JP2002517260A

JP2002517260A - 制限酵素遺伝子発見法

Info

Publication number: JP2002517260A
Application number: JP2000553622A
Authority: JP
Inventors: ローリ，エリザベス・エイ; バイスビラ，ロミユアルダス; モーガン，リチヤード・デイ
Original assignee: ニユー・イングランド・バイオレイブズ・インコーポレイテツド
Priority date: 1998-06-12
Filing date: 1999-06-11
Publication date: 2002-06-18
Also published as: WO1999064632A1; EP1086244A4; EP1086244A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、発現方向が事前に分かる可能性が高く、かつ外因性の可能な毒性遺伝子と結合し得る可能性が低い無傷な遺伝子の直接的なクローニングに関する。特に本発明は、変化しやすいオープンリーディングフレームに隣接する反復配列からなるＤＮＡカセットにコードされる遺伝子を得ることに関する。本発明は、反復エレメントにハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドを使用してそのようなカセットコード遺伝子を得ること、それらをクローニングすること、およびそれらを発現させることを包含する。発現には、厳密に調節されるベクターおよび開示された有用な菌株を用いることができる。制限エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡメチルトランスフェラーゼの遺伝子を、それらの配列または生化学的特異性に関する事前の情報がない条件下で同定するための方法もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願）本出願は、米国仮特許出願第６０／０８９，１０１号（１９９８年６月１２日
出願）および米国仮特許出願第６０／０８９，０８６号（１９９８年６月１２日
出願）のＰＣＴ出願である。これらの開示は、それらによって参考として本明細
書中に援用される。

【０００２】（発明の分野）本発明は、一般には、遺伝子発見、クローニングおよび発現の分野に関する。
本発明の特定の局面は、本発明により、発現方向が事前に分かる可能性が高く、
かつ外因性の可能な毒性遺伝子と結合し得る可能性の低い無傷な遺伝子の直接的
なクローニングが可能になるということである。

【０００３】本発明は、特定の種類の遺伝子に限定される。なぜなら、遺伝子の中には、本
発明の方法によるクローニングおよび発見がらの遺伝子よりも容易であると考え
られる遺伝子が存在するからである。従って、本発明は、より詳細には、保存さ
れた反復配列によって隔てられている遺伝子カセットのアレイ内に見出される遺
伝子をクローニングすることに関する。現在の理解に基づいて、そのようなアレ
イは原核生物において見出されており、特定の状況下では選択的に非常に好都合
であって、他の条件下では必要とされない機能を有する遺伝子を含有している。
従って、ある種の遺伝子はこのようなアレイにおいて見出されないが、他の種類
の遺伝子はそのようなアレイ内に濃縮されているはずである。そのようなカセッ
トのアレイにおいて見出され得る遺伝子の中には、商業的に注目される遺伝子が
多い。そのようなアレイにおいて予想され得る注目される遺伝子の種類を下記に
示す：制限酵素。制限酵素は、分子生物学における様々な手法に有用であり、多くの
有用なベクターの構築を可能にする。

【０００４】接着因子。接着因子は、細胞が特定の表面に結合することを可能にし得る。他
の表面と区別して、特定の表面への特異的な結合が可能になることによって、多
くの使用法がコーティングの提供および、目的とする位置への分子または生物の
標的化においてもたらされる。そのような接着因子はまた、病原性生物によって
発現されたときに病原性プロセスを媒介し得る。従って、接着因子が得られるこ
とによって、そのような病原性生物の競争的排除を可能にすることができる。

【０００５】小分子を改変する酵素。このような酵素は、特定の環境において多量に存在す
る毒性物質または他の物質を、ヒトまたは動物に対してあまり毒性のない別の物
質に、あるいはより有用な形態に変換することができる。

【０００６】宿主生物と相互作用する特異的なトキシン分子。このようなトキシン分子は、
トキシンの阻害剤またはアンタゴニストの合成に有用であり、あるいはワクチン
目的に有用であり得る。

【０００７】関連するカセットにコードされる遺伝子産物のその他の例は、共通した一般的
な性質を有する（接着因子は物体に接着する）が、非常に変化しやすい特異性を
有する（接着する特定の表面は、岩から腸粘膜〜泌尿上皮までの多くの異なる種
類に及ぶ）。この種の遺伝子は、「選択された多様性の遺伝子」と下記では呼ば
れる。上記の遺伝子タイプの列記は完全なものではない。

【０００８】（発明の背景）原核生物における超可変遺伝子領域同じ種の近縁菌株の間における大きな配列発散を示す超可変領域が、原核生物
の染色体の様々な位置において見出されている。場合によっては、ある菌株に存
在する遺伝子が近縁の菌株から完全に失われている。この現象の例には、いわゆ
る「病原性の島」、病因に必要とされる遺伝子を有する染色体エレメント（Ｍｃ
Ｄａｎｉｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２（５）
：１６６４〜１６６８（１９９５））が含まれる。制限酵素の遺伝子が、このよ
うな超可変性の領域において見出されることがある（Ｄａｎｉｅｌら、Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：１７７５〜１７８２（１９８８）；Ｒａｌｅｉｇｈ、
Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：１０７９〜１０８６（１９９２）；Ｂａｒｃ
ｕｓら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４０：１１８７〜１１９７（１９９５））。この
ような領域の組み立ておよび変化の機構は新規な遺伝子機構に依存し得る。

【０００９】超可変遺伝子領域としてのインテグロンおよびスーパーインテグロン：可動性
遺伝子カセットインテグロン（ＨａｌｌおよびＣｏｌｌｉｓ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
１５（４）：５９３〜６００（１９９５））は、λインテグラーゼと同族の部位
特異的なインテグラーゼの作用部位である関連したＤＮＡエレメント（「５９ｂ
ｐエレメント」）によって隔てられた無プロモーター遺伝子カセットのアレイで
ある（図１）。各インテグロンは、５’末端に、対応するインテグラーゼの遺伝
子を有している。インテグラーゼ遺伝子の内部には、カセットの方を向き、すべ
てのカセット内遺伝子の発現が依存しているプロモーターが存在している。カセ
ットは、染色体外の非複製性サークルとして見出され得るが、インテグラーゼに
よってアレイ内に挿入され得る。特徴づけられたインテグロンは、プラスミドに
よって運ばれる。さらに、このようなカセットにより、薬剤または他の毒性産物
（水銀など）に対する耐性が説明される。通常のインテグロンは小さい：８個ま
でのカセットが、１つの通常的なインテグロンにおいて同定されているが、大抵
の場合、１個〜３個である。すべての遺伝子が、隣接するインテグラーゼ配列の
内部に見出される１個のプロモーターから発現していると考えられる（Ｌｅｖｅ
ｓｑｕｅら、Ｇｅｎｅ、１４２（１）：４９〜５４（１９９４）；Ｒｅｃｃｈｉ
ａおよびＨａｌｌ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５（１）：１７９〜１８７
（１９９５））（図１）。いずれの場合においても、プロモーター様配列は、通
常、遺伝子カセット内において同定されていない。インテグロンのプラスミド位
置および多剤耐性特性は、おそらくは、関連する研究の歴史的起源を反映してい
ると考えられる。それらは、そのような挙動が選択的に好都合である臨床的状況
から単離された細菌における薬剤耐性の水平伝搬に関する研究の結果として見出
されたからである。

【００１０】スーパーインテグロン（Ｍａｚｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８０（５３６３）
：６０５〜６０８（１９９８））が、最近、インテグロンから得られる部位特異
的なインテグラーゼによって移動し得る非常に多数の遺伝子カセットの染色体で
のアレイとして記載された。コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ）で見
出されたこの大きなアレイは１００個までのカセットを含有することがあり、染
色体の１０％も占めることがある（Ｂａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１７６（１７）：５４５０〜５４５８（１９９４））。Ｍａｎｎｉｎｇの研究室
により、このアレイが、病因に関連した赤血球凝集素を研究している途中で同定
された（Ｆｒａｎｚｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１（７）：３０３２
〜３０３７（１９９３））。このアレイ内のオープンリーディングフレームは、
ＶＣＲ（Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅｒｅｐｅａｔｓの略）と呼ばれる反
復した配列によって隔てられている。この反復は、薬剤耐性インテグロンの「５
９ｂｐエレメント」と同じではないが、類似している（Ｍａｚｅｌら、上記（１
９９８））。Ｍａｎｎｉｎｇの研究室は、コレラ菌に関連したインテグラーゼを
同定したと主張している（Ｃｌａｒｋら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６（
５）：１１３７〜１１３８（１９９７））。Ｄａｖｉｅｓの研究室は、コレラ菌
に由来するそのような遺伝子の論文を発表している（Ｍａｚｅｌら、上記（１９
９８））。

【００１１】このスーパーインテグロンは、普通のインテグロンと、下記の４つの点で区別
される：サイズ、プロモーターの配置、複製位置、およびカセット内に見出され
る遺伝子の性質。最もよく研究されているインテグロンの例とは対照的に、６０
個〜１００個のカセットがコレラ菌のアレイ内に存在しているようである。それ
らは必ずしもすべてが同じ方向を向いているわけではないので（図２）、共通の
プロモーターから発現され得ない。さらに、スーパーインテグロンによってコー
ドされる機能は明らかに多様であり、そのいくつかは病因に関連していると考え
られる（Ｍａｚｅｌら、上記（１９９８））。カセット内遺伝子のいくつかは、
（Ｂａｒｋｅｒら、上記（１９９４）において報告された配列のＯＲＦ３．１お
よびＯＲＦ３．２のデータベース検索から）プラスミドによってコードされるい
くつかのタンパク質に関連していた。１つは熱に安定なトキシンであり（Ｏｇａ
ｗａおよびＴａｋｅｄａ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（８）：
６０７〜６１６（１９９３）、１つはリポタンパク質遺伝子に類似していた（ｖ
ｌｐＡ；ＯＲＦ２のデータベース検索から）。従って、本発明者らは、（Ｍａｚ
ｅｌらに従って）、このアレイは、病原性に関連し、そしてらの生物学的機能を
特徴づけるおとり遺伝子に関連する遺伝子をクラスター化するように機能し得る
と推測している。

【００１２】インテグロンおよびスーパーインテグロンにおける遺伝子カセット間の反復配
列遺伝子カセット間に点在している配列は、遺伝子カセットが配置されている様
々なレプリコンの間での遺伝子カセットの獲得および交換に関わっていると考え
られる。「５９ｂｐエレメント」または「ＶＣＲエレメント」と呼ばれるこれら
の配列は、配列が多様であるが、いくつかの共通した特徴を示している。下記の
配列からなるコンセンサス配列が、従来の「５９ｂｐエレメント」について最初
に推定された（Ｈａｌｌら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５（８）：１９４１
〜１９５９（１９９１）：

【００１３】

【化１】

【００１４】その後、対応するこの配列はセグメント内の長さおよび配列が変化しているこ
とが見出された（ＨａｌｌおよびＣｏｌｌｉｓ、上記（１９９５））。２つの最
も保存されたセグメントが常に同定され得る：遺伝子カセットの５’（および上
記配列の３’末端；下線部）において、ＧＴＴＲＲＲＹ（配列９３）の「コア配
列」（ＣＳ）が見出され、そしてカセットの３’（および上記配列の５’末端；
下線部）において、ＲＹＹＹＡＡＣ（配列番号９４）の「逆コア配列」（ＩＣＳ
）が見出されている。これらの２つのエレメントは、逆向き反復として関連して
いる。切り出されたとき、染色体外サークルに含まれる配列の一部は、コア配列
内のＧから離れるように遺伝子の３’にその配列を含む。従って、サークルは、
遺伝子の５’末端（ＴＴＡＧＲＹ（配列番号９５））からＣＳの残りの部分で完
了する。

【００１５】ＶＣＲエレメントは、最初、他の配列のいずれにも関連していないと言われて
いた（Ｂａｒｋｅｒら、上記（１９９４））。しかし、その後、より大きな長さ
を除いて、「５９ｂｐエレメント」の特徴と一致することが明らかにされた（Ｍ
ａｚｅｌら、上記（１９９８）；Ｃｌａｒｋら、上記（１９９７））。ＶＣＲエ
レメントは、不完全な一対の対称的な１２４ｂｐの直列反復からなり、ＩＣＳモ
チーフおよびＣＳモチーフをその両端に有する。ＶＣＲエレメントは、仮想的な
赤血球凝集素遺伝子を囲む元の配列において９回見出された（Ｂａｒｋｅｒら、
上記（１９９４））。

【００１６】ＰＣＲがインテグロンを特徴づけるために使用されている。いくつかの研究で
は、保存されたインテグラーゼ遺伝子に、あるいはｓｕｌｌ（多くのインテグロ
ンの３’末端に見出されている保存された遺伝子）にアニーリングするプライマ
ーが用いられた（例えば、Ｌｅｖｅｓｑｕｅら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅ
ｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９（１）：１８５〜１９１（１９９５）；Ｓａ
ｌｌｅｎら、Ｍｉｃｒｏｂ．ＤｒｕｇＲｅｓｉｓｔ．１（３）：１９５〜２０
２（１９９５）；Ｓａｎｄｖａｎｇら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔ
ｔ．１６０（１）：３７〜４１（１９９８））。他の研究では、カセットにコー
ドされる特定の遺伝子にアニーリングするプライマーが用いられている（例えば
、Ｓｅｎｄａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５（１２）：２９０９
〜２９１３（１９９６）；Ｔｏｓｉｎｉら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔ
ｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２（１２）：３０５３〜３０５８（１９９８））。
しかし、これらの反復配列によって、カセットにコードされる遺伝子をＰＣＲに
より獲得できることは、配列の縮重およびそれらによりコードされる二次構造の
ために疑わしいと考えられている（ＨａｌｌおよびＳｔｏｋｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉ
ｃａ、９０（２−３）：１１５〜１３２（１９９３））。しかし、Ｍａｚｅｌら
（上記（１９９８））は、ＶＣＲエレメントにアニーリングするプライマーを使
用するＰＣＲによってカセットを得ることができた。

【００１７】制限酵素遺伝子発見の背景制限酵素の性質制限酵素は、分子生物学研究の非常に便利な道具である。制限酵素は、ＤＮＡ
において４塩基対〜８塩基対の長さの部位を特異的に認識し、その選択性は極め
て大きい。すなわち、１つのミスマッチを有する部位は、典型的には、正しい部
位に対して示される親和性よりも１／１０００の小さい親和性で認識される。こ
の大きな選択性は、実用的な適用における使用には不可欠である。

【００１８】知られている制限酵素は、２００を超える種々の特異的なＤＮＡ配列を認識し
（ＲｏｂｅｒｔｓおよびＭａｃｅｌｉｓ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ
．２６（１）：３３８〜３５０（１９９８））、その多くは市販されている。し
かし、異なる部位の潜在的な数はそれよりもはるかに多い：３２，５１２個の異
なる８塩基部位が認識され得る［（（４^８／２）−２５６）：各位置において４
つの塩基が可能な８塩基の長さの部位；これは２つの相補鎖の一方で認識され得
る；８塩基パリンドロームはそれぞれ２つの鎖において同じに読まれるので、２
５６を引く］。

【００１９】８ｂｐの認識部位を有する酵素（ＮｏｔＩ、ＳｆｉＩ、ＳｗａＩ、ＰａｃＩお
よびＰｍｅＩなどの８−切断物）は特に有用である。これらの酵素は、ヒトおよ
びらの高等真核生物のゲノムなどの複雑度の大きな起源から得られるＤＮＡのマ
ップ作製および操作のために使用される。このような有用性は、例えば、大きな
イントロンが１つのＤＮＡフラグメントに存在する遺伝子全体を単離することを
可能にする部位の希少度（パリンドローム部位に関して６５，０００ｂｐに１回
）から生じる。

【００２０】８ｂｐの認識部位を有する１２個の知られている特異性のうち、２つがＰｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓｓｐｐ．で見出され、９つがＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓまた
はらの高Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌で見出され、１つがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓで見出された。配列情報はこれらの６つについて得ることができる：２つがＰ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ単離物であり、４つが高Ｇ＋Ｃ生物から得られている。

【００２１】制限酵素の発見に対する競合的方法これまでに、新しい酵素活性に関するスクリーニングおよび新しい部位を認識
させるために既存酵素を変化させる、という２つの広範囲の方法が、新しい制限
酵素を見出すという問題に対して取られている。

【００２２】１）（菌株コレクションまたは自然環境から入手した）個々の原核細胞株の粗
製抽出物のスクリーニング。供試基質（たとえばファージλＤＮＡ）をこのよう
な抽出物と一緒にインキュベーションし、消化物をアガロースゲル電気泳動にか
けて分析した。この標準的な方法によれば、約２００ｋｂの組み合わせの複雑度
を持った標的を日常的に使用して、スクリーニングにかけられた粗製抽出物の約
２５％に少なくとも一つの部位特異的なヌクレアーゼが同定される。

【００２３】この手法には重大な欠陥が二つある。その第一は、新しい部位を認識するこの
ような酵素のフラクションは今のところ非常に低いということである。その原因
の一部は、長さが４ｂｐと６ｂｐの間の認識部位で酵素を同定することに偏って
いることと、標的の基質に存在しないことが少なくないより大きな標的で酵素を
検出することの不完全さのためであるかもしれない。

【００２４】第二の欠点は、この方法が非常に手間がかかるという点である。各菌株は個々
に検査する必要があり、関係している手順のいくつかは、それ自体がプロジェク
トと言えるものである。細胞の培養、細胞の溶解、抽出物の純化は、それぞれが
常套的な手順となりうる。粗製抽出物の良否は、外来ヌクレアーゼ、ＤＮＡ結合
タンパク質およびプロテアーゼの混入の程度の点で、単離株によって大きく変わ
る。

【００２５】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種とその近縁種の特定の例では、ヌクレアーゼの混入
がひどいために、抽出物の取扱いが困難なことがしばしば起こる。Ｘａｎｔｈｏ
ｍｏｎａｓ株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓと近縁）は、細胞外多糖類を著量に産生
するため、培養物を遠心分離によって集めることが困難であることがしばしば起
こり、同じ理由で抽出物の純化は困難な作業である。

