｚｍａＲ若しくはΔｏ
ｒｆ２は、Ｂ．セレアスＵＷ８５へ形質転換され、抗生物質の選択なしで、ｐ１
４Ｂ’由来のプラスミドの複製を阻害する４２℃にて培養された。推定される単
一の組み込み物は、クロラムフェニコール及びスペクチノマイシンを含む培地を
４２℃で培養することにより確認され、組み込みはサザンブロッティング解析に
よって確認された。単一の組み込み物は、抗生物質の選択マーカーなしで４８時
間、４２℃にて繰り返し培養し、切りこみ及びプラスミドの欠損を促進し、選択
性を有しない培地に培養された。コロニーが、スペクチノマイシン耐性及びクロ
ラムフェニコール感受性のＴＳＡ、２８℃にてスクリーニングされた。スペクチ
ノマイシン耐性コロニーの４分の１から３分の１が、クロラムフェニコールに感
受性で、ベクター及び野生型対立遺伝子を失ったが、突然変異対立遺伝子を維持
していることを示す。

【００７８】クロラムフェニコール感受性のゲノミックＤＮＡ及びスペクチノマイシン耐性
クローンのサザンブロッティング解析を実行し、上記領域のゲノミック構造が確
立された。ＵＷ８５及びＵＷ８５ΔｚｍａＲ由来のゲノミックＤＮＡをＳｐｈＩ
／ＢａｍＨＩで消化し、ｚｍａＲコード領域の断片の内部のプローブで行い、Ｕ
Ｗ８５の１．２ｋｂ長のバンドを検出し、ＵＷ８５ΔｚｍａＲの１．７ｋｂ長の
バンドを検出し、ｚｍａＲコード領域の分裂したコピーの存在を確認した。ＵＷ
８５及びＵＷ８５Δｏｒｆ２由来のＤＮＡをＳａｌＩ／ＥｃｏＲＶで消化し、同
一のＤＮＡ断片のプローブで行ったところ、ＵＷ８５ではおよそ４．５ｋｂが検
出され、一方ＵＷ８５Δｏｒｆ２では、上記より多少長めのバンドが検出され、
ｏｒｆ２コード領域の分裂したコピーの存在を確認した。

【００７９】Ｂ．セレアスＵＷ８５におけるｚｍａＲ及びｏｒｆ２の挿入不活性の効果。ゼ
ッターマイシンＡの生合成及びゼッターマイシンＡの耐性におけるｚｍａＲ及び
ｏｒｆ２のさらなる役割を調査するために、各々の野生型コード領域が欠損を有
する変異型対立遺伝子と置換えられ、及び抗生物質耐性コード領域はプラスミド
ＤＮＡの相同性組換えによってＵＷ８５ゲノムに組み入れられた。サザンブロッ
ティング解析が、ΔｚｍａＲ及びΔｏｒｆ２変異体のゲノム構造を確認し、変異
体は成長し、普通に胞子を形成したのが分かった。ＵＷ８５ΔｚｍａＲは、ゼッ
ターマイシンＡに感受性で、ＵＷ８５Δｏｒｆ２はゼッターマイシンＡに耐性で
あることが、ラジアル・ストリーク・アッセイ（ｒａｄｉａｌｓｔｒｅａｋ
ａｓｓａｙ）で分かった。エルウィニア・ヘルビコラの阻害のプレートアッセイ
及び培養上清液からのゼッターマイシンＡの直接分離によって示されたように、
ＵＷ８５Δｏｒｆ２は、検出可能なゼッターマイシンＡの合成は行わず、一方Ｕ
Ｗ８５ΔｚｍａＲは、ゼッターマイシンＡを合成する（表３）。上記テストは、
ＵＷ８５における抗生物質の自己耐性の第２機能の存在を提示し、おそらく、上
記機能は細胞の内部からゼッターマイシンＡを速く取り除く流出ポンプであろう
。

【００８０】

【表３】ｚｍａＲがトランスのプラスミドｐＺＭＳ７に導入された時、ＵＷ８５Δｚｍ
ａＲのゼッターマイシンＡ耐性が破壊された（表３）。プラスミドベクターのｐ
ＨＴ３０４は、Ｂ．セレアスの感受性株におけるゼッターマイシンＡ耐性を与え
なかった（Ｍｉｌｎｅｒｅｔａｌ．，１９９６）。ｏｒｆ２がトランスの
プラスミドｐＯＲＦ２に導入された時、ＵＷ８５Δｏｒｆ２に合成するゼッター
マイシンＡを破壊した。ｐＨＴ３０４は、ＵＷ８５Δｏｒｆ２に合成するゼッタ
ーマイシンＡを破壊しなかった（表３）。ｚｍａＲがゼッターマイシンＡ耐性に
必要であり、ｏｒｆ２がゼッターマイシンＡ合成に必要であることをデータが示
している。

