JPH09510876A - 形質転換真核細胞の選択方法及びそれを用いて得られた細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ストレプトトリシン又はその類似体に対して耐性のある真核動物又は植物細胞若しくはクラスターの製造方法であって、前記真核細胞を、適当な向きに置かれたストレプトトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ−ＤＮＡ）をコードするＤＮＡ配列を含有するストレプトトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）をコードする外生ＤＮＡ配列、および前記細胞中での前記ＳＡＴ−ＤＮＡ配列の発現を制御する要素をコードする一つ以上のＤＮＡ配列を含有するプラスミドにより形質転換する工程と、形質転換後にストレプトトリシン又はその類似体に耐性のある細胞を選択する工程と、を含んでなる方法。

Description

【発明の詳細な説明】 形質転換真核細胞の選択方法及びそれを用いて得られた細胞 本発明は、とりわけ形質転換真核、特に動物又は植物細胞の新規な選択方法に 関する。 本発明は、形質転換植物組織の選択においてストレプトトリシン、特にストレ プトトリシンアセチルトランスフェラーゼ、を不活性化できるタンパク質をコー ドする遺伝子の使用に関する。 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｖｅｎｄｕｌａｅから単離されたストレプト トリシンは、抗菌剤である。これらは、グルコサミン、ストレプトリジン及びβ −リジンのペプチド鎖により表される３つの領域からなる。この鎖の長さは、１ 〜７残基で変化し、ストレプトトリシンＡ、Ｂ、Ｃ等の型を特性付ける（Ｋｈｏ ｋｌｏｖ及びＳｈｕｔｏｖａ、１９７２；Ｃａｒｔｅｒ等、１９５２）。この種 の抗生物質は、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方、特に腸内細菌に対して、静 菌作用と殺菌作用の両方を有している。この種の抗生物質は、３０リボソームサ ブユニットに結合して、タンパク質合成を阻害する。 家畜の飼料にストレプトトリシンを使用後、この抗生物質に対して耐性のあるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの菌株が単離された。ほとんどの場合におい て、このストレプトトリシン耐性は、ストレプトトリシンアセチルトランスフェ ラーゼ（ＳＡＴ）と称する特異的アセチルトランスフェラーゼをコードする異な る適合性（ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）基のプラスミドにより保持されている ことが判明した。リジン残基のアミン基にアセチル化されたストレプトトリシン は、不活性である。 ２つの遺伝子sａｔ１及びsａｔ２が特性付けされている（Ｔｉｅｔｚｅ等、 １９８８）。これらは、それぞれトランスポソンＴｎ７に関連するトランスポソ ンＴｎ１８２５及びＴｎ１８２６に由来のものである。これらの２つの遺伝子の ヌクレオチド配列が決定された（Ｈｅｉｍ等、１９８９；Ｔｉｅｔｚｅ及びＢｒ ｅｖｅｔ、１９９０）。これらの２つの配列の間には、極めて高度の相同性があ る。 アセチルトランスフェラーゼストレプトトリシンをコードする別の遺伝子、ｓ ａｔ４も、特性付けされている（Ｊａｃｏｂ等、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．；１９９４、Ｊｕｌ １：１２０（１〜２）：１３〜７）。この遺 伝子は、インサートとしてｓａｔ４遺伝子を保持している組み換えプラスミドｐ ＡＴ１３２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中で検出された。 本発明の範囲において、ストレプトトリシンアセチルトランスフェラーゼをコ ードするがｓａｔ１又はｓａｔ２遺伝子と実質的に相同性を示さないｓａｔ３遺 伝子の存在が示された。 より詳細には、本発明は、ストレプトトリシン又はその類似体に対して耐性の ある単離されたか、又は他の形態の真核細胞の製造方法であって、 前記真核細胞を、適当な向きに置かれたストレプトトリシンアセチルトランス フェラーゼ（ＳＡＴ−ＤＮＡ）をコードするＤＮＡ配列を含むストレプトトリシ ンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）をコードするＤＮＡ配列、および前記 細胞中での前記ＳＡＴ−ＤＮＡ配列の発現を制御する要素をコードする一つ以上 のＤＮＡ配列のための発現ベクターを用いて形質転換する工程と、 形質転換後にストレプトトリシン又はその類似体に耐性のある細胞を選択する 工程と を含んでなる方法に関する。 