【００２６】２）突然変異による既存酵素の変化で新しい配列を認識。構造情報が利用でき
る、６塩基対を認識する酵素から始めて、部位指向ランダムまたはランダムカセ
ット変異誘発によって特異性を変える試みが行われている（たとえば、Ｄｏｒｎ
ｅｒおよびＳｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２
２（６）：１０６８〜１０７４（１９９４）；ＨｅｉｔｍａｎおよびＭｏｄｌ，
ＥＭＢＯＪ．９（１０）：３３６９〜３３７８（１９９０）；Ｉｖａｎｅｎｋ
ｏら，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７９（４−５）：４５９〜４６５（１９９８）；
ＨＡＧＥＲら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（３５）：２１５２０〜２１５
２６（１９９０）およびＩ．Ｓｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ，私信）。この研究は有益
な産物をもたらすかもしれないが、特異性の向上（すなわち、さらに多くの塩基
を認識する）も特異性の変化（すなわち、同じ長さで異なる配列を認識）もまだ
得られていない。

【００２７】制限酵素による遺伝子クローンの同定およびクローニングの背景制限酵素は非常に多様な原核生物に存在しており、その多くは増殖要件が難し
く、しばしば存在量も少ない。商業生産のためには、大腸菌のような十分に理解
され遺伝子的に取り扱いやすいバクテリア宿主中で制限酵素が生産できれば、最
も有益である。遺伝子の発現と調節、および宿主細胞の遺伝子的取扱いのための
多くの手段があれば、より高い純度でより安く制限酵素を調製することが可能に
なる。従って、分子クローンとしてエンドヌクレアーゼのための遺伝子を入手す
ることが極めて有益である。

【００２８】メチルトランスフェラーゼ選択法クローンライブラリーに制限酵素の遺伝子が存在するかどうかを確認する一つ
の方法は、同系のＤＮＡメチルトランスフェラーゼに対する密接に関連した遺伝
子の存在と発現に基づく方法である（Ｗｉｌｓｏｎ，米国特許第５，２００，３
３３号（１９９３））。このようなメチルトランスフェラーゼ酵素は、特定のＤ
ＮＡ配列を認識し、その配列内のＡまたはＣ残基にメチル基を付加する。この修
飾によってエンドヌクレアーゼによる切断が阻止され、その結果、宿主ゲノムが
致命的な損傷を受けるのを防止する。このようなメチルトランスフェラーゼ遺伝
子がクローンライブラリーに存在し、有効に発現されるなら、そのクローンＤＮ
Ａは切断から保護される。これは試験管内でそのクローンの選択を可能にし、ク
ローンプールからプラスミドクローンＤＮＡが精製され、所望のエンドヌクレア
ーセ酵素で切断される。メチルトランスフェラーゼクローンは切断されないのに
対して、ライブラリーの他のクローン（異なる細胞中に存在する）は破壊される
。このような手順による再形質転換によって、メチルトランスフェラーゼ遺伝子
の発現量が著しく高くなる選択プールが確立される。エンドヌクレアーゼ遺伝子
は、しばしばメチルトランスフェラーゼ遺伝子と隣り合わせになっており、もし
そのように隣接していると、エンドヌクレアーゼ遺伝子（またはその一部）は、
しばしば回収される。この方法は「メチルトランスフェラーゼによる選択」法と
呼ばれる。次の三つの条件が成立すれば大いに有用である：同系メチルトランス
フェラーゼが存在する；前記二つ機能の遺伝子がＤＮＡ中で強く結合している；
そしてメチルトランスフェラーゼが大腸菌中で発現される。

【００２９】この基本的な方法にはいくつかの改変法が加わり、最初のクローンが完全なエ
ンドヌクレアーゼ遺伝子を含まない場合、または、エンドヌクレアーゼの移入が
可能になる前に、まず細胞にメチルトランスフェラーゼが発現される必要がある
場合（「二段階法」）に、エンドヌクレアーゼ遺伝子の単離を可能にする（Ｂｒ
ｏｏｋｓおよびＨｏｗａｒｄ、米国特許第５，３２０，９５７号（１９９４））
。

【００３０】縮重メチルトランスフェラーゼ−モチーフＰＣＲ法クローンライブラリー中に制限系遺伝子対が存在するかどうかを同定する第二
の方法は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼタンパク質中に存在する保存ポリペ
プチドモチーフエレメントが存在するかどうかに基づいている（Ｋｌｉｍａｓａ
ｕｓｋａｓら、，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７：９８２３〜９８
３２（１９８９）；Ｌａｕｓｔｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０６：３０５
〜３１２（１９８９）；Ｐｏｓｆａｉら、Ｇｅｎｅ７４（１）：２６１〜２６
５（１９８８））。この方法は、次の三つの条件が成立するときに最も有用であ
る：同系メチルトランスフェラーゼが存在する；前記二つ機能の遺伝子がＤＮＡ
中で強く結合している；そしてメチルトランスフェラーゼが大腸菌中で効果的に
発現されない。メチルトランスフェラーゼは、効果的に発現されないので、メチ
ルトランスフェラーゼ選択法は使用することができない。この代替の方法は、簡
単に言うと、次のようである：保存ポリペプチドモチーフエレメントのポリペプ
チド配列は、それぞれ問題のポリペプチド配列を指定することができるＤＮＡ配
列のプールに逆翻訳される。遺伝子暗号は縮重し、多くの場合、いくつかの異な
るＤＮＡ三文字暗号が同じアミノ酸を指定することができるため、このプールは
縮重したプールと呼ばれる。このように、ＰＣＰフラグメントの配列が決定され
、ハイブリッド化またはＰＣＲによってゲノムＤＮＡまたはクローンライブラリ
ー中の正しい配列の存在を検出する、縮重していない（唯一の）さらなるプライ
マーの設計を可能にする。そこで、隣接ＤＮＡ配列は、逆ＰＣＲ法またはサザン
ブロットスクリーニング法によって得ることができる。さらなる配列が得られ、
最後に完全な制限系を構築することが出来る。この方法は、メチルトランスフェ
ラーゼ遺伝子および隣接するエンドヌクレアーゼ遺伝子を単離するために単独で
も使用できるし、他の方法と組み合わせて使用することもできる。

【００３１】「メチラーゼインジケーター」ＤＮＡ損傷法メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むクローンを同定する別の方法（Ｐｉｅ
ｋａｒｏｗｉｃｚら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：１５０〜１５５（１９
９１）；Ｐｉｅｋａｒｏｗｉｃｚら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，
１９：１８３１−１８３５（１９９１）；ＰｉｅｋａｒｏｗｉｃｚらおよびＷｅ
ｇｌｅｎｓｋａ，ＡｃｔａＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｏ．４３（２）：２２９〜
２３１（１９９４））は、メチル化に依存する制限系Ｍｃｒａ、ＭｃｒＢＣおよ
びＭｒｒ（ＨｅｉｔｍａｎおよびＭｏｄｅｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９
＆７）：３２４３〜３２５０（１９８７）；ＨｅｉｔｍａｎおよびＭｏｄｅｌ，
Ｇｅｎｅ１０３：１〜９（１９９１）；Ｗａｉｔｅ−Ｒｅｅｓら，Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．１７３（１６）：５２−７〜５２１９（１９９１）；Ｒａｌｅｉ
ｇｈおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
３：９０７０〜９０７４（１９８６）；ＫｅｌｌｅｈｅｒおよびＲａｌｅｉｇｈ
，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３（１６）：５２２０〜５２２３（１９９１）
）およびｄｉｎＤ１：：ｌａｃＺオペロン融合に基づくもので、これによってメ
チルトランスフェラーゼ遺伝子を含むクローンのスクリーニングが可能になる。
ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢＣおよびｍｒｒにおける温度感受性変異株は、クローン化さ
れた外来遺伝子によるメチルトランスフェラーゼ活性の表現に対して高温で許容
性を示す。しかし、これらの制限機能が（低温で）活性な場合は、外来メチルト
ランスフェラーゼ酵素によってメチル化されたＤＮＡを開裂する。この開裂によ
って、内因性のＤＮＡの損傷を誘導する（ＳＯＳ）レギュロンの発現を誘導する
信号が発生する。つづいて、このレギュロン中の遺伝子の一つ（ｄｉｎＤ）とｌ
ａｃＺ遺伝子の間でｄｉｎＤ１：：ｌａｃＺ転写融合が誘導され、βガラクトシ
ダーゼが発現される。βガラクトシダーゼの作用により、コロニーがＸｇａｌを
含むプレート上で青色に変化させる。従って、高温で白色（または淡い青色）で
あるが低温では暗青色に変わるクローンライブラリーからのコロニーは、メチル
トランスフェラーゼクローンの候補である。

【００３２】Ｎ−末端配列／縮重ＰＣＲ法メチルトランスフェラーゼ遺伝子が同定できないとか、あるいはメチルトラン
スフェラーゼは同定できるが、エンドヌクレアーゼを指定する開放型読みとり枠
がはっきりしないことが起こるかもしれない。こうした例では、元の生物体から
十分な量と純度でエンドヌクレアーゼが精製できれば、エンドヌクレアーゼの遺
伝子を同定するためのさらに別の有用な手順が適用できる。この方法では、エン
ドヌクレアーゼポリペプチドは、均質になるまで精製され、Ｎ−末端ポリペプチ
ドの配列決定にかけられる。ポリペプチド配列は、該当する配列を指定すること
ができるＤＮＡプライマーのプールに逆翻訳される。これらのプライマーは、元
の生物体のゲノムＤＮＡまたはクローンライブラリーからのエンドヌクレアーゼ
遺伝子の部分を増幅するために使用される。

【００３３】この手順は、エンドヌクレアーゼ遺伝子部分を得るために単独で使用すること
もでき、あるいは、制限系の両要素の遺伝子部分を得るために、縮重トランスフ
ェラーゼ・モチーフＰＣＲ法（Ｍｏｒｇａｎ，米国特許第５，５４３，３０８号
（１９９６））のような他の方法と組み合わせて使用することができる。同系メ
チルトランスフェラーゼ遺伝子を得ることが出来ない場合や発現させることがで
きない場合は、単独エンドヌクレアーゼクローンの安定性と有用性は大幅に低下
する。このようなクローンは、同じか、または関連する配列を認識して、エンド
ヌクレアーゼがその認識配列を開裂するのを阻止するなら、元の宿主中でエンド
ヌクレアーゼと会合していなかった異種特異的メチルトランスフェラーゼ遺伝子
を使って、安定化させることができる（ＷｉｌｓｏｎおよびＭｅｄａ，米国特許
第５，２４６，８４５号（１９９３））。

【００３４】Ｅｎｄｏ−ｂｌｕｅ法同系メチルトランスフェラーゼ遺伝子の有無には関係なく、クローンライブラ
リー中にエンドヌクレアーゼ遺伝子が存在するかどうかを確認するためのさらに
別の方法は、ＤＮＡの損傷のリポーターを含む無制限宿主大腸菌株にライブラリ
ーを移入する方法である。この方法は、前記の「メチラーゼインジケーター法」
と関連しているが、使用される菌株はメチル化ＤＮＡに特異的な制限活性を含ま
ない。この例では、制限酵素の発現によって開裂が起きるため、メチルトランス
フェラーゼの作用と内因性の制限活性を通して誘導するのではなくて、直接にＳ
ＯＳレギュロン（およびｄｉｎＤ１：：ｌａｃＺインジケーター）を誘導する。
つづいて、βガラクトシダーゼを作用させれば、コロニーは、Ｘｇａｌを含むプ
レート上で青色に変色することになる。

【００３５】このインジケーターは、修飾メチルトランスフェラーゼがうまく発現されない
時に、制限エンドヌクレアーゼクローンを確認するのに使用することができ、エ
ンドヌクレアーゼの条件付き活性を得ることができれば、メチルトランスフェラ
ーゼの有無に関係なく、何らかのＤＮＡの損傷が起きる。たとえば、問題のエン
ドヌクレアーゼは、低い増殖温度で不活性であったとしても、温度を高くすれば
ある程度の活性は示す。後者の状況は、たとえば、通常は非常に高温で増殖する
超好熱菌中に元来発現されるいくつかの制限エンドヌクレアーゼで得られる（Ｆ
ｏｍｅｎｋｏｖら，米国特許第５，４９８，５３５号（１９９６）；Ｆｏｍｅｎ
ｋｏｖら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２（１２）：２３９９〜２
４０３（１９９４））。

【００３６】クローニングされた遺伝子中における遺伝子の発現の調節の背景ベクタープロモーターからの発現の調節非常に多くの例で、実験担当者側の問題は、新しい細胞環境で有用な量の遺伝
子産物を作るのに十分な発現を、クローニングされたＤＮＡから得ることである
。従って、外来ＤＮＡが移入されるべき位置を通して進行する高レベルの転写活
性を可能にする一つまたは複数のプロモーターを与える、利用可能な発現ベクタ
ーが多数存在する。しばしば、これらのベクターには、調節分子の遺伝子、たと
えば、移入されるプロモーターからの発現を調節することができる転写抑制因子
が移入され、あるいはこれらのベクターはそれ自体が調節因子を与える宿主生物
において使用される。このようにして、所望の発現を要求に応じて、すなわち特
定の発現を移入する間に、手に入れることが可能になる。多くのこのようなベク
ターは文献に記載されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（１９８９））。

【００３７】いくつかの例では、逆の問題が発生する：クローニングされたＤＮＡから発現
させた産物が、ある理由でそれを発現する細胞に毒性を示し、高レベルで発現さ
れるように設計された通常のベクターは、特異的な誘導がなくても、過度に多量
の毒性を発現する。従って、誘導なくきわめて高いレベルでクローニングされた
遺伝子を発現するよう設計されたベクターが記載されている。このようなベクタ
ーで最も良く知られたベクターは、大腸菌で使用するように設計されたＴ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼ依存発現系である（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．１８５：６０〜８９（１９９０））。この系の場合、クローニングされた
遺伝子は、いかなる内因性の大腸菌のＲＮＡポリメラーゼホロ酵素でも認識され
ない転写プロモーターから発現される。それに対して、使用されるプロモーター
は、バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼによって認識される。このポ
リメラーゼは、大腸菌ゲノムにコードされない。この系によって、要求されるＲ
ＮＡポリメラーゼがなくても毒性を持ったクローンの構築が可能になる。このよ
うにして、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をあらかじめ移入した好適な菌株に
そのクローンを移入することが可能になる。あるいは、ファージ由来のクローン
を感染させることによってポリメラーゼ遺伝子を移入することができる。

【００３８】固有のプロモータ類似配列からの発現阻止有毒タンパク質に関するもう一つの問題は、発現ベクターに移入された外来Ｄ
ＮＡ自身が、大腸菌の発現構造によって認識される配列を含む時に持ち上がる可
能性がある。ベクター／宿主の組み合わせによってもたらされる特異的な調節因
子は、クローニングされた配列内に由来するプロモーターの活性を調節しない。
いくつかの例では、この発現は、特異的なプロモーターの認識の結果であること
もあるが、単に、ＤＮＡ、特にＡ＋Ｔに富むＤＮＡに見られる偶発的なプロモー
ター類似の活性によって生じることもある（ＭｉｌｌｅｒおよびＳｉｍｏｎｓ，
Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４（６）：８８１〜８９３（１９９０））。こう
した例では、有益な制御方法は、ベクター中に、クローニングされたＤＮＡの翻
訳の方向に対向する調節可能なベクターを移入することである（Ｃｏｌｅおよび
Ｈｏｎｏｒｅ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３（６）：７１５〜７２２（１９
８９）：ＡｄｈｙａおよびＧｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｃｅｌｌ２９（３）：９３
９〜９４４（１９８２）；Ｅｌｌｅｄｇｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６（１０）：３６８９〜３６９３（１９８９）；Ｓｉｍｏｎ
ｓおよびＫｌｅｃｋｎｅｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：５６７〜６
００（１９８８）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＰｕｌｉ
ｃａｔｉｏｎＮｏ．ＷＯ９９／１１８２１（１９９９））。ポリペプチド
の発現に必要な方向とは反対方向の転写が高レベルで起こると、二通りに発現が
妨害される可能性がある。その第一は、発現に必要な方向の転写が封鎖される可
能性である。第二は、有毒タンパク質の発現に使用されるＲＮＡと、反対方向の
ＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）の間でＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが形成され、
翻訳が阻止される可能性である。

【００３９】厳格な調節のための発現ベクターへのクローニング特定の配列でＤＮＡを切断する制限エンドヌクレアーゼは、普通、保護的な修
飾メチルトランスフェラーゼと会合している。この方法の場合、このようなエン
ドヌクレアーゼに対する遺伝子は、パートナーのメチルトランスフェラーゼ遺伝
子がなくても単離される可能性が極めて高い。従って、このようにしてクローニ
ングされたカセットの極めて厳格な調節は非常に重要である。

【００４０】プールされたＰＣＲフラグメントをクローニングすることができる、細かく調
節される便利な発現プラスミド、ｐＬＴ７Ｋが使用できる（Ｒｏｂｅｒｔｓ、上
記（１９９９））。このベクターの場合、２種類の制御レベルが使用できる：す
なわち、発現を誘起することと、阻害作用を抑えることができる。Ｔ７遺伝子１
０プロモーターはクローニング部位の一方の側へ読みとる。発現に使用される宿
主細胞によってもたらされるＴ７ＲＮＡの発現と同様、ベクターによってもた
らされるＬａｃＩは、前記プロモーターからの発現を抑制する。Ｔ７ＲＮＡポ
リメラーゼのインヒビターを発現するｐＬｙｓＰを使って制御することもできる
。

【００４１】クローニングされたフラグメントによって指示される発現と、Ｔ７プロモータ
ーからの残った漏出発現をさらに抑制するため、λＰＬプロモーターは、ｐＴ７
からの発現と拮抗しながら、クローニング部位のもう一方の側へ向かって読みと
る。この拮抗転写は、熱感受性抑制因子のλｃＩ^８５７によって調節される。従
って、４０℃、ＩＰＴＧ不在下では、実質的に発現は認められない。３０℃では
いくらか漏出発現が観察される。３０℃で、ＩＰＴＧが存在すると、かなりのレ
ベルで発現を達成することが可能である。このベクターを使用することにより、
メチルトランスフェラーゼによる保護がなくても、（制限酵素ＰａｃＩおよびＮ
ｌａＩＩＩをコードする）ｐａｃＩＲおよびｎｌａＩＩＩＲ遺伝子を確立し、そ
れを発現することに成功している。