【００８１】実施例３Ｂ．セレアスＵＷ８５及びＵＷ８５ΔｚｍａＲにおけるｚｍａＲの発現。ｐＺ
ＭＧ４を有するＥ．コリＤＨ５αＦ´ＩＱ株の５００ｍＬの培養液が０．５から
０．６の吸光度（６００ｎｍにおいて）にてアンピシリン及びカナマイシンを有
するＬＢ培地で培養された。ＩＰＴＧ（１ｍＭ）が添加され、細胞は３時間培養
された。細胞は、遠心分離によって集められ、５０ｍＬの５０ｍＭトリス（ｐＨ
８．０）、２ｍＭＥＤＴＡバッファーにて再懸濁化された。０．６ｍｇのリソザ
イム及び２．５ｍＬの１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００をサンプルに添加後、サンプ
ルは３０℃で１５分間インキュベートされた。前述のように、細胞は超音波処理
によって分裂し、また、封入小体は最初に精製された（Ｍｉｌｎｅｒｅｔａ
ｌ．，１９９６）。封入小体は、さらに尿素濃度を上昇しながら洗浄を繰り返
すことによって精製され、結果として、５ｍＬの８Ｍ尿素、１％ＳＤＳ、２０ｍ
Ｍトリス−酢酸塩ｐＨ８．０になった。５ＸＳＤＳサンプルバッファーを添加し
た後、サンプルは、マイナス２０℃にて保存された。封入小体は、さらに１２％
に調製されたポリアクリルアミドゲルにて、標準方法により調製され、電気泳動
されて精製された（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）。タンパク質は、ゲルを塩化
第二銅（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，１９９０）にて染色することにより可視化でき
、４３．５ｋＤａのタンパク質がゲルから切り出せ、４℃にて保存した。タンパ
ク質は、非方向性電気溶出器を使用し、マニュアルに従ってゲルから電気溶出し
た（ＩＢＩ、ＮｅｗＨｅａｖｅｎ，ＣＴ）。タンパク質濃度及び２０ｍＭトリ
ス（ｐＨ８．０）へのバッファー交換は、ＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓＭＷＣＯ１０
及びＣｅｎｔｒｉｃｏｎ１０カラム（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖ
ｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用して超濾過によって達成される。タンパク質濃度は、
ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃａｃｉｄａｓｓａｙ（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍ
ｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって測定される（Ｓｍｉｔｈ
ｅｔａｌ．，１９８５）。

【００８２】抗ＺｍａＲポリクローナル抗血清の合成。２０ｍＭトリスｐＨ８．０（０．５
ｍＬ）にて精製されたＺｍａＲタンパク質（３５０ｍｇ）をフロインドアジュバ
ンドで混合し、ウサギへ皮内に注射する。ウサギは、毎月３５０ｍｇの精製した
タンパク質で刺激され、毎刺激２週間後、耳の静脈血管から採血された。血清は
４℃にて遠心分離（９，８００Ｘｇ、１０分間）され、血球細胞を除去され、１
ｍＬずつ分注され、マイナス２０℃にて凍結された（ＨａｒｌｏｗａｎｄＬ
ａｎｅ，１９８８）。免疫血清は、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）を有するＥ．コリＤ
Ｈ５αＦ´ＩＱ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）及び
標準方法（ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，１９８８）によって調製された
Ｂ．セレアスＵＷ０３０の細胞の抽出から調製されたアセトン粉末にあらかじめ
吸着された。

【００８３】Ｂ．セレアスから全タンパク質の分離。３ｍＬの培養液が、遠心分離（１６，
０００Ｘｇ、５分間）によってペレットにされ、上清が除去された。ペレットを
、２００ｍＬのタンパク質抽出バッファー（１０ｍＭトリスーＣｌ（ｐＨ８．０
）、１００ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＤＴＴ，１％ＳＤＳ）で再溶解し、５０ｍ
Ｌの０．１ｍｍシリカビーズを添加し、サンプルを室温で４分間攪拌した。サン
プルを４℃にて遠心分離（１４，０００Ｘｇ、５分間）して、５ＸＳＤＳタンパ
ク質サンプルバッファーを１００ｍＬのサンプル上清に添加し、次いで、サンプ
ルはマイナス２０℃にて保存した。１０ｍＬのサンプルの上清は、Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙ（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用してタンパク質濃度の測定に用いられた
。