「発現ベクター」は、ＳＡＴコードＤＮＡ配列の組み込み及び発現を可能とす る何れの系をも意味し、プラスミド型自己複製系であっても、ウイルス型又は裸 ＤＮＡ型組み込み系であってもよい。 本発明を実施するのに使用することができる形質転換法のうち、植物細胞につ いては、バイナリーベクター又は共組み込みベクターを有するＡｇｒｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓバクテリアを用いたいわゆる「アグロインフ ェクション（Ａｇｒｏ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」法か、いわゆる「ＤＮＡボンバ ードメント（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）」又は「バイオリステック（ｂｉｏｌｉ ｓｔｉｃ）」法が有利に使用でき、動物細胞については、レトロウイスルからの 配列が有利に使用できる。 ストレプトトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする配列のうち、 ａ）ｓａｔ１、ｓａｔ２及びｓａｔ３、ｓａｔ４遺伝子、 ｂ）前記遺伝子とハイブリダイゼーションし且つＳＡＴ活性を有するタンパク 質をコードするＤＮＡ配列、及び ｃ）配列ａ）及びｂ）からの縮重により得られ且つＳＡＴ活性を有するタンパ ク質をコードするＤＮＡ配列、 から選択された配列が最も特に好ましいことを規定することが重要である。 ｓａｔ３配列は、本明細書に記載されている。 ｓａｔ１配列は、とりわけＨｅｉｍ等、１９８９に記載されている。 ｓａｔ２配列は、とりわけＴｉｅｔｚｅ及Ｂｒｅｖｅｔ、１９９０に記載され ている。 ＳＡＴ−ＤＮＡ配列を、形質転換細胞中で機能する少なくとも一つのプロモー ターの制御下に配置する。このようなプロモーターの使用は実施例の主題である が、これらは、動物細胞か植物細胞かを問わず、真核細胞について当業者にとっ て公知である。 また、トランスポソンを用いた方法を想定することもできる。 本発明は、特に植物細胞に適用することを意図し、したがって、使用されるベ クターは、より詳細には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、とりわけＡ．ｔｕｍｅ ｆａｃｉｅｎｓ 又はＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ由来のベクターである。この技術 も、当業者に公知である。 また、本発明は、これらのストレプトトリシンアセチルトランスフェラーゼを コードする遺伝子の、単離されたか、分化したか、又は例えば、細胞懸濁液、細 胞凝集物、胚、組織又は植物の形態で存在する、形質転換細胞の選択マーカーと しての使用に関する。 また、本発明は、ストレプトトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードす る遺伝子の、植物プロモーターを取得のための選択マーカーとしての使用に関す る。前記遺伝子を、とりわけＴ−ＤＮＡの右領域と置き換えられたとき、植物か らプロモーターにより発現できることが実際に判明した。 しかしながら、ストレプトトリシンアセチルトランスフェラーゼの発現は唯一 の選択要素であること、及びほとんどの場合、さらに、形質転換に使用される遺 伝子構築物は、形質転換細胞及びそれに由来する形質転換組織、器官又は植物が 意図する形質、とりわけ植物細胞の場合には意図する農業上の形質の発現を可能 にする一組のＤＮＡ配列を含むことは明らかである。 勿論、ベクターにより担持できる意図する形質を余すところなく挙げることは できず、簡単に述べれば、作物に関してげっ歯類種の防除における一定の昆虫に 対する耐性、例えば一定の作物における雑草防除を容易にするための除草剤に対 する耐性、また、菌類病等の一定種類の病気又は天候条件に対する耐性が挙げら れる。さらに、ある活性成分又は二次代謝生成物含量の増加や、一定の植物が、 例えば窒素供給等の一定の供給物なしでもよいこと、又は一定植物の技術性又は 食品性の向上等の形質も挙げられる。 また、本発明は、本発明の方法により得られる細胞並びにこれらの細胞から再 生した組織培養又は植物に関する。 また、本発明は、 ａ）本明細書に記載のｓａｔ３配列、 ｂ）前記遺伝子とハイブリダイゼーションし且つＳＡＴ活性を有するタンパク 質をコードするＤＮＡ配列、及び ｃ）配列ａ）及びｂ）からの縮重により得られ且つＳＡＴ活性を有するタンパ ク質をコードするＤＮＡ配列、 から選択されたものであるストレプトトリシンアセチルトランスフェラーゼ（Ｓ ＡＴ−ＤＮＡ）をコードするＤＮＡ配列にも関する。 