TWI284150B - Plasmid-free clone of E. coli strain DSM 6601 - Google Patents

Description

1284150 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本舍明係關於大腸桿菌菌株D S Μ 6 6 01之一種無質體選 殖株，一種製備該等細菌之方法及如此獲得之該等細菌作 爲選殖載體之用途。 【先前技術】 大腸桿菌係一種存於自然界的細菌，尤其係存在於人類 及動物腸内’且相當長時期以來一直係深入微生物及基因 試驗之標的物。在基因工程中，其尤其用於特異基因或蛋 白質之選殖及/或表達上。 大多數埃希氏（Escherichia)型菌株在腸腔外具有致病 性，且一般會在感染區引發感染。一種非致病性埃希氏型 大腸桿菌菌株係為菌株DSM 6601，其收錄在the以啦⑽ Compilation of Micro_〇rganisms中，其若干基因特性有別於 所有其他大腸桿菌菌株。然而，咸已發現該菌株之基因操 作極其困難或根本不能進行，因而不能作爲一簡單的選殖 手段使用。 大腸桿菌DSM 6601自然性地含有兩種質體，稱爲pMuU 或PMut2’大小爲3177吐或5552以。該等質體及其dna序 列闡述於例如美國專利第6,391，631號中。 基於該等大腸桿菌細菌之致病性質或非致病性質係由其 質體顯著控制至某-定程度，且另外基於該等大腸桿菌菌 株部分出現之「基因抗性」亦可能與其隱性質體有關，故 本發明任務係開發一種無質體大腸桿菌菌株，而另外該菌 94349.doc 1284150 株與原始菌株在基因體DNA方面完全相同。 【發明内容】 述任矛力了藉由長1供大腸桿菌菌株DSM 6601之無質體 選殖株及製備此一選殖株之方法而得以解決。 【實施方式】 在達成本發明之艱苦試驗過程中，人們已發現，藉由基 因工，之-般性方法根本無法或僅能以極絲難之操作^ 製備菌株DSM 6601之無質體選殖株，故産生該等選殖株需 知用特殊途&。因爲該菌株之野生型除其基因體簡A外還 含有兩種不同大小之質體，故必須在若干部分並行之步驟 中去除該等質體。 製備本發明之選殖株時，係依據本發明之方法將天缺存 在於大腸桿菌菌株DSM 660!中之pMuti及pMut2質體標記 爲具有抗生素抗性。另夕卜’根據習知方法分離該等質體， 且將該抗性基因置於—所期望之位點。根據—較佳方法， 該抗性基因與-表達盒置於個別㈣中，其含卜可胃胃 有型（constitutive)或誘導型之啓動子。 · 然後，依據習知方法(例如，CaCl2方法或電穿孔法 此獲得之質體置於一合適宿主巾 I 、 T亚於该處選殖，此時插 入個別質體中的抗性基因可助於篩選攜帶該質體之宿 胞。適於選殖攜帶有抗性基因的質體之宿主係(例如^ ^ 菌菌株DH5a或大腸桿菌fjBlOl。 于 而將McB基因弓|人 分離該等攜帶有抗性基因之質體，繼 該等質體作爲提供的另一標記。 94349.doc 1284150 j後將如此獲知或標記之質體插入大腸桿菌菌株dsm 6601 中。 轉化後，將該等大腸桿菌DSM 6601培養於一培養基上， / k養基中包s針對上述傳遞抗性步驟所插入質體之（該 等）抗性基因之（若干）抗生素。 藉由此培養基之培養作用，只有可抵抗該營養培養基中 所3之3 (等）抗生素之選殖株才會生&。