【００８４】ウェスタンブロッティング解析。オーバーナイトで培養したＢ．セレアスＵＷ
８５及びＵＷ８５ΔｚｍａＲの培養の１／１００を新鮮な培地に２８℃にて振り
混ぜながら培養した。３ｍＬの培養を取り出し、培養６、１２、２４、４８、及
び７２時間後にペレットにした。全タンパク質が分離され、タンパク質の濃度が
上述のように決定された。すべてのＢ．セレアスのたんぱく質の２０ｍｇが１２
％に調製されたタンパク質ゲルの各々のレーンにロードされ、標準的な技術によ
って電気泳動された（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）。事前に染色されたマーカ
ー（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が、すべてのゲルに含まれて
いる。転写する前に、ゲルは、０．１％ＳＤＳが添加された転写バッファー（０
．０２５Ｍトリス，０．１９２Ｍグリシン、１０％メタノール）にて１０
分間平衡化される。ゲルは、０．４５ｍｍのポリビニリジンジフロライド（ＰＶ
ＤＦ）メンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｉｌｌｆｏｒｄ，ＭＡ）にＢｉ
ｏ−Ｒａｄｔｒａｎｓｆｅｒｃｅｌｌ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を用い
て３０Ｖ、４℃、オーバーナイトでブロットされた。ウェスタンブロッティング
は、下記の修正を採用したＥＣＬＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇｐｒｏ
ｔｏｃｏｌ（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｒ
ｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）に従って行われた。ブロットは、ブ
ロッキング溶液（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ（ｐＨ７．６
），０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）に溶解したＣａｒｎａｔｉｏｎｐｏｗｄ
ｅｒｅｄｍｉｌｋ（ＮｅｓｔｌｅＦｏｏｄＣｏｍｐａｎｙ，Ｇｌｅｎｄ
ａｌｅ，ＣＡ）の５％溶液２５ｍＬを３４℃で１時間のブロッキング操作を行
った。抗ＺｍａＲ１次抗体及びホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ウサ
ギ２次ＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）はブロッキング
溶液にて５，０００倍希釈され、３４℃で１時間インキュベートされた。すべて
の洗浄は、室温で行われた。

【００８５】ゼッターマイシンＡの合成及びゼッターマイシンＡ耐性のアッセイ。記述のよ
うに高電圧ペーパー電気泳動（ＨＶＰＥ）に続くＣＭＳＥＰ−ＰＡＫカートリ
ッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用い陽イオン交換クロマトグラフィーによってＢ
．セレアスＵＷ８５及びＵＷ８５由来の作られた変異体胞子の培養液の上清にゼ
ッターマイシンＡは確認された（Ｍｉｌｎｅｒｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４３：６８５−６９１（１９
９５））。ゼッターマイシンＡの合成はまた、エルウィニア・ヘルビコラＬＳ０
０５株（Ｓｉｌｏ−Ｓｕｈｅｔａｌ．，１９９４）の阻害を測定する修正
した方法で０．１％ＴＳＡプレートを用い、プレート生物検定にて試験され、阻
害された領域の有無を測定する前に、プレートは２８℃で２４時間インキュベー
トされた。Ｅ．コリ株及びＢ．セレアス株のゼッターマイシンＡ耐性の表現型は
、記載のように各々の微生物からそれぞれ１００ｍｇ及び３００ｍｇのゼッター
マイシンＡを１００ＭＨ８．１寒天を用いてラジアル・ストリーク・アッセイに
よって行われた（Ｍｉｌｎｅｒｅｔａｌ．，１９９６）。

