TWI697559B

TWI697559B - 穿梭載體、包含其之原核宿主細胞與試劑組以及利用該宿主細胞生產蛋白質之方法

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Publication number: TWI697559B
Application number: TW106133120A
Authority: TW
Inventors: 林俊宏; 王志鵬; 陳正文; 黃文正; 王泓智; 宣詩玲
Original assignee: 財團法人農業科技研究院
Priority date: 2017-09-27
Filing date: 2017-09-27
Publication date: 2020-07-01
Also published as: TW201915169A; US10801031B2; US20190093113A1

Abstract

本申請案提供一種穿梭載體，其可於多種宿主細胞中操作，從而提供基因工程領域中的一種新穎的工具。另一方面，本申請案更提供一種包含所述穿梭載體的原核宿主細胞與試劑組，以利用該穿梭載體建構含有欲表現基因的表現載體，便可利用單一載體而在不同宿主中生產蛋白質。

Description

穿梭載體、包含其之原核宿主細胞與試劑組以及利用該宿主細胞生產蛋白質之方法

本申請案關於一種用於基因工程之載體，尤指一種能在不同宿主複製的穿梭載體。

質體(plasmid)為微生物染色體外之遺傳物質(extrachromosomal genetic material)，在基因工程中常被應用作為載體(vector)以攜帶外源基因至宿主細胞中進行表現。目前有關質體之研究內容大致涵括八大類，包括質體之分離與解序、質體於生理功能中所扮演之角色、質體之複製形式、質體間之不相容性(incompatibility)、質體之宿主範圍、質體之穩定性、質體於宿主中之複製數、利用質體建構基因工程用之載體，例如穿梭載體(shuttle vector)、選殖載體(cloning vector)及表現載體(expression vector)。

其中，穿梭載體係指能在兩種親源關係不同之生物中進行複製之質體。例如大腸桿菌/枯草桿菌穿梭載體pHY300PLK是由大腸桿菌質體pACYC177之複製區域與糞鏈球菌(Enterococcus faecalis)DS-5質體pAMα1之複製區域組合而成，可轉形入大腸桿菌與枯草桿菌中。由於穿梭載體具有可在不同之生物中進行複製的能力，因此可有效提升基因操作之便利性。舉例而言，基因選殖之工作可於容易操作之大腸桿菌中進行，之後再將含有正確基因片段之穿梭載體轉形入另一宿主中，即可進行基因之表現。有鑑於穿梭載體可應用於兩種或兩種以上宿主中進行基因操作之優勢，領域中持續需要多種新穎之穿梭載體以滿足研究與商業之需求。

爰是，本申請案的一個目的在於提供一種新穎的穿梭載體，其至少可應用於一乳酸菌及另一非乳酸菌之原核細胞而滿足領域中的需求。在一較佳實施態樣中，乳酸菌為胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus,LGG)或食竇魏斯氏菌(Weissella cibaria)，非乳酸菌之原核細胞可包括大腸桿菌(Escherichia coli)或枯草桿菌(Bacillus subtilis)等。

在一方面，穿梭載體可包括：(a)大腸桿菌質體複製子基因，其具有如SEQ ID NO：3所示之序列；以及(b)乳酸菌質體複製子基因，其具有如SEQ ID NO：4所示之序列。

較佳地，所述穿梭載體序列可為如SEQ ID NO：2所示之序列。在一實施態樣中，其中該載體為pBRLP31-8。

較佳地，所述穿梭載體更包括單股複製起始點(single strand origin,sso)及雙股複製起始點(double strand origin,dso)。

較佳地，所述穿梭載體更包括多重選殖區，供選殖目標基因。在一可行實施態樣中，所述目標基因上游更包括表現元件。

較佳地，所述穿梭載體更包括篩選基因。在一實施態樣中，所述篩選基因為抗藥性篩選基因、非抗藥性篩選基因、或其組合。在一較佳實施態樣中，所述篩選基因為氯黴素抗性基因。

較佳地，所述穿梭載體能夠於大腸桿菌(E.coli)、胚芽乳酸桿菌(L.plantarum)、鼠李糖乳酸桿菌(L.rhamnosus,LGG)、食竇魏斯氏菌(W.cibaria)及枯草桿菌(B.subtilis)中進行複製。

較佳地，所述穿梭載體更包括大腸桿菌引子抑制子基因。在一實施態樣中，所述大腸桿菌引子抑制子基因具有如SEQ ID NO：5所示之序列。

本申請案的另一個目的在於提供一種穿梭載體，其可包含：乳酸菌區域，該乳酸菌區域序列可為如SEQ ID NO：6所示之序列；以及大腸桿菌區域，該大腸桿菌區域序列可為如SEQ ID NO：7所示之序列。在一實施態樣中，所述乳酸菌區域中包含：單股複製起始點、雙股複製起始點以及乳酸菌質體複製子基因。在另一實施態樣中，所述大腸桿菌區域包含：大腸桿菌質體複製子基因以及大腸桿菌引子抑制子基因。

較佳地，所述大腸桿菌質體複製子基因可為大腸桿菌質體pBR322的rep，或該大腸桿菌引子抑制子基因可為大腸桿菌質體pBR322的rop。

較佳地，所述穿梭載體更包括篩選基因，篩選基因可為抗藥性篩選基因、非抗藥性篩選基因、或其組合。在一實施態樣中，所述篩選基因可為氯黴素抗性基因。

較佳地，所述穿梭載體更包括多重選殖區，供選殖目標基因。在一可行實施態樣中，所述目標基因的上游更包括表現元件。

本申請案的又一個目的在於提供一種原核宿主細胞，其包含前述之穿梭載體。

較佳地，所述原核宿主細胞可包括大腸桿菌(E.coli)、胚芽乳酸桿菌(L.plantarum)、鼠李糖乳酸桿菌(L.rhamnosus,LGG)、食竇魏斯氏菌(W.cibaria)或枯草桿菌(B.subtilis)。

本申請案的再一個目的在於提供一種利用前述之原核宿主細胞生產蛋白質之方法，該方法包含下列之步驟：將前述之原核宿主細胞置入培養基中，並於適當培養條件下使所述原核宿主細胞表現所述蛋白質；以及由所述原核宿主細胞或所述原核宿主細胞之培養液中回收蛋白質。

較佳地，所述方法可更包括建構如前述含有目標基因之穿梭載體。

較佳地，所述方法可更包括利用所述穿梭載體轉形所述原核宿主細胞。

本申請案的一個目的在提供一種表現外源性基因之試劑組，包括：如前述之穿梭載體。

也就是說，在本申請案中，利用自味噌中所分離之胚芽乳酸桿菌ATIT-031之最小無性狀質體pLP31-8及大腸桿菌質體pBR322複製區域，進行新型穿梭載體pBRLP31-8之建構。在一實施態樣中，可將pLP31-8中之複製區域中所帶有的限制酶切位EcoRI，利用PCR方式將EcoRI進行定點突變，使所產生載體不再帶有限制酶切位EcoRI，進而衍生易於基因操作之穿梭載體。