このｓａｔ３配列とｓａｔ１及びｓａｔ２の配列を比較すると、相同性のない ことがわかる。これは、以前実施された実験で、ｓａｔ３配列を一方とし、ｓａ ｔ１及びｓａｔ２配列を他方としたときに、これらの間にハイブリダイゼーショ ンがなかったことと一致する。ｓａｔ３は、分子量２０，３３５ダルトンを有す る１８０アミノ酸からなるタンパク質をコードしている。これらの３種の遺伝子 のアセチルトランスフェラーゼ活性はストレプトトリシンに特異的であり、クロ ルアンフェニコール、ゲンタマイシン、カナマイシン及びネオマイシン（Ｔｓｃ ｈａｅｐｅ等、１９８４）等の他の抗生物質に不活性である。 また、本発明は、ＳＡＴ−ＤＮＡ配列のためのクローニング及び発現ベクター だけでなく、プラスミドベクター、組み込みベクター、形質転換真核細胞（単離 又は分化されたもの）、又は本発明による方法を用いて得られた植物にも関する 。 本発明の他の特徴及び利点は、以下の実施例により明らかとなろう。 ストレプトトリシンの利点の一つに、多数の原核細胞及び真核細胞のそれらに 対する感受性にある。 上記した構築物の有効性を試験する前に、ストレプトトリシンに対する種々の 生物の感受性を調査した。例として、種々の細胞について判明した最適抑制濃度 を、表１に示す。最初から細胞分裂が完全になくなる最小濃度を、最適抑制濃度 とする。経験のある科学研究者は、この最適濃度は、当該細胞及び培養法により 異なり、そして最適濃度を新規な細胞の形質転換を実施する前に測定しなければ ならないことを理解するであろう。 本発明の用途をより明瞭に理解するために、以下に実験例を示す。これらの例 は、上記選択性マーカーの利点を説明するためのものであり、いずれの場合であ っても、このマーカーの唯一の可能な例であると解釈されべきではない。 添付図面において、 第１図は、構築物ｐＪＢＪ１０６のＢｇｌＩＩ〜ＢｇｌＩＩ断片を示し、この 断片は、以下の実施例で説明する形質転換に必須のＤＮＡセグメントを構成して いる。 第２図は、ｓａｔ３遺伝子が植物プロモーターを取得できるようにするプラス ミドｐＪＢＪ３３３を得るために作製した構成マップである。実施例１ 実験１ 遺伝子導入植物の選択におけるｓａｔ３遺伝子の使用についての試験に必須の 要素を組み合わせた構築物を、ベクターｐＫ１８（Ｐｒｉｄｍｏｒｅ、１９８７ ）を用いて作製した。このベクターに、種々のＤＮＡ断片を順次クローニングし た。最終的な構築物を、ｐＪＢＪ１０６と称する。この実験に必須のＢｇｌＩＩ 〜ＢｇｌＩＩ断片（４．７ｋｂ）のみを示す（第１図）。左側から右側の方向で 、Ｂｇ１ＩＩとＣｌａＩ部位との間に、ｐＲｉ２６５９（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎ ｅｓ ＮＣＰＰＢ２６５９キュキュモパイン（ｃｕｃｕｍｏｐｉｎｅ）プラスミ ド（Ｂｒｅｖｅｔ等、１９８８）のＴ−ＤＮＡの左側をカバーするＢｇ１ＩＩ− ＤｒａＩ断片がある。プラスミドｐＭＯＡ４（Ｂｒｅｖｅｔ等、１９８８）の消 化により得たこの断片は、ｐＲｉ２６５９のＴ−ＤＮＡの左端領域を含有してい る。ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＶ部位は、全てプラスミドＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の多クローニング配列（ＭＣＳ） から得られる。ＸｍｎＩとＳｓｔＩとの間に位置する配列は、プラスミドｐＢｉ １２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩ断片の形態で単離されたノ パリンシンターゼ（ｎｏｓ−ｔｅｒ）の未翻訳ターミネーターを含有している。 次に、クローニング部位としての役割を果たしたＥｃｏＲＩ部位を消化し、Ｋｌ ｅｎｏｗ酵素を充填して、ＸｍｎＩ部位を生成した。ＫｐｎＩ〜ＢａｍＨＩ 断片は、ｓａｔ３遺伝子のコード配列を含有している。この断片は、プラスミド ｐＩＥ９２８（Ｔｉｅｔｚｅ等、１９８９）由来のＳｓｐＩ〜ＨｉｎｄＩＩ断片 をｐＫ１８（Ｐｒｉｄｍｏｒｅ、１９８７）のユニークＳｍａＩ部位にクローニ ングすることにより構築されるプラスミドｐＪＢｓａｔ３から得られる。Ｈｉｎ ｄＩＩ〜ＢａｍＨＩ消化に続いてプラスミドｐＢｉ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ） から抽出したＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの配列は、ＢａｍＨＩ部位とＳｐｅ Ｉ部位との間の構築物ｐＪＢＪ１０６に含有される。続いてのＳｐｅＩ〜Ｅｃｏ ＲＩ断片は、プラスミドｐＭＯＡ９（Ｂｒｅｖｅｔ等、１９８８）由来のプラス ミドｐＲｉ２６５９のＴ−ＤＮＡの右部からなる。