【００８６】Ｂ．セレアスＵＷ８５及びＵＷ８５ΔｚｍａＲにおけるｚｍａＲの発現。Ｂ．
セレアスＵＷ８５及びＵＷ８５ΔｚｍａＲにおけるｚｍａＲの発現の傾向を判断
するために、サザンブロット解析を行った。ｚｍａＲのヌクレオチド配列及びＥ
．コリにおけるＺｍａＲの発現（Ｍｉｌｎｅｒｅｔａｌ．，１９９６）か
ら、ＺｍａＲは４３．５ｋＤａのタンパク質として電気泳動することが予測され
た。ＵＷ８５の細胞抽出から、４３．５ｋＤａのバンドが検出されたが、ｚｍａ
Ｒを欠損した変異体であるＵＷ８５ΔｚｍａＲにおいては検出されなかった。ゲ
ノムの大量な欠損がｚｍａＲも含む変異型であるＵＷ０３０（表１）の細胞抽出
からは、バンドは全く検出されなかった。結果から、４３．５ｋＤａのバンドは
、ＺｍａＲによるものであると結論できる。ＺｍａＲの発現は、指数増大期の到
着点である１２時間後のＵＷ８５にて観察された。上記バンドの発現は、時間が
経つにつれて増大し、４８から７２時間後に最大の発現を示した（図４）。興味
深いことに、ＵＷ８５の培養にリン酸塩と鉄を加えると、それぞれ、ゼッターマ
イシンＡの抑制と増加を示し（Ｍｉｌｎｅｒｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４３：６８５−６９１（１９９
５））、それらは、抗生物質の生合成のコード領域と抗生物質自己耐性コード領
域の間に異なる調節の多数のレベルがあるかもしれないと示唆するＺｍａＲの発
現に効果があるようには見えなかった。

【００８７】実施例４Ｂ．セレアス変異体の合成。

【００８８】バチルスの置換可能な要素を用いたＢ．セレアス変異体の合成。プラスミドｐ
ＥＧ９２２（Ｂａｕｍ，Ｊ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１７６，２８３５−２８４５
（１９９４））は、バチルス・セレアス１０１Ｃ株にＳｉｌｏ−Ｓｕｈｅｔ
ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｒｃｏ．，６０，２０２３−２０
３０（１９９４）の方法を用いて形質転換された。プラスミドｐＥＧ９２２は、
グラム陽性の複製オリジン及びＴｎ５４０１の置換可能な要素を含むシャトルベ
クターである。バチルス・セレアス１０１Ｃ株は、Ｔｎ９１７を突然変異させ、
常在のプラスミドｐＢＣ８５を欠損させたバチルス・セレアスＵＷ８５の派生物
である。Ｓｉｌｏ−Ｓｕｈ，Ｌ．Ａ．，Ｐｈ．Ｄ．ｔｈｅｓｉｓ（１９９
４）。

【００８９】形質転換体は、テトラサイクリンを１０μｇ／ｍｌ含む半強度のＴＳＡ寒天倍
地にて選択された。プラスミドの調製は、選択された１０１Ｃ形質転換体におけ
るｐＥＧ９２２の存在を確かめることで行われた。１０１ＣにＴｎ５４０１変異
体を合成するために、ｐＥＧ９２２を有する１０１Ｃの個々のコロニーが、テト
ラサイクリンを１０μｇ／ｍｌ含む半強度のＴＳＢ寒天倍地に植付け、２８℃、
オーバーナイトで培養された。

【００９０】上記オーバーナイトの培養は、次いでＴＳＢ倍地に１００倍希釈にて培養され
、４２℃にて振動させながら６から８時間培養を行った。上記培養は、次いで水
にて１００倍希釈され、１００μｌずつに分注した希釈した培養液は、次いでテ
トラサイクリンを１０μｇ／ｍｌ含む半強度のＴＳＡ寒天倍地にプレートされた
。上記プレートは、４３℃、オーバーナイトにてインキュベートされた。オーバ
ーナイトのインキュベート後、大小のコロニーが観察された。個々の大きなコロ
ニーは、テトラサイクリンを１０μｇ／ｍｌ含む半強度のＴＳＡ寒天倍地プレー
ト及びクロラムフェニコールを１０μｇ／ｍｌ含む半強度のＴＳＡ寒天倍地プレ
ートに植え付けられた。植え付けられたプレートは、２８℃にてオーバーナイト
でインキュベートされた。次いで、テトラサイクリンのプレートは４℃に置き成
長を遅らせ、クロラムフェニコールのプレートは室温にて２４時間インキュベー
トされた。クロラムフェニコール感受性及びテトラサイクリン耐性コロニーは、
Ｔｎ５４０１挿入部位を含むことをサザンブロット解析にて確かめた。上記成長
を強いた各々の培養から、２４若しくは４８個のＴｎ５４０１変異体が合成され
た。同一の培養液から取り出した１８個の変異体のサザンブロット解析は、各々
の変異体が唯一１つの挿入を含み、上記挿入体の変異体におけるゲノムの位置が
異なることを示した。上記プロトコールを採用して、バチルス・セレアス１０１
Ｃ株の４８００Ｔｎ５４０１変異体が合成された。

