TWI565799B

TWI565799B - 乳酸菌菌株、其質體、及其衍生之載體

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Publication number: TWI565799B
Application number: TW103142753A
Authority: TW
Inventors: 林俊宏; 王志鵬; 陳正文; 方健宇; 黃文正; 賴建逢; 宣詩玲
Original assignee: 財團法人農業科技研究院
Priority date: 2014-12-09
Filing date: 2014-12-09
Publication date: 2017-01-11
Also published as: TW201621044A

Description

乳酸菌菌株、其質體、及其衍生之載體

本發明關於一種用於基因工程之載體，尤指一種衍生自乳酸菌的乳酸菌載體。

乳酸菌為革蘭氏陽性、不產生孢子及非好氣性之桿菌或球菌，能利用碳水化合物進行發酵，產生多量乳酸。乳酸菌的應用十分多元化，例如作為發酵乳製品及蔬菜製品之菌酛(starter)、作為益生菌(probiotic)、生產工業用乳酸及抑菌素(bacteriocin)等。在生物技術領域中，某些GRAS(generally recognized as safe)級之乳酸菌如胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)與乳酸鏈球菌(Lactococcus lactis)亦被開發成為基因表現宿主。

近年來有關乳酸菌表現系統之研究逐漸受到重視，學者們開發不同表現載體及宿主，建構不同乳酸菌表現系統，並應用於酵素、細菌素、機能性蛋白質、機能性胜肽及重組抗原之表現。以乳酸菌作為表現宿主具有多項優勢包括(一)乳酸菌生長快速且無需好氧培養。(二)與大腸桿菌表現系統相較之下，GRAS級乳酸菌應用於重組蛋白質之表現，無內毒素殘留之顧慮。(三)GRAS級乳酸菌可開發成為疫苗攜帶者(vaccine carrier)或重組細胞激素(cytokine)及機能性胜肽或蛋白質之傳遞者。

有鑑於乳酸菌表現系統有諸多優勢，領域中持續需要多種新穎的乳酸菌載體以滿足研究及商業上的需求。

爰是，本發明的一個目的在於提供一種新穎的乳酸菌株，並從中分離質體以建構領域中所需的乳酸菌載體。

本發明的另一個目的在於提供一種乳酸菌質體，其可用於建構乳酸菌載體，以滿足領域中的需求。

本發明的又一個目的在於提供一種乳酸菌穿梭載體，其至少可於乳酸菌表現系統及另一非乳酸菌之原核細胞表現系統中表現而滿足領域中的需求。

為了達到前述目的，本發明提供一種乳酸菌菌株，前述乳酸菌菌株在中華民國食品工業發展研究所菌種中心的寄存編號為BCRC 910654。

本發明又提供一種乳酸菌質體(plasmid)，其包含：一單股複製起始點，其包含SEQ ID NO 01所示序列；一雙股複製起始點，其包含SEQ ID NO 02所示序列；及一轉譯為複製蛋白質的基因，其包含SEQ ID NO 03所示序列。

較佳地，前述乳酸菌質體進一步包含一移轉起始點(origin of transfer)，其包含SEQ ID NO 04所示序列。

較佳地，前述乳酸菌質體，其進一步包含一移轉酶的核酸序列，其包含SEQ ID NO 05所示序列。

較佳地，前述乳酸菌質體係分離自前述乳酸菌菌株。

本發明另提供一種乳酸菌載體(vector)，其包含：一乳酸菌區域，其包含：一單股複製起始點，其包含SEQ ID NO 01所示序列；一雙股複製起始點，其包含SEQ ID NO 02所示序列；及一轉譯為第一複製蛋白質的基因，其包含SEQ ID NO 03所示序列；一非乳酸菌之原核細胞區域，其包含：一轉譯為第二複製蛋白質的基因。

較佳地，前述非乳酸菌之原核細胞是一革蘭氏陰性菌。

較佳地，前述革蘭氏陰性菌是大腸桿菌、新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)、貪銅菌(Cupriviadus necator)、假單胞菌(Pseudomonas spp.)、或沙門氏桿菌(Salmonella spp.)。

較佳地，前述非乳酸菌之原核細胞區域進一步包含一複製調控元件。

較佳地，前述轉譯為第二複製蛋白質的基因是大腸桿菌質體pBR322的rep。

較佳地，前述複製調控元件是大腸桿菌質體pBR322的rop。

較佳地，前述乳酸菌載體進一步包含一表現卡匣，其包含：一表現元件及一轉錄終止區。

較佳地，前述表現元件為原核細胞表現元件、真核細胞表現元件、或其組合。較佳地，前述原核細胞表現元件為乳酸菌表現元件。較佳地，前述乳酸菌表現元件是P23表現元件。

較佳地，前述表現卡匣進一步包含一欲表現之基因。較佳地，前述欲表現之基因的產物為免疫誘發物質。

較佳地，前述乳酸菌載體進一步包含一篩選基因。較佳地，前述篩選基因是抗藥性篩選基因、非抗藥性篩選基因、或其組合。

較佳地，前述乳酸菌載體進一步包含一多重選殖部位。

綜上所述，本發明提供一新穎的乳酸菌菌株並從中分離一無性狀質體。本發明並以前述質體建構一乳酸菌穿梭載體，其可提供領域中基因工程之需求中的另一個新穎的選擇。

第一圖顯示本發明之質體pLP-8的圖譜。

第二圖顯示實施例二之乳酸菌穿梭載體pBRLP-8的圖譜。

第三圖顯示實施例二之乳酸菌穿梭載體pBRLP-8-P23-GFPT的圖譜。

第四圖顯示實施例三中使用本發明之乳酸菌穿梭載體pBRLP-8-P23-GFPT之綠螢光蛋白質的表達情況。

本發明的目的在於提供一種用應用於乳酸菌表現系統的乳酸菌載體。更明確地說，前述乳酸菌載體為一穿梭載體。本發明所稱「穿梭載體」係指可至少於乳酸菌表現系統及另一非乳酸菌之原核細胞表現系統中表現的載體。在一可行實施態樣中，前述乳酸菌為胚芽乳酸桿菌或鼠李糖乳酸桿菌。前述穿梭載體憑藉其可於兩種以上的表現系統中表現的特性，在基因工程的應用上更具優勢。