この断片は、キュキュモパイ ンの合成のための機能遺伝子全体だけでなく、反復配列を有するＴ−ＤＮＡの右 端領域も含有している（Ｈａｎｓｅｎ等、１９９２）。ＥｃｏＲＩとＢｇ１ＩＩ との間の部分は、ベクタープラスミドｐＫ１８の一部分である。次に、２つの末 端Ｂｇ１ＩＩ部位の間の断片全体を、ｐＢｉｎ１９（Ｂｅｖａｎ、１９８４）の ＢｇｌＩＩ〜ＢｇｌＩＩセグメントにライゲーションした。 ｐＢｉｎ１９は、プラスミドＲＫ２由来の広範な宿主スペクトルプラスミドの複 製起点を含有し且つバクテリア選択性マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を 有している。後者の構築物は、ｐＪＢＪ３０２と称される。 プラスミドｐＪＢＪ３０２を、マンノパインプラスミドｐＲｉ８１９６（Ｃｈ ｉｌｔｏｎ等、１９８２）を有するＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの菌株にエレクト ロポレーションにより導入し、形質転換細胞を、カナマイシン（Ｋｍ）１００ｍ ｇ／ｌ添加したリッチアガー培地を用いて選択した。形質転換体を、唯一の炭素 源としてのマンノパインとカナマイシン（１００ｍｇ／ｌ）とを添加した合成ア ガー培地で培養した。クローンを選択し、そのプラスミド含量を、Ｋａｄｏ法（ Ｋａｄｏ及びＬｉｕ、１９８１）によるミニ抽出（Ｋｍ添加リッチ培地での２８ ℃一晩培養５ｍｌ）（但し、Ｒｉプラスミドの破壊を最小限とする ために３７℃で実施）した後、アガロースゲル電気泳動により確認した。このプ ラスミドｐＲｉ８１９６は、「毛根」型の根の形成を誘発するＴ−ＤＮＡのドナ ーとしての役割りを果たすとともに、バイナリーベクターにより担持されるＴ− ＤＮＡ構築物の転移に必要なＶＩＲ機能を提供する。これらの２つのプラスミド を担持するバクテリアは、植物に接種したときに、「毛根」Ｔ−ＤＮＡと第二プ ラスミドに担持された意図するものとの両方を含有する二重形質転換根の分化を 生じさせることができる。このクローンを使用して、ニンジンのディスクに接種 した（Ｐｅｔｉｔ等、１９８３）。２〜３週間後、「毛根」型根が現れる。次に 、これらをニンジンのディスクから切除し、暗所において、成長ホルモンを含有 せず且つバクテリアの成長を抑制するためにセファロスポリン（２５０ｍｇ／ｌ ）を添加したＭＳスクロース（３０ｇ／ｌ）（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏ ｇ、１９６２）アガー培地で２５℃の温度で培養した。この培地で、根は２４時 間で２〜５ｍｍ成長し、且つ多数の分枝を示す。これらの根は細胞クローンを構 成することが公知である（Ｄａｖｉｄ等、１９８４）。根（長さ約１．５ｃｍ） を、ストレプトトリシン（１００ｍｇ／ｌ）添加又は含有固形ＭＳスクロース培 地に移植した。ｐＲｉ８１９６からのＴ−ＤＮＡのみを含有する根は２４時間の 間低成長であり、成長が停止した。ストレプトトリシン非含有培地に置き換えて も、成長は回復せず、抗生物質の作用が不可逆性であることが分かる。一方、一 部の根は、ストレプトトリシン添加培地と抗生物質非含有培地の両方で実質的な 成長を示した。これらの根は、ｓａｔ３遺伝子を含有する構築物を組み込んだと 考えられた。実質的に７０〜８０％の根はストレプトトリシンの存在下で成長で きることが判明した。この結果は、前記した観察とよく一致している（Ｐｅｔｉ ｔ等、１９８６）。 ストレプトトリシンの存在下で成長する根が実際に構築物を含有しているかを 確認するために、根のオパイン含量を濾紙電気泳動により分析した（Ｐｅｔｉｔ 等、１９８６）。ストレプトトリシンの存在下で成長できない根は、マンノパイ ン、ｐＲｉ８１０６Ｔ−ＤＮＡマーカーのみを含有していたのに対して、ストレ プトトリシンの存在下で成長できる根の全て（２０の独立した根を分析）は、マ ンノパイン及びキュキュモパインの両方を含有した。後者は、構築物に含有され るマーカーである。この結果は、ストレプトトリシン耐性根が構築物を組み込ん だことを示している。キュキュモパインを合成するこれらの根がｓａｔ３遺伝子 を実際に有することを確認するために、根から抽出したゲノムＤＮＡを、ＰＣＲ （ポリメラーゼ連鎖反応）法により分析した。２種のオリゴヌクレオチドを合成 した。一つは、２０塩基からなり、配列５’−ＴＣＡＡＴＧＣＧＴＧＡＡＴＴＧ ＧＴＣＡＴ−３’を、配列の位置２３３〜２５２に位置して有しており、他のも のは、１８塩基からなり、配列５’−ＧＧＡＴＧＣＡＧＧＣＣＡＣＧＡＴＡＣ− ３’を配列の位置７２０〜７０３に位置して有している。ＰＣＲ反応にこれらの オリゴヌクレオチドを使用することにより、ＰＣＲ反応させた混合物のアガロー スゲル電気泳動後に検出できるｓａｔ３遺伝子の実質的に全体をカバーする４８ ８塩基対からなるＤＮＡ配列を増幅することができる。