JP2022031673A - Ｃｒｉｓｐｒ核酸を用いて、細菌、古細菌、藻類、および、酵母をスクリーニングする方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】細菌、古細菌、藻類及び／又は酵母における必須及び非必須の遺伝子及び消費されてよいゲノムアイランドをスクリーニングするため、死滅させるため、縮小されたゲノムサイズ及び／又は遺伝子欠失をスクリーニングするための、ＣＲＩＳＰＲ核酸の使用を提供する。【解決手段】必須遺伝子、非必須遺伝子、及び／又は消費されてよいゲノムアイランドに関して、細菌細胞の集団をスクリーニングする方法は、細胞の集団に、（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物を導入するステップ；及び形質転換された細胞の集団における欠失の存在又は不存在を判定するステップを含む。【選択図】なし
Description
［優先権の陳述］
本出願は、２０１５年５月２９日に出願された米国仮出願第６２／１６８，３５５号および２０１６年２月１８日に出願された米国仮出願第６２／２９６，８５３号の合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）の下での利益を主張し、それぞれの内容全体は、参照により本明細書中に援用される。
本出願は、２０１５年５月２９日に出願された米国仮出願第６２／１６８，３５５号および２０１６年２月１８日に出願された米国仮出願第６２／２９６，８５３号の合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）の下での利益を主張し、それぞれの内容全体は、参照により本明細書中に援用される。
［本発明の分野］
本発明は、細菌、古細菌、藻類および／または酵母における必須および非必須の遺伝子および消費されてよい（ｅｘｐｅｎｄａｂｌｅ）ゲノムアイランドをスクリーニングするため、細菌、古細菌、藻類および／または酵母を死滅させるため、遺伝子（単数または複数）の表現型を同定するため、および／または、細菌、古細菌、藻類および／または酵母において縮小されたゲノムサイズおよび／または遺伝子欠失をスクリーニングするための、ＣＲＩＳＰＲ核酸の使用に関する。
本発明は、細菌、古細菌、藻類および／または酵母における必須および非必須の遺伝子および消費されてよい（ｅｘｐｅｎｄａｂｌｅ）ゲノムアイランドをスクリーニングするため、細菌、古細菌、藻類および／または酵母を死滅させるため、遺伝子（単数または複数）の表現型を同定するため、および／または、細菌、古細菌、藻類および／または酵母において縮小されたゲノムサイズおよび／または遺伝子欠失をスクリーニングするための、ＣＲＩＳＰＲ核酸の使用に関する。
Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）は、関連配列（ｃａｓ）と組み合わせて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成し、多くの細菌において適応免疫を与える。ＣＲＩＳＰＲが仲介する免疫付与は、プラスミドおよびファージなどの侵襲性遺伝因子由来のＤＮＡの、新規の「スペーサー」としての取り込みを介して生じる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、超可変配列により隔てられた短いＤＮＡリピートのアレイからなり、ｃａｓ遺伝子が隣接し、配列特異的ターゲッティングおよび干渉を介して、ファージおよびプラスミドなどの侵襲性遺伝因子に対する適応免疫を提供する（Ｂａｒｒａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１５：１７０９－１７１２；Ｂｒｏｕｎｓ ｅｔ ａｌ．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９６０－４；Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ．２０１０．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２７：１６７－７０；Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ａｎｄ Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２２：１８４３－１８４５；Ｂｈａｙａ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．４５：２７３－２９７；Ｔｅｒｎｓ ａｎｄ Ｔｅｒｎｓ．２０１１．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４：３２１－３２７；Ｗｅｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．４６：３１１－３３９；Ｂａｒｒａｎｇｏｕ Ｒ．２０１３．ＲＮＡ．４：２６７－２７８）。
典型的に、侵襲性ＤＮＡ配列は、新規の「スペーサー」として獲得され（Ｂａｒｒａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１５：１７０９－１７１２）、それぞれがＣＲＩＳＰＲリピートと対になり、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座において新規のリピート－スペーサーユニットとして挿入される。続いて、リピート－スペーサーアレイは、長いｐｒｅ－ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）として転写され（Ｂｒｏｕｎｓ ｅｔ ａｌ．２００８．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９６０－４）、配列特異的認識を駆動する低分子干渉ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）へ処理される。具体的には、ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼにより仲介される配列特異的核酸切断のために、ヌクレアーゼを相補標的に向かってガイドする（Ｇａｒｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｎａｔｕｒｅ．４６８：６７－７１；Ｈａｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２９：１３５５－１３５８；Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３９：９２７５－９２８２；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７：８１６－８２１；Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９：Ｅ２５７９－Ｅ２５８６；Ｍａｇａｄａｎ ｅｔ ａｌ．２０１２．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．７：ｅ４０９１３；Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．２０１３．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．１０：８４１－８５１）。これらの広範なシステムは、細菌のほぼ半数（約４６％）および大多数の古細菌（約９０％）で生じる。
一般論として、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの２つの主なクラスが存在し（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：７２２－７３６（２０１５））、ｃａｓ遺伝子含有量、ｃａｓオペロン構造、Ｃａｓタンパク質配列、および処理ステップに基づき、５つの主なタイプおよび１６の異なるサブタイプを包含する（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌ Ｄｉｒｅｃｔ．６：３８（２０１１）；Ｍａｋａｒｏｖａ ａｎｄ Ｋｏｏｎｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１３１１：４７－７５（２０１５）；Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｒ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６：２４７（２０１５））。Ｉ型およびＩＩＩ型では、特別なＣａｓエンドヌクレアーゼがｐｒｅ－ｃｒＲＮＡを処理し、それから、ｃｒＲＮＡに相補の核酸を認識および切断することのできる巨大な多重－Ｃａｓタンパク質複合体に集合する。Ｉ型システムは最も頻繁であり普及したシステムであり、Ｃａｓｃａｄｅによって駆動されてＰＡＭに依存性の様式でＤＮＡを標的化して、シグネチャタンパク質Ｃａｓ３を用いて標的核酸を破壊する。異なるプロセスは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに関する。ここで、ｐｒｅ－ＣＲＮＡは、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）がｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズするメカニズムにより処理される。ハイブリダイズしたｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＲＮａｓｅ ＩＩＩにより切断され、各スペーサーの５’末端を除去する第２のイベントが続き、ｔｒａｃｒＲＮＡとＣａｓ９の両方と結合したままの成熟ｃｒＲＮＡが生産される。成熟複合体は、それから、複合体内のスペーサー配列と相補の標的ｄｓＤＮＡ配列（「プロトスペーサー」配列）を探して両鎖を切断する。ＩＩ型システムでの複合体による標的の認識および切断は、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体上のスペーサー配列と標的「プロトスペーサー」配列との間で相補の配列を必要とするだけでなく、プロトスペーサー配列の３’末端に位置するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列も必要とする。