【００４２】発明の要旨本発明の一般的な目的は、多様性選択された遺伝子のクローンを得ることであ
る。本発明の具体的な目的は、アレイに存在し反復配列によって隔てられた遺伝
子カセットの同定とクローニングに適する反復配列を同定する方法を提供するこ
とである。７４メンバーを含むこのような反復配列ファミリーの具体的な一例は
、一つまたは複数のカセットアレイを含む４個の連続するＤＮＡ区間の配列と一
緒に与えられる。本発明のさらにもう一つの目的は、カセットの両側に隣接する
反復配列と混成するオリゴヌクレオチドによって指示されるＰＣＲ法によって、
このようなアレイからカセットをクローニングするための手順を提供することで
ある。このようなＰＣＲ法の具体的な一例を提供する。本発明のさらにもう一つ
の具体的な目的は、制限酵素のような有毒遺伝子を安定化させることができる発
現ベクターに、このようなＰＣＲ断片をクローニングするための手順を提供する
ことである。この手順によってクローニングすることが可能なこのような遺伝子
の具体的な一例を提供する。本発明のさらにもう一つの具体的な目的は、目的の
特定のクローニングされた遺伝子を確認する方法を提供することである。従って
、３種類の同定方法が提供される。すなわち、第一の方法は、タンパク質の配列
の類似性によって同定する方法である。第二の方法は、遺伝子の活性を間接的に
リポートさせる方法である。第三の方法は、生化学的な性質を直接試験する方法
である。この方法に従えば、ベクターｐＬＴ７Ｋの背景の中で、クローニングさ
れた発現可能なヌクレアーゼ遺伝子の間接的なリポートの提供を可能にする、２
種類の新規な菌株が、使用法と一緒に提供される。さらにもう一つの具体的な目
的は、その生化学的活性またはＤＮＡ配列があらかじめ分からなくても、活性な
制限酵素遺伝子の発現クローンを提供することである。このようなクローンを入
手する方法の具体的な一例を提供する。

【００４３】本発明は、特定の種類の高頻度で変化する遺伝子座に存在する遺伝子に関係し
ているため、これらがどのような種類の遺伝子かについて説明する。

【００４４】クローニング法に有用な遺伝子カセットの特徴インテグロンまたはスーパーインテグロンである高頻度変化遺伝子座の特定の
場合、これらの領域は多様性選択遺伝子を発見するための機構を提供する。これ
らの系が持つ特徴によって、制限酵素遺伝子を含め、ある種の遺伝子に富むＤＮ
Ａを単離すること、およびこのＤＮＡにコードされた産物のクローニング、配列
決定、発現が可能になる。

【００４５】カセットアレイの次に挙げる三つの特徴は、クローニングするために格別有用
である：・各遺伝子（まれに遺伝子対）は、予想可能な配列コンテキストに埋め込まれ
ている−特定種類のくり返しＤＮＡ配列は、各側に存在する。

【００４６】・このようなアレイに存在するほとんどの遺伝子は、両側に隣接する配列に対
して同じ方向にある。

【００４７】・カセットにコードされた遺伝子の発現は、しばしばカセットの外から指示さ
れる。

【００４８】これらの性質は、両側に隣接するくり返しエレメントから、ＰＣＲ法によって
クローニングされた遺伝子は元の状態を保ち、クローニングビヒクルに対して、
あらかじめ指定した向きを取り、クローニングビヒクル中で発現シグナルによっ
て調節することができる可能性を与える。その結果、一組のＤＮＡ断片が得られ
、操作可能な配列状況の中で、その断片の中に各遺伝子（まれに遺伝子対）は埋
め込まれ、クローニングに適する部位が、ＰＣＲプライマーの５’末端に挿入さ
れる。

【００４９】この反復配列で遭遇する問題点は、反復アレイのメンバーが縮重するため、ア
レイのメンバーのほとんどまたは全部に対してハイブリダイズするＰＣＲプライ
マーを設計することが困難なことである。従って、このような配列を非常に多数
所有して、ファミリー特異的な多重プライマーの設計を可能にすることが重要で
ある。反復配列のこのようなコレクションは、本発明に従って同定され特徴付け
される。

【００５０】これら反復配列の第二の問題点は、反復アレイの個々のメンバーが不完全な対
象要素を示し、その結果、設計されるＰＣＲプライマーは、ヘアピンまたはプラ
イマー二量体を形成してプライムＤＮＡ増幅が達成できなくなる可能性があるこ
とである。したがって、これらの特異性を示さない反復部分をアニールするプラ
イマーを設計することが重要である。本発明によれば、ハイブリッド形成が可能
なプライマー、または多くのカセットからの増幅を可能にするプライマーが提供
される。

【００５１】カセットにコードされた遺伝子の発現クローニングこの方法によって極めて多数の特徴付けされていないカセットが得られる可能
性がある。そのため、実験担当者にとっては、これらのカセットを通して目的の
機能を選び出す何らかの方法が必要となる。従って、本発明は、これらを国際出
願Ｗ／Ｏ９９／１１８２１号（Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９９））に記載されて
いる適当なベクター、たとえばｐＬＴ７Ｋベクタにクローニングすることによっ
て、たとえ有毒であっても、カセットにコードされた機能の発現を得る方法を提
供する。

【００５２】このベクターは、この適用において、（最初の特許において提供される利点に
加えて）二つの形態で使用することができるという利点を持つ。ＰＣＲプライマ
ー上のクローニング部位の配列に依存して、発現条件は、３０Ｃ＋ＩＰＴＧか、
４０Ｃ−ＩＰＴＧのいずれかとなりうる。抑制条件はそれとは逆にするのが適当
である。こうすることで、柔軟性が与えられ、温度に感応する活性を示す分子を
スクリーニングするか、または選定し、得られたクローンライブラリーの保存条
件を選択することが可能となる。

【００５３】ヌクレアーゼの活性の間接的なリポートを可能にする菌株ベクターｐＬＴ７Ｋによって要求されるＴ７−ＲＮＡＰに依存する調節の文脈
の中で、目的の少数派発現クローンの検出を可能にする機能試験法が提供される
。この試験法は、ｄｉｎＤ：：ｌａｃＺ対立遺伝子によってヌクレアーゼまたは
その他のＤＮＡ損傷活性を検出する。２種類の菌株が準備される：

【００５４】

【化２】

【００５５】前者は３０℃または４２℃で使用することができ、淡い青色コロニーの背景に
暗青色でＤＮＡの損傷を示す。後者は、３０℃ないし３７℃の範囲（両温度を含
む）で使用することができ、白色コロニーの背景に何らかの色合いを帯びた青色
でＤＮＡの損傷を示す。従って、発現が、Ｔ７ＲＮＡＰの存在下にｐＴ７によ
って推進され、λｐＬからの発現によって阻害されるような方向で、ｐＬＴ７Ｋ
（またはその誘導体）中にクローニングされたカセットライブラリーの活性を、
３０℃または３７℃の温度で（ＩＰＴＧの存在または不在で）前記両株のいずれ
かを使用して、また４０℃の温度で（ＩＰＴＧの存在または不在で）、ＥＲ２７
４６でなくＥＲ２７４５を使用して、スクリーニングすることができる。いずれ
の場合も、コロニーの色が他より青味を増し、そして、最初の形質転換細胞の単
一コロニー誘導体として再単離した時にこの性質が安定していれば、活性が存在
していることを示す。

【００５６】これらの菌株は、ヌクレアーゼ以外の酵素を含め何らかの作用因子、化学物質
または放射線によって引き起こされるＤＮＡの損傷を試験するのに、同じように
使用することができるであろう。損傷が、これらの菌株の中で得られるようなＴ
７ＲＮＡポリメラーゼ発現の調節された状態変化に応じて結果をもたらした時
に、これらの菌株の有用性は最も明確に現れる。

【００５７】この方法を適用することのできる遺伝子の種類本発明に従えば、本発明が有益である遺伝子の種類に制限がある。ある種の遺
伝子は、カセットアレイに存在する可能性が高いのに対してその他の遺伝子は、
それらに存在しない可能性が高い。機能が分かっている最初のカセットは、薬物
またはその他の抗細菌剤に対する耐性をすべて指定した。インテグロンが薬物耐
性以外の機能の広がりを仲介しないと仮定する先験的な理由はない。このような
アレイに濃縮されている可能性が高い遺伝子のタイプは、個々にまたは対の形で
有益な、そして選択的な価値が極めて変動しやすい機能を含んでいる。典型的に
、このような遺伝子は、ある時は非常に重要であるが、それ以外の時は有益でな
い、強い一時的な選択を受ける。場合によっては、そのような遺伝子は、細胞が
生き残るために一時的に不可欠的であったり−必要であったりする：薬物抵抗因
子、制限−修飾系。また場合によっては、そのような遺伝子は非常に高い選択的
な価値を持つが、生き残るにはそのままでは必要ない。例には、豊富な環境で細
胞が特定の表面に接着する特異的な接着；細胞環境で豊富な物質を修飾してそれ
を栄養として利用できる形に変換する特定の酵素；または、宿主生物と相互作用
する特定の有毒分子が含まれよう。特定の種の多くの個々のメンバーは、共通す
る一般的な性質（物に粘着する接着）を持つ遺伝子産物を作り出す。しかし、重
要な遺伝子産物の重要な特徴は、集合の中で非常に変動しやすい特異性を有する
例が見られることである（岩石から腸管粘膜そしてさらに泌尿器の内皮まで、接
着する特異的な表面には多くの異なった種類がある）。

【００５８】従って、カセットアレイは、前記したような多様性に対して選択を受ける遺伝
子が濃縮される。すなわち、集団の中で希少の時は有益であるが、頻出する時は
取り立てて役には立たない遺伝子；および一時的に必要とされる遺伝子である。

【００５９】このようなアレイに存在しないと予想される遺伝子のタイプには、細胞維持機
構の基本的要素のすべてが含まれる：ＤＮＡレプリカーゼ、基本的な転写因子、
たとえば増殖期ＲＮＡポリメラーゼ、翻訳機構、細胞生理学の中心を成す小さい
分子代謝の酵素、たとえば、トリカルボン酸サイクルの酵素。これらの遺伝子は
、次に述べる二つの理由で存在しないだろう。第一に、たとえば細胞の集合に対
して使用可能な対立遺伝子のプールにおけるような、変化の起こり易さを維持す
ることからは、選択的な利点は期待されない。第二に、多くのそのようなタンパ
ク質は、数種類の異なるタンパク質相互の特異的な相互作用（たとえばレプリカ
ーゼ／ＲＮＡポリマーゼ／翻訳開始因子の間の相互作用）を維持（保存）しなけ
ればならない。

【００６０】図面の簡単な説明図１は、特徴付けされたインテグロン、反復配列（黒塗りの四角；５９ｂｐエ
レメント）によって隔てられた遺伝子カセットのアレイ（細い線；ｆｎ１，ｆｎ
２，ｆｎ３）の構造の模式図である。これらは、染色体外サークル（カセット）
のａｔｔＩ（矢印）への挿入による部位特異的インテグラーゼ（大きな四角；ｉ
ｎｔＩ）の作用によって組み立てられる。インテグラーゼ遺伝子（矢印）内でプ
ロモーターからカセットが転写される。多くのインテグロンが、インテグロン自
体の一部ではないスルホンアミド耐性保存遺伝子と会合している。

【００６１】図２は、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ中に同定されたスーパーインテグロ
ンの断片の略図である。開放型読み取り枠（１〜９およびｍｒｈＡ，ｍｒｈＢ）
は、インテグロンの５９ｂｐエレメントに類似する反復（四角）によって隔てら
れている。

【００６２】図３Ａ〜３Ｅは、ＰＡＲエレメントのいくつか（配列番号９６〜配列番号１１
６）のアライメントである。これらは実施例１に記載したモチーフ探索法によっ
て１（配列番号１）を含むスーパーインテグロンで同定された。コンセンサスの
ラインは、アライメントのエレメントの全部（一番上のライン）、９０％（２番
目のライン）または大半（３番目のライン）の塩基が共通する。個々のエントリ
ーは、図示されているｂｐ以外は大半が共通するコンセンサスと同じである。

【００６３】図４は、反復配列を同定するためのもう一つの方法であるドットプロットの図
である。

【００６４】図５は、個々のＰＡＲエレメントの自己相補性を示す図である（ＧＣＧプログ
ラムセットにおけるＦＯＬＤの出力のＳＱＵＩＧＧＬＥ表示）。

【００６５】図６は、表１に示す本明細書のＰＡＲエレメントのセット（配列番号５〜配列
番号７８）の中で同定可能なサブファミリーのアライメント。パネルＡ〜Ｄ、フ
ァミリー１〜４。ＰＡＲ２は、同定された要素の中で最も関係が薄いので、各フ
ァミリーアライメントの中ではグループ外にある。７４個のエレメントのＣＲＵ
ＳＴＡＬアライメントから生成させた系統樹の中でブッシーグループとして識別
される。

【００６６】図７は、すべてのＰＡＲエレメントの大部分のコンセンサスおよび典型的なカ
セットに関係するサザンブロット（パネルＡ）およびＰＣＲフィンガープリント
表示（パネルＢ）に対して使用されるオリゴヌクレオチドの位置を示す。

【００６７】図８は、オリゴヌクレオチド２〜５（配列番号７９〜配列識別番号８３；図７
、表２も参照）の混合物のＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓＤＮＡへのハイブリッ
ド化のサザンブロットを示す。

【００６８】図９は、図７に示したオリゴヌクレオチド６および７を使用した６種類のＰｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ種の単離株の染色体ＤＮＡから生成したＰＣＲ生成物のアガ
ロースゲル電気泳動パターンを示す。

【００６９】図１０は、カセットにコードされた開放型読み取り枠のクローンライブラリー
を作製するためのスキームとｐＬＴ７Ｋからのそれらの産物の発現を示す。

【００７０】発明の詳細な説明本発明の一つの実施態様に従えば、カセットアレイに存在する多様性選択遺伝
子を直接的にクローニングし、発現させるための新規方法が提供される。一般に
、本法は、以下に述べる段階を含むが、もちろん当業者が認めるところに従って
、本発明の範囲から逸脱することなく、これらの段階に変更を加えることができ
る。

【００７１】１）目的の遺伝子のクラスを確認し、そのクラスが本法に適合するかどうかを
評価する。

【００７２】本発明の一つの実施態様において、望ましい遺伝子は、制限エンドヌクレアー
ゼおよび修飾メチルトランスフェラーゼに関する遺伝子である。カセットアレイ
に濃縮される可能性の高い遺伝子のタイプは、個別に、または対の形で生物体に
有益かつ、選択的な価値が極めて変化しやすい機能を含む。機能とは、ある生物
種の異なる単離株を調べて、機能またはその特異性の存在が、収集した単離株の
中で変動する場合に、そのようなアレイの中の遺伝子によってコードされる可能
性の高い機能であると認識することができよう。たとえば、大腸菌の単離株を調
べると、すべてではないが多くの単離株がタイプＩＩの制限酵素を発現すること
；そして、発現する単離株の中で、酵素の特異性（認識される配列）は変動し、
種の中で多くの異なる特異性が決定されることが判明する。このような変動を受
ける機能の候補としては、制限酵素に加えて、細胞表面の抗原、たとえば、多糖
抗原またはポリペプチド抗原または分泌される分子；各種の接着分子、たとえば
フィンブリンタンパク質、線毛タンパク質または外膜タンパク質；小分子輸送体
、特に特異性の狭い輸送帯；放出される機能、たとえば毒素、ヘモリシン、ヘマ
グルチニン、キナーゼおよびシグナル分子；解毒酵素、たとえば薬物耐性決定因
子、一時的に使用可能になる化合物（トリカルボン酸サイクルのような中心代謝
回路に要求される化合物は除く）に対して特異的な異化酵素；希少な糖（リボー
ス、デオキシリボースおよび細胞壁を構成する糖のように、すべての細胞で要求
される糖は除く）、特に周辺細胞外皮の一部を形成する糖を生合成するための酵
素を挙げることができる。

【００７３】本発明の一つの実施態様において、望ましい遺伝子は、制限エンドヌクレアー
ゼおよび修飾メチルトランスフェラーゼに関する遺伝子である。典型的なそのよ
うな遺伝子は、一時的に強い選択を受け、ある時期には非常に重要であるが、そ
れ以外の時期には役に立たない遺伝子である。制限機能は、外来ＤＮＡ（たとえ
ば、バクテリオファージが細胞に侵入した場合）の侵入に対して強力に保護する
ことができる。この保護は、バクテリオファージが宿主と同じ制限機能を運び込
まなかった場合にのみ有効である。そうでない時は、そのＤＮＡは既に、侵入さ
れた細胞の保護修飾パターンを運んでいると考えられる。従って、個体群は、制
限修飾系の広範な特異性を運搬するはずであり、進化の時間スケールで速やかに
それらを切り換えるに違いない。この予想に一致して、プラスミドには多くの制
限系が見られる。インテグロン様構造は、プラスミドのような外部供給源から制
限系を獲得する簡単な道を提供するが、それはうまく確立しないかもしれない。
反復エレメントが存在すると高い損失率の機構が与えられ（複製の過程で不等乗
り換えまたは滑りによる誤対合）、それによって、細胞による制限修飾系の補完
に高い流動性が付与される。

【００７４】２）ＤＮＡの調製ゲノムＤＮＡは、目的の菌株または菌株集合体または環境から採取した菌から
、当業者によく知られた方法に従って調製される。このような入手源から得たゲ
ノムＤＮＡのプラスミド、コスミド、ＢＡＣまたはＰＡＣクローンのＤＮＡを調
製する。

【００７５】３）本発明の方法に使用する調製ＤＮＡの適合性調製ＤＮＡの適合性は、反復配列アレイの存在を決定することによって評価さ
れる。それに好適な方法は、サザンブロットハイブリッド形成、実施例１に挙げ
るハイブリッド形成プローブまたはＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲフィンガ
ープリント法である。実施例１に挙げた配列、または実施例１に記載する方法で
同定される別の特定な反復配列を基にして、他の適当なプライマー対を考案して
も良い。ハイブリッド形成シグナル、ＰＣＲ産物、または両者が得られる場合は
、その調製ＤＮＡは使用に適している。好ましい実施態様では、非プルーフリー
ディングＤＮＡポリメラーゼを使用し、プライマー／テンプレート比、アニーリ
ング温度、マグネシウムイオン濃度および時間を変えて、ＰＣＲの条件が最適化
される。