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ型管 を用いて、１ｃｍの根を無菌蒸留水０．１ｍｌに添加して粉砕することにより根 のゲノムＤＮＡを抽出し、管を沸騰水浴上で５分間インキュベーションした。遠 心分離後、上清１μｌを、ＰＣＲ用の通常の反応混合物５０μｌに添加した。所 望のＤＮＡが３０サイクル（１サイクルは、以下のインキュベーションを含んで なる：９４℃で１分間、５５℃で１分間及び７２℃で１．５分間）増幅された。 結果から、キュキュモパインを合成している根から抽出したゲノムＤＮＡのみが 、４８８塩基対の断片を増幅でき、したがってｓａｔ３遺伝子が存在することが 分かった。 結論として、ストレプトトリシン１００ｍｇ／ｌの存在下で成長できる根は、 構築物により実際に形質転換されることが判明した。実施例２ 実験２ プラスミドｐＪＢＪ３０２を、プラスミドｐＡｉ４４０４（Ｏｏｍｓ等、１９ ８２）を含有している菌株Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４に導入 した。このデスアームドプラスミドにより、Ｔ−ＤＮＡの転移に必要なＶＩＲ機 能が提供される。形質転換バクテリアを、カナマイシンを添加したリッチアガー 培地を用いて選択した。得られたクローンを、実験１と同様にして分析し、選択 されたクローンを、Ｈｏｒｓｃｈ等、１９８５の方法により、Ｎｉｃｏｔｉａｎ ａ ｔａｂａｃｕｍ ｖａ．．Ｘａｎｔｈｉの葉面ディスクに接種した。接種し てから２４時間後、ディスクを、６−ベンジルンアミノプリン（ＢＡＰ）（１ｍ ｇ／ｌ）、ナフタリン−酢酸（ＮＡＡ）（０．１ｍｇ／ｌ）、セファロスポリン （２５０ｍｇ／ｌ）及びストレプトトリシン（１００ｍｇ／ｌ）を添加した固形 ＭＳ培地に移して、形質転換細胞由来の小植物（ｐｌａｎｔｌｅｒ）を得た。小 植物は、４週間後に現れた。これらを、ストレプトトリシン含有ＭＳ培地に移植 した。これらの根は、発育した。３週間後、Ｍａｇｅｎｔａポットに入れた固形 ＭＳ培地にさし穂することにより、植物を発育させることにより、個々に繁殖さ せた。直径１ｃｍの葉のディスクを各植物から除去して、電気泳動（Ｐｅｔｉｔ 等、１９８６）によりキュキュモパイン含量を評価した。分析した５０植物のう ち、４６植物（９２％）が、明らかにキュキュモパインが存在することが明らか となった。陰性と思われる４植物は、偽陽性物又はキュキュモパインシンターゼ の発現が弱すぎる植物の場合と思われる。いずれの場合も、偽陽性植物の１０％ の割合が完全に許容でき、しばしば、形質転換組織を選択するのに使用される最 も選択性のあるマーカーを用いて観察できることがある。また、キュキュモパイ ン含有植物がｓａｔ３遺伝子を有することを確認するために、それらのゲノムＤ ＮＡを抽出し（Ｅｄｗａｒｄｓ等、１９９１）、実験１と同様にし てＰＣＲ法により分析した。標準タバコから抽出したＤＮＡはなんの兆候もなか ったのに対して、キュキュモパイン合成植物から抽出したＤＮＡでは、４８８塩 基対のＤＮＡ断片の増幅が常に見られ、ｓａｔ３遺伝子の存在が確認された。 結論として、ｓａｔ３選択マーカーを用いた遺伝子導入タバコの選択が、例の 少なくとも９０％に極めて有効であることが判明した。実施例３ 実験３ 実験２で使用した菌株Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（プラスミドｐＪＢＪ３０ ２含有菌株ＬＢＡ４４０４）を使用して、選択剤としてカナマイシンの代わりに ストレプトトリシンを用いた以外はＶａｌｖｅｋｅｎｓ等、（１９８８）の方法 によりＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの根を形質転換した。２種の 抗生物質濃度、２５ｍｇ／ｌ及び４０ｍｇ／ｌを並列試験した。３週間後、緑色 小植物が現れ、ストレプトトリシン（２５又は４０ｍｇ／ｌ）添加ＧＭ培地（Ｖ ａｌｖｅｋｅｎｓ等、１９８８）に移植して、個々に発育させた。これらの小植 物のオパイン含量を分析により求めた。２５ｍｇ／ｌのストレプトトリシンの存 在下で成長した１０小植物のうち、５小植物がキュキュモパインが存在したのに 対して、抗生物質４０ｍｇ／ｌの存在下で成長した１５小植物のうちの１４植物 がキュキュモパインを含有することが判明した。この結果は、最適抗生物質濃度 を用いることが、高確率で形質転換植物のみを選択するか、少なくとも主に形質 転換植物を選択するのに重要であることを明らかに示している。ストレプトトリ シン４０ｍｇ／ｌの場合、得られた植物の９３％が構築物を組み込んでいた。