本発明の一態様は、必須遺伝子、非必須遺伝子、および／または消費されてよいゲノムアイランドに関して、細菌細胞の集団をスクリーニングする方法を提供し、細菌細胞の前記集団に、（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物を導入するステップ（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列のスペーサーは、前記集団の細菌細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、それにより、形質転換された細菌細胞の集団を生産する）；形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団における欠失の存在または不存在を判定するステップ（ここで、形質転換された細菌、古細菌または酵母細胞の集団における欠失の存在は、標的領域が非必須遺伝子および／または消費されてよいゲノムアイランド内に含まれることを意味し、形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団における欠失の不存在は、標的領域が必須遺伝子内に含まれることを意味する）を含む。本発明で有用なＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型またはＶ型ＣＲＩＳＰＲアレイであり得る。
本発明の第２の態様は、必須遺伝子、非必須遺伝子、および／または消費されてよいゲノムアイランドに関して、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団をスクリーニングする方法を提供し、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団に、（ａ）トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物、（ｂ）（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列のスペーサーは、前記集団の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム（染色体および／またはプラスミド）内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含む）、および（ｃ）Ｃａｓ９ポリペプチドまたはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物を導入するステップ（それにより、形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団を生産する）；および、形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団における欠失の存在または不存在を判定するステップ（ここで、形質転換された細菌、古細菌または酵母細胞の集団における欠失の存在は、標的領域が非必須遺伝子および／または消費されてよいゲノムアイランド内に含まれることを意味し、形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団における欠失の不存在は、標的領域が必須遺伝子内に含まれることを意味する）、を含む。
本発明の第３の態様は、細菌細胞の集団内の１つまたは複数の細菌細胞を死滅させる方法を提供し、細菌細胞の集団に、（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ（ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）を含む異種核酸構築物を導入するステップを含み、ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列のスペーサーは、前記集団の細菌細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、それにより、細菌細胞の集団内の標的領域を含む１つまたは複数の細菌細胞を死滅させる。本発明で有用なＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型またはＶ型ＣＲＩＳＰＲアレイであり得る。
本発明の第４の態様は、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団内の１つまたは複数の細胞を死滅させる方法を提供し、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団に、（ａ）トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物、（ｂ）（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列のスペーサーは、前記集団の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム（染色体および／またはプラスミド）内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含む）、および、（ｃ）Ｃａｓ９ポリペプチドおよび／またはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物を導入するステップを含み、それにより、それらのゲノム内に標的領域を含む細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団内の１つまたは複数の細胞を死滅させる。
本発明の第５の態様は、細菌遺伝子と関連する表現型を同定する方法を提供し、細菌細胞の集団に、（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物を導入するステップ（ここで、少なくとも１つのリピート－スペーサー配列およびリピート－スペーサー－リピート配列のスペーサーは、前記集団の細菌細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、ここで、標的領域は、ポリペプチドまたは機能性核酸をコードするオープンリーディングフレームの少なくとも一部を含み、それにより、標的領域を含む細胞を死滅させ、そして、標的領域を含まない形質転換された細菌細胞の集団を生産する）；および、集団の表現型を分析するステップ、を含む。本発明で有用なＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型またはＶ型ＣＲＩＳＰＲアレイであり得る。
本発明の第６の態様は、細菌、古細菌、藻類または酵母遺伝子の表現型を同定する方法を提供し、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団に、（ａ）トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物、（ｂ）（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列のスペーサーは、前記集団の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム（染色体および／またはプラスミド）内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含む）、および（ｃ）Ｃａｓ９ポリペプチドおよび／またはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物、を導入するステップ（それにより、標的領域を含む細菌、古細菌または酵母細胞を死滅させ、そして、標的領域を含まない形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団を生産する）；および、形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団の表現型を分析するステップ、および／または、（ｉ）形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団から、個々の細菌、古細菌、藻類または酵母コロニーを増殖させるステップ、および、（ｉｉ）個々のコロニーの表現型を分析するステップ、を含む。
本発明の第７の態様は、細菌細胞の集団から、縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌細胞を選択する方法を提供し、細菌細胞の集団に、（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物を導入するステップを含み、ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列のスペーサーは、前記集団の１つまたは複数の細菌細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、ここで、標的領域を含む細胞は死滅して、それにより、細菌細胞の集団から、標的領域を含まない縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌細胞を選択する。本発明で有用なＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型またはＶ型ＣＲＩＳＰＲアレイであり得る。