本發明的一個面向係提供一種乳酸菌菌株，前述乳酸菌菌株在中華民國食品工業發展研究所菌種中心的寄存編號為BCRC910654。更明確地說，前述乳酸菌菌株係為一胚芽乳酸桿菌(Lactobaillus plantarum)。

本發明的又一個面向係提供一種乳酸菌質體(pLP-8，3414bp)。具體來說，前述乳酸菌質體係自前述乳酸菌菌株中分離而得。在一個較佳實施態樣中，前述乳酸菌質體包含：一單股複製起始點，其包含SEQ ID NO 01所示序列；一雙股複製起始點，其包含SEQ ID NO 02所示序列；及一轉譯為複製蛋白質的基因，其包含SEQ ID NO 03所示序列。在一個較佳實施態樣中，前述轉譯為複製蛋白質的基因的上游具有一乳酸菌可辨識的啟動子。

在一較佳實施態樣中，前述乳酸菌質體為一種可移動質體(mobilizable plasmid)，其進一步包含一移轉起始點，且前述移轉起始點包含SEQ ID NO 04所示序列。在一較佳實施態樣中，前述乳酸菌質體進一步包含一移轉酶的核酸序列，且前述移轉酶包含SEQ ID NO 05所示序列。

本發明的另一個面向係提供一種乳酸菌載體，其包含：一乳酸菌區域，其包含：一單股複製起始點，其包含SEQ ID NO 01所示序列；一雙股複製起始點，其包含SEQ ID NO 02所示序列；及一轉譯為第一複製蛋白質的基因，其包含SEQ ID NO 03所示序列；一非乳酸菌之原核細胞區域，其包含：一轉譯為第二複製蛋白質的基因。

本發明所稱「乳酸菌區域」係指可為前述乳酸菌辨識及表達的區域；所稱「非乳酸菌之原核細胞區域」係指可為前述非乳酸菌之原核細胞辨識及表達的區域。

於一較佳實施態樣中，前述「非乳酸菌之原核細胞」的選擇為複製時間(doubling time)較乳酸菌短的原核細胞(如，革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌)。由於通常而言，革蘭氏陽性菌在基因工程的操作上較革蘭氏陰性菌複雜，因此，於一較佳實施態樣中，前述非乳酸菌之原核細胞為一革蘭氏陰性菌。於一可行實施態樣中，前述革蘭氏陰性菌為：大腸桿菌、新月柄桿菌、貪銅菌、假單胞菌、或沙門氏桿菌。惟若此僅是本發明之可行實施態樣之一，所屬領域具有通常知識者當可理解，本發明所述非乳酸菌之原核細胞也可以是一種革蘭氏陽性菌。

本發明所稱「複製蛋白質」係指在宿主的表現系統中得以複製本發明之穿梭載體的蛋白質。本發明所稱「轉譯為複製蛋白質的基因」係指一基因序列，其經生物體內的轉錄/轉譯作用後，所得蛋白質產物為前述複製蛋白質。

在一可行實施態樣中，屬於前述乳酸菌區域的前述「轉譯為第一複製蛋白質的基因」係指可經前述乳酸菌辨識並進行轉錄/轉譯的基因，且經轉錄/轉譯所得之複製蛋白質可於前述乳酸菌體內進行前述載體的複製。

在一可行實施態樣中，屬於前述非乳酸菌之原核細胞區域的前述「轉譯為第二複製蛋白質的基因」係指可經前述非乳酸菌之原核細胞辨識並進行轉錄/轉譯的基因，且經轉錄/轉譯所得之複製蛋白質可於前述非乳酸菌之原核細胞體內進行前述載體的複製。前述轉譯為第二複製蛋白質的基因可為但不限於：來自大腸桿菌質體pBR322、ColE1、p15A、pBBR1、pSC101、R6K、RK2、或RSF1010的rep。

本發明所稱「複製調控元件」係指在宿主的表現系統中得以調控前述載體的複製數(copy number)的分子。若一載體於一宿主中的複製數過高，在無篩選壓力之情況下，會使得宿主傾向於將前述載體丟至體外。此外，表現過量之重組蛋白質也會有影響菌體生理的風險，而造成基因工程操作上的困難。於一較佳實施態樣中，本發明之乳酸菌載體於前述乳酸菌中的複製數為30至50；在前述非乳酸菌之原核細胞中的複製數為15至20。

在一可行實施例中，前述複製調控元件為一核酸片段，其直接執行前述複製調控的功能、經轉錄為反意RNA(antisense RNA)後才執行前述複製調控的功能、或經轉譯為一複製調控蛋白質後才執行前述複製調控的功能。在前述「直接執行前述複製調控的功能」的情況中，前述核酸片段係為一重覆核酸序列(例如但不限於：iterons)。在前述「經轉錄為反意RNA後才執行前述複製調控的功能」的情況中，前述核酸片段係為一轉錄為RNA的片段(例如但不限於：ColE1所轉錄之RNAI)。在前述「經轉譯為一複製調控蛋白質後才執行前述複製調控的功能」的情況中，前述核酸片段係為一轉譯為複製調控蛋白質的基因。