【００９１】ゼッターマイシン合成のためのバチルス・セレアス変異体のスクリーニング。
各変異体は、ゼッターマイシン合成の指標であるエルウィニア・ヘルビコラを阻
害する能力に基づいてスクリーニングされた。各々の変異体は、テトラサイクリ
ンを１０μｇ／ｍｌ含む半強度のＴＳＢ寒天倍地１ｍｌにて２８℃で３日間培養
された。おおよそ１０^５個のエルウィニア・ヘルビコラＬＳ００５株の細胞が、
１０００倍希釈ＴＳＡプレートにて観察された。６個の８ｍｍサイズのウェルが
、コルクボーラーを用いて各々の希釈されたＴＳＡプレートに打ち抜かれた。各
々のウェルに、１００μｌづつに分注した変異体の培養液をピペットで注入した
。各々のプレートにおいて、１つのウェルをコントロールとしてＢ．セレアスＵ
Ｗ８５を使用した。プレートは、各々のウェルにおけるエルウィニア・ヘルビコ
ラの阻害領域が測定された後に、２８℃にて２日間置かれた。下記の表は、変異
体の認証番号及び領域の大きさを含んだ結果を示している。

【００９２】

【表４】上記のデータの結果から、９つの変異体がわずかな阻害を有したか、若しくは
エルウィニアの成長に対して全く阻害を表さなかった。例えば、上記変異体の阻
害領域は、コントロール（ＵＷ８５）の阻害領域よりも小さい。しかしながら、
驚くべきことに、１つの変異体（Ｎｏ．５６．３４）はエルウィニアの成長を大
きく阻害し、コントロールよりも約２倍のゼッターマイシン合成を示している。

【００９３】Ｂ．セレアス変異体のシークエンス解析。上記に示された１０の変異体のサザ
ンブロット解析は、各変異体が１つの挿入を含み、上記各々の挿入が異なったゲ
ノムの位置にあることを示した。各々の変異体からトランスポソン挿入及びフラ
ンキングＤＮＡのクローンニングするために、プラスミドｐＵＣ１８が採用され
た。各変異体のゲノムＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，
ＣＡから市販されているキット添付のプロトコールに従って調製された。調製さ
れたゲノムＤＮＡは、次いで、トランスポゾンの配列内を消化しないと信じられ
ているＰｓｔＩ制限酵素によって消化された。ＰｓｔＩによって消化されたＤＮ
Ａは、ｐＵＣ１８のＰｓｔＩ部位に連結された。連結された混合物は、大腸菌Ｄ
Ｈ５の受容細胞にエレクトロポレ−ションされ、形質転換細胞は、５μｇ／ｍｌ
のテトラサイクリンを含んだＬＢ寒天培地にて選択された。上記方法を用いて、
トランスポゾン及びフランキングＤＮＡが５つの変異体１１．３５、３２．１８
、５６．３４、６４．２７、及び８９．３としてクローンを作成した。ＰＣＲシ
ークエンシングが、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎＢｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒによって合成されたプライマーを用いて行
われた。プライマーの設計において、トランスポゾンＴｎ５４０１の両末端にＴ
ｎ５４０１の独特なＨｐａＩ部位を読み込んで、下記の対にて使用した。

【００９４】Ｐ１ＧＧＴＣＴＴＣＴＧＡＡＴＣＧＡＡＧＡＡＣＣ（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：
３８）とＰ３ＧＧＡＧＴＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＴＧＣＣ（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３９
）並びにＰ２ＣＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＧ（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ
：４０）とＰ４ＣＣＡＣＣＴＧＣＧＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＧＧ（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：
４１）Ｐ１及びＰ２は、Ｔｎ５４０１の末端に対して相補的で、Ｐ３及びＰ４は、Ｔ
ｎ５４０１の内部のＨｐａＩ部位である独特な領域周辺と相補的である。各変異
体のゲノムＤＮＡは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡのＴ
ａｑＰｌｕｓロングポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅の鋳型として使用され
た。ＰＣＲの条件は、まず最初に９５℃で３分間温め、続いて９５℃を３０秒間
、５５℃を３０秒間、７２℃を５分間を３０回行った、又、最後の伸長は７２℃
を７分間でもありえる。各５つの変異体にとって、少なくともＰＣＲ産物が得ら
れた。変異体５２．６及び７８．２４にとって、唯一のＰＣＲ産物は、Ｐ２−Ｐ
４プライマーセットから得られた。変異体９６．３、１０１．１９、及び１２０
．４は、ＰＣＲ産物はプライマーセットＰ１−Ｐ３及びＰ２−Ｐ４から得られた
。