こ れらの植物が実際にｓａｔ３遺伝子を有するかを確認するために、それらのゲノ ムＤＮＡを抽出し、実験１と同様にＰＣＲ反応における鋳型として用いた。全て のキュキュモパイン合成植物のＤＮＡにより、４８８塩基対のｓａｔ３遺伝子の 典型的なＤＮＡ断片を増幅できたのに対して、非形質転換植物のＤＮＡは何の 兆候も示さなかった。 これらの結果は、形質転換することが望ましく、且つこれらの条件下で高頻度 で形質転換組織を選択するのにｓａｔ３遺伝子を使用することができる細胞の種 類ごとに最適なストレプトトリシン濃度を決定することが重要であることを示し ている。実施例４ 実験４ 金属ポンチを用いて無菌的に切断した直径１ｃｍの葉ディスクを、標準タバコ か、生体外で培養したｓａｔ３遺伝子形質転換タバコから除去した。これらのデ ィスクを、ＮＡＡ（１ｇ／ｌ）を添加したＭＳ２０アガー培地を入れたペトリ皿 に配置して、根の形成を誘発させた。１バッチのペトリ皿にストレプトトリシン （１００ｍｇ／ｌ）を添加した。葉ディスクを、２４℃、１日当り１６時間光照 射の条件でインキュベーションした。１５日後、ストレプトトリシン非含有培地 で標準タバコ及び遺伝子導入タバコから根が出現した。、一方、抗生物質含有培 地では、遺伝子導入タバコのディスクだけに根が出現し、標準タバコディスクは 細胞又は根の発育を示さなかった。 この結果から、ストレプトトリシン耐性の発現は植物の発育中維持され、後で 、ｓａｔ３遺伝子含有植物とその遺伝子を欠く植物との間の区別をするのが極め て容易であることが明らかにされた。実施例５ 酵母細胞及び哺乳動物細胞 酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅの形質転換細胞の 選択にｓａｔ３遺伝子が有効であることを実証するための他の実験を、この酵母 中で活性であることが知られているカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮ Ａのプロモーターの制御下にｓａｔ３遺伝子を配置した第２図に示した構築物を 用いて通常の形質転換法に準じて行った。これらの実験により、Ｓｃｈｉｚｏｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅにおけるｓａｔ３遺伝子の有効性を示す ことができた。形質転換は、Ｉｔｏ等、（１９８３）の手法を用いて実施した。 動物細胞に使用するために、ストレプトトリシン耐性遺伝子を、ヒトサイトメ ガロウイルス（ＣＭＶ）（記載の実験に使用）、ＳＶ４０ウイルス又はＲｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａウイルス（ＲＳＶ）の初期遺伝子の遍在発現等の遍在発現を可 能とするプロモーターの制御下に配置できる。また、ストレプトトリシン耐性遺 伝子を、一定の細胞型においてのみ発現する遺伝子のプロモーターの制御下に配 置してもよい。実験は、ｓａｔ３遺伝子をＣＭＶプロモーターの制御下に配置し た構築物を用いて実施した。マウス乳細胞ＨＣ１１及びハムスターの卵巣細胞Ｃ ＨＯを、Ｆｅｌｇｎｅｒ等（１９８７）により記載のリポソーム法によりこの構 築物を用いて形質転換した。両方の場合において、ストレプトトリシンの存在下 で選択することにより、多数の形質転換クローンを得ることができた。 これらの実験から、ｓａｔ３遺伝子を使用して形質転換酵母及び哺乳動物細胞 を選択できることが明らかにされた。実施例６ この実験の目的は、ｓａｔ３遺伝子が植物プロモーターをトラップするのに使 用できることを確認することにある。開発された方法は、ａｐｈ（３’）ＩＩ（ アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼＩＩ）遺伝子を選択マーカーとして 使用した以前に記載された方法（Ｋｏｎｃｚ等、１９８９）に基づくものである 。この方法の原理は、プロモーターを有しないｓａｔ３遺伝子を、Ａｇｒｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓＴ−ＤＮＡの両端部の間に、選択遺伝子 の翻訳の開始ＡＴＧコドンはＴ−ＤＮＡの右端領域と並列（ｉｎ ｊｕｘｔａｐ ｏｓｉｔｉｏｎ ｗｉｔｈ）に配置する。もしこのＴ−ＤＮＡの植物ゲノムへの 組み込みがプロモーター領域で生じるならば、ｓａｔ３遺伝子が発現するであ ろう。形質転換細胞はストレプトトリシン耐性を取得して、これらの細胞のみが 抗生物質の存在下で小植物を再生するであろう。この仮説を試験するためにプラ スミドｐＪＢＪ３３２を構築した。本質的な部分のみを図示する（第２図）。プ ラスミドの残部は、前記実験に使用されるプラスミドｐＪＢＪ３０２の場合と同 様にｐＢｉｎ１９型レプリコン部（Ｂｅｖａｎ、１９８４）に他ならない。