在一可行實施態樣中，屬於前述非乳酸菌之原核細胞區域的前述「轉譯為複製調控蛋白質的基因」係指可經前述非乳酸菌之原核細胞辨識並進行轉錄/轉譯的基因，且經轉錄/轉譯所得之複製調控蛋白質可於前述非乳酸菌之原核細胞體內調控前述載體的複製數。前述轉譯為複製調控蛋白質的基因可為但不限於：大腸桿菌質體PBR322的rop。

在一可行實施態樣中，前述乳酸菌載體可進一步包含一表現卡匣，其包含：一表現元件；及一轉錄終止區。本發明所稱「表現元件」係指調控下游基因表達之核酸序列。於一可行實施態樣中，前述表現元件可為原核細胞表現元件、真核細胞表現元件、或其組合。

於一可行實施態樣中，前述表現元件包含一啟動子。於一可行實施態樣中，前述表現元件進一步包含：核醣體結合部位、操縱子(operator)、轉錄/轉譯的加強子序列(enhancer sequences)、或其組合。前述表現元件可為但不限於：乳酸菌的P23表現元件、乳酸鏈球菌P2P表現元件、乳酸鏈球菌P32表現元件、乳酸鏈球菌P59表現元件、乳酸鏈球菌P6C表現元件、乳酸桿菌表層蛋白質(S-layer protein)基因表現元件、乳酸菌Tuf基因表現元件、巨大細胞細胞病毒(CMV)表現元件、猿猴病毒40(simian virus 40,SV40)表現元件、Rous肉瘤病毒(rous sarcoma virus,RSV)表現元件、磷酸甘油激酶(phosphoglycerate kinase,PGK)基因表現元件、胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因表現元件、人類延伸因子1a(elongation factor 1 alpha,EF-1a)基因表現元件、泛素(ubiquitin)基因表現元件、或肌動蛋白質基因表現元件、或其組合。

在一可行實施態樣中，本發明之乳酸菌載體中的前述表現卡匣進一步包含一欲表現之基因。本發明所稱「欲表現之基因」係依據使用者的需求而有所不同。舉例來說，若欲將本發明之乳酸菌載體應用於以基因工程大量製造某一種蛋白質(如胰島素)，則前述欲表現之基因即為該蛋白質的核酸序列。又舉例來說，若欲將本發明之乳酸菌載體作為疫苗使用，則前述欲表現之基因於宿主(例如：人)體內經轉譯轉錄之後所得之蛋白質產物應具有免疫誘發效果(即，免疫誘發物質)。前述免疫誘發物質可為但不限於：病原(病菌、病毒和寄生蟲)之具有抗原性的胜肽、蛋白質、或其片段。

本發明所稱「篩選基因」係用來確認前述載體是否有順利轉形(transform)進入宿主體內。前述篩選基因可為但不限於：抗藥性篩選基因、非抗藥性篩選基因、或其組合。在一可行實施態樣中，前述篩選基因可為抗藥性篩選基因。舉例來說，前述抗藥性篩選基因為氯黴素抗性基因。在此可行實施態樣中，順利轉形有前述載體的宿主(如，大腸桿菌或是乳酸菌)便可以產生對氯黴素的抗性，而得以存活於含有氯黴素的環境。

本發明所稱「非抗藥性篩選基因」係指非以對抗生素之抗性與否來確認轉形的基因。前述非抗藥性篩選基因例如但不限於：β-半乳糖苷酶的核酸序列。在採用β-半乳糖苷酶的核酸序列作為篩選基因的實施態樣中，轉形成功的菌株會將X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)分解為半乳糖和5-溴-4-氯-3-羥基吲哚，而5-溴-4-氯-3-羥基吲哚會二聚合為5,5'-二溴-4,4'-二氯靛藍，因此產生不可溶而可供辨識的藍色物質。

在一較佳實施態樣中，前述非抗藥性篩選基因為營養缺乏篩選基因(如，胸苷酸合成酶機因thyA)、醣類代謝基因(如，乳糖代謝途徑相關之lacF與lacG)、抑菌素抗性基因(如，nisin抗性基因)、重金屬抗性基因(如，鎘抗性基因)、膽鹽水解酵素基因(bile sal hydrolase)、α-半乳糖苷酶基因(α-galactosidase)、D- 丙胺酸消旋酶(alanine racemase)基因、或熱震撼蛋白質(heat shock protein)基因。

實施例一：本發明之乳酸菌篩選及質體分離 篩選

本實施例自不同地區挑選17種發酵蔬果進行乳酸菌之篩選並進一步以16S rDNA序列分析鑑定菌種。篩選與鑑定方式如下所述，將不同地區之發酵蔬果與10mL滅菌0.1%(w/v)蛋白腖液(peptone water)均勻混合後，取出1mL含有菌體之蛋白腖液進行序列稀釋。將稀釋後之菌液以塗抹法接種至deMan Rogosa Sharpe固態培養基(簡稱MRS Agar；Merck,USA)，於30℃下進行厭氧培養。