【００９５】ＰＣＲ産物は、ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡから市
販されている商標ＱＩＡＱＵＩＣＫＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉ
ｔ精製キットを使用して反応混合物から精製された。次いで、配列情報を得るた
めに、精製されたＰＣＲ産物を鋳型とするサイクルシークエンシングを行い、余
分でないＧｅｎＢａｎｋ配列と比較し、変異体１１．３５，３２．１８、５２．
６、５６．３４、６４．２７、７８．２４、８９．３、９６．３、１０１．１９
、及び１２０．４のＢＬＡＳＴ結果を示す。下記の表は、ＢＬＡＳＴによって確
認された各変異体の相同性を表す。

【００９６】

【表５】Ｂ．セレアス変異体のバイオコントロール効果の評価。シュミレーションされ
た植物の成長環境における病原体の成長を阻害するＢ．セレアス変異体の効果が
評価された。植物の種子及び植物病原体は、例えば、土壌、バーミキュライトの
ような栽培環境、若しくは種子から植物の成長を支持する他の媒体に適用できる
。バイオコントロール剤は、栽培するための媒体に適用でき、媒体中の存在％が
評価される。媒体の表面から出現したバイオコントロール剤に対して算出された
全種子の比率が計算されるのが一般的であり、存在可能な植物の生成を示す。コ
ントロールは、一般的に、バイオコントロール剤無し（例えば、種子と植物病原
体）、Ｂ．セレアスＵＷ８５（ポジティブコントロール）、及びＢ．セレアス１
０１Ｃ株（ｐＢＣ８５の改良であるＵＷ８５由来）を含む。グラフに示されてい
るように、変異体５６．３４の出現率は、ポジティブコントロール（ＵＷ８５標
識）の出現率と比較可能であった。

【００９７】すべての特許、特許の適用、出版物、及び核酸断片、並びに、例えばＧｅｎＢ
ａｎｋのアクセス番号及びＥＭＢＬのアクセス番号を含むタンパク質データベー
スエントリーの完全な開示は、ここに引用され、あたかも個々に関連するかのよ
うに参照によって関連づけられる。本発明の様々な修正及び改変が、本発明の特
許請求の範囲及び目的に関わらず当業者には明白であり、本発明は、ここで例証
した実施態様に限ったことではない。

【００９８】シークエンスリストの詳細な説明ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１は、ｚｍａＲ，ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、及びｏｒｆ３を
含む３．９ｋｂ長のＤＮＡ領域のヌクレオチドの配列である。ｚｍａＲ，ｏｒｆ
１、ｏｒｆ２、及びｏｒｆ３の場所は、注意されるべく特徴のある分野にあり、
様々な制限酵素認識部位、推定されるリボソーム結合部位、及びｏｒｆ２内のア
クリルトランスフェラーゼ（ＡＴ）活性部位の装飾部分などである。

【００９９】推論されたｚｍａＲ，ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、及びｏｒｆ３のアミノ酸配列は、
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯＳ：４２＆４３（各々が、ｏｒｆ１遺伝子及びＯｒｆ１タン
パク質）、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯＳ：４４＆４５（各々が、ｏｒｆ２遺伝子及びＯ
ｒｆ２タンパク質）、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯＳ：４６＆４７（各々が、ｏｒｆ３遺
伝子及びＯｒｆ３タンパク質）、及びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯＳ：４８＆４９（各々
が、ｚｍａＲ遺伝子及びＺｍａＲタンパク質）に存在する。

【０１００】ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯＳ：２−２５は表２記載のＰＣＲプライマーである。

【０１０１】ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２６は、１１．３５として設計されたＢ．セレアス変異
体である。

【０１０２】ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２７は、３２．１８として設計されたＢ．セレアス変異
体である。

【０１０３】ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２８は、５２．６として設計されたＢ．セレアス変異体
である。

【０１０４】ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２９は、５６．３４として設計されたＢ．セレアス変異
体である。

【０１０５】ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３０は、６４．２７として設計されたＢ．セレアス変異
体である。

【０１０６】ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３１は、７８．２４として設計されたＢ．セレアス変異
体である。