本発明の第８の態様は、細菌細胞の集団から、縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌細胞を選択する方法を提供し、細菌細胞の集団に、（ａ）（ｉ）前記細菌細胞のゲノム内に存在する少なくとも３００個の連続したヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、１つまたは複数の異種核酸構築物、または、（ｉｉ）少なくとも１つのトランスポゾンを含む２以上の異種核酸構築物（それにより、ゲノム中に組み込まれた前記の１つまたは複数の異種核酸構築物およびゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、または、ゲノム中に組み込まれた第１および第２のトランスポゾンの間の、相同組み換えに関する非天然部位を含むトランスジェニック細菌細胞の集団を生産する）；および（ｂ）（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物、を導入するステップを含み、ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列のスペーサーは、前記集団の１つまたは複数の細菌細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、ここで、標的領域は、ゲノム中に導入された前記の１つまたは複数の異種核酸構築物およびゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、および／または、第１のトランスポゾンおよび第２のトランスポゾンの間に位置し、および、標的領域を含む細胞は死滅して、それにより、トランスジェニック細菌細胞の集団から、標的領域を有さない縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌細胞を選択する。本発明で有用なＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型またはＶ型ＣＲＩＳＰＲアレイであり得る。
本発明の第９の態様は、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団から、縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞を選択する方法を提供し、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団に、（ａ）トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物、（ｂ）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物（ここで、前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列および前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー－リピート配列のスペーサーは、前記集団の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム（染色体および／またはプラスミド）内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含む）、および、（ｃ）Ｃａｓ９ポリペプチドおよび／またはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物、を導入するステップを含み、ここで、標的領域を含む細胞は死滅して、それにより、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団から、標的領域を有さない縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞を選択する。
本発明の第１０の態様は、細菌、古細菌または酵母細胞の集団から、縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞を選択する方法を提供し、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団に、（ａ）（ｉ）前記の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム内に存在する少なくとも３００個の連続したヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、１つまたは複数の異種核酸構築物、または（ｉｉ）少なくとも１つのトランスポゾンを含む２以上の異種核酸構築物（それにより、ゲノム中に組み込まれた前記の１つまたは複数の異種核酸構築物およびゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、または、ゲノム中に組み込まれた第１および第２のトランスポゾンの間の、相同組み換えに関する非天然部位を含むトランスジェニック細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団を生産する）；および（ｂ）（ｉ）トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物、（ｉｉ）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物（ここで、前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列および前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー－リピート配列のスペーサーは、前記集団の１つまたは複数の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム（染色体および／またはプラスミド）内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含む）、および（ｉｉｉ）Ｃａｓ９ポリペプチドおよび／またはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物、を導入するステップを含み、ここで、標的領域は、ゲノム中に取り込まれた前記の１つまたは複数の異種核酸構築物およびゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、および／または、第一のトランスポゾンおよび第二のトランスポゾンの間に位置し、標的領域を含む細胞は死滅して、それにより、トランスジェニック細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団から、標的領域を有さない縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞を選択する。
本発明の第１１の態様は、細菌の集団において、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する方法を提供し、細菌細胞の集団に、（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物を導入するステップ（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列のスペーサーは、前記集団の１つまたは複数の細菌細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、ここで、標的領域を含む細胞は死滅して、それにより、標的領域を含まない形質転換された細菌細胞の集団を生産する）；および、形質転換された細菌細胞の集団から個々の細菌コロニーを増殖させるステップを含み、それにより、形質転換された細菌の集団から、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する。本発明で有用なＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型またはＶ型ＣＲＩＳＰＲアレイであり得る。
本発明の第１２の態様は、細菌の集団において、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する方法を提供し、細菌細胞の集団に、（ａ）（ｉ）前記細菌細胞のゲノム内に存在する少なくとも３００個の連続したヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、１つまたは複数の異種核酸構築物、または、（ｉｉ）少なくとも１つのトランスポゾンを含む２以上の異種核酸構築物（それにより、ゲノム中に組み込まれた前記の１つまたは複数の異種核酸構築物およびゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、または、ゲノム中に組み込まれた第１および第２のトランスポゾンの間の、相同組み換えに関する非天然部位を含むトランスジェニック細菌細胞の集団を生産する）；およびｂ）（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物を導入するステップ（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列のスペーサーは、前記集団の１つまたは複数の細菌細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、ここで、標的領域は、ゲノム中に導入された前記の１つまたは複数の異種核酸構築物およびゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、および／または、第１のトランスポゾンおよび第２のトランスポゾンの間に位置し、標的領域を含む細胞は死滅して、それにより、標的領域を含まない形質転換された細菌細胞の集団を生産する）；および、形質転換された細菌細胞の集団から個々の細菌コロニーを増殖させるステップを含み、それにより、細菌の集団から、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する。本発明で有用なＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型またはＶ型ＣＲＩＳＰＲアレイであり得る。