另外，該等細菌將 失去多餘的基因材料，乃因其不再需要該等原始質體—a 及pMut2供其生長，因而，最後，該等細菌僅含有經修飾之 貝體pMutl及pMut2(其含有該（等）抗性基因及基因）。 在下一步驟中，係將經此培養之該等細菌轉移至會阻礙 含有mcB細菌生長之營養培養基，當施加一筛選壓力時， 其基本上僅允許已失去攜帶有^cB基因之質體之細菌生 長。 結果，獲得一衍生自菌株]〇8]^66〇1的無質體菌株。 現已確定，本發明之選殖株在失去該等質體之狀態下， 其基因體DNA未發生任何改變，且其驚人地適合作爲一選 殖載體使用。 因此，它們在實驗室中可毫無風險地作為用以選殖或表 達大ϊ基因或蛋白質之宿主細胞。使用本發明菌株dsm 6601 ΔρΜιιΠ/2之試驗已顯示，當外源DNA整合入該菌株自 有的經分離質體中時，該菌株係外源DNA之尤佳接受體， 此意谓该等質體可作爲外源DNA之選殖載體。另外，因爲 它們來自於非致病菌株，故其可用以治療動物及人類之胃 94349.doc 1284150 腸道疾病。若需要，其可另外用外源基因加以轉化，該等 外源基因可促進細菌對黏膜之黏附，例如，黏附素，其在 必要時可促使細菌黏附至（例如）母牛及/或豬之黏膜上（此 黏附性對宿主動物而言具有特異性），且藉此可阻礙或阻止 其他致病生物之生長。 現參照實例來更加詳細地闡釋本發明。 實例1 pMutl之改變 根據 Quiagen Plasmid Purification Handbook(12/2002，第 16-20頁）分離野生型DSM 6601之兩種天然存在的質體 pMutl及pMut2。 以標記質體pMutl而言，係選擇來自載體pBR322之四環 素抗性盒。相關啓動子來自質體PASK75。由該選殖得到之 質體稱爲pKS-tetAtetp/°。用限制酶切下插入部 分化L4tetp/°(插入部分之大小爲1.5 kb)。該尤^//讯以///片斷 經由一 iW/e/限制介面插入至質體pMutl。用相應酵素限制性 消化該等質體後，該限制基質以一管柱（Quiagen，PCR Purification Kit)純化，經Klenow處理，以形成“鈍端”。 爲防止質體pMut 1之再連接，對已經限制酶線性化且經 Klenow酶處理的質體進行去磷酸化。最後，載體pMutl與 插入部分kdtetp/°彼此結合在一起，且據此轉化大腸桿菌 K-12 菌株 DH5 α。 爲製備轉化能力細胞，將1.5毫升UeN培養物加入至150 毫升LB培養基（LureaBertaniMedium)中，並於37°C下震盪 94349.doc 1284150 培養’直至〇D6〇〇 =0.5。繼而，將該細菌培養物冰上培養20 分鐘，接著於4°c下以4000轉/分鐘之轉速離心10分鐘。在 無菌、冰冷的10%甘油中將所得細菌團洗滌三次，第一次 用相當於其原體積i〇〇%的甘油洗滌，繼而用相當於其原體 積50%的甘油洗滌，最後一次用相當於其原體積10%的甘油 洗滌。最後，將該經洗滌之細菌團重新懸浮於3〇〇微升1〇% 甘油中、等分分裝（每份4〇微升）並儲存於_80°C下。爲轉化 該等細菌細胞，將1至2微升質體DNA(1至100奈克）與40微 升已在冰上解康之轉化能力細胞混合，並於冰上培養5分 鐘。然後，在一無菌且預先冷卻之2毫米電穿孔比色皿的兩 電極間以移液管移除該基質中氣泡。充分乾燥該比色皿並 將其置於電極夾中。經2.5kV、200Ω及25 pF之電衝擊後， 用1毫升LB培養基洗滌來自該比色皿之細菌懸浮液，並於37 C下在震盪器中培養1至2小時。最後，將該細菌離心分離 並移除上清液直至其降至1〇〇微升爲止。