【００７６】４）カセットの単離調製ＤＮＡを、カセットの両側に隣接し、プラスミドベクターへのクローニン
グと両立しうるエンドヌクレアーゼに対する部位を５’末端側に含む反復配列に
対してプライマー対のアニーリングを使用するＰＣＲにかける。好ましいプライ
マーの対としては、実施例２に挙げられているものが含まれる。実施例１に記載
されている他の適当な配列や、文献に記載されている他の特定の反復配列に基づ
いて、または実施例１に記載の方法によって他の適当なプライマー対を設計して
も良い。好ましい方法においては、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼを
使用し、プライマー／テンプレート比、アニーリング温度、マグネシウムイオン
濃度および時間を変えて、ＰＣＲの条件が最適化される。ＰＣＲフラグメントは
、たとえば、市販のキットを使ったサイズ分画法によって精製し、プライマーが
除かれる。

【００７７】５）カセットのクローニングクローニングを行うには、一つの好ましい方法により、ＸｈｏＩおよびＸｂａ
Ｉを使用して、適当な制限エンドヌクレアーゼでＰＣＲ断片を消化する。消化し
たフラグメントを適当なベクターに連結させる。この目的に使用するベクターが
備えるべき好ましい性質は次に述べる二つである。その第一は、フラグメントの
指向性クローニングを可能にするクローニング部位を含むことである。指向性ク
ローニング法は、複製開始点を含むベクター主鎖の一方の端における一本鎖の伸
張と、もう一方の端における一本鎖の伸張とがハイブリッド形成しないように、
異なる制限酵素でベクターを切断し、それから、ベクター主鎖の一方の伸張一本
鎖とハイブリッド化する伸張鎖を一方の端に持ち、ベクター主鎖の他方の伸張一
本鎖とハイブリッド化する伸張鎖を他方の端に持つＤＮＡフラグメントをベクタ
ーの主鎖に連結する工程を含む。部位特異的再結合酵素の使用と、制限酵素によ
る切断以外の方法によって与えられる伸張鎖のハイブリッド形成とを含む、別の
指向性クローニング法を構想することもできる。第二に、好ましいベクターは、
別々に調節が可能な二つの発現シグナルを含み、それらは前記のクローニング位
置の各側に一つずつ位置し、クローニング部位に存在する配列の発現に向けられ
る。一つの好ましいベクターは、ｐＬＴ７Ｋである（Ｒｏｂｅｒｔｓら、国際出
願ＷＯ９９／１１８２１（１９９９））。別のベクターは、ｐＢＲ３２２、ｐ
ＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＳＣ１０１、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１またはそれ
らの誘導体である。

【００７８】６）菌株の選択連結させた産物は、所望の機能をコードするカセットを選抜または選択するの
に好適な株に形質転換される。この目的のための菌株は、選択したベクターによ
って与えられる発現調節シグナルと両立しうるものでなければならない。さらに
、所望のカセットを同定するために当該の方法が使用できなければならない。

【００７９】最も単純な場合では、多数のクローニングしたカセットを配列決定し、それか
ら配列情報を生体情報学的な方法によって評価することによって、目的のカセッ
トを同定する。このような方法は、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡといった類似性を決
定するアルゴリズムを使って、カセットにコードされた配列と公開されたまたは
私的なデータベースとの整合性を取ること、またはＰＲＯＳＩＴＥプロフィール
データベースもしくはＢＬＯＣＫＳおよびＰＲＩＮＴＳデータベースなどを使っ
てモチーフまたはパターンに基づいてカセットにコードされた配列を検索するこ
とによって、前記の整合性を取ることを含む（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｈａｎ
ｄｅｌ，Ｍ．（１９９８））ＴｒｅｎｄｓＧｕｉｄｅｔｏＢｉｏｉｎｆｏ
ｒｍａｔｉｃｓ，ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕ
Ｋ）。この例では菌株またはベクターの選択にほとんど制約はない。

【００８０】他の例では、目的のカセットは、ＰＣＲまたはハイブリッド形成など、配列に
基づく方法によって同定される。これらの例も、菌株またはベクターの選択にほ
とんど制約はない。

【００８１】好ましい実施態様では、目的のカセットは、生体内で発現される活性によって
同定される。この例では、菌株またはベクターの選択は制約を受ける：すなわち
、ベクターおよび菌株は、両立しなければならず、カセット発現の適切な調節を
可能にしなければならない。発現されるべき活性の種類も菌株の選択に制約を加
える。

【００８２】一つの実施態様においては、発現させるべき活性は、修飾メチルトランスフェ
ラーゼ活性または制限エンドヌクレアーゼ活性であって、両活性は、細胞内ＤＮ
Ａに加えられた損傷およびＤＮＡ損傷修復応答の誘導に基づく活性の間接リポー
トによって同定しなければならない。２種類の好ましい菌株ＥＲ２７４５：

【００８３】

【化３】

【００８４】およびＥＲ２７４６：

【００８５】

【化４】は、ベクターｐＬＴＫ７と両立可能な菌株である。

【００８６】ＥＲ２７４５は、通常Ｔ７ＲＮＡＰ指向発現に使用される特定の菌株のバッ
クグラウンドから誘導され、最終的には大腸菌Ｂの誘導体である。この菌株のバ
ックグラウンドのタンパク質発現性については良く分かっている。この菌株はＤ
ＮＡで形質変換することができるが、得られたそのレベルは他の菌株と比較して
低い。ＤＮＡの損傷がなくて発現されるインジケーターｌａｃＺの量は比較的高
く、損傷が起こっていなくてもＸｇａｌのプレート上で淡青色のコロニーが認め
られる。

【００８７】ＥＲ２７４６は、熱感応性ｌａｃＺ部分を持っている。この菌株は、元のｄｉ
ｎＤインジケーター対立遺伝子によって観察されるＸ−ｇａｌ上での淡青色のバ
ックグラウンドを弱めるので有用である。何らかの損傷を誘導する（目的の）ク
ローンと損傷を誘導しない（目的のものでない）クローンの間の識別は、この状
況で改善される。しかし、インジケーター融合のｌａｃＺ構造は不活性で、ＤＮ
Ａの大きな損傷があっても白色のままであるため、この対立遺伝子は、高温（≧
３７℃）でＤＮＡの損傷を検出するのに使用することができない。この点は、Ｘ
−ｇａｌを含むプレート上で、さまざまな温度で行った、十分に特徴付けされた
ＤＮＡ損傷剤、ナリジキシン酸による青色呈色試験によって裏づけられた。

【００８８】この系のさらなる高性能化が可能である。たとえば、手間のかかるスクリーニ
ングに代わって、損傷誘導プロモーターに対する薬物耐性遺伝子の転写融合によ
って、目的のクローンの選択的な単離が可能になるはずである。もしそうであれ
ば、使用する薬物の濃度に応じて、ＤＮＡ損傷活性レベルの異なるクローンの単
離が可能になるだろう。もしｒｅｃＤ突然変異を移入すれば、細胞の主要なＡＴ
Ｐ依存性二本鎖エキソヌクレアーゼを不活性化し、ｘｔｈ突然変異を移入すれば
、主要なＡＴＰ非依存性二本鎖エキソヌクレアーゼであるＥｘｏＩＩＩを不活性
化するものと思われる。ヌクレアーゼが三重に欠損した菌株であっても生存可能
であろうが、プラスミドを安定に維持することはできないかもしれない（Ｎｉｋ
ｉら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２４（１）：１〜９（１９９０））。

【００８９】使用可能なＤＮＡの損傷を誘導する別のプロモーターは次に挙げる文献に記載
されている（Ｌｅｗｉｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：３３７７〜３３
８５（１９９２）；Ｌｅｗｉｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４１：５０６〜５
２３（１９９４））。これらのプロモーターは、ｒｅｃＡ，ｌｅｘＡ，ｕｖｒＡ
，ｕｖｒＢ，ｄｉｎＧ，ｐｏｌＢ，ｕｖｒＤ，ｒｕｖＡＢ，ｕｍｕＤＣ，ｓｕｌ
Ａ，ｄｉｎＨ，ｄｉｎＩ，ｓｏｓＡ，ｓｏｓＢ，ｓｏｓＣ，ｓｏｓＤである。同
定されたＳＯＳ誘導可能なその他の遺伝子としてはｒｅｃＮ，ｄｉｎＢ，ｄｉｎ
Ｆを挙げることができる（Ｗａｌｋｅｒ，ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＲ
ｅｖｉｅｗ，４８：６０〜９３（１９８４））。使用可能な別のいくつかのイン
ジケーター／リポーター遺伝子は次の文献に報告された（Ｆｏｍｅｎｋｏｖら，
前記（１９９５））。

【００９０】７）カセットの同定：エンドヌクレアーゼ遺伝子選択されたベクターに連結させたカセットを、形質転換またはエレクトロポレ
ーションによって選択された菌株に移入し、それから形質変換体を平板法により
適当な培地で培養する。好ましい手順によれば、ベクターはｐＬＴ７Ｋ、菌株は
ＥＲ２７４６、培養基はアンピシリンを添加したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培
地、そしてインキュベーション温度は４０℃である。コロニーは、ＩＰＴＧを添
加（０．１ｍＭ〜１ｍＭの範囲で濃度を変え）または無添加で、Ｘｇａｌを含む
培地でレプリカ平板法で培養し、一組のレプリカを３０℃、３７℃、４０℃の各
温度でインキュベーションする。これらの条件は、完全な誘導と陽性反応をもた
らす条件（３０℃、高濃度のＩＰＴＧ）から、完全な抑制と陰性反応をもたらす
条件（熱感応性ｌａｃＺ対立遺伝子のため、たとえ誘導された細胞であっても青
色に呈色しないだろう）（４０℃、ＩＰＴＧ無添加）までを網羅する。いかなる
条件でも青色を呈すればそのコロニーはヌクレアーゼ遺伝子の候補である。青色
が濃くなるほどＤＮＡ損傷活性は大きい。

【００９１】そこで、個々のコロニーは、最初の配列を回収できるようにするため損傷条件
にかけず、保存のために作られた少量培養液（抗生物質を添加した１０ｍｌＬ
Ｂ培地）と調製プラスミドで増殖させたマスタープレートから回収することがで
きる。

【００９２】発現条件を反転させ、抑制条件を３０℃＋ＩＰＴＧとし、誘導条件を４０℃−
ＩＰＴＧとするには、ｐＬＴ７Ｋを使用し、ＰＣＲのためにオリゴヌクレオチド
プライマーに加えられたクローニング部位を切り換えて、カセットが反対向きと
なるようにすれば、簡単に実現することができる。これは、誘導されることがな
いコロニーの保存を容易にするために望ましいことかもしれない。損傷を誘発し
うる融合は、４０℃で陽性反応を可能にする野生型ｌａＺ対立遺伝子を運ぶため
、ＥＲ２７４５が好ましい菌株である。その場合、所望のコロニーの色は、普通
の淡青色より濃色の青色である。

【００９３】再形質転換に続いてレプリカ平板法のマスターから継続するか、保管されたプ
ラスミドＤＮＡから継続しながら、同定されたプラスミドに対してさらなる特徴
付けを行う。その特徴付けには次に挙げる三つの段階の一部またはすべてが含ま
れる。

【００９４】粗製抽出物アッセイ。ＤＮＡ損傷スクリーニングにおいて正のクローンを、後
期対数期に対してはＬＢ＋アンピシリン中、４０℃−ＩＰＴＧ（非誘導条件）の
中規模培養（２０〜２００ｍｌ）で増殖させ、その後４時間クローン同定条件の
誘導（通常、３０℃＋ＩＰＴＧであるが、半誘導条件も可能である）に切り替え
る。この手順は、天然の宿主Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（Ｄ．Ｂｙｒｄ、ｐｅ
ｒｓｏｎａｌｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）の発現量と類似のＰａｃＩの量を
発現させることに成功した。次いで、細胞を遠心分離によって回収し、緩衝液中
に懸濁し、リゾチーム−ＥＤＴＡ処理によって溶解し、遠心分離によって明澄化
する。

【００９５】次いで、粗製抽出上清を、標準的なプラスミド、ファージ、およびウイルスＤ
ＮＡ（ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１８７、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＢＲ３２２、Ｍ１
３ｍｐ１８複製可能形態のＤＮＡ、λＤＮＡ、またはＴ７ＤＮＡなど）を用いた
、３７℃〜６８℃での４〜６塩基切断物についての一般的なスクリーニングにお
けるヌクレアーゼ活性についてアッセイする。同様に、この方法によっていくつ
かの８塩基特異性を検出することができる。

【００９６】ＤＮＡ消化パターンを、２００ｋｂと０．０５ｋｂとの間でのバンドの視覚化
に適切なアガロース濃度（通常、０．７％アガロースおよび１．３％アガロース
）を用いたアガロースゲル電気泳動によって分離し、臭化エチジウム染色で検出
する。

【００９７】次いで、ＤＮＡ消化パターンを評価し、認識配列を当該分野で公知の方法によ
って同定する。従って、これらの方法を適用するために同定したエンドヌクレア
ーゼのさらなる精製が必要であり得る。

【００９８】粗製抽出上清を、以下の種々のＧＣ含量の染色体ＤＮＡを用いた、８塩基部位
を有する酵素のｉｎｖｉｔｒｏスクリーニングにおいてもアッセイする：６６
％〜３４％のＧ＋Ｃ範囲のＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、
大腸菌、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓが希少な部位を有
する種々の酵素の検出に適切である。通常、特異的フラグメント（特に、大型）
は更なる消化に供されないので、非特異的ヌクレアーゼと８塩基エンドヌクレア
ーゼを区別可能である。フラグメントがゲルで分離されなくとも（認識部位を予
想することができない）、結果は、非特異的ヌクレアーゼ（優先的に大きなフラ
グメントを分解する）によって産生される結果と認識可能に異なる。各々の場合
、抽出物のアリコートを、Ｍｇ^＋＋の存在下で潜在的なＤＮＡ基質とインキュベ
ートし、アガロースゲルで分離し、臭化エチジウムで染色する。

【００９９】次いで、染色体消化では正の結果であるが標準的な基質の消化では正の結果で
はない単離物を、正の結果を生じる染色体ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量によって導かれる
、別の基質の検索によってさらに特徴付ける。

【０１００】パルスフィールドゲルアッセイ。８塩基認識部位についての潜在的により情報
を得られるアッセイは、パルスフィールドゲルによる全染色体フラグメントの分
離に依存する。粗製抽出物をスクリーニング法に使用した場合、これらのゲルは
、非常に扱いにくいか、一般に有用である抽出物における他のヌクレアーゼに非
常に感受性が高い。

【０１０１】標準的な手順では、基質ＤＮＡは、アガロースプラグ中への全細胞の第１の包
埋によって得られる。ＤＮＡを、細胞壁を分解する一連の酵素処理および洗浄に
よってｉｎｓｉｔｕで細胞から放出させる。ついで、制限エンドヌクレアーゼ
を、プラグと共にインキュベートする。酵素がアガロースおよびその前の消化の
残遺物を浸透しなければならないので、通常、これは数時間を要する。

【０１０２】本方法では、制限ヌクレアーゼ消化工程は、アガロースゲル添加前の細胞内発
現の誘導、アガロースへの細胞の包埋、およびパルスフィールドゲルでの細胞の
電気泳動からなる。対照には、陽性対照、精製ＰａｃＩおよびＮｏｔＩをアガロ
ースプラグ中に包埋した宿主ＤＮＡの標準的な消化物、および陰性対照、実験サ
ンプルと並行して処理された、空のベクターを含む宿主のサンプルが含まれる。

【０１０３】本調査のこの部分に使用される菌株の可能な改良には、細胞の主要なＡＴＰ依
存性二本鎖エキソヌクレアーゼを不活化するｒｅｃＤ変異の移入および主要なＡ
ＴＰ独立性二本鎖エキソヌクレアーゼを不活化するｘｔｈ変異の移入が含まれる
。３重ヌクレアーゼ欠乏菌株（ｅｎｄＡｘｔｈｒｅｃＤ）は生存できるはず
であるが、プラスミドを安定に維持できない（Ｎｉｋｉ、前出、１９９０）。

【０１０４】次いで、従来のパルスフィールド分析を行うことができるように、本方法で同
定された単離物を、カセットコードポリペプチドの更なる精製および過剰発現を
行う。

【０１０５】フィンガープリント法。間接レポートアッセイによって得た候補クローンから
調製したプラスミドＤＮＡを、制限酵素消化によってフィンガープリント法を行
った。各候補を、４塩基認識部位を有する２〜４つの酵素（例えば、ＨａｅＩＩ
ＩおよびＭｓｅＩが好ましい）で別々に消化してクローン化カセットに特徴的な
パターンを得る。

【０１０６】配列決定。次いで、粗製抽出物またはパルスフィールドゲルアッセイによって
帯状のパターを示した全てのプラスミドを、配列決定する。

【０１０７】フィンガープリント法を行ったすべてのプラスミドをフィンガープリントによ
って分類する。予備的な相同性検索を行うために十分な信頼性を持たせるために
は、最低３倍の配列対象が必要である。

【０１０８】Ｔｎ７ベースの転座システムＧＰＳ^ＴＭ−１（ＮＥＢカタログ番号１７００、
ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）
を用いて配列決定を行った。本システムは、目的のプラスミド中の無作為な位置
でのプライマー結合部位の移入、トランスポゾン内で切断する希少な切断物での
消化による挿入位置の迅速なマッピング、および目的のフラグメント内での挿入
配列が可能である。これらの標的分子を用いて、約２０％のトランスポゾン挿入
が目的の配列内で見出される。ほとんどの場合、カセットは通常２ｋｂよりも小
さいので、多くの場合６未満の適切な挿入が必要である。隣接するベクタープラ
イマーから２つの配列（５００ｂｐ／配列）および挿入由来の１２配列により、
７０００ｂｐの未加工の配列（約３倍の重複性）を得た。これは、最初の分析と
しては十分である。最も興味深いフラグメントの質の高い配列を得るために更な
る配列決定を行うことができる。

【０１０９】プライマーウォーキング、ネスト化欠失構築などの別の配列決定法、またはＰ
ｒｉｍｅｒＩｓｌａｎｄｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）などのトランスポゾ
ンベースの方法などの別法を使用することができる。