本発明の第１３の態様は、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団において、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する方法を提供し、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団に：（ａ）トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物、（ｂ）（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列のスペーサーは、前記集団の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム（染色体および／またはプラスミド）内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含む）、および（ｃ）Ｃａｓ９ポリペプチドまたはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物、を導入するステップ（ここで、標的領域を含む細胞は死滅して、それにより、標的領域を含まない形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団を生産する）；および、形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団から、個々の細菌、古細菌または酵母コロニーを増殖させるステップを含み、それにより、形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団から、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する。
本発明の第１４の態様は、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団において、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する方法を提供し、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団に（ａ）（ｉ）前記の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム内に存在する少なくとも３００個の連続したヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、１つまたは複数の異種核酸構築物、または（ｉｉ）少なくとも１つのトランスポゾンを含む２以上の異種核酸構築物（それにより、ゲノム中に組み込まれた前記の１つまたは複数の異種核酸構築物およびゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、または、ゲノム中に組み込まれた第１および第２のトランスポゾンの間の、相同組み換えに関する非天然部位を含むトランスジェニック細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団を生産する）；および（ｂ）（ｉ）トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物、（ｉｉ）（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列のスペーサーは、前記集団の１つまたは複数の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム（染色体および／またはプラスミド）内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含む）、および、（ｉｉｉ）Ｃａｓ９ポリペプチドおよび／またはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物、を導入するステップ（ここで、標的領域は、ゲノム中に組み込まれた前記の１つまたは複数の異種核酸構築物およびゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、および／または、第一のトランスポゾンおよび第二のトランスポゾンの間に位置し、標的領域を含む細胞は死滅して、それにより、標的領域を有さない形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団を生産する）；および、形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団から、個々の細菌、古細菌または酵母コロニーを増殖させるステップを含み、それにより、集団から、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する。
本明細書においてさらに提供されるのは、発現カセット、本発明の核酸構築物、核酸アレイ、核酸分子および／またはヌクレオチド配列を含む細胞およびキットである。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の説明において詳細に示される。
ここで、本発明は、以降に、付随する図面および実施例に関して説明されて、そこに本発明の実施態様が示される。この説明は、本発明が実施され得る全ての異なる手段または本発明に加えられ得る全ての特徴の、詳細な一覧であることを意図しない。例えば、一実施態様に関して説明される特徴は、他の実施態様に取り込まれ得て、特定の実施態様に関して説明される特徴は、その実施態様から取り除かれ得る。したがって、本発明は、本発明の一部の実施態様では、本明細書において示される任意の特徴または特徴の組み合わせを除外または省略することができることを検討する。加えて、本明細書において示唆される様々な実施態様に対する非常に多くの変更および追加は、本開示に照らして当業者に明らかであり、本発明から逸脱しない。それ故に、以下の説明は、本発明の一部の特定の実施態様を説明することを意図し、それらの全ての並べ替え、組み合わせ、および変更を徹底的に特定することを意図しない。
別段の定義がされない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者の一人により一般に理解されるのと同一の意味を有する。本発明において、本発明の説明に用いられる専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のためのみであり、本発明の限定を意図しない。
本明細書において引用される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照が提供される文章および／または段落に関連のある教示に関して、それらの全体で参照により援用される。
文脈が別段の指示をしない限り、本明細書に説明される本発明の様々な特徴は、任意の組み合わせで用いることができることが明確に意図される。さらにまた、本発明は、本発明の一部の実施態様では、本明細書において示される任意の特徴または特徴の組み合わせは、除外または省略することができることも検討する。説明すると、明細書が、組成物は構成要素Ａ、ＢおよびＣを含む、と述べる場合、Ａ、ＢまたはＣのいずれか、またはそれらの組み合わせが、単独でまたは任意の組み合わせで、省略および放棄され得ることが明確に意図される。
本発明の説明および添付の特許請求の範囲において用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形を同様に含むことが意図される。
また、本明細書において用いられる「および／または」は、関係がある列挙された項目の１つまたは複数の任意および全てのあり得る組み合わせ、ならびに、選択肢で（「または」）解釈された場合は組み合わせの欠失を指し、および包含する。
本明細書において用いられる用語「約」は、例えば用量または期間のような測定可能な値を言及する場合、規定の量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または実に±０．１％の変動を指す。
本明細書において用いられる、「ＸおよびＹの間」および「約ＸおよびＹの間」のような語句は、ＸおよびＹを含むと解釈されるべきである。本明細書において用いられる「約ＸおよびＹの間」のような語句は、「約Ｘおよび約Ｙの間」を意味し、「約ＸからＹまで」のような語句は、「約Ｘから約Ｙまで」を意味する。
本明細書において用いられる用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられた特徴、整数、ステップ、操作、エレメント、および／または、構成要素の存在を特定するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、操作、エレメント、構成要素、および／または、それらの群の存在または追加を排除しない。
本明細書において用いられる、移行句「から本質的になる」は、クレームの範囲が、クレーム内に挙げられた規定の材料またはステップおよびクレームされた発明の基本的および新規の特徴（単数または複数）に実質的に影響を及ぼさないものを包含すると解釈すべきであることを意味する。したがって、用語「から本質的になる」は、本発明のクレームにおいて用いられる場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されることを意図しない。
「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムにおいて、二本鎖ＤＮＡ切断を触媒するエンドヌクレアーゼの大きなグループを指す。これらのポリペプチドは、当技術分野でよく知られていて、それらの構造（配列）の多くが特徴付けられている（例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２；ＷＯ／２０１３／１８８６３８を参照）。二本鎖ＤＮＡの切断を触媒するドメインは、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインである。ＲｕｖＣドメインは、（－）鎖にニックを入れるのを担い、ＨＮＨドメインは、（＋）鎖にニックを入れるのを担う（例えば、Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １０９（３６）：Ｅ２５７９－Ｅ２５８６（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ４，２０１２）を参照）。
本明細書において用いられる「キメラ」は、少なくとも２つの構成要素が、異なる供給源（例えば、異なる生物、異なるコード領域）に由来する、核酸分子またはポリペプチドを指す。
本明細書において用いられる「相補体」は、コンパレータ―ヌクレオチド配列との１００％相補性または同一性を意味することができ、または、１００％未満の相補性（例えば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％などの相補性）を意味することができる。