此外，根據本申請案之一實施例所建構之穿梭載體，至少可轉形入大腸桿菌(E.coli)、胚芽乳酸桿菌(L.plantarum)、鼠李糖乳酸桿菌(L.rhamnosus,LGG)、食竇魏斯氏菌(W.cibaria)或枯草桿菌(B.subtilis)中並進行複製，表示所述穿梭載體確實可運用於多宿主表現系統之開發，利於研究與商業之需求。

第1圖係顯示利用瓊脂醣膠體電泳分析L.plantarum ATIT-031之質體的膠體電泳圖。其中Lane M代表1kb DNA Ladder之電泳結果。

第2圖係顯示pLP31-8之物理圖譜。各縮寫代表之涵義為rep：質體複製子基因；dso：雙股複製起始點；及sso：單股複製起始點。

第3圖係顯示pBRLP31-8之物理圖譜。各縮寫代表之涵義為rop-pBR322：pBR322之引子抑制子基因；rep-pBR322：pBR322之複製子基因；rep-pLP31-8：pLP31-8之質體複製子基因；dso-pLP31-8：pLP31-8之雙股複製起始點；sso-pLP31-8：pLP31-8之單股複製起始點；及Cm^r-pC194：pC194之氯黴素抗性基因。

第4圖係顯示胚芽乳酸桿菌ATIT-018、鼠李糖乳酸桿菌BCRC 16000、食竇魏斯氏菌ATIT-044及枯草桿菌DB430轉形株中pBRLP31-8質體之確認。(A)自含有及未含有pBRLP31-8質體之胚芽乳酸桿菌ATIT-018抽取質體並經限制酶剪切質體後之瓊脂膠體電泳結果。(B)自含有及未含有pBRLP31-8質體之鼠李糖乳酸桿菌BCRC 16000抽取質體並經限制酶剪切質體後之瓊脂膠體電泳結果。(C)自含有及未含有pBRLP31-8質體之食竇魏斯氏菌ATIT-044抽取質體並經限制酶剪切質體後之瓊脂膠體電泳結果。(D)自含有及未含有pBRLP31-8質體之枯草桿菌DB430抽取質體並經限制酶剪切質體後之瓊脂膠體電泳結果。

除非另有定義，本文所用之所有技術與科學術語均與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所通常理解的意義相同。在發生衝突的情況下，以本說明書包括之定義為準。

除非另有說明，所有百分比、部分、比例等皆以重量計。

如本文中所用者，術語「由......製成」(produced from)與「包含」(comprising)同義。如本文中所用者，術語「包含」(includes,including)、「包括」(comprises,comprising)、「具有」(has,having)、「含有」(contains,containing)、或其任何其他變型，係意欲涵蓋非排他性的涵括。例如，含有清單列出的複數元素的一組合物、製程、方法、製品或裝置不一定僅限於清單上所列出的這些元素而已，而是可以包括未明確列出但卻是該組合物、製程、方法、製品或裝置固有的其他元素。術語「包含」一般係以包括之意思被使用，此即係允許一或數種其他特徵或組成份之存在。

本申請案的目的在於提供一種穿梭載體，其為一種至少可於乳酸菌及另一非乳酸菌之原核細胞中複製的載體。該穿梭載體憑藉其可於兩種以上的宿主細胞中複製的特性，在基因工程的應用上更具優勢。

在一實施例中，提供一種穿梭載體，包括：(a)大腸桿菌質體複製子基因，其具有如SEQ ID NO：3所示之序列；以及(b)乳酸菌質體複製子基因，其具有如SEQ ID NO：4所示之序列。在一個較佳實施態樣中，穿梭載體之序列可為SEQ ID NO：2所示之序列。在一實施態樣中，將該穿梭載體命名為pBRLP31-8。

在另一實施例中，提供一種穿梭載體，其可包含：乳酸菌區域，該乳酸菌區域序列可為如SEQ ID NO：6所示之序列相同；以及大腸桿菌區域，該大腸桿菌區域序列可為如SEQ ID NO：7所示之序列。在一實施態樣中，所述乳酸菌區域中包含：單股複製起始點、雙股複製起始點以及乳酸菌質體複製子基因；以及所述大腸桿菌區域包含：大腸桿菌質體複製子基因以及大腸桿菌引子抑制子基因。在一較佳實施態樣中，大腸桿菌引子抑制子基因可為如SEQ ID NO：5所示之序列。

在又一實施例中，提供一種原核宿主細胞，其包含前述之穿梭載體。在一可行實施態樣中，所述原核宿主細胞可包括大腸桿菌(E.coli)、胚芽乳酸桿菌(L.plantarum)、鼠李糖乳酸桿菌(L.rhamnosus,LGG)、食竇魏斯氏菌(W.cibaria)或枯草桿菌(B.subtilis)。

本文中所稱「宿主」、「宿主細胞」及「重組宿主細胞」等術語於本文中可彼此相互交替使用，其可表示原核細胞。可於該宿主細胞中引入一或數種本發明所述之載體或經基因工程方法插入欲表現基因的所述載體。如本發明所屬技術領域中通常知識者所瞭解，上述術語不僅意指特定之細胞，而且亦指該種細胞之後代或潛在可能之後代。因為基因突變或環境之影響，後繼之世代中可能會出現改變，故該等細胞之後代實質上不會與親代之細胞相同，然而卻仍包括於本文中所使用之該術語之範圍內。

本文所使用之「穿梭載體」一詞係指在載體上同時存在有大腸桿菌及乳酸菌之質體複製起源區(replication origin)，使此載體可至少於大腸桿菌及乳酸菌中複製並增殖，以突破質體菌種種別的限制性。通常該穿梭載體可包含篩選基因，如抗康納黴素(kanamycin)抗性基因標記或氯黴素(Chloramphenicol)抗性基因標記，不以此為限。此外，該載體亦可包含能夠用於基因操作之限制酶切位。較佳地，載體可更包括多重選殖區，供嵌入欲表現基因，而嵌入於所述多重選殖區之基因可受表現元件所控制。在一可行實施態樣中，表現元件可包含啟動子，且該啟動子為持續表現之啟動子或可誘導之啟動子。