隨機挑取培養基上之菌落接種於5mL MRS液體培養基中，並利用DNA純化套組(Tissue & Cell Genomic DNA Purification kit；GMbiolab,Taiwan)進行分離菌株染色體之抽取。首先取3mL之培養菌液至離心管中，經離心(5,870×g,5分鐘)後，倒除上清液，收集菌體部分。加入200μL Solution A[10mM Tris-HCl,pH 8.0；10mM EDTA；50mM；NaCl；20%(w/v)sucrose；10mg/mL lysozyme]重新懸浮菌體，於37℃下作用1小時。此步驟之目的在於分解菌體之細胞壁。接著加入20μL的蛋白酶K(proteinase K；10mg/mL)及200μL的萃取試劑，於56℃下作用3小時，其中每5分鐘便輕緩地上下搖晃以使菌體與試劑充分混合。經萃取試劑作用後，菌體會完全分解呈現澄清狀。之後，加入200μL的結合試劑(Binding solution)並於70℃下作用10分鐘。反應結束後，加入200μL的無水酒精至微量離心管中並均勻混合，吸取所有溶液(包括沉澱物)至離心分離小管(spin column)，並將離心分離小管放置於收集小管(collection tube)中。離心2分鐘(17,970×g)倒除流出液後，加入300μL的結合試劑至離心分離小管，再離心2分鐘(17,970×g)，倒除流出液。之後，再加入700μL的清洗試劑(Wash solution)至離心分離小管，經離心2分鐘(17,970×g)後，倒除流出液，並重複上述步驟一次。最後以17,970×g之條件離心5分鐘，去除殘留酒精。將離心分離小管放入一滅菌微量離心管中，加入適量無菌去離子水引流DNA。

利用16SUNI-L(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’；SEQ ID NO 36)與16SUNI-R(5’-GTGTGACGG GCGGTGTGTAC-3’；SEQ ID NO 37)增幅部分16S rDNA。PCR反應混合物之體積為100μL，其中包括10μL 10X Taq buffer,200μM dNTPs,1μM擴增引子，100ng細菌染色體萃取液及2.5 U DreamTaq DNA Polymerase(Thermo,USA)。聚合酶連鎖反應條件為95℃反應5分鐘(1個步驟)；95℃反應30秒、55℃反應30秒、72℃反應1分鐘30秒(35個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。利用DNA電泳確認有無預估大小之DNA片段。PCR產物經PCR-M^TM Clean Up kit(GMbiolab,Taiwan)回收後，送至源資國際生物科技股份有限公司進行定序。定序之結果再送至NCBI網站中進行比對(Blast)，由比對結果判定菌種之屬名及種名。

由17種發酵蔬果中共篩選出31株胚芽乳酸桿菌(L.plantarum)。針對其中9株胚芽乳酸桿菌進行質體之抽取並進行DNA電泳。結果顯示，不同胚芽乳酸桿菌中帶有不同數目及分子量之質體；其中胚芽乳酸桿菌ATIT-023之質體電泳結果所呈現之DNA條帶數目最多(數據未示)，代表含有多種質體，遂以此胚芽乳酸桿菌ATIT-023為後續研究進行的菌株。將此胚芽乳酸桿菌ATIT-023寄存於中華民國食品工業發展研究所菌種中心，取得寄存編號：BCRC 910654。

培養基

將前述胚芽乳酸桿菌ATIT-023培養於MRS培養基。視需要添加5μg/mL氯黴素(chloramphenicol)或1.5%(w/v)洋菜(agar)製備固體培養基，培養基及洋菜均購自美國BD公司。

本發明之質體(pLP-8)的分離

由於分子量小的質體有操作容易的優點，因此本研究首先針對前述胚芽乳酸桿菌ATIT-023中所含最小的質體進行分離，以供後續研究。實驗步驟概述如下：

1.乳酸菌質體之抽取

挑取乳酸菌ATIT-023的單一菌落接種於MRS液體培養基中。於30℃靜置培養16小時後，利用Plasmid Miniprep Purification Kit II(GMbiolab,Taiwan)進行乳酸桿菌質體之抽取。取1.5mL隔夜培養之菌液至微量離心管中，離心(21,910×g，5分鐘，室溫)收集菌體，並倒除上清液，重複此步驟一次。所得之菌體以1.0mL TSE buffer(10mM Tris-HCl、10mM EDTA、300mM NaCl，pH 8.0)懸浮後，離心(21,910×g，5分鐘，室溫)收集菌體，並倒除上清液。將菌體重新懸浮於200μL LAB plasmid solution I(50mM Tris-HCl、10mM EDTA、25%sucrose，pH 8.0，另額外添加30mg/mL lysozyme及100μg/mL RNase A)中，於37℃下作用30分鐘。之後加入200μL solution II，緩和混合數次。接著加入200μL Solution III，緩和混合數次。離心(21,910×g，10分鐘，室溫)收集上清液。

將離心分離小管放置於收集小管上，並將上清液置入離心分離小管中，經離心(21,910×g，2分鐘，室溫)後，倒除濾液。接著加入500μL清洗溶液A至離心分離小管中，離心(21,910×g，2分鐘，室溫)後，倒除濾液，此步驟可有效降低核酸內切酶(endonuclease)的污染。緊接著加入500μL清洗溶液B，經離心(21,910×g，2分鐘，室溫)後，倒除濾液。之後，繼續離心(21,910×g，5分鐘，室溫)以去除殘留之酒精。最後將離心分離小管放入一滅菌微量離心管中，加入適量之溶離溶液(elution solution)至離心分離小管中並離心(21,910×g，2分鐘，室溫)以引流質體DNA。將質體貯存於-20℃中備用。

2.利用瓊脂醣膠體電泳分離前述步驟中所獲得的質體

以0.5%或0.7%瓊脂醣(Affymetrix,USA)膠體作為電泳介質；以0.5倍TAE緩衝液作為電泳緩衝液。首先將DNA樣品與6倍EZ-Vision^TM乘載緩衝液以5：1比例混合均勻後，將此混合物注入瓊脂醣膠體之樣品凹槽中。於50V下進行電泳。電泳完畢後，於紫外光觀察箱下觀察結果(數據未示)，並將欲分析之條帶切下(由於本發明之質體(pLP-8)為乳酸菌ATIT-023中最小的質體，因此即切下移動距離最長的條帶)。