【０１１０】配列の評価：公的なデータベース中の遺伝子に対する相同性は、新規のＩＩ型
ＲＭ遺伝子の候補の排除の一助となる。本方法で回収されるべき遺伝子の多数は
保存されたアミノ酸セグメントを示す：トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、接合プ
ラスミド伝達に関連するニック酵素、およびトランスポザーゼは全てＢＬＡＳＴ
または他の相同性検索方法によって同定されるデータベースに注釈がつけられて
いることを見出すことができる。これに反して、ＩＩ型制限酵素の遺伝子は、本
方法でほとんど同定することができない。これらが相同性によって同定すること
ができる場合、そのほとんどがデータベース中の酵素（として同一の部位を認識
する）のアイソシゾマーである（Ｒ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、ｐｅｒｓｏｎａｌｃｏ
ｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）。従って、相同性検索によって同定されない遺伝子中
の標的遺伝子（新規の特異性を認識するエンドヌクレアーゼ）を、予想すること
ができる。

【０１１１】２．カセット同定：メチルトランスフェラーゼ遺伝子の獲得好ましい手順では、所望の機能はメチルトランスフェラーゼ遺伝子であり、こ
れは、上記の当該分野で公知の方法によって選択またはスクリーニングすること
ができる。

【０１１２】Ａ．メチラーゼ選択法適切な特異性を有するエンドヌクレアーゼが利用可能な場合、本方法を使用す
ることができる。潜在的なメチルトランスフェラーゼ酵素の特異性について何か
公知であるか疑いがあり、適切なエンドヌクレアーゼが利用可能な場合、本方法
は適用可能である。このようなエンドヌクレアーゼは、関連部位のサブセットを
認識する異種エンドヌクレアーゼであり得る。

【０１１３】Ｂ．メチルトランスフェラーゼインジケーター。使用されるベクターが以前に
記載の菌株（Ｐｉｅｋａｒｏｗｉｃｚら、前出、１９９１、Ｐｉｅｋａｒｏｗｉ
ｃｚら、前出、１９９１、ＰｉｅｋａｒｏｗｉｃｚａｎｄＷｅｇｌｅｎｓｋ
ａ、前出、１９９４）と適合する場合、本方法を使用することができる。ただし
、ＰｉｅｋａｒｏｗｉｃｚａｎｄＷｅｇｌｅｎｓｋａ、前出、１９９４で同
定された菌株におけるｄｉｎＤ：：ｌａｃＺインディケーター対立遺伝子の位置
は、３７℃を超える温度で表示することができないので、その温度またはそれ以
下の温度での青色の存在でのみ評価されるべきである。これら由来の他の菌株を
、ｐＬＴ７Ｋなどの他のベクターの使用が可能なように構築することができる。

【０１１４】Ｃ．変性メチルトランスフェラーゼ−モチーフＰＣＲ本方法を単独で用いるか、変性メチルトランスフェラーゼ−モチーフプライマ
ーを、一方向での隣接反復にアニーリングした反復特異的プライマー（上記のＰ
ＣＲフィンガープリント法またはカセットクローニングで使用されるプライマー
）と組み合わせることができる。

【０１１５】Ｄ．生化学的方法メチルトランスフェラーゼ遺伝子存在の他の評価法には、特異的ＤＮＡ配列へ
の^３Ｈ−ＳＡＭ組込みの評価などの酵素活性の検出が含まれ、各クローンまたは
クローンのプールに適用することができる。

【０１１６】Ｅ．ハイブリッド形成法コロニーリフトなどのハイブリッド形成検出法を使用して利用可能なメチルト
ランスフェラーゼ遺伝子またはその遺伝子配列に基づいて設計されたオリゴヌク
レオチドに対して高いＤＮＡ相同性レベルを有する遺伝子の存在を検出すること
ができる。

【０１１７】本発明は、以下の実施例によってさらに例示される。これらの実施例は、本発
明の理解を目的とするのもであって、本発明を限定するものではない。

【０１１８】上記または以下に記載の引例は、本明細書中で参考として援用される。

【０１１９】実施例１反復配列の同定およびカセットの獲得本実施例は、候補反復配列の一般的な同定ストラテジーを概説する。特異的な
反復配列ファミリー、類似の反復を含む生物の同定用のプローブ、および遺伝子
カセットの複製用のプライマーもまた提供する。

【０１２０】Ａ）スーパーインテグロンアレイの部分のクローニングＰａｃＩおよびＰｍｅＩを発現する生物をＮＥＢで単離した（Ｐｏｌｉｓｓｏ
ｎに付与された米国特許第５，０９８，８３９、１９９２、Ｍｏｒｇａｎおよび
Ｚｈｏｕに付与された米国特許第５，１９６，３３０号、１９９３）。これらの
制限酵素を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ番号
５５０４４）（ＮＥＢ寄託番号５８５、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂ
ｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｅｎ
ｄｏｃｉｎａ（ＡＴＣＣ番号５５１８１）（ＮＥＢ寄託番号６９８、ＮｅｗＥ
ｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）の特定の単
離物から作製する。これらの酵素をコードする遺伝子を同定し、以下の７つの工
程を用いて同定およびクローン化する。１）ＰａｃＩおよびＰｍｅＩを、Ｐｏｌ
ｉｓｓｏｎ、前出、１９９２、ＭｏｒｇａｎａｎｄＺｈｏｕ、前出、１９９
３に記載の方法によってＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（Ａ
ＴＣＣ番号５５０４４）（ＮＥＢ寄託番号５８５、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢ
ｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓｍｅｎｄｏｃｉｎａ（ＡＴＣＣ番号５５１８１）（ＮＥＢ寄託番号６９８、
ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）
から均一に精製した。２）これらのタンパク質のＮ末端配列を、標準的なマイク
ロシークエンシング法によって得た。３）これらの配列に基づいて設計した変性
オリゴヌクレオチドを使用して、これらのＮ末端をコードするＰＣＲフラグメン
トを得た。４）これらのＮ末端を特定するＤＮＡ配列を、ＰＣＲフラグメントか
ら同定した。５）これら特異的配列から設計された特有のオリゴヌクレオチドを
逆ＰＣＲに使用して、全遺伝子をコードする巨大なフラグメントを得た。６）両
方の場合、適切な酵素活性を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの調節下で関連遺伝子
を保有する大腸菌の粗製抽出液において同定した。７）隣接配列の更なるクロー
ニングを行い、４．０７ｋｂのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ（ＡＴＣＣ番号５５０４４）（ＮＥＢ寄託番号５８５、ＮｅｗＥｎｇｌａｎ
ｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）のＤＮＡおよび５．３
７ｋｂのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｅｎｄｏｃｉｎａ（ＡＴＣＣ番号５５１８
１）（ＮＥＢ寄託番号６９８、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎ
ｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）のＤＮＡを得た。

【０１２１】視覚的検査によるこれらの配列の試験により、両遺伝子セグメントに共通の反
復配列の予備的同定が可能であった。更なるクローニング試験は、Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ番号５５０４４）（ＮＥＢ寄託
番号５８５、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒ
ｌｙ、ＭＡ）に存在するカセットアレイの完全な配列の描写の獲得を目的とし、
以下に記載のように連続配列の４つのセグメントを得た。日常的なクローニング
の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出、１９８９、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８２、Ｒａｌｅｉｇｈら、Ｃｕｒｒｅｎｔ
ＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ
ＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１．４．１〜１．４．７、
１９８９、Ｍｏｏｒｅら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌ
ｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ、Ｎ
ｅｗＹｏｒｋ、２．０．１〜２．６．１２、１９９９に記載されている。

【０１２２】反復アレイが大腸菌において不安定であり得る検査では、本発明者らは、はじ
めにＰＡＲエレメントを含む巨大フラグメントの単離を回避した。さらに、Ｐ．
ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ番号５５０４４）（ＮＥＢ寄託番号５８５、
ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）
染色体ＤＮＡフラグメントを、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄＩＩＩ部位へのサイズ選
択ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントのクローニングによって構築したＨｉｎｄＩＩＩ
ライブラリーから得た。Ｑｉａｇｅｎ（Ｇｅｎｏｍｉｃｔｉｐ１００／Ｇ（
カタログ番号１０２４３））の説明者に記載の方法によって調製したＰ．ａｌｃ
ａｌｉｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ番号５５０４４）（ＮＥＢ寄託番号５８５、Ｎｅｗ
ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）の染色
体ＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した。ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを
アガロースゲル（０．７％）でのゲル分画によって単離し、２ｋｂと１０ｋｂと
の間のフラグメントを、製造者の指示に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌｅｘｔ
ｒａｃｔｉｏｎキット（カタログ番号２８７０４）を用いて単離し、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ消化脱リン酸化ｐＢＲ３２２と連結した。

【０１２３】本方法の原理は、Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓのＤＮＡはＧＣリッチである一
方でＨｉｎｄＩＩＩ部位はＡＴリッチ（ＡＡＧＣＴＴ）である点である。したが
って、ｐａｃＩＲおよびＰＡＲ特異的プローブに対するサザンブロットによって
同定したフラグメントのように小さな（２ｋｂおよび８ｋｂ）である染色体ＤＮ
Ａフラグメントはあまり存在しない（本方法のＣ１節を参照のこと）。プラスミ
ド調製物を、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（カタログ
番号２７１０６）を用いた形質転換に従って、１０８個のコロニーから作製した
。１０８個のＨｉｎｄＩＩＩクローンのうち９５個（８８％）が挿入物を保有し
ていた。これらを、目で同定したＰＡＲ配列内であるが稀にＧＣリッチなＰ．ａ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ染色体中を切断するＡｃＩＩ（ＡＡＣＧＴＴ）で消化し、
予想通りに多数のＡｃｌＩ部位を保有しているクローンを同定した。挿入物（１
１クローン）を有する１１％のクローンが、この基準に適合する。さらに、ＰＡ
Ｒ特異的ＰＣＲ（第Ｃ２節を参照のこと）および配列分析（以下）による特徴付
けによってこれらがＰＡＲ配列を実際に含むことを実証した。

【０１２４】サイズ以外の任意の選択を行っていないＰＡＲ含有フラグメントの頻度の高さ
は、おそらく、染色全体よりもＰＡＲ含有領域内のＨｉｎｄＩＩＩ部位密度の高
さに影響を受ける。本発明者らは、サイズ選択によって全ての染色体配列の約９
０％が取り除かれると評価する。全ゲノムが６〜８Ｍｂ（Ｒｏｄｌｅｙら、Ｍｏ
ｌＭｉｃｒｏｂｉｉｌ．、１７（１）、５７〜６７、１９９５、Ｄｅｗａｒら
、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｏｍｐ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ３（２）、１０５〜１１７、１
９９８）であり、その１０％が選択したサイズ画分（６００〜８００ｋｂ）に相
当する場合、平均サイズが約８ｋｂの１００個の挿入物がこの画分の全てを対象
とする必要があるだろう。勿論、このサイズのライブラリーは、全てのフラグメ
ントを厳密に含んでおらず、画分中の全てのフラグメントが８ｋｂとうわけでは
ない。それにもかかわらず、ライブラリー中のＰＡＲ含有フラグメントの範囲は
、推定スーパーインテグロンの評価サイズ（≧６０ｋｂ、１０％の８００ｋｂが
８０ｋｂであろう）と一致する。

【０１２５】ＣｌａＩでの消化によって作製したその後のライブラリー中の更なるクローン
を単離し、ｐＢＲ３２２のＣｌａＩ部位にクローニングした。この工程で、巨大
フラグメントの不安定度による問題は生じなかったので、ＤＮＡを分画せず直接
クローン化した。ＰＡＲポジティブクローンを第Ｃ２節に記載の方法によるＰＡ
Ｒフィンガープリント法によって同定した。

【０１２６】候補ＰＡＲ含有クローンを、染色ターミネーターを用いたＡＢＩ３７７シーク
エンサーで配列決定した。組み合わせ法によって鋳型を作製した。半無作為相で
は、Ｔｎ７ベースのトランスポゾン（ＮＥＢＧＰＳ^ＴＭ−１キット（Ｎｅｗ
ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＮＥＢカ
タログ番号７１００）の初期バージョン）を、クローンの挿入変異誘発に使用し
、選択した挿入物をトランスポゾン由来の配列に対して設計した普遍プライマー
（プライマーＮおよびプライマーＳ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ
，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＮＥＢカタログ番号ＯＳ１２６６およびＮ
ＥＢカタログ番号１２６７））を用いて配列決定した。トランスポゾン内の稀な
切断部位を用いた挿入物の限定マッピングによって配列決定を促進した。初代ク
ローンおよび少数の欠失誘導体のベクター−挿入物連結部もまた、ｐＢＲ３２２
にアニーリングしたプライマー（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉ
ｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＮＥＢカタログ番号１２０４およびＮＥＢカタ
ログ番号１２０５）を用いて配列決定した。

【０１２７】これにより、７４例の反復配列を含む、全部で５９．４ｋｂの４つの配列コン
ティグを得た。これらの配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および
配列番号４である。

【０１２８】Ｂ）反復配列候補の公式化。

【０１２９】カセットアレイの存在を表示すると考えられる特異的反復配列を、Ｖｉｂｒｉ
ｏｃｈｏｌｅｒａｅのＶＣＲエレメントなどの公知のアレイに見出されるもの
との類似性または現存の配列情報のコンピューターアシスト分析によって同定す
ることができる。これらの配列をコンピューター化した検索方法（ＵＷＧＣＧ
ＳＥＱＥＤおよびＤＮＡＳＴＡＲＥＤＩＴＳＥＱプログラムが適切である）を
用いた以下の方法によって同定した。反復の５’末端を配列ＴＡＡＣＷＡについ
ての検索によって見出し、反復の３’末端を配列ＣＧＴＴＲＲについての検索に
よって見出し、そして５’エレメントの５’塩基を３’エレメントの３’末端か
ら２００ｂｐ以上にならないようにして更なる制約を課した。このストラテジー
で、１４．１４４ｋｂのこの連続ストレッチ中の１８個の反復配列を同定した。
比較のために、Ｈａｌｌ（５）によって示唆されるモチーフを用いた類似の検索
によって１１個のエレメントを同定した。これらのうち１０個は、本明細書中で
引用されたストラテジーによって同定されたセットに一致し、１つはどちらかの
ストラテジーで同定した他のエレメントを有する内部領域に非常に不十分に配列
した。図３は、Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ番号５５０４４）（Ｎｅ
ｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＮＥ
Ｂ寄託番号５８５）スーパーインテグロン配列（配列番号１）の一部で同定され
たこのような配列のセットのアラインメントを示す。エレメントを、ＤＮＡＳＴ
ＡＲＭＥＧＡＬＩＧＮプログラムを用いたＣＬＵＳＴＡＬ法によって整列させ
た。アラインメントは、大多数のコンセンサス（３番目のライン）（９０％コン
センサス）を示し、この時点で、１８エレメント中１６エレメントが同一（２番
目のライン）および同一コンセンサス（全てのエレメントが一致する）である。
大多数のコンセンサスと不一致のこれらの位置のみをアラインメントに示す。ア
ラインメントの４８％（４２／８７）の位置が表示の９０％で同一である。ほと
んどの不一致の表示（ＰＡＲｆ９）でも半分を超える位置（４７／８７）で大多
数に一致する。

【０１３０】このような反復を同定する更なる方法は、コンピュータ化した比較アルゴリズ
ム（ＵＷＧＣＧＣＯＭＰＡＲＥおよびＤＯＴＰＬＯＴ、またはＤＯＴＰＬＯＴ
をサブプログラムとして有するＤＮＡＳＴＡＲアルゴリズムＡＬＩＧＮなど）を
用いることである。これらのプログラムの出力により、対角線から離れた類似の
配列（図４、３０のウインドウ、２４の適合）を同定し、プログラムの特徴（Ｄ
ＮＡＳＴＡＲ）を用いるか、アラインメントの近似の位置に注目して対角線周囲
の局所的配列をＵＷＧＣＧＢＥＳＴＦＩＴアルゴリズムで処理してより密接に
試験することができる。ＤＯＴＰＬＯＴ法により１８個のエレメントも同定した
。これらのうちの１６個を、本明細書中で引用したストラテジーによって同定し
、一方で、モチーフ検索によって同定されたエレメントのうちの２つはＤＯＴＰ
ＬＯＴで見出されなかった。これらの方法に基づいたより精巧なコンピューター
化検索方法を、この目的で開発および使用することもできる。

【０１３１】記載のモチーフ検索によって同定されたエレメントの完全なセットを、本明細
書中にリストで示した（配列番号５〜配列番号７８：表１）。これらのエレメン
トでは、５’末端のさらに２ｂｐの隣接を各エレメントに付加したが、これは、
これらのｂｐは、５’ＧＣ３’として配列の大部分で保存されているからである
。さらに１つの塩基を３’末端に付加したが、これは、この塩基対もまた配列の
大部分でＣとして保存されているからである。各フラグメントの長さ、関連する
コンティグ中のその位置、および見出されたコンティグの名称もこの表に記入す
る。

【０１３２】セット内の各配列は不完全な内部逆位反復を示すこと（表５に、潜在的な二次
構造の例を示す）を注目すべきである。この特性はまた、「５９ｂｐエレメント
」およびＶＣＲエレメントに認められた。

【０１３３】ＰＡＲエレメントがより密接に関連する配列のファミリーに分類されることも
また注目すべきである。これら４つのファミリーのアラインメントを、図６Ａ〜
図６Ｄに示す。これらのファミリーの知識により、以下に記載の方法などの更な
る方法用の特異的オリゴヌクレオチドの設計に情報を与える。

【０１３４】公知のアレイ由来または新規の配列の分析によって、一旦配列候補またはファ
ミリーが選択されると、オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを、以下
にさらに記載のサザンブロットおよびＰＣＲ実験に使用するために設計すること
ができる。これらの例を、図７Ａ（サザンブロット用のオリゴヌクレオチド１〜
５（配列番号７９〜配列番号８３、表２を参照のこと））および図７Ｂ（ＰＣＲ
用のオリゴヌクレオチド１〜５（配列番号８４および配列番号８５、表２を参照
のこと））の７４ＰＡＲエレメントのコンセンサス（多数決原理）と並べて記載
する。

【０１３５】Ｃ）候補原核生物集団の同定１つまたは複数のアレイセットから情報が得られると、サザンブロット法また
はＰＣＲによってこのようなアレイの存在についてのさらなる単離物をスクリー
ニングできるようになる。