於一可行實施態樣中，前述表現元件可進一步包含：核醣體結合部位、操縱子(operator)、轉錄/轉譯的加強子序列(enhancer sequence)、或其組合。前述表現元件可為但不限於：乳酸菌的P23表現元件、乳酸鏈球菌P2P表現元件、乳酸鏈球菌P32表現元件、乳酸鏈球菌P59表現元件、乳酸鏈球菌P6C表現元件、乳酸桿菌表層蛋白質(S-layer protein)基因表現元件、乳酸菌Tuf基因表現元件、巨大細胞細胞病毒(CMV)表現元件、猿猴病毒40(simian virus 40,SV40)表現元件、Rous肉瘤病毒(rous sarcoma virus,RSV)表現元件、磷酸甘油激酶(phosphoglycerate kinase,PGK)基因表現元件、胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因表現元件、人類延伸因子1a(elongation factor 1 alpha,EF-1a)基因表現元件、泛素(ubiquitin)基因表現元件、或肌動蛋白質基因表現元件、或其組合。

本文中所稱「乳酸菌區域」係指可為前述乳酸菌辨識及表現的區域；所稱「大腸桿菌區域」係指可為前述大腸桿菌辨識及表現的區域。

本文中所稱「非乳酸菌之原核細胞」的選擇為除乳酸菌外的原核細胞(如，革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌)。在一較佳實施態樣中，前述非乳酸菌之原核細胞為一革蘭氏陰性菌。於一可行實施態樣中，前述革蘭氏陰性菌為：大腸桿菌(E.coli)。本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可理解，本文中所述非乳酸菌之原核細胞也可以是一種革蘭氏陽性菌。於一可行實施態樣中，前述革蘭氏陽性菌為：枯草桿菌(B.subtilis)。

本文中所稱「質體複製子」係指在宿主的表現系統中得以使本發明之穿梭載體進行複製的蛋白質。本文中所稱「質體複製子基因」係指一基因序列，其經生物體內的轉錄/轉譯作用後，所得蛋白質產物為前述質體複製子。

在一可行實施態樣中，屬於前述乳酸菌區域的「乳酸菌質體複製子基因」係指可經前述乳酸菌辨識並進行轉錄/轉譯的基因，且經轉錄/轉譯所得之乳酸菌質體複製子可於前述乳酸菌細胞內進行前述載體的複製。在另一可行實施態樣中，穿梭載體可更包括單股複製起始點及雙股複製起始點，使前述經轉錄/轉譯所得之乳酸菌質體複製子可於所述雙股複製起始點開始進行前述載體的複製，產生雙股DNA和游離之單股DNA。游離之單股DNA上之單股複製起始點會形成莖環(stem-loop)二級結構，可被宿主RNA聚合酶所辨識，並於此合成一RNA引子，再藉由宿主DNA聚合酶沿著RNA引子之3’端進行DNA複製作用，將單股DNA轉換成雙股DNA。

在一可行實施態樣中，屬於前述大腸桿菌區域的「大腸桿菌質體複製子基因」係指可經前述大腸桿菌辨識並進行轉錄/ 轉譯的基因，且經轉錄/轉譯所得之複製蛋白質可使前述載體於前述大腸桿菌細胞內進行複製。前述大腸桿菌質體複製子基因可為但不限於：來自大腸桿菌質體pBR322、ColE1、p15A、pBBR1、pSC101、R6K、RK2、或RSF1010的rep。

在一可行實施態樣中，屬於前述大腸桿菌區域的「引子抑制子基因」係指可經前述大腸桿菌辨識並進行轉錄/轉譯的基因，且經轉錄/轉譯所得之引子抑制子可於前述大腸桿菌細胞內調控前述載體的複製數。前述引子抑制子基因可為但不限於：大腸桿菌質體pBR322的rop。

本文中所稱「欲表現之基因」係依據使用者的需求而有所不同。舉例來說，若欲將根據本發明之一實施例的穿梭載體應用於以基因工程大量製造某一種蛋白質(如胰島素)，則前述欲表現之基因即為該蛋白質的核酸序列。又舉例來說，若欲將根據本發明之一實施例的穿梭載體作為疫苗使用，則前述欲表現之基因於宿主(例如：人)體內經轉譯轉錄之後所得之蛋白質產物應具有免疫誘發效果(即，免疫誘發物質)。前述免疫誘發物質可為但不限於：病原(病菌、病毒和寄生蟲)之具有抗原性的胜肽、蛋白質、或其片段。

本文中所稱「篩選基因」係用來確認前述載體是否有順利轉形(transform)進入宿主中。前述篩選基因可為但不限於：抗藥性篩選基因、非抗藥性篩選基因、或其組合。在一可行實施態樣中，前述篩選基因可為抗藥性篩選基因。舉例來說，前述抗藥性篩選基因為氯黴素抗性基因。在此可行實施態樣中，順利轉形有前述載體的宿主(如，大腸桿菌或是乳酸菌)便可以產生對氯黴素的抗性，而得以存活於含有氯黴素的環境。

本文中所稱「非抗藥性篩選基因」係指非以對抗生素之抗性與否來確認轉形的基因。前述非抗藥性篩選基因例如但不限於：β-半乳糖苷酶的核酸序列。在採用β-半乳糖苷酶的核酸序列作為篩選基因的實施態樣中，轉形成功的菌株會將X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)分解為半乳糖和5-溴-4-氯-3-羥基吲哚，而5-溴-4-氯-3-羥基吲哚會二聚合為5,5'-二溴-4,4'-二氯靛藍，因此產生不可溶而可供辨識的藍色物質。

在一較佳實施態樣中，前述非抗藥性篩選基因為營養缺乏篩選基因(如，胸苷酸合成酶機因thyA)、醣類代謝基因(如，乳糖代謝途徑相關之lacF與lacG)、抑菌素抗性基因(如，nisin抗性基因)、重金屬抗性基因(如，鎘抗性基因)、膽鹽水解酵素基因(bile sal hydrolase)、α-半乳糖苷酶基因(α-galactosidase)、D-丙胺酸消旋酶(alanine racemase)基因、或熱休克蛋白質(heat shock protein)基因。

本文中所稱「轉形」、「經轉形」或「將核酸送入宿主細胞中」等術語係表示利用任何之方法，使細胞外之核酸(如載體)於有或無伴隨物質之下進入宿主細胞。「細胞轉形」或「經轉形之細胞」等術語係表示於該細胞或其子代細胞中送入細胞外之核酸，因此宿主細胞含該細胞外之核酸。核酸送入細胞中，而使該核酸可與染色體結合成一體之片段形式或以染色體外之元件之形式進行複製。將適當之宿主細胞以例如表現載體之轉形可利用習知之方法加以完成，例如電穿孔轉形法、粒子撞擊法等，或利用化學方法，例如由磷酸鈣促成之轉形反應，其敘述於例如「Maniatis et al.1982,Molecular Cloning,A laboratory Manual,Cold Spring Habor Laboratory中或於Ausubel et al.1994,Current protocols in molecular biology,John Wiley and Sons中。