3.自瓊脂醣膠體中回收質體pLP-8

利用Gel Elution Kit(GMbiolab,Taiwan)進行膠體中質體DNA之回收，操作流程依照廠商提供之方法進行。操作方式如下所述，將含有欲回收DNA片段之瓊脂醣膠體裝入微量離心管中。在此離心管中加入0.5mL GEX buffer，於60℃下反應10分鐘，直至膠體完全熔解。待溶液冷卻後，將溶液裝填於離心分離小管中，並將離心分離小管放置於收集小管上，進行離心(21,910×g,1分鐘)，此時溶液中之DNA會被吸附於離心分離小管之樹脂上。取0.5mL WF buffer加入離心分離小管中，經離心(21,910×g,1分鐘)後，倒除流出液。再加入0.7mL WS buffer，離心(21,910×g,1分鐘)後，倒除流出液，重覆此步驟一次。此步驟之目的在於去除樹脂上之鹽類雜質。為避免殘留之酒精影響後續之實驗，再以21,910×g之條件離心5分鐘。最後將離心分離小管放入一滅菌微量離心管中，加入適量之溶離溶液至離心分離小管中並離心(21910×g， 2分鐘，室溫)以引流質體DNA。

本發明之質體(pLP-8)的定序與分析 1.質體pLP-8 DNA之選殖及定序

將質體以XhoI限制酶剪切後，以PCR-M^TM Clean Up system(GMbiolab,Taiwan)進行DNA之回收，操作流程依照廠商提供之方法進行。接續利用CloneJET^TM PCR cloning kit(Thermo,USA)進行DNA之補齊反應(fill-in reaction)及平端選殖(blunt-end cloning)，操作流程依照廠商提供之方法進行。將pLP-8 DNA片段及選殖載體pJET1.2之黏合產物轉形至E.coli ECOS 9-5(益生，臺灣)中。利用引子pJET1.2NEWF(5’-GGCGTAATACGACTCACTATAGGGAG-3’；SEQ ID NO 06)/pJET1.2NEWR(5’-CATCGATTTTCCATGGCAGCT GAG-3’；SEQ ID NO 07)搭配PCR Master Mix II試劑進行菌落聚合酶連鎖反應(colony polymerase chain reaction)，以挑選可能帶有pLP-8 DNA片段之轉形株。隨機挑選2株轉形株進行培養，並利用Plasmid Miniprep Purification Kit II進行質體之抽取。

將抽取之DNA委由源資國際生物(Tri-I Biotech)科技股份有限公司進行DNA定序。為確認已獲得全長序列，根據pLP-8 DNA定序結果設計引子pLP-8XHOISF(5’-CGAACGCAACATCACAAAAATACTG-3’；SEQ ID NO 08)及pLP-8XHOISR(5’-GCCACTCATTTGGTAAGCCAACAC-3’；SEQ ID NO 09)。利用pLP-8SF/pLP-8SR引子組合、GDP-HiFi DNA Polymerase及pKL-8質體進行PCR。利用PCR Clean-Up kit回收PCR產物後，以CloneJET^TM PCR cloning kit進行PCR產物之選殖。經菌落聚合酶連鎖反應、轉形株質體DNA抽取及DNA定序後，可獲得pLP-8之部分序列。將此序列與前述之pLP-8 DNA定序結果比對後，即可獲得全長序列。

2.序列分析

pLP-8定序結果顯示，此質體之序列全長為3414bp(SEQ ID NO 26)，GC含量為37.74%。利用NCBI之ORF finder可預測此質體帶有3個大於300bp之開放讀碼區(open reading frame；ORF)。根據ORF胺基酸同源性比對分析結果顯示，orf1所編碼之蛋白質被預測為與質體複製有關之複製蛋白質(Rep)；orf2所編碼之蛋白質為生物功能未知之假設性蛋白質；orf3所編碼之蛋白質為與質體轉移有關之移動蛋白質(mobilization protein,Mob)。在orf1(rep)上游發現帶有單股複製起始點(sso)及雙股複製起始點(dso)。在orf3(mob)上游則帶有移轉起始點oriT。第一圖顯示本發明之質體pLP-8的圖譜。

實施例二：本發明之乳酸菌載體的建構

本實施例所製備的乳酸菌載體係以實施例一所獲得之乳酸菌質體pLP-8及大腸桿菌質體pBR322建構，是一種可以應用於乳酸菌表現系統及大腸桿菌表現系統的穿梭載體。本實施例之乳酸菌載體的建構過程如下：

1.大腸桿菌載體pBRCM之建構

本實施例所用大腸桿菌ECOS 9-5係培養於Lurai-Bertani(LB)培養基，並視需要添加100μg/mL安比西林(ampicillin)或1.5%洋菜製備固體培養基。培養基及洋菜均購自美國BD公司。

以pET29a(Merck KGaA/Novagen,Germany)質體作為模板，利用pBRF(5’-GATATACTCGAGAGTAACCCGTATCGTGAGCA TCCTC-3’；SEQ ID NO 10)/pBRR(5’-CAATATGAGCTCCGTT TCCCGTTGAATATGGCTC-3’；SEQ ID NO 11)進行大腸桿菌質體複製區域(replicon-PBR322)之擴增。此DNA片段中含複製蛋白質基因(rep-PBR322)及複製調控蛋白質基因(rop-PBR322)。

在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng pET29a及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。以pNW33N(購自食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心；菌種編號為BCRC 41794)質體作為模板，利用CMF(5’-GATATAGAGCTCATTGCATGCTTTGGTACCGGATTGACTTT TAAAAAAGGATTGATTC-3’；SEQ ID NO 12)/CMR(5’-CAATATCTCGAGATAGTCGACGTCAGATCTTAGTGACATTAGA AAACCGACTGTAAAAAG-3’；SEQ ID NO 13)進行抗氯黴素基因(chloramphenicol resistance gene，CM^r-pC194)之擴增。