【０１３６】Ｃ１）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ番号５５
０４４）（ＮＥＢ寄託番号５８５、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，
Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に対するサザンブロット反復配列（ＰＡＲエレメント）のプローブとしてビオチン標識オリゴヌクレオ
チド（オリゴヌクレオチド２〜５、配列番号８０〜配列番号８３、表２を参照の
こと）とＱｉａｇｅｎ（Ｇｅｎｏｍｉｃｔｉｐ１００／Ｇ（カタログ番号１
０２４３））の方法によって調製したＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ番
号５５０４４）（ＮＥＢ寄託番号５８５、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａ
ｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）のＤＮＡとの混合物を用いて、サザン
ブロット（図８）を行った。８つの異なる制限酵素（ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、Ｓｔ
ｕＩ、ＮｄｅＩ、ＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＣｌａＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩ）を
用いた制限消化を、製造者の指示（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，
Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に従って行った。産物を、Ｔｒｉｓホウ酸緩
衝液（０．０９ＭＴｒｉｓ−ホウ酸組成物、０．００２ＭＥＤＴＡ、１０⁻ ^４ μｇ／ｍｌ臭化エチジウム）を用いた０．７％アガロースで中、１００ｍＡで
１時間電気泳動に供した。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタ
ログ番号ＭＢＢＵＩＭＳ０２）膜を用いて、ＮｅＢｌｏｔ（登録商標）Ｐｈｏ
ｔｏｔｏｐｅ（登録商標）キット（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，
Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＮＥＢカタログ番号７５５０）の指示（６８
℃で４時間ハイブリダイゼーション、２３℃で２回洗浄、０．１×ＳＳＰＥ、０
．１％ＳＤＳ、６８℃で５分間で２回洗浄）に従ってサザン法を行った。製造者
の指示に従って、Ｐｈｏｔｏｔｏｐｅ（登録商標）−Ｓｔａｒ検出キット（Ｎｅ
ｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＮＥ
Ｂカタログ番号７０２０）化学発光検出を用いて現像を行った。図８は、各消化
物中の複数のフラグメントがプローブとハイブリッド形成することを示し、これ
によりオリゴヌクレオチドが反復配列を認識したことが確認された。ハイブリッ
ド形成バンドの最小合計が約２０（ＰｓｔＩ）〜約４４（ＮｄｅＩ）の範囲であ
り、これは、多数のカセットが存在することを示唆する。これらのバンドのいく
つかは、２種または３種が同時に移動する種を示し得るので、最大のサイズを確
実に評価できない。

【０１３７】可能な別のオリゴヌクレオチド配列を、ＰＡＲエレメントの特異的ファミリー
に基づいて設計することができる。オリゴヌクレオチド１（配列番号７９、表２
を参照のこと）などの一本鎖オリゴヌクレオチドを使用することができ（データ
示さず）、これを使用して非標識オリゴヌクレオチドで開始し、ＮＥＢｌｏｔ（
登録商標）Ｐｈｏｔｏｔｏｐｅ（登録商標）などのランダムプライミングキット
の使用による標識によってビオチン標識したプローブを調製することができる。

【０１３８】プローブオリゴヌクレオチドとＤＮＡ調製物との間のハイブリッド形成の存在
を検出するための他の詳細な方法を使用することができる。サザンブロット法に
より、ＤＮＡフラグメントをサイズで分離し、膜支持体に移し、ＤＮＡを変性し
、プローブとハイブリッド形成し、洗浄によって（オリゴヌクレオチドの場合）
ハイブリッド形成した産物とハイブリッド形成していないプローブとを分離する
。ハイブリッド形成したＤＮＡの存在を検出するための別の派生法には、サイズ
で分離されず膜（ドットブロットまたはスポットブロット（Ｍｏｏｒｅ、前出、
１９９９））またはマイクロタイタープレート（ＣｈａｐｌｉｎおよびＢｒｏｗ
ｎｓｔｅｉｎ、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ、ＮｅｗＹｏ
ｒｋ、第１巻、６．９．１〜６．９．７、１９９９）もしくは他の支持体に吸着
させた後に非ハイブリッド形成プローブを洗浄したＤＮＡのアレイの使用が含ま
れる。ラベルの構成を示し得る（標的ＤＮＡ調製物を標識する一方で、試験プロ
ーブを膜または他の支持体に固定する）。

【０１３９】別の可能な検出法には、放射性標識オリゴヌクレオチド（Ｓ^３５またはＰ^３２もしくはＰ^３３での標識）の使用または別の化学的検出法（ジゴキシゲニンベー
ス（ＰｏｃｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓカタログ番号
１２１０２２０１）または蛍光ベース（ＡＰＢｉｏｔｅｃｈカタログ番号３０
３０）標識および検出法など）が含まれる。ＤＮＡ調製の別法には、界面活性剤
／プロテアーゼ処理後の沈殿もしくはＣｓＣｌ遠心分離またはアガロースゲルで
の精製（Ｍｏｏｒｅ、前出、１９９９）による精製を含むことができる。ゲル濾
過による他の市販のキット（例えば、５Ｐｒｉｍｅ−−＞３Ｐｒｉｍｅ、または
ＰｒｏｍｅｇａＷｉｚａｒｄＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎＫｉｔ、カタログ番号Ａ１１２０から市販のキット）もまた使用すること
ができる。

【０１４０】Ｃ２）６つのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種のＰＣＲフィンガープリント法。

【０１４１】集団中のカセットアレイの第２の検出法は、ＰＣＲ試験（図７および図９）で
分離したカセットの反復の各末端にアニーリングしたプライマーを使用すること
である。反復が存在し、有効なＰＣＲ増幅用に互いに十分に接近している場合、
カセットを示すＤＮＡバンドが、電気泳動による分離後の臭化エチジウム染色し
たアガロースゲルに見出された。

【０１４２】この方法を確証するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの以下の６つの種を試験
した：Ｐ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌａ（ＮＥＢ寄託番号５１５）（ＮｅｗＥｎｇｌ
ａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）（ＰｍｌＩ）、Ｐ
．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（ＮＥＢ寄託番号３７５）（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）（ＰｆｌＭＩ）、Ｐ．ｐ
ｕｔｉｄａ（ＮＥＢ寄託番号３７２）（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂ
ｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）（ＰｐｕＭＩ）、Ｐ．ｌｅｍｏｉｇｎｅ
ｉ（ＮＥＢ寄託番号４１８）（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎ
ｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）（ＰｌｅＩ）、Ｐ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａ（ＡＴＣ
Ｃ番号５５１８１）（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂ
ｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＮＥＢ寄託番号６９８）（ＰｍｅＩ）、およびＰ．ａｌｃ
ａｌｉｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ番号５５０４４）（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉ
ｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＮＥＢ寄託番号５８５）（Ｐａ
ｃＩ）。上記（パートＡ）で作製した染色体ＤＮＡを、オリゴヌクレオチド６お
よび７（図７の配列番号８４および配列番号８５、表２を参照のこと）で準備し
たＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ反応には、１００ｎｇのＤＮＡ、０．２μｍｏ
ｌの各オリゴヌクレオチド、１単位のＶｅｎｔ（登録商標）Ｅｘｏ^＋ポリメラー
ゼ、５０μｌの反応体積の１×ＮＥＢのＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液が含まれる。
熱サイクルパラメータは、９５℃で１５秒間の変性、５５℃で１分間のアニーリ
ング、７２℃で１分間の伸長であった。これを２５サイクル行った。産物を、０
．７％アガロースの１００ｍＡで１時間の電気泳動に供し、１０^−４μｇ／ｍｌ
の臭化エチジウムで染色した。

【０１４３】図８は、本法によって６種のうち２種が複数の増幅を生じたことを示す。これ
により、複製するために正確な方向で、かつ正確な間隔での反復セグメントの存
在を確認する。いくつかのカセットは、特に、短いカセットの増幅が好まれ場合
は効率的に増幅するのには長すぎるので、この方法により潜在的なカセット数を
評価するのは不可能である。さらに、いくつかの増幅産物は、２つのカセットに
わたる増幅を示し得る。この場合、カセットを分離する反復は、アンプリコンの
末端のものよりプライマーと離れて関与し得る。

【０１４４】種々の伸長時間の使用により、最大の種類のカセット産物の獲得が促進される
。反復の別のファミリーに高い効率でアニーリングした別のプライマーセットを
使用した複数の反応もまた、カセットの全収量が増加する。図８に示すように、
プライマー８〜１１（配列番号８６から配列番号８９（表２を参照のこと））は
、正方向の候補プライマーであり、プライマー１２および１３（配列番号９０お
よび配列番号９１（表２を参照のこと））は、逆方向の候補プライマーである。

【０１４５】別の視覚化法には、親和性標識オリゴヌクレオチドプライマーの化学発光検出
、ＰＣＲにおいて組込まれた蛍光標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプ
ライマーの蛍光検出、または放射性標識オリゴヌクレオチドプライマーまたは放
射性標識ｄＮＴＰを用いた場合はオートラジオグラフィーが含まれる。

【０１４６】Ｃ３）混合集団のＰＣＲフィンガープリント法原理的には、集団中の少数のカセットアレイの存在を同定するための混合集団
に対するＰＣＲフィンガープリント法を適用することができるはずである。混合
集団に対して少なくとも以下の２つのアプリケーションを試用することができる
：各菌株を組み合わせたプールを使用したＰＣＲおよび環境ＤＮＡを用いたＰＣ
Ｒ。

【０１４７】Ｃ３ａ）組み合わせプールに対するＰＣＲアドレス可能なアレイ（例えば、９６ウェルプレート）に各菌株を配列するこ
とによって、組み合わせプールを行うことができる。プールを、各菌株を組み合
わせることによって作製することができる（例えば、１つのプールにおいて１列
に全ての菌株、１つのプールにおいて１段に全ての菌株、または一連のプレート
由来の１つの２Ｄアドレス中に全ての菌株）。多くのこのようなプール法が成功
しており、当業者に公知である（例えば、ＣｈａｐｌｉｎａｎｄＢｒｏｗｓ
ｔｅｉｎ、前出、１９９９、Ｇｒｅｅｎら、ＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ、
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ、第３巻、２９７〜５４８、１９
９９）。

【０１４８】これらの各菌株から個別にＤＮＡを作製し、ＤＮＡサンプルをプールするか、
菌株の培養物をプールして、プールからＤＮＡに形成することができる。各方法
には、不都合がある。第１の例として、多数のＤＮＡ調製物が作製されなければ
ならないが、第２の方法において、異なる菌株は異なる細胞破壊およびＤＮＡ抽
出に供されるので、いくつかの菌株由来のＤＮＡは、他のものと比較して少ない
。

【０１４９】このようなプール法では、いくつかの簡単な対照によって方法全体の効率を評
価することができる。例えば、アレイを含むことが公知の菌株（Ｐ．ａｌｃａｌ
ｉｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ番号５５０４４）（ＮＥＢ寄託番号５８５、ＮｅｗＥ
ｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）など）であ
る陽性対照は、１つのプールに１種類のメンバーとして含まれ得るが、他のメン
バーは陰性対照（Ｐ．ｌｅｍｏｉｇｎｅｉ（ＮＥＢ寄託番号４１８）（Ｎｅｗ
ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ））から得
られる。別の場合では、陰性対照の存在の減少に対応して陽性対照が二重または
三重で含まれ得る。これにより、方法全体の感受性の評価が可能である。

【０１５０】Ｃ３ｂ）環境サンプルに対するＰＣＲ特に目的とするＤＮＡ供給源は、純粋培養で得られた最初の生物を含まない環
境サンプル（例えば、土壌、水、濾過空気など）から単離したＤＮＡと思われる
。この場合、カセットアレイ由来のＰＣＲは、完全な形態での遺伝子の獲得メカ
ニズムとしてさらにより有望であり得る。この場合、Ｃ１に記載の対照として何
種類かのポジティブおよび陰性対照を含むことができる。公知の陰性対照中で連
続希釈した陽性対照に加えて、他の対照が含まれるべきである。ＤＮＡが単離さ
れるべき元の環境サンプルを分割し、その一部を少量の陽性対照菌株で滴下する
ことができる。サンプル由来のＤＮＡ抽出物はいくつかの陽性対照を含むので、
サンプルの一部がＤＮＡ抽出の効率の良い対照として使用され、公知の供給源由
来の公知のカセットの回収が可能となる。環境サンプルＤＮＡ中で希釈された一
連の精製陽性対照ＤＮＡを含むことにより、環境サンプル中の阻害物質について
の対照として作用する。

【０１５１】更なる一連の対照により、真核生物由来のサンプルの画分を評価することがで
きる。ＰＣＲ対照により、当業者に公知の方法（ｖｏｎＷｉｎｔｚｉｎｇｅｒ
ｏｄｅら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、２１（３）、２１３〜２
２９、１９９７、Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４４（
Ｐｔ．９）、２６５５〜２６６５、１９９８）によってミトコンドリア、葉緑体
、および核リボゾームＤＮＡ遺伝子の存在について試験することができる。

【０１５２】Ｄ）ＤＮＡフラグメントのクローニング一旦反復セグメントに隣接したフラグメントが得られると、これらは、標準的
な方法によってクローニングすることができる。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉ
ｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２８１０４）または他の類
似のキットを用いて精製することができる。フラグメントを消化して、適切に消
化したプラスミドまたはバクテリオファージベクターに適合する連結可能な末端
を得ることができる。本実施例では、ベクター方向性発現シグナルに関して限定
された方向が得られるように、ＰＣＲで使用するオリゴヌクレオチドプライマー
の５’末端に付加したＸｈｏＩおよびＸｂａＩ部位は、ｐＬＴ７Ｋ（以下の実施
例２を参照のこと）に定方向クローニングされる。従って、ベクター中に存在す
る調節シグナルの使用が可能である。適切なクローニング部位がＰＣＲに使用さ
れるオリゴヌクレオチドの５’末端に含まれる場合、発現の調節が関与しないと
しても、任意のベクターを使用してこのようなカセットをクローン化することが
できる。このようなベクターは、高頻度コピー（例えば、ｐＵＣ１９）プラスミ
ド、中頻度コピー（例えば、ｐＡＣＹＣ１８４またはｐＢＲ３２２）プラスミド
、または低頻度コピー（例えば、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１）プラスミドであり得る
か、バクテリオファージレプリコン（例えば、λｇｔ１１）であり得る。このよ
うなベクターは、大腸菌（例えば、ｐＬＴ７Ｋ、実施例２を参照のこと）におけ
る調節発現に適切な発現シグナルを含み得るか、特定のカセットの更なる試験に
適切な生物（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ、または他の原核生物）における発現用に設計することができる。

【０１５３】連結したフラグメントプールを、通常、化学的な方法またはエレクトロポレー
ション（Ｈａｎａｈａｎら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．、２０４
、６３〜１１３、１９９１）による翻訳後の固体培地上のベクターの１つまたは
複数の選択マーカーを含むレシピエント生物のクローンからなるフラグメントの
クローンライブラリーとして回収する。

【０１５４】Ｅ）所望のカセットの存在についてのアッセイ得られたカセットは、多くの異なる種類の遺伝子をコードする。多くの場合、
１つの特定の種であるが異なる特異性を有するフラクションをコードする遺伝子
は、関連するポリペプチド配列を有する。この種に関連する特定の例は、同一の
反応（特定の配列中の特定の塩基にメチル基を付加する）を有するが異なる特性
（異なる特定の配列内の異なる特定の塩基が改変されている）を有するＤＮＡメ
チルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のセットである。これらは、保存さ
れたポリペプチドモチーフ（Ｍｏｒｇａｎ、前出、１９９６）にアニーリングす
るプライマーを用いるＰＣＲによって試験的に同定することができる。簡単に述
べれば、個々のコロニーまたは工程Ｄ）由来のコロニーのプールを、Ｍｏｒｇａ
ｎ、１９９６に詳述の改変を用いた方法によるＰＣＲの変性に供することができ
る。メチルトランスフェラーゼモチーフにアニーリングした変性プライマーがア
ンプリコンの片側を形成し、アンプリコンの他の末端が隣接した反復にアニーリ
ングした１つまたは複数のプライマーによって形成される設計が最も適切であろ
う。適切なサイズのＰＣＲ産物が得られた場合、関連するコロニーはメチルトラ
ンスフェラーゼの遺伝子を含むようである。本方法で同定された候補コロニー由
来のプラスミドまたはファージクローンの一部または全体を配列決定することが
できる。

【０１５５】あるいは、無作為に選択したコロニー由来のプラスミドまたはファージを配列
決定することができる。潜在的なメチルトランスフェラーゼを有するクローンを
、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどのＤＮＡ比較アルゴリズムを用いた評価また
はこのような類似性を評価することを特に目的としたプログラム（Ｐｏｓｆａｉ
ら、Ｃｏｍｐｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、１０（５）、５３７〜５４４、１
９９４）によって同定することができる。

【０１５６】実施例２のように、比活性についての機能試験も使用することができる。

【０１５７】実施例２機能的レポートによる制限酵素カセットの発見およびその後の特徴付け本方法により、多様性選択機能を有する種々の遺伝子を特定する多数のカセッ
トの発現が準備された形態の単離が可能である。従って、所望の型の機能を発現
する特定のクローンの同定は、本方法の重要な部分である。本実施例は、所望の
特定の機能、ＤＮＡ損傷剤の同定、および部位特定的二本鎖ＤＮＡエンドヌクレ
アーゼ（制限酵素）が特徴付けられるまで機能同定を洗練するための１つの方法
を例示する。さらに、本実施例は、所望の機能が発現する細胞に毒性を示すとし
ても本方法が有用であることを例示する。分離する反復エレメントに関連するカ
セットアレイ中の遺伝子の天然の方向のために、遺伝子の方向が遊離に特定され
るので、本実施例の手順は、特に可能である。

【０１５８】従って、１つの実施態様では、使用したベクターｐＬＴ７Ｋ（図１０）を使用
してカセットの個性または配列について既知のことが全く無くとも、クローン化
カセットフラグメントの発現を調節することができる。このベクターでは、以下
の２つのレベルの調節が可能である：発現を誘導することができ、阻害を抑制す
ることができる。Ｔ７遺伝子の１０プロモーターは、クローニング部位の片側に
読み込まれる；このプロモーター由来の発現は、発現に使用される宿主細胞から
得たＴ７ＲＮＡポリメラーゼ自身の発現のままで、ベクターから得たＬａｃＩ
によって抑制される。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのインヒビターを発現するｐＬ
ｙｓＰの使用によって、更なる調節を得ることができる。