本明細書において用いられる用語「相補」または「相補性」は、塩基対合による、許容的な塩および温度条件下での、ポリヌクレオチドの自然な結合を指す。例えば、配列「Ａ－Ｇ－Ｔ」は、相補配列「Ｔ－Ｃ－Ａ」と結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、ヌクレオチドの一部のみが結合する「部分的」であってよく、または、一本鎖分子間に全体的な相補性が存在する場合は完全であってよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に重大な効果を有する。
本明細書において用いられる「接触する（ｃｏｎｔａｃｔ）」、「接触する（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」、「接触される（ｃｏｎｔａｃｔｅｄ）」、および、それらの文法的変形は、所望の反応（例えば、組込み、形質転換、スクリーニング、選択、死滅、同定、増幅など）を行なうのに適切な条件下に、所望の反応の構成要素を一緒に置くことを指す。そのような反応を行なうための方法および条件は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９：Ｅ２５７９－Ｅ２５８６；Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．４ｔｈ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照）。
本明細書において用いられる「欠失」は、制限されないが、染色体またはプラスミドの一部の欠失、染色体またはプラスミド由来の遺伝子または遺伝子の一部の欠失を含む、遺伝物質の喪失または欠失を含むことができる。一部の実施態様では、欠失は、１つの遺伝子または１つよりも多い遺伝子を含むことができる。一部の実施態様では、欠失は、小さな非コードＲＮＡをコードしてよい非タンパク質コード領域の喪失を含んでもよい。一部の実施態様では、欠失は、プラスミド全体または可動遺伝要素全体の喪失を含んでよい。一部の実施態様では、可動遺伝要素の喪失は、例えば、複製または存続の不可能性として定義され得る。
一部の実施態様では、本発明のファスミドは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、および／または、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム由来の、ＣＲＩＳＰＲアレイを含んでよい（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：７２２７３６（２０１５）を参照）。
したがって、一部の実施態様では、Ｉ型ｃｒＲＮＡに加えて、本発明のファスミドは、Ｉ型ポリペプチドおよび／またはＩ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチド（すなわち、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）を含んでよい。
本明細書において用いられる「Ｉ型ポリペプチド」は、Ｃａｓ３ポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチド、Ｃａｓ３’’ポリペプチド、それらの融合変異体、および、任意の１つまたは複数の、抗ウイルス防御のためのＩ型Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）関連複合体（「Ｃａｓｃａｄｅ」）ポリペプチドのいずれかを指す。したがって、用語「Ｉ型ポリペプチド」は、Ｉ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、および／または、Ｉ－Ｕ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを作り上げるポリペプチドを指す。それぞれのＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、少なくとも１つのＣａｓ３ポリペプチドを含む。Ｃａｓ３ポリペプチドは、一般に、ヘリカーゼドメインおよびＨＤドメインの両方を含む。しかしながら、一部のＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムでは、ヘリカーゼおよびＨＤドメインは、別個のポリペプチド、Ｃａｓ３’およびＣａｓ３’’内に見られる。具体的には、Ｃａｓ３’はヘリカーゼドメインをコードし、一方で、Ｃａｓ３’’はＨＤドメインをコードする。その結果として、両方のドメインがＣａｓ３機能に必要とされるので、Ｉ型サブタイプは、Ｃａｓ３（Ｉ－Ｃ、Ｉ－Ｄ、Ｉ－Ｅ、Ｉ－Ｆ、Ｉ－Ｕ）またはＣａｓ３’およびＣａｓ３’’（Ｉ－Ａ、Ｉ－Ｂ）のいずれかをコードする。
本明細書において用いられる「Ｉ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチド」は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおける、Ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡのプロセッシングおよびその後の標的ＤＮＡに対する結合に関与するポリペプチドの複合体を指す。これらのポリペプチドは、限定されないが、Ｉ型サブタイプＩ－Ａ、Ｉ－Ｂ、Ｉ－Ｃ、Ｉ－Ｄ、Ｉ－ＥおよびＩ－ＦのＣａｓｃａｄｅポリペプチドを含む。Ｉ－Ａ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドの非限定の例は、Ｃａｓ７（Ｃｓａ２）、Ｃａｓ８ａ１（Ｃｓｘ１３）、Ｃａｓ８ａ２（Ｃｓｘ９）、Ｃａｓ５、Ｃｓａ５、Ｃａｓ６ａ、Ｃａｓ３’および／またはＣａｓ３’’を含む。Ｉ－Ｂ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドの非限定の例は、Ｃａｓ６ｂ、Ｃａｓ８ｂ（Ｃｓｈ１）、Ｃａｓ７（Ｃｓｈ２）および／またはＣａｓ５を含む。Ｉ－Ｃ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドの非限定の例は、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ８ｃ（Ｃｓｄ１）、および／またはＣａｓ７（Ｃｓｄ２）を含む。Ｉ－Ｄ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドの非限定の例は、Ｃａｓ１０ｄ（Ｃｓｃ３）、Ｃｓｃ２、Ｃｓｃ１、および／またはＣａｓ６ｄを含む。Ｉ－Ｅ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドの非限定の例は、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃａｓ７（ＣａｓＣ）、Ｃａｓ５（ＣａｓＤ）および／またはＣａｓ６ｅ（ＣａｓＥ）を含む。Ｉ－Ｆ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドの非限定の例は、Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ２、Ｃａｓ７（Ｃｙｓ３）および／またはＣａｓ６ｆ（Ｃｓｙ４）を含む。Ｉ－Ｕ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドの非限定の例は、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６および／またはＣａｓ４を含む。
一部の実施態様では、本発明のファスミドは、ＩＩ型ｃｒＲＮＡに加えて、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含んでよい。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、３つのサブタイプ：ＩＩ－Ａ型、ＩＩ－Ｂ型およびＩＩ－Ｃ型を含み、それぞれ、多重ドメインタンパク質、Ｃａｓ９を、適合ポリペプチド、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２および場合により、Ｃｓｎ２および／またはＣａｓ４に加えて含む。また、ほとんどのＩＩ型遺伝子座は、ｔｒａｃｒＲＮＡもコードする。例示的なＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む生物は、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ ｓｔｒ． Ｐａｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＮＲＺ１０６６およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ ０２０－０６を含む。
さらなる実施態様では、本発明のファスミドは、ＩＩＩ型ｃｒＲＮＡに加えて、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含んでよい。Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと同様に、ＩＩＩ型システムでは、プロセッシングおよび干渉は、多重タンパク質ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）－エフェクター複合体によって仲介される（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：７２２７３６（２０１５））－Ｉ型における「ＣＡＳＣＡＤＥ」およびＩＩＩ型における「Ｃｓｍ」または「Ｃｍｒ」。したがって、一部の実施態様では、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃｓｍ複合体（例えば、ＩＩＩ－Ａ型Ｃｓｍ）および／またはＣｍｒ複合体（例えば、ＩＩＩ－Ｂ型Ｃｍｒ）、および場合により、Ｃａｓ６ポリペプチドを含むことができる。代表的な実施態様では、Ｃｓｍ複合体は、Ｃａｓ１０（またはＣｓｍ１）、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、およびＣｓｍ６ポリペプチドを含んでよく、Ｃｍｒ複合体は、Ｃｍｒ１、Ｃａｓ１０（またはＣｍｒ２）、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、およびＣｍｒ６ポリペプチドを含んでよい。