【０１０７】ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３２は、８９．３として設計されたＢ．セレアス変異体
である。

【０１０８】ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３３は、９６．３として設計されたＢ．セレアス変異体
である。

【０１０９】ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３４は、１０１．１９として設計されたＢ．セレアス変
異体である。

【０１１０】ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３５は、１２０．４として設計されたＢ．セレアス変異
体である。

【０１１１】ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３６は、植物の一般的な転写開始配列である。

【０１１２】ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３７は、植物の他の一般的な転写開始配列である。

【０１１３】ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯＳ：３８−４１は、Ｂ．セレアス変異体のシークエンスに
使用されるＰＣＲシークエンシングプライマーである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｂ．セレアスＵＷ８５ゲノムの地図である。矢は、遺伝子の転写の方
向を示している。制限部位は、下記の略語で示されている：ＲＩ＝ＥｃｏＲＩ、
Ｓｐ＝ＳｐｈＩ、Ｂａ＝ＢａｍＨＩ、ＢＩ＝ＢｌｐＩ、Ｂｇ＝ＢｇｌＩＩ、ＲＶ
＝ＥｃｏＲＶ、及びＳａ＝ＳａｌＩ。

【図２】図２は、ｚｍａＲの挿入不活性を示すｐΔｚｍａＲの地図を示している。点線
は、削除されたＤＮＡを示す。Ｓｐｒは、プラスミドがスペクチノマイシン耐性
を有することを明示する。他の略語は、図１と同様である。