在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFiPCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng pNW33N及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認PCR產物中是否含有預估大小的DNA片段。

接著，利用PCR-M^TM Clean Up kit進行PCR產物之回收。replicon-pBR322與氯黴素抗性基因之PCR產物以SacI及XhoI剪切後，以T4 DNA接合酶進行黏合。將黏合產物轉形(transform)入大腸桿菌ECOS 9-5中。以CMF/CMR引子搭配PCR Master Mix II試劑進行菌落聚合酶連鎖反應(colony PCR)篩選轉形株。PCR 反應條件為95℃反應5分鐘(1個步驟)；95℃反應30秒、55℃反應30秒、72℃反應1分鐘(25個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。經colony PCR確認轉形株中之重組質體帶有插入的DNA後，再抽取轉形株中之質體進行DNA定序。將序列正確無誤的質體命名為pBRCM。

2.大腸桿菌載體pBRCMMCS之建構

此載體係由大腸桿菌載體pBR322之複製區域、氯黴素抗性基因及一人工合成多重選殖部位所構成。其建構方式如下所述。

利用重疊延伸聚合酶連鎖反應(overlapping-extension polymerase chain reaction,OEPCR)進行多重選殖部位的合成；其中所設計的限制酶切位包括BglII、EcoRI、SpeI、NdeI、BamHI、XmaI、PstI、SalI、HindIII、XhoI及XbaI。設計之引子包括MCST1(5’-AGATCTGCTAGCGAATTCACTAGTCATATGTCGCGAGGAT CCCCCGGGCTGCAGAT-3’；SEQ ID NO 14)、MCST2(5’-CTCGAGTACGTATCTAGAGCAAAGCTTATCGTCGACATGC ATCTGCAGCCCGGGGGATC-3’；SEQ ID NO 15)、MCSF(5’-GATATAAGATCTGCTAGCGAATTCACTAGTC ATATGTC-3’；SEQ ID NO 16)及MCSR(5’-CAATATCTCGAGTACGT ATCTAGAGCAAAGCTTA TCG-3’；SEQ ID NO 17)；其中MCST1及MCST2作為模板引子，MCSF及MCSR則做為增幅引子。於PCR反應時，模板引子間會黏合，以使聚合酶以3’至5’的引子為模板，由5’至3’的引子進行延伸，而產生全長DNA。

接著，增幅引子以全長DNA作為模板，大量增幅DNA片段。在50μL的PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM引子及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94 ℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認PCR產物中是否含有預估大小的DNA片段。

接著，利用PCR-M^TM Clean Up kit進行PCR產物之回收。合成之多重選殖部位以BglII及XhoI剪切後，以T4 DNA接合酶黏合至以相同限制酶剪切之pBRCM中。將黏合產物轉形入大腸桿菌ECOS 9-5中。以MCSF/MCSR引子搭配PCR Master Mix II試劑進行colony PCR篩選轉形株。PCR反應條件為95℃反應5分鐘(1個步驟)；95℃反應30秒、55℃反應30秒、72℃反應30秒(25個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。經colony PCR確認轉形株中之重組質體帶有插入的DNA後，再抽取轉形株中之質體進行DNA定序。將序列正確無誤的質體命名為pBRCMMCS。

3.大腸桿菌/乳酸菌穿梭載體pBRLP-8之建構

此載體係由大腸桿菌載體pBR322之複製區域、氯黴素抗性基因、一人工合成多重選殖部位及L.plantarum ATIT-023質體pLP-8最小可複製區域所構成。

L.plantarum ATIT-023之最小無性狀質體pLP-8之全長為3,414bp(SEQ ID NO 26)。序列分析結果顯示，此質體帶有orf1~orf3等三個開放讀碼區，可編碼出ORF1~ORF3等三個蛋白質。其中ORF1被預測為複製蛋白質；ORF2為生物功能未知之假設性蛋白質；ORF3為移動蛋白質。在orf1(rep)上游帶有單股複製起始點及雙股複製起始點。由質體序列推測最小可複製之區域應包括單股複製起始點、雙股複製起始點及複製蛋白質基因；在此段DNA中帶有基因操作常用之限制酶切位BglII、EcoRI及NdeI。

為增進未來基因操作之便利性，針對限制酶切位處設計突變引子並利用重疊延展聚合酶連鎖反應進行定點突變。突變引子之設計原則包括：突變點位於引子中央、及引子之Tm值溫度需高於78℃。突變引子之Tm值以Invitrogene公司提供之公式計算：Tm=81.5+0.41(%GC)-675/N-%mismatch，公式中的「%GC」為GC在引子核苷酸中所佔的百分比；「N」為引子長度；「%mismatch」為突變base在引子核苷酸中所佔的百分比。

有關pLP-8最小可複製之區域之突變及選殖之方式如下所述。首先設計6條突變引子。突變過程中，以pLP-8作為模版，利用LP8F(5’-GATATAAGATCTGCCCCTCAGAGGCCACAGG-3’；SEQ ID NO 18)/LP8M2(5’-GGGTCGCCAAACTAGAAATTCTCACGT GGG-3’；SEQ ID NO 19)、LP8M1(5’-CCCACGTGAGAATTTCTAG TTTGGCGACCC-3’；SEQ ID NO 20)/LP8M4(5’-CTTTTTTATA CTGAAAGATTTTTGCAATGG CTCGTCCC-3’；SEQ ID NO 21)、LP8M3(5’-GGGACGAGCCATTGCAAAAATCTTTCAGTATAAA AAAG-3’；SEQ ID NO 22)/LP8M6(5’-CATAAAAAGCAAAA CATGCATGTGGTGGTGATACA TCAGCTG-3’；SEQ ID NO 23)及LP8M5(5’-CAGCTGATGTATCACCACCACATGCATGTTTTGCT TTTTATG-3’；SEQ ID NO 24)/LP8R(5’-GATATAGAATT CTTCAAAAATATTTATAAGAGCCTAATTCCC-3’；SEQ ID NO 25)等引子組分別進行DNA片段增幅。