位於本文中之元素或成份之前的不定冠詞「一」及「一個」旨在非限制性地說明該元素或成份的實例數目(即出現數)。因此「一」或「一個」應理解為包括一個或至少一個，且該元素或成分的單數詞形也包括複數，除非該數目顯然是指單數。

本文中之材料、方法及實例僅為說明性質，除非特別說明，否則非意欲為限制本發明。儘管可用類似或等效於本文所述的方法或材料來實施或測試本發明，然本文所述者為較適當的方法及材料。

具體實施例：菌種、培養基、藥品及試劑

1.菌種

以味噌所分離之胚芽乳酸桿菌(L.plantarum)ATIT-031作為質體研究對象。以大腸桿菌(E.coli)ECOS 9-5(益生，臺灣)作為DNA選殖用之宿主細胞。以自家泡菜所分離之胚芽乳酸桿菌(L.plantarum)ATIT-018、鼠李糖乳酸桿菌(L.rhamnosus,LGG)BCRC 16000、枯草桿菌(B.subtilis)DB430及桃子醃漬液中所分離之食竇魏斯氏菌(W.cibaria)ATIT-044進行穿梭載體之轉形試驗。

2.培養基

利用deMan Rogosa Sharpe(MRS)培養基(Merck,USA)進行乳酸菌之培養，視需要添加5μg/mL氯黴素(chloramphenicol)或1.5%(w/v)洋菜(agar)製備固體培養基。利用Lurai-Bertani(LB)培養基進行大腸桿菌之培養，可視需要添加25μg/mL氯黴素或1.5%洋菜製備固體培養基。利用Lurai-Bertani(LB)或Select APS^TM Super Broth培養基進行枯草桿菌之培養，可視需要添加5μg/mL氯黴素或1.5%(w/v)洋菜製備固體培養基。培養基與洋菜均購自美國BD公司。deMan Rogosa Sharpe(MRS)培養基、Lurai-Bertani(LB)培養基及/或Select APS^TM Super Broth培養基之成分及其比例為本發明所屬技術領域中具有通常知識者所習知，並可依各實驗室或實驗人員習慣對成分及比例進行微調。

3.藥品及試劑

本研究所使用之藥品為美國Sigma-Aldrich、Affymetrix或Amresco公司之試藥級藥品。RNase A溶液與DNeasy Blood & Tissue Kit購自德國Qiagen公司；核酸限制酶(restriction enzyme)、GeneRuler^TM 1 kb DNA Ladder、Dream taq DNA polymerase及CloneJET^TM PCR cloning kit購自美國Thermo Fisher Scientific公司；50倍TAE buffer與6倍EZ-Vision^TM loading buffer購自美國Amresco公司；T4 DNA接合酶(ligase)購自臺灣益生(Yeastern) 公司；Plasmid Miniprep Purification Kit II、PCR Clean Up Kit、Gel Elution Kit及PCR Master Mix II購自臺灣捷恩麥克生物科技(GMbiolab)有限公司；GDP-HiFi DNA Polymerase購自美國Genedirex公司；Faststart Universal SYBR Green Master(ROX)購自美國Roche公司。

實施例一：胚芽乳酸桿菌ATIT-031質體之抽取

由於分子量小的質體具有容易操作的優點，因此本實施例中首先針對前述胚芽乳酸桿菌ATIT-031中所含最小的質體進行分離。

首先，挑取單一胚芽乳酸桿菌ATIT-031菌落接種於MRS液體培養基中。於30℃靜置培養16小時後，利用Plasmid Miniprep Purification Kit II進行乳酸桿菌質體之抽取，操作流程依照廠商提供之方法加以修飾，流程中提及之溶液II(solution II)、溶液III(solution III)、清洗溶液B(washing solution A)、清洗溶液B(washing solution B)及溶離溶液(elution solution)均為套組中所附之試劑。簡言之，取2mL隔夜培養之菌液至微量離心管中，離心(21,910 ×g，5分鐘，4℃)收集菌體，並倒除上清液，重複此步驟一次。所得之菌體以1.0mL TSE緩衝液(10mM Tris-HCl、10mM EDTA、300mM NaCl，pH 8.0)懸浮後，離心(21,910 ×g，5分鐘，4℃)收集菌體，並倒除上清液。將菌體重新懸浮於200μL LAB質體溶液I(50mM Tris-HCl、10mM EDTA、25% sucrose，pH 8.0，另額外添加30mg/mL lysozyme與100μg/mL RNase A)中，於 37℃下作用30分鐘。之後加入200μL溶液II，緩和混合數次。接著加入200μL溶液III，緩和混合數次。離心(21,910 ×g，10分鐘，室溫)收集上清液。

將離心分離小管(spin column)放置於收集小管(collection tube)上，並將上清液置入離心分離小管中，經離心(21,910 ×g，2分鐘，室溫)後，倒除濾液。接著加入500μL清洗溶液A至離心分離小管中，離心(21,910 ×g，2分鐘，室溫)後，倒除濾液，此步驟可有效降低核酸內切酶(endonuclease)的污染。緊接著加入600μL清洗溶液B，經離心(21,910 ×g，2分鐘，室溫)後，倒除濾液(重覆此步驟兩次)。之後，繼續離心(21,910 ×g，5分鐘，室溫)以去除殘留之酒精。最後將離心分離小管放入一滅菌微量離心管中，加入適量之40μL溶離溶液至離心分離小管中並離心(21,910 ×g，2分鐘，室溫)以引流質體DNA。將質體貯存於-20℃中備用。

實施例二：利用瓊脂醣膠體電泳分離胚芽乳酸桿菌ATIT-031質體與標的質體pLP31-8之回收

以0.7%瓊脂醣(Affymetrix,USA)膠體作為電泳介質；以0.5倍TAE緩衝液作為電泳緩衝液。首先將DNA樣品與6倍EZ-Vision^TM乘載緩衝液以5：1比例混合均勻後，將此混合物注入瓊脂醣膠體之樣品凹槽中。於110V下進行電泳。電泳完畢後，於紫外光觀察箱下觀察結果，並將欲分析之條帶切下。欲分析之條帶為分子量最小的質體，因此切下移動距離最長的條帶，即為胚芽乳酸桿菌 ATIT-031中最小的質體pLP31-8，如第1圖所示。