將所得沈澱物重新 懸浮於剩餘的1〇〇微升中，塗佈於一含有Tc及UeN之選擇平 板上，並於37。(：下培育。 藉由少量製備個別細菌選殖株之相應質體來檢驗該選殖 成功與否。經四環素盒標記的質體pMuti被稱爲pMutl-Tc。 圖2展示經四環素盒標記的質體pMuti。該圖示展示傳遞四 裱素抗性之DNA片斷的插入位點（最初係單一 位點該 DNA片斷亦含有適合選殖的單一五c〇RI序列。另外，亦展示 了引子Muta 5及Muta 6之結合位點，該等結合位點可藉由 PCR而適合作爲該質體之特異性證明。 94349.doc -10- 1284150 實例2 pMut2之改變 爲標記質體pMut2，選擇一來自載體pACYC177之卡那黴 素（kanamycin)抗性盒。另外，該抗性盒（大小爲1.34 kb)以 限制酶Awl切除，且經一 5g/II限制酶介面插入至質體pMut2 中。該等質體用相應酵素進行限制酶消化後，該限制酶基 質經一管柱（Quagen，PCR Fraktion kit)純化，且質體 pMut2 經Klenow處理，以形成用於選殖之「鈍端」。爲避免質體 pMut2之再連接作用，將業經限制酶5g///線性化且Klenow 酶處理之質體進行去磷酸化作用。最後，載體pMut2與卡那 黴素盒結合，並用以轉化大腸桿菌K-12菌株DH5oc，如實例 1所述。將所得轉化物塗佈於含Kn成分之LB瓊脂平板上。 少量製備個別細菌選殖株之對應質體DNA來檢驗選殖是否 成功。經卡那黴素盒標記的質體pMut2被稱爲pMut2-Kn。 圖3展示質體pMut2-Kn之物理圖。其中標示了卡那黴素抗 性盒之插入位點（最初係一 5g/II位點）及單一且適合作爲選 殖位點之五coRI序列。Muta 7至Muta 10標記出與該等序列 互補且係適於藉由PCR方法來特異性證明該質、體之引物之 彼等區域。 / 實例3 插入sacB基因 爲將sacB基因（編碼用於果聚糖蔗糖酶）插入經抗性盒標 記的質體pMutl-Tc及pMut2-Kn中，在兩種質體中選擇單一 五限制介面。使用限制酶hil自質體pCVD442中分離 94349.doc -11 - 1284150 mcB基因（大小爲2.6 kb)。爲製備載體pMutl-Tc及 pMut2-Kn，用五將該等質體線性化，接著經Klenow處 理以形成「鈍端」並實施去磷酸化。用/^1限制性消化且經 Klenow酶處理後，對插入部分mcB實施純化。該等線性化 載體與插入部分結合在一起，且大腸桿菌K-12菌株DH5a 由此得以轉化，如實例1所述。該選殖成功與否係藉由少量 製備個別細菌選殖株之質體DNA並隨後進行限制分析來檢 驗。標記有基因的質體pMutl-Tc及pMut2-Kn被稱爲 pMutl-TcSac及 pMut2-KnSac 〇 實例4 製備大腸桿菌菌株DSM 6601之一無質體選殖株 首先，質體pMutl-TcSac藉由該菌株中之電穿孔而加以轉 化，如實例1所述。經電穿孔以將質體pMutl-TcSac轉移至 菌株DSM 6601中後，將該基質塗佈於含有Tc(50微克/毫升） 之LB平板上。檢測所得四環素抗性細菌選殖株中是否存在 質體pMutl-TcSac及天然存在之質體pMutl的相關失去情 況。在藉由使代表pMutl的DNA带不存在來對線性化質體實 施電穿孔分離之後，並於製備質體DNA且該質體DNA經酵 素五coRI限制消化後，即可證明質體pMutl之失去情況。 