在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng pLP-8及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應之條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認有無預估大小之DNA片段。PCR產物以Gel-M^TM gel extraction system kit回收。之後，以回收的四個PCR產物作為模版，利用LP8F/LP8R引子組合進行基因增幅。PCR反應之條件為96℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應1分鐘(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。經此步驟後，即可獲得定點突變之pLP-8最小可複製區域。利用PCR-M^TM Clean Up system kit進行PCR產物之回收。

PCR產物以BglII及EcoRI剪切後，以T4 DNA接合酶黏合至以相同限制酶剪切之pBRCMMCS中。將黏合產物轉形入大腸桿菌ECOS 9-5中。以LP8F/LP8R引子搭配PCR Master Mix II試劑進行colony PCR篩選轉形株。PCR反應條件為95℃反應5分鐘(1個步驟)；95℃反應30秒、55℃反應30秒、72℃反應2分鐘(25個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。經colony PCR確認轉形株中之重組質體帶有插入的DNA後，再抽取轉形株中之質體進行DNA定序。將序列正確無誤的質體命名為pBRLP-8。本實施例之乳酸菌穿梭載體pBRLP-8的圖譜係如第二圖中所示。

4.表現載體pBRLP-8-P23-GFPT之建構及轉形

此載體係由大腸桿菌載體pBR322之複製區域、氯黴素抗性基因、一人工合成多重選殖部位、L.plantarum ATIT-023質體pLP-8最小可複製區域、乳酸鏈球菌(Lactococcus lactis)P23表現元件、增強型綠螢光蛋白質基因(作為欲表現之基因)及轉錄終止子(terminator)所構成。其建構方式如下所述。

以L.lactis MG1363染色體作為模板，利用P23PF(5’-GATATAGAATTCTCGAAAAGCCCTGACAACGCT-3’；SEQ ID NO 27)/P23PR(5’-CAATATCATATGCATATGATTTGGCCT CCCTTTTTAATTTAATTC-3’；SEQ ID NO 28)進行P23表現元件之擴增。在50μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1μM擴增引子，100ng L.lactis MG1363染色體及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為96℃反應5分鐘(1個步驟)；94℃反應30秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。PCR反應結束後，利用瓊脂醣膠體電泳確認PCR產物中是否含有預估大小的DNA片段。

接著，利用PCR-M^TM Ciean Up kit進行PCR產物之回收。PCR產物以EcoRI及NdeI剪切後，以T4 DNA接合酶黏合至以相同限制酶剪切之pBRLP-8中，建構成pBRLP-8-P23。將含有增強型綠螢光蛋白質基因及轉錄終止子(含有大腸桿菌噬菌體Lambda t0 terminator及大腸桿菌rrnB T1 terminator)之質體pSECS-GFPT利用NdeI與XbaI剪切後，回收增強型綠螢光蛋白質基因及轉錄終止子，以T4 DNA接合酶黏合至以相同限制酶剪切之pBRLP-8-P23中，建構成pBRLP-8-P23-GFPT(SEQ ID NO 29)。將此質體分別轉形入胚芽乳酸菌(L.plantarum ATIT-018)與鼠李糖乳酸桿菌(L.rhamnosus GG)中。本實施例之乳酸菌穿梭載體pBRLP-8-P23-GFPT的圖譜係如第三圖中所示。

實施例三：本發明之乳酸菌載體的分析

本實施例將實施例二所得之乳酸菌載體pBRLP-8轉形進入乳酸菌中觀察其特性，並將實施例二所得之乳酸菌載體pBRLP-8-P23-GFPT轉形進入乳酸菌中觀察欲表現之基因的表達。

1.乳酸菌之轉形

挑取單一菌落接種至30mL MRS培養基中，於30℃下進行靜置培養。經隔夜培養後，轉移適量菌液至含3%甘胺酸(glycine)之400mL MRS培養基中，將起始OD₆₀₀調整為0.1，繼續於30℃ 下進行靜置培養。培養3.5小時後，離心(12,000xg，10分鐘，4℃)收集菌體部分，並加入400mL之滅菌清洗緩衝液以懸浮菌體。經離心(12,000xg，10分鐘，4℃)後，小心倒除上清液，加入1mL電穿孔緩衝液(electroporation buffer)使菌體充份懸浮。經離心(12,000xg，10分鐘，4℃)後，小心倒除上清液，加入適量電穿孔緩衝液充份懸浮菌體後，將其分裝至微量離心管中(50μL/管)。以液態氮進行急速冷凍，並貯存於-70℃下備用。

進行DNA之轉形時，取電勝任細胞50μL加入1μg質體並置入預先冰冷之電極管中。冰浴5分鐘後，取出電極管於電場強度1.75KV/cm與電容25μF之條件下進行電轉形。將電轉形後之細胞加入1mL MRS培養基中，於30℃下靜置培養2小時。取適量菌液塗佈於含氯黴素(5μg/mL)之MRS固態培養基上，於30℃下厭氧培養48小時並觀察結果。

2.利用即時定量聚合酶連鎖反應檢測pBRLP-8於胚芽乳酸桿菌與鼠李糖乳酸桿菌中之相對複製數(copy number)