利用Gel Elution Kit進行膠體中標的質體pLP31-8之回收，操作流程依照廠商提供之方法進行。操作方式如下所述，將含有欲回收DNA片段之瓊脂醣膠體裝入微量離心管中。在此離心管中加入0.5mL GEX buffer，於60℃下反應10分鐘，直至膠體完全溶解。待溶液冷卻後，將溶液裝填於離心分離小管中，進行離心(21,910 ×g，1分鐘)，此時溶液中之DNA會被吸附於離心分離小管之樹脂上。取0.5mL WF緩衝液加入離心分離小管中，經離心(21,910 ×g，1分鐘，室溫)後，倒除流出液。再加入0.7mL WS緩衝液，離心(21,910 ×g，1分鐘，室溫)後，倒除流出液，重覆此步驟一次。此步驟之目的在於去除樹脂上之鹽類雜質。為避免殘留之酒精影響後續之實驗，再以21,910 ×g之條件離心5分鐘。最後將離心分離小管放入一滅菌微量離心管中，加入適量之溶離溶液至離心分離小管中並離心(21,910 ×g，2分鐘，室溫)以引流質體DNA。

實施例三：pLP31-8質體DNA之選殖與定序

將質體pLP31-8以EcoRI限制酶剪切後，進行瓊脂醣膠體電泳，並利用Gel Elution Kit進行膠體中質體DNA之回收。將回收的質體DNA利用CloneJET^TM PCR cloning kit進行DNA之補齊反應(fill-in reaction)與平端選殖(blunt-end cloning)，操作流程依照廠商提供之方法進行。將pLP31-8 DNA片段與選殖載體pJET1.2之黏合產物轉形至E.coli ECOS 9-5中。利用引子pJET1.2NEWF(如SEQ ID NO：8所示)/pJET1.2NEWR(如SEQ ID NO：9所示)搭配 Dream taq DNA polymerase試劑進行菌落聚合酶連鎖反應(colony polymerase chain reaction)，以挑選可能帶有pLP31-8 DNA片段之轉形株。隨機挑選2株轉形株進行培養，並利用Plasmid Miniprep Purification Kit II進行質體之抽取。將抽取之DNA委由源資國際生物(Tri-I Biotech)科技股份有限公司進行DNA定序。為確認已獲得全長序列，根據pLP31-8 DNA定序結果設計引子pLP31-8 check F(如SEQ ID NO：10所示)與pLP31-8 check R(如SEQ ID NO：11所示)。利用pLP31-8 check F/pLP31-8 check R引子組合、GDP-HiFi DNA Polymerase及pLP31質體進行PCR。利用PCR Clean-Up kit回收PCR產物後，以CloneJET^TM PCR cloning kit進行PCR產物之選殖。經菌落聚合酶連鎖反應、轉形株質體DNA抽取及DNA定序後，可獲得pLP31-8之部分序列。將此序列與前述之pLP31-8 DNA定序結果比對後，即可獲得全長序列。

胚芽乳酸桿菌ATIT-031係自味噌所分離之乳酸菌，本文中針對此菌之質體進行抽取與DNA電泳分析。如第1圖所示，DNA電泳結果呈現胚芽乳酸桿菌ATIT-031中帶有多個質體。將分離自胚芽乳酸桿菌ATIT-031之不同分子量DNA條帶分別命名為pLP31- 1~pLP31-8，並針對分子量最小之pLP31-8進行分離、選殖、定序及分析。

pLP31-8之定序結果顯示，此質體之序列全長為1,753bp，GC含量為45%。利用NCBI之ORF finder可預測此質體帶有1個660bp之開放讀碼區(open reading frame)。根據ORF胺基酸同源性比對分析結果顯示，ORF被預測為與質體複製有關之質體複製子(Rep)，其與Lactobacillus helveticus質體pLH2之rep序列具有88%相似度。在rep上游發現帶有單股複製起始點(sso)與雙股複製起始點(dso)。有關pLP31-8質體之物理圖譜請見第2圖，序列見SEQ ID NO：1。

實施例四：大腸桿菌/乳酸菌穿梭載體pBRLP31-8之建構

在本實施例中所製備的穿梭載體係以實施例一所獲得之乳酸菌質體pLP31-8及大腸桿菌質體pBR322複製區域所建構，是一種可以應用於乳酸菌及非乳酸菌原核細胞的穿梭載體。

根據本實施例所述之載體的建構過程如下：

1.乳酸菌區域之改造

胚芽乳酸桿菌ATIT-031之最小無性狀質體pLP-8之全長為1,753bp，如第2圖所示。根據序列分析結果，此質體帶有一個orf1開放讀碼區，可編碼出ORF1蛋白質。此ORF1被預測為複製蛋白質。在orf1(rep)上游帶有單股複製起始點(sso)與雙股複製起始點(dso)。此外，在pLP31-8中帶有基因操作常用之限制酶切位EcoRI。

為增進未來基因操作之便利性，針對EcoRI設計突變引子並利用重疊延展聚合酶連鎖反應進行定點突變。突變引子之設計原則包括：突變點位於引子中央及引子之Tm值溫度需高於78℃。突變引子之Tm值以Invitrogene公司提供之公式計算：Tm=81.5+0.41(%GC)-675/N-%mismatch計算，公式中之「%GC」為GC在引子核苷酸中所佔的百分比；「N」為引子長度；「%mismatch」為突變base在引子核苷酸中所佔的百分比。

首先設計2對突變引子pLP31-8F(如SEQ ID NO：12所示)/pLP31-8M2(如SEQ ID NO：13所示)與pLP31-8M1(如SEQ ID NO：14所示)/pLP31-8R(如SEQ ID NO：15所示)。以pLP31-8作為模版，利用pLP31-8F(如SEQ ID NO：12所示)/pLP31-8M2(如SEQ ID NO：13所示)與pLP31-8M1(如SEQ ID NO：14所示)/pLP31-8R(如SEQ ID NO：15所示)等引子組分別進行DNA片段增幅。

在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng pLP31-8及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應之條件為98℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。PCR產物以Gel-M^TM gel extraction system kit回收。

接著，以回收之兩個PCR產物作為模版，利用pLP31-8F(如SEQ ID NO：12所示)/pLP31-8R(如SEQ ID NO：15所示)引子組合進行基因增幅。PCR反應之條件為98℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應1分鐘(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。經此步驟後，即可獲得定點突變之pLP31-8 DNA片段。利用PCR-M^TM Clean Up system kit進行PCR產物之回收。

2.大腸桿菌載體pBRCMMCS之建構

大腸桿菌載體pBRCMMCS之建構方法已描述於中華民國專利I565799，本發明所屬技術領域中具有通常知識者參照該專利所述之方法，可了解並完成大腸桿菌載體pBRCMMCS之建構。簡單來說，所述載體係包括大腸桿菌載體pBR322之複製區域、氯黴素抗性基因及多重選殖區。