プラ スミドｐＲｉ２６５９のＴ−ＤＮＡの左端領域を含有するＢｇｌＩＩ−ＣｌａＩ ＤＮＡセグメントは、第２図を左から右にみれば分かる。このＤＮＡは、上記 したプラスミドｐＪＢＪ１０６由来のものである（第１図）。ＨｉｎｄＩＩＩと ＥｃｏＲＩとの間のセグメントは、プラスミドｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ〜Ｐ ｅｒｒｏｎ等、１９８５）から得た多クローニング部位（ＭＣＳ）に他ならない 。ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩとの間の領域は、ＸｈｏＩ部位が翻訳開始のためのＡＴ Ｇのすぐ上流に付加されたプロモーターを含有しないノパリンシンターゼ（ｎｏ ｓ−ｔｅｒ）の未翻訳ターミネーター部、ｓａｔ３遺伝子、を含有している。Ｘ ｈｏＩ〜ＢｇｌＩＩ右領域は、プラスミドｐＲｉ２６５９のＴ−ＤＮＡの右縁を 含有している。プラスミドｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ〜Ｐｅｒｒｏｎ等、１９ ８５）をプラスミドｐＪＢＪ３３２のＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、構築 物ｐＪＢＪ３３３を得た（第２図）。 ｐＪＢＪ３３３は、エレクトロポレーションによりプラスミドＶｉｒ ｐＡＬ ４４０４（Ｏｏｍs等、１９８２）を含有する菌株Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４に導入した広範な宿主スペクトルを有するプラスミドである。 形質転換バクテリアを、カナマイシンの存在下でリッチアガー培地を用いて選択 した。得られたクローンのプラスミド含量を分析し、クローンを選択して残りの 実験に使用した。このクローンを使用して、２００タバコ葉ディスクを感染させ た。形質転換小植物の再生及び選択を、上記した実験２と同様にして実施した。 ８週間後、極めて発育の悪い極めて数多くの小さな小植物の間によく発育した １３小植物が出現した。これらを抗生物質非含有ＭＳ培地に移植して、根を迅速 に発根させるようにした。葉ディスクを除去して、ゲノムＤＮＡ（Ｅｄｗａｒｄ ｓ等、１９９１）を抽出し、ＰＣＲ法による分析を、実験１と同様にして実施し た。９植物から、ｓａｔ３遺伝子について予想される増幅に相当するＰＣＲシグ ナルが得られた。 ｓａｔ３遺伝子が選択された植物に転写されたことを確認するために、葉２０ ０ｍｇから全ＲＮＡを抽出し（Ｌｏｋｅｍａｎｎ等、１９８７）、ＲＮａｓｅ非 含有ＤＮａｓｅＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で消化処理して、極微量ＤＮＡを除去 した。メッセンジャーＲＮＡに相補のＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、ポリｄＴプライマ ー及び「第一ストランドｃＤＮＡ合成（Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡｓ ｙｎｔｈｅｓｉｓ）」と称するＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒキットを用いて、全ＲＮＡ １μｇから生体外で合成した。反応媒体の一部分を、ｓａｔ３遺伝子の増幅に 関して上記した２つのオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応に鋳型として使用 した。転写ＲＮＡを検索するこの方法は、略名「ＲＴ−ＰＣＲ」である。上記で 選択された９植物では、ｓａｔ３遺伝子の典型であるＤＮＡ断片の増幅が得られ たのに対して、陰性であると判断された植物では、ＤＮＡを示すものは何ら得ら れなかった。 形質転換植物がストレプトトリシン耐性を表現したことを確認するために、第 一段階の間に選択された１３植物を、生体外で抗生物質含有ＭＳ２０アガー培地 にさし穂することにより繁殖させた。形質転換植物のみが、８日以内に、選択剤 の存在下で発根を示した。 この実験から、Ｔ−ＤＮＡの右端領域に並列して配置したプロモーター非含有 ｓａｔ３遺伝子は、植物ゲノムへの組込み後に、植物プロモーターにより発現で き、且つこの様なプローモーターを取得するのに使用できるマーカーを構成する ことが結論として言える。さらに、使用されるｐＪＢＪ３３３構築物は、２つの 縁の間に、プラスミドｐＵＣ１８の複製起点及びアンピシリン耐性のための遺伝 子を含有している。この構造により、Ｋｏｎｃｚ等（１９８９）により提案され ているような組込み部位を含有する植物ＤＮＡセグメントをＥ．ｃｏｌｉにクロ ーニングできる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 タンプ，ジャック フランス国リムール、アンパース、ド、シ ョミュソン、４ (72)発明者 ティエッツェ，エルハルト ドイツ連邦共和国ベルニゲローデ、ブライ ト、シュトラーセ、29