Ｃｓｍ複合体またはＣｍｒ複合体に加えて、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ７ポリペプチドをさらに含んでよい。ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの４つのサブタイプ、ＩＩＩ－Ａ、ＩＩＩ－Ｂ、ＩＩＩ－Ｃ、ＩＩＩ－Ｄが特徴付けられている。一部の実施態様では、ＩＩＩ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ６、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃａｓ７（Ｃｓｍ３）、Ｃａｓ５（Ｃｓｍ４）、Ｃａｓ７（Ｃｓｍ５）、およびＣｓｍ６ポリペプチドを含む。一部の実施態様では、ＩＩＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ７（Ｃｍｒ１）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ５（Ｃｍｒ３）、Ｃａｓ７（Ｃｍｒ４）、Ｃｍｒ５、Ｃａｓ６、およびＣａｓ７（Ｃｍｒ６）ポリペプチドを含む。一部の実施態様では、ＩＩＩ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ７（Ｃｍｒ１）、Ｃａｓ７（Ｃｍｒ６）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ７（Ｃｍｒ４）、Ｃｍｒ５およびＣａｓ５（Ｃｍｒ３）、ポリペプチドを含む。一部の実施態様では、ＩＩＩ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ７（Ｃｓｍ３）、Ｃａｓ５（Ｃｓ×１０）、Ｃｓｍ２、Ｃａｓ７（Ｃｓｍ３）、およびａｌｌ１４７３ポリペプチドを含む。
一部の実施態様では、本発明のファスミドは、ＩＶ型ｃｒＲＮＡに加えて、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含んでよい。ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃｓｆ４ポリペプチド（ｄｉｎＧ）および／またはＣｓｆ１、Ｃａｓ７（Ｃｓｆ２）および／またはＣａｓ５（ｃｓｆ３）ポリペプチドを含むことができる（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １３：７２２－７３６（２０１５））。
一部の実施態様では、本発明のファスミドは、Ｖ型ｃｒＲＮＡに加えて、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをさらに含む。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃｐｆ１ポリペプチドおよび／またはＣａｓ１、Ｃａｓ２および／またはＣａｓ４ポリペプチドを含むことができる（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １３：７２２－７３６（２０１５））。
本発明のヌクレオチド配列の「フラグメント」または「部分」は、参照核酸またはヌクレオチド配列に対して縮小された長さのヌクレオチド配列を意味すると理解され（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれよりも多くのヌクレオチドが縮小される）、参照核酸またはヌクレオチド配列と同一または実質的に同一（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一）の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、および／またはからなる。本発明に係るそのような核酸フラグメントまたは部分は、適切な場合、それが構成成分である、より大きなポリヌクレオチド内に含まれてよい。したがって、例えば、標的ＤＮＡ（例えば、ゲノム内の標的領域）の少なくとも一部にハイブリダイズすること（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）（または、ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ）、および、それらの他の文法的変形）は、標的ＤＮＡの連続したヌクレオチドの長さと同一または実質的に同一であるヌクレオチド配列に対するハイブリダイゼーションを指す。一部の実施態様では、リピートスペーサー配列またはリピート－スペーサー－リピート配列のリピートは、野生型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のリピート配列または合成のＣＲＩＳＰＲアレイのリピート配列のフラグメントを含むことができ、ここで、リピートのフラグメントは、ｔｒａｃｒ核酸とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲアレイにおけるリピートの機能を維持する。
一部の実施態様では、本発明は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３’、Ｃａｓ３’’、またはＣｐｆ１ヌクレアーゼの機能性フラグメントを含んでよい。Ｃａｓ９機能性フラグメントは、制限されないが、ＨＮＨヌクレアーゼ活性、ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＰＡＭ認識および結合活性を含む、ネイティブのＣａｓ９ヌクレアーゼの活性の１つまたは複数を維持する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの機能性フラグメントは、Ｃａｓ９ポリヌクレオチドのフラグメントによってコードされてよい。Ｃａｓ３、Ｃａｓ３’またはＣａｓ３’’機能性フラグメントは、制限されないが、ニッカーゼ活性、エキソヌクレアーゼ活性、ＤＮＡ結合、および／またはＲＮＡ結合を含む、ネイティブのＣａｓ９ヌクレアーゼの活性の１つまたは複数を維持する。Ｃａｓ３、Ｃａｓ３’またはＣａｓ３’’ヌクレアーゼの機能性フラグメントは、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３’またはＣａｓ３’’ポリヌクレオチドのフラグメントによって、それぞれコードされてよい。
本明細書において用いられる用語「遺伝子」は、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、抗－マイクロＲＮＡアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＡＭＯ）などを生産するために用いることが可能な核酸分子を指す。遺伝子は、機能性タンパク質または遺伝子産物を生産するための用いることが可能であってよく、または可能でなくてよい。遺伝子は、コードおよび非コード領域の両方（例えば、イントロン、調節エレメント、プロモーター、エンハンサー、終結配列および／または５’および３’非翻訳領域）を含むことができる。遺伝子は、「単離」されてよく、それによって、その天然の状態で核酸と関連して通常見られる構成要素から実質的または本質的にフリーである核酸が意味される。そのような構成要素は、他の細胞物質、組み換え生産による培養培地、および／または、核酸の化学合成で用いられる様々な化学物質を含む。
本明細書において用いられる用語「ゲノム」は、生物の染色体／核ゲノムならびに任意のミトコンドリアおよび／またはプラスミドゲノムを含む。
本明細書において用いられる「ヘアピン配列」は、ヘアピンを含むヌクレオチド配列（例えば、１つまたは複数のヘアピン構造を形成するもの）である。ヘアピン（例えば、ステムループ、フォールドバック）は、一本鎖領域によっていずれか側にさらに隣接される二本鎖を形成する相補ヌクレオチドの領域を含む二次構造を有する核酸分子を指す。そのような構造は、当技術分野でよく知られている。当技術分野で知られているように、二本鎖領域は、塩基対合内にいくつかのミスマッチを含むことができ、または、完全に相補であることができる。本開示の一部の実施態様では、核酸構築物のヘアピン配列は、ｔｒａｃｒ核酸の３’末端に位置することができる。
「異種」または「組み換え」ヌクレオチド配列は、それが導入される宿主細胞と天然に関連しないヌクレオチド配列であり、非天然起源の、多コピーの天然起源ヌクレオチド配列を含む。
相同性を有する異なる核酸またはタンパク質は、本明細書において「相同体」と呼ぶ。相同体という用語は、同一および他の種由来の相同配列および同一および他の種由来のオルソロガス配列を含む。「相同性」は、位置同一性（すなわち配列類似性または同一性）のパーセントの観点からの、２以上の核酸および／またはアミノ酸配列の間の類似性のレベルを指す。また、相同性は、異なる核酸またはタンパク質間の類似の機能特性の概念を指す。したがって、本発明の組成物および方法は、本発明のヌクレオチド配列およびポリペプチド配列に対する相同体をさらに含む。本明細書において用いられる「オルソロガス」は、種分化の間に共通の祖先遺伝子から生じる異なる種における相同ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列を指す。本発明のヌクレオチド配列の相同体は、本発明の前記ヌクレオチド配列と実質的な配列同一性（例えば、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％）を有する。したがって、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、またはＶ型ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同体は、任意の公知または後に同定されるＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、またはＶ型ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれか１つと、約７０％相同またはそれよりも高くてよい。