舉例而言，以pET29a(Merck KGaA/Novagen,Germany)質體作為模板，利用所設計之引子對pBRF/pBRR進行大腸桿菌質體複製區域(replicon-pBR322)之擴增。此DNA片段中含大腸桿菌質體複製子基因(rep-pBR322)及大腸桿菌引子抑制子基因(rop-pBR322)。

在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng pET29a及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。以pNW33N(購自食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心；菌種編號為BCRC 41794)質體作為模板，利用CMF/CMR進行抗氯黴素基因(chloramphenicol resistance gene，CM^r-pC194)之擴增。

在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng pNW33N及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認PCR產物中是否含有預估大小的DNA片段。

接著，利用PCR-M^TM Clean Up kit進行PCR產物之回收。replicon-pBR322與氯黴素抗性基因之PCR產物以SacI及XhoI剪切後，以T4 DNA接合酶進行黏合。將黏合產物轉形(transform)入大腸桿菌ECOS 9-5中。以CMF/CMR引子搭配PCR Master Mix II試劑進行菌落聚合酶連鎖反應(colony PCR)篩選轉形株。PCR反應條件為95℃反應5分鐘(1個步驟)；95℃反應30秒、55℃反應30秒、72℃反應1分鐘(25個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。經菌落聚合酶連鎖反應確認轉形株中之重組質體帶有插入的DNA後，再抽取轉形株中之質體進行DNA定序。將序列正確無誤的質體命名為pBRCM。

利用重疊延伸聚合酶連鎖反應(overlapping-extension polymerase chain reaction,OEPCR)進行多重選殖部位的合成；其中所設計的限制酶切位包括BglII、EcoRI、SpeI、NdeI、BamHI、XmaI、PstI、SalI、HindIII、XhoI及XbaI。於PCR反應時，模板引子間會黏合，以使聚合酶以3’至5’的引子為模板，由5’至3’的引子進行延伸，而產生全長DNA。

接著，增幅引子以全長DNA作為模板，大量增幅DNA片段。在50μL的PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM引子及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認PCR產物中是否含有預估大小的DNA片段。

接著，利用PCR-M^TM Clean Up kit進行PCR產物之回收。合成之多重選殖部位以BglII及XhoI剪切後，以T4 DNA接合酶黏合至以相同限制酶剪切之pBRCM中。將黏合產物轉形入大腸桿菌ECOS 9-5中。以MCSF/MCSR引子搭配PCR Master Mix II試劑進行菌落聚合酶連鎖反應篩選轉形株。PCR反應條件為95℃反應5分鐘(1個步驟)；95℃反應30秒、55℃反應30秒、72℃反應30秒(25個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。經菌落PCR確認轉形株中之重組質體帶有插入的DNA後，再抽取轉形株中之質體進行DNA定序。將序列正確無誤的質體命名為pBRCMMCS。

3.穿梭載體pBRLP31-8之建構

簡言之，將第1步中製得的乳酸菌區域PCR產物以BglII及EcoRI剪切後，以T4 DNA ligase黏合至以相同限制酶剪切之pBRCMMCS(即大腸桿菌區域)中。將黏合產物轉形入大腸桿菌ECOS 9-5中。以pLP31-8F(如SEQ ID NO：12所示)/pLP31-8R(如SEQ ID NO：15所示)引子搭配Dream taq DNA polymerase試劑進行菌落聚合酶連鎖反應篩選轉形株。PCR反應條件為95℃反應5分鐘(1個步驟)；95℃反應30秒、55℃反應30秒、72℃反應2分鐘(25個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。經菌落聚合酶連鎖反應確認轉形株中之重組質體帶有外插DNA後，再抽取轉形株中之質體進行DNA定序。將序列正確無誤的質體命名為pBRLP31-8。

pBRLP31-8係包括大腸桿菌載體pBR322之複製區域、氯黴素抗性基因、多重選殖區及經定點突變後之pLP31-8。pBRLP31-8質體物理圖譜請見第3圖所示，序列請見SEQ ID NO：2。

實施例五：穿梭載體pBRLP31-8的分析

本實施例將實施例四所得之穿梭載體pBRLP31-8轉形進入胚芽乳酸桿菌、鼠李糖乳酸桿菌、食竇魏斯氏菌或枯草桿菌中觀察其特性，並檢測pBRLP31-8在前述不同菌株中的相對複製數(copy number)。

1.胚芽乳酸桿菌與鼠李糖乳酸桿菌之轉形與轉形株之分析

挑取單一菌落接種至30mL MRS培養基中，於30℃下進行靜置培養。經隔夜培養後，轉移適量菌液至含3%甘胺酸(glycine)之200mL MRS培養基中，將起始OD₆₀₀調整為0.1，繼續於30℃下進行靜置培養。培養5小時後，離心(12,000 ×g，10分鐘， 4℃)收集菌體部分，並加入200mL之滅菌清洗溶液(wash buffer；5mM sodium phosphate、1mM MgCl₂，pH 7.4)使菌體充分懸浮。經離心(12,000 ×g，10分鐘，4℃)後，小心倒除上清液，加入1mL電穿孔緩衝液(electroporation buffer；0.9M sucrose，3mM MgCl₂)使菌體充分懸浮。經離心(12,000 ×g，10分鐘，4℃)後，小心倒除上清液，加入適量電穿孔緩衝液使菌體充分懸浮，並分裝至微量離心管中(100μL/管)。以液態氮進行急速冷凍，並貯存於-70℃下備用。進行DNA之轉形時，取電勝任細胞100μL加入1μg質體並置入預先冰冷之電極管中。冰浴5分鐘後，取出電極管於電場強度8.75kV/cm與電容25μF之條件下進行電轉形。將電轉形後之細胞加入1mL MRS培養基中，於30℃下靜置培養2小時。取適量菌液塗佈於含氯黴素(5μg/mL)之MRS固態培養基上，於30℃下厭氧培養48小時並觀察結果。利用Plasmid Miniprep Purification Kit II進行乳酸桿菌轉形株質體之抽取。由轉形株中所抽取之質體，進一步利用BglII與BglII/EcoRI進行剪切，並利用瓊脂醣膠體電泳確認質體DNA之剪切情形。結果如第4圖(A)與(B)部分所示，箭頭所指處即為轉形入胚芽乳酸桿菌與鼠李糖乳酸桿菌之穿梭載體pBRLP31-8經過或未經過限制酶剪切的條帶，質體大小與預測值符合。