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ストレプトトリシン又はその類似体に対して耐性のある真核細胞の製造 方法であって、 前記真核細胞を、適当な向きに置かれたストレプトトリシンアセチルトランス フェラーゼ（ＳＡＴ−ＤＮＡ）をコードするＤＮＡ配列を含むストレプトトリシ ンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）をコードするＤＮＡ配列、および前記 細胞中での前記ＳＡＴ−ＤＮＡ配列の発現を制御する要素をコードする一つ以上 のＤＮＡ配列のための発現ベクターを用いて形質転換する工程と、 形質転換後にストレプトトリシン又はその類似体に耐性のある細胞を選択する 工程と、を含んでなる方法。 ２． ストレプトトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする配列が、 ａ）ｓａｔ１、ｓａｔ２及びsａｔ３、ｓａｔ４遺伝子、 ｂ）前記遺伝子とハイブリダイゼーションし且つＳＡＴ活性を有するタンパク 質をコードするＤＮＡ配列、及び ｃ）配列ａ）及びｂ）からの縮重により得られ且つＳＡＴ活性を有するタンパ ク質をコードするＤＮＡ配列、 からなる群から選択されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法 。 ３． ＳＡＴ−ＤＮＡ配列が、形質転換細胞中で機能するプロモーターの制御 下に置かれることを特徴とする、請求項１及び２のいずれか１項に記載の方法。 ４． 前記真核細胞が植物細胞であることを特徴とする、請求項１〜３のいず れか１項に記載の方法。 ５． 前記ベクターがＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のものであることを特 徴とする、請求項４に記載の方法。 ６． 前記ベクターがＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 又はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ由来のものであること を特徴とする請求項５に記載の方法。 ７． 前記ベクターが、形質転換細胞に意図する形質を発現させる一組のＤＮ Ａ配列をさらに含んでなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 ８． 意図する形質が、植物細胞についての農業上有用な機能であることを特 徴とする、請求項７に記載の方法。 ９． 前記ベクターが組込みベクターであることを特徴とする、請求項１〜８ のいずれか１項に記載の方法。 １０． 請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法を実施することにより得ら れた、真核細胞。 １１． 請求項１０に記載の細胞から得られた、植物。 １２． ストレプトトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子 の、植物組織及びその後の植物の形質転換における選択マーカーとしての使用。 １３． ストレプトトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子 の、植物プロモーターを取得するための選択マーカーとしての使用。 １４． 前記遺伝子がsａｔ３遺伝子であることを特徴とする、請求項１３に 記載の使用。 １５． ａ）本明細書に記載のｓａｔ３配列、 ｂ）前記遺伝子とハイブリダイゼーションし且つＳＡＴ活性を有するタンパク 質をコードするＤＮＡ配列、及び ｃ）配列ａ）及びｂ）からの縮重により得られ且つＳＡＴ活性を有するタンパ ク質をコードするＤＮＡ配列、 からなる群から選択されたものであるストレプトトリシンアセチルトランスフェ ラーゼ（ＳＡＴ−ＤＮＡ）をコードするＤＮＡ配列。 １６． 真核細胞中でのＳＡＴのクローニング及び発現用ベクターであって、 適当な向きに置かれたストレプトトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡ Ｔ−ＤＮＡ）をコードするＤＮＡ配列と、前記細胞中での前記ＳＡＴ−ＤＮＡ配 列の発現を制御する要素をコードする一つ以上のＤＮＡ配列とを含有することを 特徴とする、ベクター。 １７．前記発現制御要素が、宿主生物由来の要素であることを特徴とする、請 求項１６に記載のベクター。 １８． プラスミドｐＪＢＪ３３３であることを特徴とする、請求項１７に記 載のベクター。