本明細書において用いられる、ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）、ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）、およびそれらの文法的変形は、２つの完全に相補のヌクレオチド配列またはいくつかのミスマッチの塩基対が存在してよい実質的に相補の配列の結合を指す。ハイブリダイゼーションの条件は当該分野でよく知られていて、ヌクレオチド配列の長さおよびヌクレオチド配列間の相補性の程度に基づき変化する。一部の実施態様では、ハイブリダイゼーションの条件は、高ストリンジェンシーであってよく、または、それらは、ハイブリダイズされる配列の長さおよび相補性の量に応じて、中ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシーであってよい。ヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションの目的に関して低、中および高ストリンジェンシーを構成する条件は、当該分野でよく知られている（例えば、Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９：Ｅ２５７９－Ｅ２５８６；Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．４ｔｈ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照）。
本明細書において用いられる用語「増大する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「増大する（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」、「増大した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」「増強した（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」「増強する（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」および「増強（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」（およびそれらの文法的変形）は、コントロールと比べて、少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれよりも高い上昇を表す。
「ネイティブ」または「野生型」の核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、天然起源または内因性の核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたはアミノ酸配列を指す。したがって、例えば、「野生型ｍＲＮＡ」は、生物において天然起源または内因性であるｍＲＮＡである。「相同」核酸配列は、それが導入される宿主細胞と天然に関連するヌクレオチド配列である。
また、本明細書において用いられる用語「核酸」、「核酸分子」、「核酸構築物」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド」は、直鎖または分岐の一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡ、またはそれらのハイブリッドを指す。また、用語は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドも包含する。ｄｓＲＮＡが合成的に生産される場合は、一般的でない塩基、例えば、イノシン、５－メチルシトシン、６－メチルアデニン、ヒポキサンチンおよびその他もまた、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ、およびリボザイム対合に用いることができる。例えば、シチジンおよびウリジンのＣ－５プロピンアナログを含むポリヌクレオチドは、高アフィニティでＲＮＡと結合し、遺伝子発現の強力なアンチセンス阻害剤となることが示されている。他の修飾、例えば、ホスホジエステル主鎖、またはＲＮＡのリボース糖基内の２’－ヒドロキシに対する修飾もすることができる。本開示の核酸構築物は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよいが、好ましくはＤＮＡである。したがって、本発明の核酸構築物は、ＤＮＡの形態で記載され用いられ得るが、使用目的に応じて、ＲＮＡの形態で記載され用いられてもよい。
明細書において用いられる用語「ヌクレオチド配列」は、ヌクレオチドのヘテロポリマーまたは核酸分子の５’から３’末端のこれらのヌクレオチドの配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含み、ｃＤＮＡ、ＤＮＡフラグメントまたは部分、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば化学合成）ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡを含み、そのいずれかは一本鎖または二本鎖であってよい。用語「ヌクレオチド配列」「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において交換可能に用いられて、ヌクレオチドのヘテロポリマーも指す。別段の指示がされる場合を除き、本明細書において提供される核酸分子および／またはヌクレオチド配列は、本明細書において、５’から３’の方向で左から右に示され、米国の配列規則（連邦規則法典第３７巻セクション１．８２１～１．８２５）および世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５に示されるヌクレオチド記号を表すための標準的なコードを用いて表される。
本明細書において用いられる用語「パーセント配列同一性」または「パーセント同一性」は、２つの配列が最適に並べられた場合の、試験（「対象」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）と比較した、参照（「クエリー」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）の直鎖ポリヌクレオチド配列内の同一のヌクレオチドのパーセンテージを指す。一部の実施態様では、「パーセント同一性」は、アミノ酸配列内の同一のアミノ酸のパーセンテージを指し得る。
「プロトスペーサー配列」は、標的二本鎖ＤＮＡを指し、具体的には、ＣＲＩＳＰＲリピート－スペーサー配列、ＣＲＩＳＰＲリピート－スペーサー－リピート配列、および／またはＣＲＩＳＰＲアレイの、スペーサー配列と完全または実質的に相補（およびハイブリダイズする）標的ＤＮＡ（例えば、または、ゲノム内の標的領域）の部分を指す。
本明細書において用いられる用語「縮小する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「縮小された（ｒｅｄｕｃｅｄ）」、「縮小する（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」、「縮小（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」、「減少する（ｄｉｍｉｎｉｓｈ）」、「抑制する（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）」、および、「低減する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」（およびそれらの文法的変形）は、例えば、コントロールと比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の低減を説明する。特定の実施態様では、縮小は、測定される構成要素（例えば、ゲノムサイズまたは細胞の集団）の検出可能な活性または量をもたらさなくてよく、または本質的にもたらさなくてよい（すなわち、ほんのわずかな量、例えば、約１０％未満または実に５％）。したがって、例えば、縮小されたゲノムサイズは、コントロールと比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％のゲノムのサイズの縮小を意味することができる。
本明細書において用いられるコントロールは、例えば、本発明の異種核酸構築物によって形質転換されていない、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団であってよい。一部の実施態様では、コントロールは、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の野生型集団であってよく、または、リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種構築物によって形質転換された細菌、古細菌または酵母細胞の集団であってよく、ここで、スペーサーは、前記集団の細菌、古細菌または酵母細胞のゲノム内の標的領域に相補でないヌクレオチド配列を含む（すなわち、非自己標的化／「スクランブルスペーサー」）。さらなる態様では、コントロールは、例えば、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の野生型集団、または、リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種構築物によって形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団であってよく、ここで、スペーサーは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して配置されない前記集団の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補であるヌクレオチド配列を含む。