2.食竇魏斯氏菌之轉形與轉形株之分析

挑取單一菌落接種至30mL MRS培養基中，於30℃下進行靜置培養。經隔夜培養後，取16mL菌液接種至含1%甘胺酸(glycine)之200mL MRS培養基中，繼續於30℃下進行靜置培養。培養3.5小時後，離心(12,000 ×g，10分鐘，4℃)收集菌體部分，並加入64mL之滅菌TSLD緩衝液(10mM Tris，0.6M sucrose，0.1M Li-Ac，0.01M DTT，pH 7.5)懸浮菌體，於37℃下放置20分鐘。經離心(12,000 ×g，10分鐘，4℃)後，小心倒除上清液，加入200mL預冷之滅菌電穿孔緩衝液使菌體充分懸浮，經離心(12,000 ×g，4℃，10分鐘)後，小心棄除上清液，重覆此步驟三次。加入適量電穿孔緩衝液使菌體充分懸浮，並分裝至微量離心管中(100μL/管)。以液態氮進行急速冷凍，並貯存於-70℃下備用。進行DNA之轉形時，取電勝任細胞100μL加入1μg質體並置入預先冰冷之電極管中。冰浴5分鐘後，取出電極管於電場強度8.75kV/cm與電容25μF之條件下進行電轉形。將電轉形後之細胞加入1mL MRS培養基中，於30℃下靜置培養2小時。取適量菌液塗佈於含氯黴素(5μg/mL)之MRS固態培養基上，於30℃下厭氧培養48小時並觀察結果。由轉形株中所抽取之質體，進一步利用BglII與BglII/EcoRI進行剪切，並利用瓊脂醣膠體電泳確認質體DNA之剪切情形。結果如第4圖(C)部分所示，箭頭所指處即為轉形入食竇魏斯氏菌之穿梭載體pBRLP31-8經過或未經過限制酶剪切的條帶，質體大小與預測值符合。

3.枯草桿菌之轉形與轉形株之分析

挑取單一菌落接種至50mL LB培養基中，於37℃下，以180rpm進行振盪培養。經隔夜培養後，取40mL菌液接種至含0.5%甘胺酸(glycine)之400mL LB培養基中，將起始OD₆₀₀調整為 0.1，繼續於37℃下進行靜置培養。培養5小時後，離心(12,000 ×g，10分鐘，4℃)收集菌體部分，並加入200mL之滅菌水使菌體充分懸浮。經離心(12,000 ×g，10分鐘，4℃)後，小心倒除上清液，加入2mL預冷之滅菌SHMPYT緩衝液(0.25M sucrose，1mM HEPES，1mM MgCl₂，20%(v/v)polyethylene glycol 6000(PEG6000)，0.125% yeast extract，0.25% tryptone)使菌體充分懸浮。經離心(12,000 ×g，10分鐘，4℃)後，小心倒除上清液，加入適量SHMPYT緩衝液使菌體充分懸浮，並分裝至微量離心管中(100μL/管)。以液態氮進行急速冷凍，並貯存於-70℃下備用。進行DNA之轉形時，取電勝任細胞100μL加入1μg質體並置入預先冰冷之電極管中。冰浴5分鐘後，取出電極管於電場強度10kV/cm與電容25μF之條件下進行電轉形。將電轉形後之細胞加入1mL Select APS^TM Super Broth培養基中，以37℃與80rpm之條件下進行振盪培養2小時。取適量菌液塗佈於含氯黴素(5μg/mL)之LB固態培養基上，於37℃下培養24~48小時並觀察結果。由轉形株中所抽取之質體，進一步利用BglII與BglII/EcoRI進行剪切，並利用瓊脂醣膠體電泳確認質體DNA之剪切情形。結果如第4圖(D)部分所示，箭頭所指處即為轉形入枯草桿菌之穿梭載體pBRLP31-8經過或未經過限制酶剪切的條帶，質體大小與預測值符合。

4.利用即時聚合酶連鎖反應檢測pBRLP31-8於胚芽乳酸桿菌、食竇魏斯氏菌及枯草桿菌中之相對複製數(copy number)

針對胚芽乳酸桿菌與鼠李糖乳酸桿菌基因體中之單一基因tuf、食竇魏斯氏菌基因體中之單一基因pepX、枯草桿菌基因體中之單一基因amyE及pLP31-8中之DNA片段設計real-time PCR專用之引子組合。針對胚芽乳酸菌tuf基因之引子為LPTufF(SEQ ID NO：16)/LPTufR(SEQ ID NO：17)；針對鼠李糖乳酸桿菌tuf基因之引子為LGGTufF(SEQ ID NO：18)/LGGTufR(SEQ ID NO：19)；針對食竇魏斯氏之基因之引子為PepXF(SEQ ID NO：20)/PepXR(SEQ ID NO：21)；針對枯草桿菌之基因之引子為AmyF(SEQ ID NO：22)/AmyR(SEQ ID NO：23)；針對pLP31-8之基因之引子為pLp31-8RTF(SEQ ID NO：24)/pLp31-8RTR(SEQ ID NO：25)。

利用DNeasy Blood & Tissue Kit進行不同菌株總DNA之抽取。利用Faststart Universal SYBR Green Master(ROX)進行反應試劑之配置。在25μL反應體積中之總DNA量分別使用10ng、 1ng、0.1ng及0.01ng。利用ViiA^TM 7 Real Time PCR System(Life technologies,USA)進行real-time PCR。由反應所得之臨界循環數值(threshold cycle,Ct)對應總DNA量之常用對數(log₁₀)值繪製標準曲線圖。

由各標準曲線計算斜率(slope)，並推導增幅效率(E)，公式為E=10^-1/slope；其中針對基因體基因所求得之E值定義為Ec，針對pLP31-8之DNA片段所求得之E值定義為Ep。另分別計算基因體基因與pLP31-8 DNA片段反應之平均Ct值；將基因體基因反應之平均Ct值定義為Ctc，pLP31-8 DNA片段反應之平均Ct值定義為Ctp。質體相對複製數之計算公式為(Ec)^Ctc/(Ep)^Ctp。

5.大腸桿菌/乳酸菌穿梭載體pBRLP31-8轉形結果

如前實施例所述，利用電轉形法將pBRLP31-8轉形至胚芽乳酸桿菌ATIT-018、鼠李糖乳酸桿菌BCRC 16000、食竇魏斯氏菌ATIT-044及枯草桿菌DB430中。結果顯示，轉形後之菌株均可於含有抗生素之固體篩選培養基上形成菌落，即對該抗生素具有抗性(圖未示)。如第4圖所示，轉形株中之質體經抽取與限制酶剪切確認後，證實轉形株中皆帶有pBRLP31-8。上述之結果說明，pBRLP31-8可作為新型穿梭載體，應用於多種宿主細胞之基因工程研究，例如大腸桿菌、胚芽乳酸桿菌、鼠李糖乳酸桿菌、食竇魏斯氏菌及枯草桿菌等。