【図３】図３は、ｏｒｆの挿入不活性を示すｐΔｏｒｆ２の地図を示している。点線は
、削除されたＤＮＡを示す。他の略語は、図１及び２と同様である。

【図４】図４は、Ｂ．セレアスＵＷ８５におけるｚｍａＲとＵＷ８５ΔｚｍａＲのゲル
で電気泳動した結果を示す。ＵＷ８５とＵＷ８５ΔｚｍａＲの培養は、５０％Ｔ
ＳＢ中において行われた。３．０ｍＬ培養液の時間的観察は、６、１２、２４、
４８、及び７２時間後に行われた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、１レーンに
はそれぞれ２０μｇの全タンパク質を含んで電気泳動させ、タンパク質は、ＰＶ
ＤＦ膜に転写させ、続いてＥＣＬキットを用いてウェスタンブロッティング解析
を行った。ゼッターマイシンＡの合成は、４８時間後において最初に検出された
。ゼッターマイシンＡの検出限界は、０．３３μｇ／ｍＬである（Ｍｉｌｎｅｒ
ｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．４３：６８５−６９１（１９９５））。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 9/00 ４Ｈ０１１ 9/00 Ａ０１Ｎ 47/28 Ｚ４Ｈ０４５ // Ａ０１Ｎ 47/28 63/02 Ｅ 63/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:085 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:085） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ミルナー，ジョセリンエルアメリカ合衆国ウィスコンシン州 53705 マディソンメイソン・ストリート 2731 (72)発明者ストール，エリザベスエイアメリカ合衆国イリノイ州 60622 シカゴウェスト・アイオワ・ストリート 2215 アパートメント３Ｆ (72)発明者エマート，エリザベスエイアメリカ合衆国ウェストヴァージニア州 26201 バックハノンエス・フロリダ・ストリート 140 ３号Ｆターム(参考） 2B030 AD05 CA15 CA17 CA19 4B024 AA07 AA08 BA07 BA80 CA04 DA05 DA11 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA20 4B050 CC03 DD02 EE10 LL10 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA12 4B065 AA01X AA16Y AA57X AA88X AA90X AB01 AB04 BA01 BA08 CA24 CA25 CA27 CA47 CA53 4H011 AA01 BB14 BB21 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA11 DA76 DA89 EA05 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ゼッターマイシンＡの生合成に必要な少なくとも１つのポリ
ペプチドをコード化した核酸断片から成る分離した核酸分子であって、該核酸断
片は、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４３，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４５，及びＳＥＱ．Ｉ
Ｄ．ＮＯ：４７からなるグループから選択されるポリペプチド配列をコード化す
る特徴を有する分離された核酸分子。
【請求項２】ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４２，ＳＥ
Ｑ．ＩＤ．ＮＯ：４４，及びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４６から構成されるグループ
から選択される核酸から成る請求項１の分離された核酸分子。
【請求項３】ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４２，ＳＥ
Ｑ．ＩＤ．ＮＯ：４４，及びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４６からなるグループから選
択する核酸でのみ構成する請求項１の分離された核酸分子。
【請求項４】前記核酸のプローブが、請求項１の核酸断片と相補的で、Ｓ
ＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１に４０℃のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイ
ズし、次いで６５℃の０．５ＸＳＳＣで洗浄する請求項１の分離された核酸分子
。
【請求項５】前記核酸断片がバチルス・セレアスのゲノムから分離される
特徴を有する請求項１乃至３のうち、いずれか１つの分離された核酸分子。
【請求項６】前記分子がベクターである特徴を有する請求項１乃至３のう
ち、いずれか１つの分離された核酸分子。
【請求項７】前記ベクターが、プラスミドベクター、ウィルスベクター、
コスミドベクター、及び人工的染色体ベクターからなるグループから選択される
特徴を有する請求項６のベクター。
【請求項８】請求項１乃至７のうち、いずれか１つの分離された核酸分子
を含み発現する形質転換した宿主生物。
【請求項９】前記宿主生物が、細菌細胞若しくは菌類細胞である特徴を有
する請求項８の宿主細胞。
【請求項１０】エルウィニア・ヘルビコラの阻害領域が野生型によって示
されるよりも多いアミノポリオール抗生物質を合成する特徴を有し、変異型核酸
断片から成る遺伝子工学的改変微生物。
【請求項１１】前記アミノポリオール抗生物質が、野生型よりも２倍多く
合成される特徴を有する請求項１０の遺伝子工学的改変微生物。
【請求項１２】前記アミノポリオール抗生物質が、ゼッターマイシンＡで
ある請求項１０の遺伝子工学的改変微生物。
【請求項１３】前記微生物が、バチルス属である請求項１０の遺伝子工学
的改変微生物。
【請求項１４】前記核酸断片がＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２９からなる請求項
１０の遺伝子工学的改変微生物。
【請求項１５】前記アミノポリオール抗生物質の生合成に必要な少なくと
も１つのポリペプチドをコード化するコード領域からなるトランスジェニック核
酸断片から成るトランスジェニック植物であって、該トランスジェニック核酸分
子が該トランスジェニック植物内で該アミノポリオール抗生物質を直接発現する
特徴を有するトランスジェニック植物。
【請求項１６】前記アミノポリオール抗生物質が、前記ゼッターマイシン
Ａである請求項１５のトランスジェニック植物。
【請求項１７】前記トランスジェニック核酸断片が、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ
：４３，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４５，及びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４７からなるグ
ループから選択されるポリペプチド配列をコード化する特徴を有する請求項１５
のトランスジェニック植物。
【請求項１８】前記トランスジェニック核酸断片に機能的に関連する損傷
を誘発するプロモーターを有する請求項１５乃至１７のうち、いずれか１つのト
ランスジェニック植物。
【請求項１９】前記トランスジェニック核酸断片が、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ
：１，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４２，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：４４，及びＳＥＱ．Ｉ
Ｄ．ＮＯ：４６からなるグループ及び上記配列の組み合わせから選択される核酸
断片から構成される特徴を有する請求項１５乃至１８のうち、いずれか１つのト
ランスジェニック植物。
【請求項２０】相補的にＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１と４０℃でハイブリダイ
ズし、次いで６５℃の０．５ＸＳＳＣにて洗浄される核酸断片によってコード化
されるアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列からなる前記アミノポリオ
ール抗生物質の生合成を含むポリペプチド。
【請求項２１】前記アミノポリオール抗生物質が、前記ゼッターマイシン
Ａである請求項２０のポリペプチド。
【請求項２２】請求項８乃至１４のうちいずれか１つにより構成される微
生物を土壌に適用し植物病原体を制御する方法。
【請求項２３】請求項８乃至１４のうちいずれか１つによりトランスジェ
ニック宿主生物を培養することからなるゼッターマイシンＡを合成する方法。
【請求項２４】相補的にＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１と４０℃でハイブリダイ
ズし、次いで６５℃の０．５ＸＳＳＣにて洗浄される核酸断片によってコード化
されるアミノ酸配列の少なくとも一部のアミノ酸配列からなる前記アミノポリオ
ール抗生物質の生合成を含むポリペプチドに結合する抗体。
【請求項２５】前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、
及び抗体断片からなるグループから選択される請求項２４の抗体。
【請求項２６】前記抗体が、ウサギ、マウス、ヤギ、及びラットからなる
グループから選択される動物から得られる請求項２４若しくは２５のうち、いず
れかの抗体。