最後，於30°C下將該等選殖株之一置於含10%蔗糖之LB 培養基中過夜，然後將其塗佈於含10%蔗糖之LB平板上（LB 培養基包括10克來自酪蛋白之蛋白腺、5克酵母提取物及5 克氯化鈉於1升蒸餾水中）。含蔗糖之LB培養基係藉由以下 獲得：將經無菌過濾之50%(重量/體積）蔗糖溶液加入冷卻 94349.doc -12- 1284150 至45°C之高壓滅菌的培養基中，使其最終濃度達到10%。 在3(TC下培育該等平板。在該等條件下，只有不再攜帶 之彼等選殖株（即，該等選殖株已失去攜帶基因的質體） 可作出響應。對所得菌株DSM 6601ApMutl的質體 pMutl-TcSac失去狀況進行檢測。 繼而，質體pMut2_KnSac藉由電穿孔插入菌株DSM 6601 ApMut 1 中。 經電穿孔以將質體pMut2-Kn-Sac轉移至菌株DSM 6601ApMutl中後，將該基質塗佈於含有Kn(50微克/毫升） 之LB平板上。檢測所得卡那黴素抗性細菌選殖株中是否存 在質體pMut2-KnSac及天然存在之質體pMut2的相關失去 情況。最後，於30°C下將該等選殖株之一置於含1〇%蒼糖 之LB培養基中過夜，並接著塗佈於含10%蔗糖之lb平板 上。在30 C下培養該等平板。檢測所得菌株dsm 6601ApMutl 之質體PMut2-KnSac失去狀況。 另外，對無質體菌株DSM 6601ApMutl實施一脈衝場凝膠 電泳’旨在消除任何菌株中之染色體變化。吾人確認未才叙 測到任何變化，且進一步試驗揭示該無質體選殖株未發生 任何形態、生化或發酵方面之變化。 【圖式簡單說明】 圖1以示意圖方式展示製備菌株DSM 6601之無質體選殖 株之方法； 圖2展示質體pMuU-Tc之物理圖； 圖3展示質體pMut2-Kn之物理圖。 94349.doc -13-

Claims (1)

1. 备告本 十、申請專利範圍： L /種大腸桿菌（Escherichia coli)菌株DSM 6601之無質體 選殖株。 2· 一種用於製備如請求項1之無質體選殖株之方法，其特徵 爲具有以下步驟： a) 將一抗性基因插入至質體pMutl&pMut2中， b) 將*yacB基因插入至步驟a)中獲得之該等質體中， c) 將步驟b)中獲得之該等質體送入該大腸桿菌菌株DSM 6601中，並培養該選殖株，培養條件係天然存在之質 體pMut 1及PMut2會受步驟b)獲得之質體抑制之條件 下，及 d) 培養步驟c)所獲得之選殖株，培養條件係基本上僅允 許缺乏該mcB基因之細菌生長之條件。 3 ·如明求項2之方法，其特徵在於該等抗性基因係存在於一 表達盒中。 4.如請求項2或3之方法，其特徵在於該等抗性基因係在四 環素（tetracycline)抗性或卡那黴素（kanamyCin)抗性下篩 選。 5·如請求項2或3之方法，其特徵在於該質體pMutHf、用一四 環素抗性盒及mcB基因標記，而該原始質體pMm2係用一 卡那黴素抗性盒及mcB基因標記。 6·如請求項2或3之方法’其中經以四環素抗性盒及⑽基 因標記之質體p M u 11加以轉化之細菌係培養在四環素平 板上，繼而培養在含蔗糖平板上，而且在第一步去除該 94349.doc 1284150 質體PMUtm，藉由培養在卡那黴素平板上及進〆〆 在庶糖平板上而去除質體pMut2。

   一種如請求項1之無質體選殖株用作選殖菌株之用途。 一種如請求項]夕么 田十 、 …、貝體選殖株之用途，其係用於製倍 用來治療動物胃腸请卜 衣爾 ^ ^逼疾病之製劑。 94349.doc