6.pBRLP31-8於不同宿主中之相對複製數

利用即時定量聚合酶連鎖反應測定pBRLP31-8於不同宿主中之複製數。測試結果顯示，pBRLP31-8於胚芽乳酸桿菌ATIT-018、鼠李糖乳酸桿菌BCRC 16000、食竇魏斯氏菌ATIT-044及枯草桿菌DB430中之複製數分別為1、5、18及34(如下表一所示)，顯示pBRLP31-8至少在胚芽乳酸桿菌、鼠李糖乳酸桿菌、食竇魏斯氏菌或枯草桿菌中皆能夠有效複製。

實施例六：生產蛋白質之方法及試劑組

在一實施例中，可利用編碼欲表達的基因之核酸序列在適合的宿主細胞中表達生成相應蛋白質。簡單來說，將原核宿主細胞置入培養基中，並於適當培養條件下使原核宿主細胞表現所述蛋白質；以及由該宿主細胞或宿主細胞之培養液中回收該蛋白質。所述方法的詳細步驟及反應條件為本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟悉，有關該方法的詳細描述可參考Sambrook等人編著的「分子選殖」(實驗手冊，冷泉港，1989)。在某些實施例中，本文中所述生產蛋白質之方法更包括利用前述穿梭載體建構含有標的基因之表現載體，並將所述建構完成之表現載體轉形到宿主細胞中，使所述宿主細胞能夠表現標的基因。

在某些實施例中，可利用表現外源性基因之試劑組轉形宿主細胞，並在宿主細胞中生產相應蛋白質。其中，所述試劑組包括上述穿梭載體。

按照本揭露內容無需過度實驗即能作出並執行此所揭露及請求保護之所有的穿梭載體、包含其之原核宿主細胞與試劑組以及利用該宿主細胞製造蛋白質之方法。雖然本申請案的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定所請發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內。

<110> 財團法人農業科技研究院

<120> 穿梭載體、包含其之原核宿主細胞與試劑組以及利用該宿主細胞生產蛋白質之方法

<130> 17P1158

<140> TW106133120

<141> 2017-09-27

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1753

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pLP31-8完整序列

<400> 1

<210> 2

<211> 4099

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pBRLP31-8完整序列

<400> 2

<210> 3

<211> 617

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 大腸桿菌質體複製子

<400> 3

<210> 4

<211> 660

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 乳酸菌質體複製子

<400> 4

<210> 5

<211> 248

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 大腸桿菌引子抑制子

<400> 5

<210> 6

<211> 1764

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 乳酸菌區域

<400> 6

<210> 7

<211> 1466

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 大腸桿菌區域

<400> 7

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引子pJET1.2NEWF

<400> 8

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引子pJET1.2NEWR

<400> 9

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引子pLP31-8 check F

<400> 10

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引子pLP31-8 check R

<400> 11

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引子pLP31-8F

<400> 12

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引子pLP31-8M2

<400> 13

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引子pLP31-8M1

<400> 14

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引子pLP31-8R

<400> 15

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引子LPTufF

<400> 16

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引子LPTufR

<400> 17

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引子LGGTufF

<400> 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引子LGGTufR

<400> 19

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引子PepXF

<400> 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引子PepXR

<400> 21

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引子AmyF

<400> 22

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引子AmyR

<400> 23

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引子pLP31-8RTF

<400> 24

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引子pLP31-8RTR

<400> 25

Claims

一種穿梭載體，包括：(a)一大腸桿菌質體複製子基因，其具有如SEQ ID NO：3所示之序列；以及(b)一乳酸菌質體複製子基因，其具有如SEQ ID NO：4所示之序列。
如請求項1所述之穿梭載體，其中該穿梭載體具有如SEQ ID NO：2所示之序列。
如請求項1所述之穿梭載體，更包括一單股複製起始點及一雙股複製起始點。
如請求項1所述之穿梭載體，更包括一多重選殖區。
如請求項4所述之穿梭載體，其中該多重選殖區上游更包括一表現元件。
如請求項1所述之穿梭載體，更包括一篩選基因。
如請求項6所述之穿梭載體，其中該篩選基因為抗藥性篩選基因、非抗藥性篩選基因、或其組合。
如請求項7所述之穿梭載體，其中該篩選基因為一氯黴素抗性基因。
如請求項1所述之穿梭載體，其中該穿梭載體係能夠於大腸桿菌(Escherichia coli)、胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、食竇魏斯氏菌(Weissella cibaria)及枯草桿菌(Bacillus subtilis)中複製。
如請求項1所述之穿梭載體，更包括一大腸桿菌引子抑制子基因，其具有如SEQ ID NO：5所示之序列。
一種穿梭載體，其包含：一乳酸菌區域，該乳酸菌區域序列係如SEQ ID NO：6所示之序列，其包含：一單股複製起始點；一雙股複製起始點；以及一乳酸菌質體複製子基因；以及一大腸桿菌區域，該大腸桿菌區域序列係如SEQ ID NO：7所示之序列，其包含：一大腸桿菌質體複製子基因；以及一大腸桿菌引子抑制子基因。
如請求項11所述之穿梭載體，其中該大腸桿菌質體複製子基因為大腸桿菌質體pBR322的rep，該大腸桿菌引子抑制子基因為大腸桿菌質體pBR322的rop。
如請求項11所述之穿梭載體，其更包含一篩選基因，該篩選基因為抗藥性篩選基因、非抗藥性篩選基因、或其組合。
如請求項13所述之穿梭載體，其中該篩選基因為一氯黴素抗性基因。
如請求項11所述之穿梭載體，其更包含一多重選殖區。
如請求項15所述之穿梭載體，其中該多重選殖區上游更包括一表現元件。
一種原核宿主細胞，其包含請求項1~16中任一項所述之穿梭載體。
如請求項17所述之原核宿主細胞，其中該原核宿主細胞包括大腸桿菌(Escherichia coli)、胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、食竇魏斯氏菌(Weissella cibaria)或枯草桿菌(Bacillus subtilis)。
一種利用如請求項17或18所述之原核宿主細胞生產蛋白質之方法，該方法包含下列之步驟：將如請求項17或18所述之原核宿主細胞置入一培養基中，並於一適當培養條件下使該原核宿主細胞表現所述蛋白質；以及由該細胞或細胞之培養液中回收該蛋白質。
如請求項19所述之方法，更包括利用如請求項1~16中任一項所述之穿梭載體建構一表現載體。
如請求項20所述之方法，更包括利用該表現載體轉形該原核宿主細胞。
一種表現外源性基因之試劑組，包括：如請求項1~16中任一項所述之穿梭載體。