【０１５９】クローン化フラグメントおよびＴ７プロモーター由来の残りの漏出発現によっ
て指向される発現をさらに減少させるために、直列λｐＬプロモーターはクロー
ニング部位の他方に読み込まれる。この拮抗的転写は、λｃＩ^８５７（熱感受性
リプレッサー）によって調節される。従って、４０℃でかつＩＰＴＧの不在下で
は、本質的に発現は観察されなかった；３０℃では、いくつかの漏出発現が認め
られた；３０℃でかつＩＰＴＧの存在下では、中程度のレベルの発現が達成され
得る。

【０１６０】本発明の実施例で使用したストラテジーであるＤＮＡ損傷の間接的レポートを
使用してＤＮＡ損傷を誘導するクローン化カセットを同定する。この方法は、各
クローンの一部をカセットの発現を誘導する条件に供し、それにより誘導された
クローンの色を試験することによって行われた。次いで、正のシグナルを生じる
クローンを選択し、誘導条件に供さないクローンの一部を次の工程に供する。こ
れにより、ＤＮＡ損傷工程は同定された遺伝子の不活化について選択しないこと
が保証される。この工程で同定された正のカセット（減数）を、より詳細に試験
することができる。次いで、これらを各クローンの別の部分の誘導および部位特
異的ＤＮＡ切断の３つの指標について誘導された部分の試験によって試験される
。最後に、目的のクローンを配列決定する。

【０１６１】Ａ．ｐＬＴ７ＬＫとの使用のためのＤＮＡ損傷のレポーターｐＬＴ７ＬＫにクローン化されたＤＮＡ損傷カセットの同定用のＤＮＡ損傷イ
ンジケーターストラテジーを使用するために、以下の５つの特徴を有する宿主菌
株が必要であった：Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは誘導後に発現されるべきである
こと；菌株はλ溶原菌を含むべきではないこと（ＤＮＡ損傷後のファージがコー
ドする死滅機能の発現を誘導し得るので）；好ましくは、クローン化カセットを
保有する形質転換体を多数回収するために、高度に形質転換可能であるべきであ
ること；好ましくはＤＮＡ損傷後のみにＤＮＡ損傷インジケーターｌａｃＺが発
現されるべきであること（すなわち、誘導されない場合、白色のコロニーのバッ
クグラウンドが透明である）；および大腸菌の主要な非特異的エンドヌクレアー
ゼであるエンドヌクレアーゼＩを発現すべきでないこと。この最後の必要条件は
、試験ＤＮＡ基質に対する部位特異的エンドヌクレアーゼの作用に起因するアガ
ロースゲルにおける制限消化バンディングパターンの明確な同定に必要である。

【０１６２】ＥＲ２７４５およびＥＲ２７４６を、標準的なＰＩｖｉｒ形質導入によって構
築した。これらの菌株により、異なる利点を有する別の宿主のバックグラウンド
が得られ、これらは、発現時にＤＮＡを損傷するｐＬＴ７Ｋ中のカセットクロー
ンの同定という本発明の目的に有用である。

【０１６３】ＥＲ２７４５のサンプル：（Ｆ⁻λ⁻ｆｈｕＡ２［ｌｏｎ］［ｄｃｍ］ｏｍｐ
ＴｌａｃＺ：：Ｔ７ｇｅｎｅ１ｇａｌｓｕｌＡ１１Δ（ｍｃｒＣ−ｍｒ
ｒ）１１４：：ＩＳ１０Ｒ（ｍｃｒ−７３：：ｍｉｎｉＴｎ１０−−ＴｅｔＳ）
２Ｒ（ｚｇｂ−２１０：：Ｔｎ１０−−ＴｅｔＳ）ｅｎｄＡ１）ｄｉｎＤ２：
：ＭｕｄＩ１７３４（ＫａｎＲ，ｌａｃＺ^＋）を、１９９９年月日付けのブ
ダペスト条約の条項に基づいてＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号・・・を受領した。

【０１６４】ＥＲ２７４６のサンプル：（Ｆ⁻λ⁻ｆｈｕＡ２ｇｌｎＶ４４ｅ１４−ｒ
ｆｂＤ１？ｒｅｌＡ１？ｅｎｄＡ１ｓｐｏＴ１？ｔｈｉ−１Δ（ｍｃｒＣ−ｍ
ｒｒ）１１４：：ＩＳ１０ｌａｃＺ：：Ｔ７ｇｅｎｅ１ｄｉｎＤ２：：Ｍ
ｕｄ１１７３４（ＫａｎＲ，ｌａｃＺ（ｔｓ））を、１９９９年月日付けの
ブダペスト条約の条項に基づいてＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号・・・を受領した。

【０１６５】ＥＲ２７４５を、現存の菌株から１つの工程で構築した。現存の菌株ＥＲ２５
５６は、公知の全ての内因性制限系で不完全であり（効率的なクローニングが可
能）、β−ガラクトシダーゼを発現せず、ｌａｃＩ調節下で染色体位置（誘導性
プロファージではない）からＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現した。これは、大
腸菌の主要な非特異性ヌクレアーゼであるエンドヌクレアーゼＩを欠くために、
粗製抽出物における制限酵素活性の視覚化に有用であろう。ｄｉｎＤインジケー
ターを、Ｆｏｍｅｎｋｏｖ、前出、１９９５に記載のＥＲ１９９２株由来のＰ１
形質導入によってこの系に移入し、ＥＲ２７４５を形成させた。

【０１６６】ＥＲ２７４６を、現存の菌株から３工程で構築した。現存の菌株ＥＲ２４１８
は比較的高度に誘導される所望の特性を有し、これは大腸菌Ｋ１２由来の多くの
系統に共通であるが、大腸菌Ｂ様ＥＲ２７４５由来の系統では存在しない特性で
ある。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現のための対立遺伝子を、以下の２つの形質
導入工程で移入した：ＥＲ２４１８×Ｐ１（ＥＲ２５５６）−−＞ＴｅｔＲ（Ｐ
ｒｏ−ＫａｎＲ）によりＥＲ２７４０を形成させ、ＥＲ２７４０×Ｐ１（ＥＲ２
５５３）−−＞Ｐｒｏ＋（ＫａｎＳＴｅｔＳＬａｃ−Ｔ７ＮＡＰ＋）により
ＥＲ２７４４を形成させる。最後に、ｄｉｎＤインジケーター対立遺伝子を、Ｅ
Ｒ２１７０からＥＲ２７４４に移入した。

【０１６７】Ｂ．カセットのクローニング染色体サンプルからの増幅によって、カセットのクローニングを行った。上記
のようにＱｉａｇｅｎ（Ｇｅｎｏｍｉｃｔｉｐ１００／Ｇ（カタログ番号１
０２４３））の手順によって調製したＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ番
号５５０４４）（ＮＥＢ寄託番号５８５、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａ
ｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）の全ゲノムＤＮＡを、プライマー８〜
１３（配列番号８６〜配列番号９１、表２を参照のこと）の以下の８つの組み合
わせを用いて増幅した：８＋１２、９＋１２、１０＋１２、１１＋１２、および
８＋１３、９＋１３、１０＋１３、１１＋１３。オリゴヌクレオチドの各ファミ
リー（８〜１１または１２〜１３）内の中心部が配列中で変動するので、種々の
組み合わせによりＰａｒ反復エレメントの異なるファミリーから有効な増幅が可
能である。各異なるバージョンは、異なるファミリーメンバーへのアニーリング
を促進する。

【０１６８】ＰＣＲ増幅を、実施例１のＣ２節の方法によって行った。次いで、増幅したカ
セットを、２０単位のＸｂａＩおよび１単位のＸｈｏＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎ
ｄＢｉｏｌａｂｓ、カタログ番号１４５および１４６、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ
）を用いて１×ＮＥＢ緩衝液２中、３７℃で１時間消化した。消化したフラグメ
ントを、２回消化した脱リン酸化ｐＬＴ７Ｋと１６℃で一晩連結した。エビアル
カリホスファターゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ番号Ｅ７００９２Ｙ）を用いて３７℃で
１時間脱リン酸化した。ＮＥＢカタログ番号２０２（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）で連結した。これらの連結ライブラリ
ーを、エレクトロポレーションによってＥＲ２７４５およびＥＲ２７４６に移入
し、ＬＢ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）にプレートし、４０℃で一晩イン
キュベートした。この温度で、アンチセンス発現が抑制され、ＩＰＴＧの不在下
でセンス発現が誘導されず、以下に記載（Ｃ節）のＤＮＡ損傷インジケーターに
よって検出不可能な発現を得た。

【０１６９】Ｃ．機能的レポートについてのスクリーニング生存度を想定するためにインテグロンカセットの発現を抑制する条件下（４０
℃−ＩＰＴＧ）で回収したクローンライブラリーを、機能的レポートについて評
価することができる。Ｘｇａｌプレートにレプリカをプレートし、半誘導（３０
℃）または誘導（３０℃＋ＩＰＴＧ）条件下でのインキュベーションによって、
ＤＮＡ損傷機能を発現するコロニーを同定することができる。これらのいくつか
は制限酵素である。次いで、各コロニーを、元の配列の回収率を評価するために
、損傷条件に供していないマスタープレートから回収することができる。

【０１７０】Ｄ．クローンの同一性の評価ＤＮＡ損傷スクリーニングによって、ＲＭ遺伝子（Ｆｏｍｅｎｋｏｖ、前出、
１９９５、Ｆｏｍｅｎｋｏｖ、前出、１９９４）の同定が可能である。しかし、
他の種類の遺伝子も得られる。例えば、一本鎖特異的ヌクレアーゼが、Ｅｎｄｏ
−Ｂｌｕｅ法を用いて遺伝子から回収された（Ｆｏｍｅｎｋｏｖ、前出、１９９
４）。３つの方法を使用してＲＭ遺伝子を同定することができる。第１に、細胞
に短期間でカセットコード遺伝子を誘導させ、粗製抽出物を作製し、これらの抽
出物を使用して標準的な標的ＤＮＡを消化し、酵素活性をアガロースゲルで分離
したバンドの産生によって検出する。第２に、クローンに短期間でカセットコー
ド遺伝子を発現させ、その後全細胞をパルスフィールド電気泳動に供する。分離
したバンドは、クローン保有細胞の染色体ＤＮＡの消化に起因する。第３のアプ
ローチは、相同性検索による分類を可能にするために、クローンの配列決定を行
う。

【０１７１】Ｄ１）粗製抽出物アッセイＤＮＡ損傷スクリーニングで正のクローンを、後期対数期までの非誘導条件お
よび４時間の誘導条件へのシフトによって成長させる。この方法により、天然の
宿主Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅの発現量に類似のＰａｃＩ量の発現が成功した（
Ｄ．Ｂｙｒｄ、ｐｅｒｓｏｎａｌｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）。細胞を遠心
分離によって回収し、緩衝液中で再懸濁し、リゾチーム−ＥＤＴＡ処理によって
溶解し、遠心分離によって明澄化する。

【０１７２】消化物は以下の３種類である：１）陽性対照として診断的パターンを得るように設計した特異的基質を用いた
ＰａｃＩ特異的消化物。

【０１７３】２）標準的なプラスミド、ファージ、およびウイルスＤＮＡを用いた４〜６塩
基切断物についての一般的なスクリーニング。同様に、本方法によっていくつか
の８塩基特異性を検出することができる。

【０１７４】３）８塩基切断物についての一般的なスクリーニング。ｉｎｖｉｔｒｏでの
８塩基部位を用いた酵素のスクリーニングは、部位が希少なためより困難である
。しかし、通常、粗製抽出物を用いたｉｎｖｉｔｒｏ消化用の基質として全染
色体ＤＮＡを用いて、非特異的ヌクレアーゼと８塩基エンドヌクレアーゼとを区
別することができる。これは、更なる消化に供していない特異的フラグメント（
特に巨大なもの）の存在による。フラグメントがゲルで分離されない（そして認
識部位が推測できない）としても、結果は、非特異的ヌクレアーゼ（好ましくは
巨大なフラグメントを分解する）によって得られた結果と認識可能に異なる。

【０１７５】それぞれの場合、抽出物のアリコートをＭｇ^＋＋の存在下で潜在的なＤＮＡ基
質とインキュベートする。次いで、産物をアガロースゲル電気泳動によって分析
する。

【０１７６】Ｄ２）パルスフィールドゲルアッセイ８塩基認識部位について潜在的により情報を与えるアッセイは、パルスフィー
ルドゲルによる全染色体フラグメントの分離に依存する。粗製抽出物をスクリー
ニング法に使用する場合、これらのゲルは、非常に取扱いにくく、一般的に使用
される抽出物中の他のヌクレアーゼに対して非常に感受性が高い。しかし、この
場合では、本発明者らは本発明の目的にこの方法を適用することができる。

【０１７７】標準的な方法では、基質ＤＮＡを、アガロースプラグ中への全細胞の第１の包
埋によって得る。ＤＮＡを、細胞壁を分解する一連の酵素処理および洗浄によっ
てｉｎｓｉｔｕで細胞から放出させる。次いで、制限エンドヌクレアーゼを、
プラグと共にインキュベートする。これは、酵素がアガロースおよび前の消化物
の残余物を浸透しなければならないので、数時間かかる。

【０１７８】アガロースを添加する前に、制限ヌクレアーゼ消化工程を、細胞内発現の誘導
によって迂回することができる。定義によって、候補クローンは、調節された様
式でｉｎｖｉｖｏでＤＮＡを損傷することが周知である。従って、バンディン
グパターンは、酵素発現が誘導された細胞の染色体ＤＮＡを用いて同定可能であ
るべきである。さらに、ＰａｃＩを、試験ケースとして使用する。全染色体消化
について予想されるパターンがすでに周知であるので、ＮｏｔＩもまた使用する
。

【０１７９】重要な工程は以下である：回収時およびアガロースへの包埋処理の間の内因性
ＤＮＡ分解（特にエキソヌクレアーゼ活性）の停止、誘導の長さ、誘導の程度。
対照には、陽性対照、精製ＰａｃＩおよびＮｏｔＩを用いたアガロースプラグ中
に包埋した宿主ＤＮＡの標準的消化、および陰性対照、実験サンプルと並行して
処理した空のベクターを含む宿主サンプルが含まれる。

【０１８０】本調査のこの部分のために使用される菌株の改良には、細胞の主要なＡＴＰ依
存性二本鎖エキソヌクレアーゼを不活化するｒｅｃＤ変異の導入、および主要な
ＡＴＰ独立性二本鎖エキソヌクレアーゼを不活化するｘｔｈ変異の導入が含まれ
る。三重ヌクレアーゼ欠失株（ｅｎｄＡｘｔｈｒｅｃＤ）は、生存できるは
ずであるが、プラスミドを安定に維持することができない（Ｎｉｋｉら、前出、
１９９０）。

【０１８１】Ｄ３）配列決定得られた遺伝子を、配列決定することができる。配列決定の際の余剰な作業を
軽減するために、多数の候補の制限酵素およびフィンガープリント法を行うこと
ができる。類似のフィンガープリントを有するセット中の回収した遺伝子および
その各２つを配列決定する。予備的な相同性検索を行うために十分に信用できる
ためには、通常、最低でも３倍量の配列が必要である。

【０１８２】新規で利用可能なＴｎ７ベースの転座システムＧＰＳ^ＴＭ−１（ＮｅｗＥｎ
ｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓカタログ番号１７００、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いて効率的に配列決定
を行うことができる。このシステムは、目的のプラスミド中の無作為な位置での
プライマー結合部位の移入、トランスポゾン内で切断する希少な切断物での消化
による挿入位置の迅速なマッピング、および目的のフラグメント内の挿入物の配
列決定が可能である。これらの標的分子を用いて、約２０％のトランスポゾン挿
入が目的の配列内に見出される。通常、カセットは２ｋｂ未満であるので、ほと
んどの場合、適切な挿入物は６未満であることが必要である。隣接ベクタープラ
イマー由来の２つの配列（５００ｂｐ／配列）および挿入物由来の１２配列によ
り７０００ｂｐ未処理の配列が得られ、これは約３倍の重複である。これは、最
初の分析に十分である。更なる配列決定を行い、最も興味深いフラグメントの高
品質の配列を得ることができる。他の配列決定ストラテジーもまた可能である。

【０１８３】公的なデータベース中の遺伝子に対する相同性は、新規のＩＩ型ＲＭ遺伝子の
候補を排除する一助となり得る。この方法で回収することができる多くの遺伝子
は、保存アミノ酸配列セグメントを示す。トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、接合
プラスミド伝達に関与するニック酵素、およびトランスポザーゼは全てＢＬＡＳ
Ｔまたは他の相同性検索方法による同定によって、公表されたデータベースに見
出すことができる。それに対して、ＩＩ型制限酵素の遺伝子は、この方法ではほ
とんど見出すことはできない。ＩＩ型制限酵素の遺伝子が相同性によって同定す
ることができる場合、それらはデータベース中の酵素（同一の部位を認識する）
のアイソシゾマーである（Ｒ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、ｐｅｒｓｏｎａｌｃｏｍｍｕ
ｎｉｃａｔｉｏｎ）。従って、標的遺伝子は（新規の特異性を認識するエンドヌ
クレアーゼ）は、相同性検索によって同定されない遺伝子であると予想すること
ができる。

【０１８４】未知の特異性を有するＩＩ型エンドヌクレアーゼのこれらの標的遺伝子は、通
常、保護改変メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子との近接によって最
良に同定することができる（Ｒ．ＲｏｂｅｒｔｓａｎｄＪ．Ｐｏｓｆａｉ、
ｐｅｒｓｏｎａｌｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）。メチルトランスフェラーゼ
は、保存モチーフエレメントがいつも存在するので（上記を参照のこと）、生命
情報科学的方法によって認識可能である。しかし、本方法で回収可能であるべき
２つの酵素（ＰａｃＩおよびＰｍｅＩ）は、任意の改変メチルトランスフェラー
ゼに類似の遺伝子に隣接しておらず、実際、今までに元の宿主には保護メチルト
ランスフェラーゼが同定されていない。これらの酵素がＡＴリッチな８塩基部位
を認識し、宿主生物がＧＣリッチなゲノムを含むので、宿主保護を部位の非存在
によって達成することができる。

【０１８５】従って、特に目的とされる候補ＩＩ型エンドヌクレアーゼ遺伝子は、データベ
ースでヒットしない単独のＯＲＦである。同定可能なメチルトランスフェラーゼ
遺伝子に隣接する候補もまた潜在的なアイソシゾマーのように保存され、安定性
に影響を与えるなどの他の所望の特性を有し得る。