針對胚芽乳酸菌與鼠李糖乳酸桿菌基因體中之單一基因tuf和pLP-8之rep基因設計即時定量聚合酶連鎖反應專用之引子組合。針對胚芽乳酸菌tuf基因之引子為LPTufF(5’-TTCCTGT TATCCGTGGTTCA-3’；SEQ ID NO 30)/LPTufR(5’-AAC AGGCATCAAGAAA GGCT-3’；SEQ ID NO 31)；針對鼠李糖乳酸桿菌tuf基因之引子為LGGTufF(5’-ACCTTGGAT CTTGGTGAAGC-3’；SEQ ID NO 32)/LGGTufR(5’-TCA ACTTGGTCACGGTTGAT-3’；SEQ ID NO 33)；針對pLP-8之rep基因之引子為pLPREPF(5’-GCAACGAGCG ATGAAATTAG-3’；SEQ ID NO 34)/pLPREPR(5’-TTGCGCACTAGCCAATAAAG-3’；SEQ ID NO 35)。

利用DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen,USA)進行乳酸菌總DNA之抽取。利用Faststart Universal SYBR Green Master(ROX)進行反應試劑之配置。在25μL反應體基中之總DNA濃度分別使用10ng、1ng、0.1ng及0.01ng。利用ViiA^TM 7 Real Time PCR System(Life technologies,USA)進行即時定量聚合酶連鎖反應。由反應所得之臨界循環數值(threshold cycle,Ct)對應總DNA濃度繪製標準曲線圖。質體相對複製數之計算公式為(1+E)^-△Ct；其中「△Ct」代表rep及tuf反應之Ct值差；「E」為PCR增幅效率。實驗結果顯示本發明之乳酸菌載體pBRLP-8於胚芽乳酸桿菌與鼠李糖乳酸桿菌中的相對複製數分別為46和39(表一)。

3.測定pBRLP-8-P23-GFPT之綠螢光蛋白質的表達

挑取單一菌落接種於含氯黴素(5μg/mL)之MRS培養基中，於30℃進行靜置培養。經隔夜培養後，轉移適量菌液至氯黴素(5μg/mL)之MRS培養基中，將起始OD₆₀₀調整為0.1，繼續於37℃下進行靜置培養。於不同培養時間下，取出1mL培養液，離心(10,000×g,10分鐘，4℃)收集菌體，並倒除上清液。以1.0mL磷酸緩衝溶液(58mM Na₂HPO₄,17mM NaH₂PO₄,68mM NaCl) 洗滌菌體一次後，將菌體重新懸浮於1.0mL磷酸緩衝溶液中。利用infinite 200Pro微孔盤檢測器(Tecan,USA)於600nm下測定菌體密度，並於激發光波長為482nm與放射光波長為512nm下，測定樣品之螢光值。螢光強度(fluorescence intensity)以每單位細胞之螢光值(fluorescence/OD₆₀₀)表示。實驗結果如第四圖所示，乳酸菌確實表現增強型綠螢光蛋白質。此結果說明利用pBRLP-8所衍生之表現載體搭配胚芽乳酸桿菌(L.plantarum ATIT-018)或鼠李糖乳酸桿菌(LGG)皆可建構基因表現系統。此外，由於本實驗中綠螢光蛋白質的表達狀況良好，意味著所建構之表現系統非常合適應用於重組蛋白質之生產或作為疫苗攜帶者。

【生物材料寄存】 國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

中華民國食品工業發展研究所菌種中心、民國103年10月29日、BCRC 910654。

國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

無

<110> 財團法人農業科技研究院

<120> 乳酸菌菌株、其質體、及其衍生之載體

<130>

<160> 37

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 85

<212> DNA

<213> Lactobacillus plantarum

<400> 1

<210> 2

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<213> Lactobacillus plantarum

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<213> Lactobacillus plantarum

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<213> Lactobacillus plautarum

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<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<220>

<223> primer

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<211> 4048

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> plasmid

<400> 38

Claims

一種乳酸菌菌株，前述乳酸菌菌株在中華民國食品工業發展研究所菌種中心的寄存編號為BCRC 910654。
一種乳酸菌質體，其具有如SEQ ID NO 26所示序列，其中包含：一單股複製起始點，其包含SEQ ID NO 01所示序列；一雙股複製起始點，其包含SEQ ID NO 02所示序列；及一轉譯為複製蛋白質的基因，其包含SEQ ID NO 03所示序列。
如請求項第2項所述之乳酸菌質體，其係分離自如請求項第1項所述之乳酸菌菌株。
一種乳酸菌載體，其包含：一乳酸菌區域，其包含：一單股複製起始點，其包含SEQ ID NO 01所示序列；一雙股複製起始點，其包含SEQ ID NO 02所示序列；及一轉譯為第一複製蛋白質的基因，其包含SEQ ID NO 03所示序列；一非乳酸菌之原核細胞區域，其包含：一轉譯為第二複製蛋白質的基因，其係大腸桿菌質體PBR322的rep；其中前述乳酸菌載體包含SEQ ID NO 38所示序列。
如請求項第4項所述之乳酸菌載體，其進一步包含一表現卡匣，其包含：一表現元件及一轉錄終止區。
如請求項第5項所述之乳酸菌載體，其中前述表現元件為原核細胞表現元件、真核細胞表現元件、或其組合。
如請求項第6項所述之乳酸菌載體，其中前述原核細胞表現元件為乳酸菌表現元件。
如請求項第6項所述之乳酸菌載體，其中前述乳酸菌表現元件是P23表現元件。
如請求項第5項所述之乳酸菌載體，其中前述表現卡匣進一步包含一欲表現之基因。
如請求項第9項所述之乳酸菌載體，其中前述欲表現之基因的產物為免疫誘發物質。
如請求項第1項所述之乳酸菌菌株，其具有一乳酸菌質體，其中前述乳酸菌質體具有如SEQ ID NO 26所示序列。