【０１８６】実施例３方法を使用するための一般的な方法認められるべき反復には、本明細書中で開示の公的な文献（Ｈａｌｌａｎｄ
Ｓｔｏｃｋｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃａ、９０、１１５〜１３２、１９９３、Ｈａｌ
ｌａｎｄＣｏｌｌｉｓ、ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１５、５９３〜６
００、１９９５、Ｌｅｖｅｓｑｕｅら、Ｇｅｎｅ、１４２、４９〜５４、１９９
４、ＲｅｃｃｈｉａａｎｄＨａｌｌ、ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１５
、１７９〜１８７、１９９５、Ｍａｚｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８０、６０５
〜６０８、１９９８、Ｂａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７６、５
４５０〜５４５８、１９９４、Ｃｌａｒｋら、ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｉｏｌ．
、２６、１１３７〜１１３８、１９９７、ＯｇａｗａａｎｄＴａｋｅｄａ、
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３７、６０７〜６１６、１９９３、
Ｈａｌｌら、ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｉｏｌ．、５、１９４１〜１９５９、１９
９１、Ｌｅｖｅｓｑｕｅら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏ
ｔｈｅｒ、３９、１８５〜１９１、１９９５、Ｓａｌｌｅｎら、Ｍｉｃｒｏｂ．
ＤｒｕｇＲｅｓｉｓｔ．、１、１９５〜２０２、１９９５、Ｓａｎｄｖａｎｇ
ら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１６０、３７〜４１、１９９
８、Ｓｅｎｄａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３４、２９０９〜２
９１３、１９９６、Ｔｏｓｉｎｉら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、４２、３０５３〜３０５８、１９９８）に記載の反復、
本明細書中で開示の反復（配列番号５〜配列番号７４）、および１つまたは複数
の目的のモデル生物ゲノム配列において同定される反復が含まれる。目的の生物
中にいて同定された反復配列のセットを、実施例１の方法によって同定した。次
いで、これらのセグメントを、プログラムＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ、
ＭａｄｉｓｏｎＷｉｓｃｏｎｓｉｎ）および好ましくはＣＬＵＳＴＡＬ法を用
いて複数のアラインメントにする。従って、同定したセグメントを、例えば、Ｍ
ＥＧＡＬＩＧＮプログラムの系統学的機能によってファミリーに分類することが
でき、多数の内部分岐を有する茂みのような群を反復ファミリーとして選択する
。これらの更なるファミリーは、本方法の適用におけるプローブまたはプライマ
ーとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計を指揮するはずである。

【０１８７】２）種々の機能のクラスの同定目的の機能を、目的のモデル生物に関連する分類において同定する。これには
、例えば、特定の組織（例えば、赤血球または植物の根毛）に接着する能力であ
り得る。

【０１８８】目的の分類内の単離物の比較的大きく（＞５０メンバー）多様な収集物を回収
する。これらの単離物の多様性を、生物の分布の端にわたる位置からの単離によ
って特徴付けられる。これらの端には、空間的（地理的）分布、温度耐性、塩耐
性、ｐＨ耐性、Ｏ_２分圧耐性もしくは要求性または宿主生物の同一性が含まれ得
る。

【０１８９】この収集のメンバーを、目的の機能およびその特異性の存在についてスクリー
ニングする。本実施例は、異なる特異的標的の例としてヒツジ、ウシ、ウサギ、
ブタ、ヤギ、カエル、およびヒトの赤血球を用いた赤血球凝集能力試験によって
行うことができるか、異なる単糖類または二糖類の存在下での赤血球の１つの型
を用いて試験することができるか、または赤血球表面の性質を変化させる種々の
処理に従って試験することができる。２つの条件のうちの１つまたは両方が得ら
れた場合、機能を、予想される方法で、カセットコード機能の変数として同定す
る。第１に、巨大なフラクション（＞１０％）は、機能の有無について残りのフ
ラクションと異なる。例えば、収集物の５つ以上のメンバーは赤血球の凝集を示
したが残りは示さず、逆も同様である。第２に、機能の特異性は、以下によって
変化する（例えば、いくつかの凝集ヒツジ赤血球、いくつかのヤギ赤血球）。こ
の基準は、同定した特異性の数が多い場合（例えば、５０個の単離物の収集にお
いて４つを超える特異性）、最も最良に満たされる。

【０１９０】可変性機能を、以下の免疫学的方法によって同定することもできる。例えば、
目的の動物またはヒト集団由来の血清または目的の化合物（例えば、ポリペプチ
ド）中の可変エピトープを認識するモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡアッ
セイ；例えば、異なる物理学的または系統発生学的起源の組織を用いる細胞傷害
性アッセイ；組織または器官特異的効果の文脈で、直接的または間接的なＤＮＡ
合成またはｃＡＭＰ加水分解のような細胞処理の阻害または刺激を試験するアッ
セイ；炭素、窒素、またはエネルギーの多様な潜在的供給源に対する成長または
形質転換試験；または種々の抗菌剤の存在下または阻害下での成長試験。

【０１９１】３）ＤＮＡ調製および本方法での使用についての適合性の同定本方法の適合性の予備試験を、一連の少量の培養培地の、試験される種類の単
離物の一部での接種（例えば、マイクロタイターウェルプレート中）、増殖、ボ
イル、および実施例１のパートＣ２に記載のＰＣＲによるコロニーＰＣＲによっ
て行うことができる。文献または工程１で同定されたこれらまたは他の反復ファ
ミリーに基づいて設計した他のプライマーも使用することができる。この工程で
１つまたは複数のＰＣＲ産物の出現によって同定された正の単離物を、次の工程
で使用する。

【０１９２】４）カセットの単離正の単離物からのＤＮＡの調製物を、実施例２に記載の末端に適切な制限酵素
クローニング部位を有する以下のプライマーペアを用いた大規模なＰＣＲに供す
る：配列番号８６と配列番号９０、配列番号８６と配列番号９１、配列番号８７
と配列番号９０、配列番号８７と配列番号９１、配列番号８８と配列番号９０、
配列番号８８と配列番号９１、配列番号８９と配列番号９０、配列番号８９と配
列番号９１（表２を参照のこと）。更なる反復ファミリーに基づいて設計した更
なるプライマーペアも設計することができる。増幅条件は、使用したペアに依存
して調整することができる。

【０１９３】５）カセットクローニング実施例２のプライマーおよびｐＬＴ７Ｋを使用する場合、ＰＣＲフラグメント
を、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化する。ｐＬＴ７Ｋの誘導体またはクローニン
グ部位に他の制限部位を保有する類似のプラスミドと使用するのに適切なプライ
マーを含む他のプライマーを使用することができる。

【０１９４】６）菌株の選択カセットの回収に適切な菌株は、目的の機能を発現しないが、その存在を認め
ることができる菌株である。例えば、赤血球凝集素遺伝子は、調査に干渉する赤
血球凝集素を菌株自体が発現しない菌株中で発現されるべきである。ＬＥ３９２
は、赤血球凝集活性を発現しない大腸菌菌株の例である。ｐＬＴ７Ｋとの使用で
は、Ｔ７遺伝子Ｉ構築物は、ＬＥ３９２に移入される必要があかる、あるいは、
以下の菌株が赤血球凝集活性を欠くことが認められた場合、ＥＲ２６４５、ＥＲ
２７４６、ＥＲ２５６６、またはＥＲ２７４４などの菌株を使用することができ
る。菌株は、例えば、認められた赤血球凝集素のクラス（例えば、線毛）を輸送
することができるタンパク質輸送系の発現によって機能の発現またはレポートを
促進するようにカスタマイズすることができる。

【０１９５】７）カセットの同定赤血球凝集の場合、機能活性を利用することによって、コロニーまたはコロニ
ーのプールを、実施例２に記載の発現の誘導後、マイクロタイタープレート中で
赤血球凝集について試験することができる。

【０１９６】別の同定法によって、予想されるタンパク質（例えば、線毛、ピリ線毛、また
は外膜タンパク質）の特定のクラスにおいて見出されるモチーフに特異的な変性
プライマーの設計およびそのプライマーを用いてコロニーまたはコロニーのプー
ルのみまたは実施例２に記載のように隣接する反復に特異的なＰＣＲプライマー
と組み合わせてＰＣＲを行うことである。

【０１９７】タンパク質クラスに特徴的なモチーフのリストを、Ｍ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ
ａｎｄＭ．Ｈａｎｄｅｌ、「ＴｒｅｎｄｓＧｕｉｄｅｔｏＢｉｏｉｎｆ
ｏｒｍａｔｉｃｓ」、ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ、１９９８に記
載の公的なデータベースに見出すことができる。

【０１９８】８）機能の特徴付け所望の遺伝子カセットと予想される特性を特に示すコロニーを、特定の機能を
同定するのに適切な以下の方法によって特徴付けられるであろう：例えば、種々
の糖などの小分子との競合による赤血球凝集試験；ヨウ素化、加熱、凍結、酸、
アルカリ、アルキル化剤またはプロテアーゼまたはヌクレアーゼとの処理などの
種々の処理に対する感受性；ならびに遺伝子配列の獲得および他のレポーター分
子（アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質また
は種々のエピトープタグ）との融合を含む種々の変異を保有する遺伝子を有する
細胞の性質の同定、または標準的な精製法もしくはポリペプチドタグによる親和
性精製によるコード化タンパク質の精製調製物の獲得。

【図面の簡単な説明】

【図１】配列表１は、配列番号５〜７８の配列を示す。配列表２は、配列番号７９〜９１の配列を示す。図１は、特徴付けされたインテグロン、反復配列（黒塗りの四角；５９ｂｐエ
レメント）によって隔てられた遺伝子カセットのアレイ（細い線；ｆｎ１，ｆｎ
２，ｆｎ３）の構造の模式図である。

【図２】図２は、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ中に同定されたスーパーインテグロ
ンの断片の略図である。

【図３Ａ】図３Ａは、配列番号１の配列を示す。

【図３Ｂ】図３Ｂは、配列番号２の配列を示す。

【図３Ｃ】図３Ｃは、配列番号３の配列を示す。

【図３Ｄ】図３Ｄは、配列番号４の配列を示す。

【図３Ｅ】図３Ｅは、ＰＡＲエレメントのいくつか（配列番号９６〜配列番号１１６）の
アライメントである。

【図４】図４は、反復配列を同定するためのもう一つの方法であるドットプロットの図
である。

【図５】図５は、個々のＰＡＲエレメントの自己相補性を示す図である（ＧＣＧプログ
ラムセットにおけるＦＯＬＤの出力のＳＱＵＩＧＧＬＥ表示）。

【図６Ａ】図６Ａは、表１に示す本明細書のＰＡＲエレメントのセット（配列番号５〜配
列番号７８）の中で同定可能なサブファミリーのアライメントを示す（ファミリ
ー１）。

【図６Ｂ】図６Ｂは、表１に示す本明細書のＰＡＲエレメントのセット（配列番号５〜配
列番号７８）の中で同定可能なサブファミリーのアライメントを示す（ファミリ
ー２）。

【図６Ｃ】図６Ｃは、表１に示す本明細書のＰＡＲエレメントのセット（配列番号５〜配
列番号７８）の中で同定可能なサブファミリーのアライメントを示す（ファミリ
ー３）。

【図６Ｄ】図６Ｄは、表１に示す本明細書のＰＡＲエレメントのセット（配列番号５〜配
列番号７８）の中で同定可能なサブファミリーのアライメントを示す（ファミリ
ー４）。

【図７】図７は、すべてのＰＡＲエレメントの大部分のコンセンサスおよび典型的なカ
セットに関係するサザンブロット（パネルＡ）およびＰＣＲフィンガープリント
表示（パネルＢ）に対して使用されるオリゴヌクレオチドの位置を示す。

【図８】図８は、オリゴヌクレオチド２〜５（配列番号７９〜配列識別番号８３；図７、
表２も参照）の混合物のＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓＤＮＡへのハイブリッド
化のサザンブロットを示す。

【図９】図９は、図７に示したオリゴヌクレオチド６および７を使用した６種類のＰｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ種の単離株の染色体ＤＮＡから生成したＰＣＲ生成物のアガ
ロースゲル電気泳動パターンを示す。

【図１０】図１０は、カセットにコードされた開放型読み取り枠のクローンライブラリー
を作製するためのスキームとｐＬＴ７Ｋからのそれらの産物の発現を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年１２月１３日（２０００．１２．１３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１６３

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１６３】ＥＲ２７４５のサンプル：（Ｆ⁻λ⁻ｆｈｕＡ２［ｌｏｎ］［ｄｃｍ］ｏｍｐ
ＴｌａｃＺ：：Ｔ７ｇｅｎｅ１ｇａｌｓｕｌＡ１１Δ（ｍｃｒＣ−ｍｒ
ｒ）１１４：：ＩＳ１０Ｒ（ｍｃｒ−７３：：ｍｉｎｉＴｎ１０−−ＴｅｔＳ）
２Ｒ（ｚｇｂ−２１０：：Ｔｎ１０−−ＴｅｔＳ）ｅｎｄＡ１）ｄｉｎＤ２：
：ＭｕｄＩ１７３４（ＫａｎＲ，ｌａｃＺ^＋）を、１９９９年６月１１日付けの
ブダペスト条約の条項に基づいてＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２１５を受領した
。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１６４

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１６４】ＥＲ２７４６のサンプル：（Ｆ⁻λ⁻ｆｈｕＡ２ｇｌｎＶ４４ｅ１４−ｒ
ｆｂＤ１？ｒｅｌＡ１？ｅｎｄＡ１ｓｐｏＴ１？ｔｈｉ−１Δ（ｍｃｒＣ−ｍ
ｒｒ）１１４：：ＩＳ１０ｌａｃＺ：：Ｔ７ｇｅｎｅ１ｄｉｎＤ２：：Ｍ
ｕｄ１１７３４（ＫａｎＲ，ｌａｃＺ（ｔｓ））を、１９９９年６月１１日付け
のブダペスト条約の条項に基づいてＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒ
ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２１４を受領し
た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者モーガン，リチヤード・デイアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 01949、ミドルトン、ドナバンズ・ウエイ・31 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA02 CA09 CA20 DA05 DA09 EA04 HA09 HA11 HA14 HA19 4B063 QA01 QA05 QA13 QA18 QQ42 QQ44 QR08 QR14 QR31 QR33 QR55 QR59 QR60 QR62 QR66 QR80 QR84 QS25 QS34 QX02 QX07

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】遺伝子カセット内から無傷の多様性選択された遺伝子をクロ
ーニングするための方法であって、（ａ）遺伝子カセットに隣接する反復ＤＮＡ配列を同定する工程；（ｂ）前記遺伝子カセットに隣接する前記反復配列にオリゴヌクレオチドをハ
イブリダイゼーションさせ、前記配列を増幅して、前記カセット内から遺伝子を
含有するＤＮＡフラグメントを得る工程；（ｃ）前記ＤＮＡフラグメントをベクターに連結する工程；および（ｄ）前記ベクターを適切な菌株に形質転換する工程を含む方法。
【請求項２】前記多様性選択された遺伝子は、多糖類抗原またはポリペプチド抗原または分泌された分子などの細胞表面抗原
；線毛タンパク質、ピリ線毛タンパク質または外膜タンパク質などの接着因子；
小分子の輸送因子、特に、特異性が狭い小分子の輸送因子；トキシン、溶血素、
赤血球凝集素、キナーゼおよびシグナル変換分子；薬物耐性決定因子などの解毒酵素；一時的に摂取された化合物（ただし、トリ
カルボン酸回路などの主要な代謝経路に必要とされる化合物を除く）に特異的な
代謝酵素；希な糖類（ただし、リボース、デオキシリボースおよび細胞壁の糖類
などのすべての細胞で必要される糖類を除く）の生合成酵素、特に、細胞周囲エ
ンベロープの一部を形成するような糖類の生合成酵素からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記多様性選択された遺伝子は制限エンドヌクレアーゼ遺伝
子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記多様性選択された遺伝子はメチルトランスフェラーゼ遺
伝子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】前記オリゴヌクレオチドは、方向性クローニングを可能にす
る認識部位を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記ＤＮＡフラグメントは、発現を可能にする方向で前記ベ
クターに連結されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】標的ＤＮＡ調製物内に由来する遺伝子カセットのアレイの存
在を同定するための方法であって、（ａ）配列番号５〜配列番号７８の１つまたは複数にハイブリダイゼーション
する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをＤＮＡ調製物にハイブリダイゼーシ
ョンさせる工程；および（ｂ）安定なＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの存在を検出する工程を含む方法。
【請求項８】前記検出は、安定なＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの存在をサ
ザンブロットまたはドットブロットによって決定することを含む、請求項７に記
載の方法。
【請求項９】前記検出は、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを用いて
、前記オリゴヌクレオチドを前記ＤＮＡ調製物にハイブリダイゼーションさせる
こと、および前記安定なＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの３’末端におけるそのＤ
ＮＡ重合能を検出することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】前記オリゴヌクレオチドは配列番号７９〜配列番号９１を
含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】前記オリゴヌクレオチドは配列番号５〜配列番号７８また
はその一部の１つまたは複数のＤＮＡにハイブリダイゼーションする、請求項７
に記載の方法。
【請求項１２】ＤＮＡ源は個々の菌株を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】ＤＮＡ源は菌株群または菌株集団を含む、請求項７に記載
の方法。
【請求項１４】ＤＮＡ源は環境ＤＮＡを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】配列番号７９〜配列番号９１またはその一部を含む単離さ
れたＤＮＡプライマーからなる組成物。
【請求項１６】配列番号５〜配列番号７８またはその一部の１つまたは複
数のＤＮＡにハイブリダイゼーションするＤＮＡプライマーからなる組成物。
【請求項１７】所定のＤＮＡ配列から遺伝子カセットのアレイを同定する
ための方法で、（ａ）前記所定のＤＮＡ配列をＴＡＡＣＷＡについてスクリーニングする工程
；（ｂ）前記所定のＤＮＡ配列をＣＧＴＴＲＲについてスクリーニングする工程
；（ｃ）工程Ａの５’Ｔは工程Ｂの３’Ｒから約２００塩基対未満であるＤＮＡ
セグメントについてスクリーニングする工程；および（ｄ）工程ＣのＤＮＡ配列が前記所定のＤＮＡ配列内において反復しているか
どうかを決定する工程を含む方法。