本明細書において用いられる「リピート配列」は、例えば、野生型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の任意のリピート配列、または、「スペーサー配列」によって分離された合成のＣＲＩＳＰＲアレイのリピート配列（例えば、本発明のリピート－スペーサー配列またはリピート－スペーサー－リピート配列）を指す。本発明で有用なリピート配列は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の任意の公知または後に同定されるリピート配列であってよい。したがって、一部の実施態様では、リピート－スペーサー配列またはリピート－スペーサー－リピートは、野生型ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイ由来のリピートと実質的に同一の、（例えば、少なくとも約７０％同一（例えば、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い））リピートを含む。一部の実施態様では、リピート配列は、野生型Ｉ型ＣＲＩＳＰＲアレイ、野生型ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイ、野生型ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイ、野生型ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲアレイ、または野生型Ｖ型ＣＲＩＳＰＲアレイ由来のリピートと１００％同一である。さらなる実施態様では、本発明で有用なリピート配列は、Ｉ型ｃｒＲＮＡ、ＩＩ型ｃｒＲＮＡ、ＩＩＩ型ｃｒＲＮＡ、ＩＶ型ｃｒＲＮＡ、またはＶ型ｃｒＲＮＡのいずれかのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座または合成のＣＲＩＳＰＲアレイのリピート配列の連続したヌクレオチドのフラグメントまたは一部である部分的リピートを含むヌクレオチド配列を含むことができる。
本明細書において用いられる、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの「ＣＲＩＳＰＲアレイ」は、５’から３’に、リピート－スペーサー－リピート配列を含む、または、５’から３’に、少なくとも１つのリピート－スペーサー配列（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のリピート－スペーサー配列、およびその中の任意の範囲または値）を含む、核酸構築物を指す。１つよりも多いリピート－スペーサーがＣＲＩＳＰＲアレイに含まれる場合は、前の（５’から３’）リピート－スペーサー配列のスペーサーは、後のリピート－スペーサーのリピートに連結することができる（例えば、第一のリピート－スペーサー配列のスペーサーは、第二のリピート－スペーサー配列のリピートに連結される）。一部の実施態様では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、スペーサーによって分離された２つのリピート（または２つの部分的リピート）（例えば、リピート－スペーサー－リピート配列）を含むことができる。
本明細書において用いられる「配列同一性」は、２つの最適に並べられたポリヌクレオチドまたはペプチド配列が、構成要素（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）のアライメントのウインドウ全体で不変である程度を指す。「同一性」は、制限されないが：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ （Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載のものを含む公知の方法により、容易に計算することができる。
本明細書において用いられる「スペーサー配列」は、標的ＤＮＡ（すなわち、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接するゲノム内の標的領域または「プロトスペーサー配列」）に相補のヌクレオチド配列である。スペーサー配列は、標的ＤＮＡと完全に相補または実質的に相補であることができる（例えば、少なくとも約７０％相補（例えば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い））。代表的な実施態様では、スペーサー配列は、標的ＤＮＡと１００％相補性を有する。さらなる実施態様では、標的ＤＮＡに対するスペーサー配列の３’領域の相補性は、１００％であるが、スペーサーの５’領域では１００％未満であり、したがって、標的ＤＮＡに対するスペーサー配列の全体的な相補性は１００％未満である。したがって、例えば、２０個のヌクレオチドスペーサー配列の３’領域における最初の７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個などのヌクレオチド（シード配列）は、標的ＤＮＡと１００％相補であることができるが、一方で、スペーサー配列の５’領域における残りのヌクレオチドは、標的ＤＮＡと実質的に相補（例えば、少なくとも約７０％相補）である。一部の実施態様では、スペーサー配列の最初の７～１２個のヌクレオチドは、標的ＤＮＡと１００％相補であることができるが、一方で、スペーサー配列の５’領域における残りのヌクレオチドは、標的ＤＮＡと実質的に相補（例えば、少なくとも約７０％相補）である。他の実施態様では、スペーサー配列の最初の７～１０個のヌクレオチドは、標的ＤＮＡと１００％相補であることができるが、一方で、スペーサー配列の５’領域における残りのヌクレオチドは、標的ＤＮＡと実質的に相補（例えば、少なくとも約７０％相補）である。代表的な実施態様では、スペーサー配列の最初の７個のヌクレオチド（シード内）は、標的ＤＮＡと１００％相補であることができるが、一方で、スペーサー配列の５’領域における残りのヌクレオチドは、標的ＤＮＡと実質的に相補（例えば、少なくとも約７０％相補）である。
本明細書において用いられる、「標的ＤＮＡ」、「標的領域」、または、「ゲノム内の標的領域」は、リピート－スペーサー配列またはリピート－スペーサー－リピート配列内のスペーサー配列と、完全に相補または実質的に相補の（例えば、少なくとも７０％相補の（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い））、生物のゲノムの領域を指す。一部の実施態様では、標的領域は、生物のゲノムにおいて、ＰＡＭ配列（標的領域のすぐ３’に配置されたＰＡＭ配列）にすぐ隣接して配置された、約１０～約４０個の連続した長さのヌクレオチドであってよい（例えば、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムおよびＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）。一部の実施態様では、例えばＩ型システムでは、ＰＡＭは、プロトスペーサーの片側にある（５’末端）。ＩＩＩ型システムについて公知のＰＡＭは存在しない。Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．は、ＣＲＩＳＰＲシステムの全てのクラス、タイプおよびサブタイプに関する命名法を記載する（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １３：７２２－７３６（２０１５））。ガイド構造およびＰＡＭは、Ｒ．Ｂａｒｒａｎｇｏｕ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１６：２４７（２０１５））に記載される。
一部の実施態様では、本発明で有用な標的領域は、必須遺伝子または非必須遺伝子内に配置される。
代表的な実施態様では、標的領域は、無作為に選択することができ、または、特異的に選択することができる。一部の実施態様では、無作為に選択される標的領域は、細菌、古細菌、藻類または酵母ゲノム内において、ＰＡＭ配列にすぐ隣接して配置された、任意の少なくとも１０個の連続したヌクレオチド（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個など、およびその中の任意の範囲または値）から選択してよい。一部の実施態様では、標的領域は、細菌、古細菌、藻類または酵母ゲノムにおいて、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列にすぐ隣接して配置された、約１０～約２０個の連続したヌクレオチド、約１０～約３０個の連続したヌクレオチド、および／または、約１０～約４０個の連続したヌクレオチドなど、または、その中の任意の範囲または値であることができる。一部の実施態様では、標的領域を特異的に選択するステップは、前記の１つまたは複数の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノムにおいて、互いから、約１００個の全てのヌクレオチド～約１０００個の全てのヌクレオチド、約１００個の全てのヌクレオチド～約２０００個全て、約１００個の全てのヌクレオチド～約３０００個全て、約１００個の全てのヌクレオチド～約４０００個全て、および／または、約１００個の全てのヌクレオチド～約５０００個の全てのヌクレオチドなどに配置された２以上の標的領域を選択するステップを含むことができる。特定の実施態様では、標的領域を特異的に選択するステップは、細菌、古細菌、藻類または酵母ゲノムにおいて、ＰＡＭ配列にすぐ隣接する少なくとも約１０～約４０個の連続したヌクレオチドを含む、遺伝子、オープンリーディングフレーム、推定のオープンリーディングフレームまたは遺伝子間領域から、標的領域を特異的に選択するステップを含む。
本明細書において用いられる「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸」または「ｔｒａｃｒ核酸」は、任意のｔｒａｃｒ ＲＮＡ（またはそのコードＤＮＡ）を指す。ｔｒａｃｒ核酸は、５’から３’に、下側ステム、上側ステム、バルジ、ネクサスヘアピンおよび末端ヘアピンを含む（Ｂｒｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ．５６（２）：３３３－３３９を参照）。トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸は、成熟または未熟ｃｒＲＮＡのリピート部分へのハイブリダイズにおいて機能し、Ｃａｓ９タンパク質を標的部位に動員し、そして、構造的再配置を誘導することによってＣａｓ９の触媒活性を促進し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ分子の機能性成分は上記に挙げられる。ｔｒａｃｒＲＮＡに関する配列は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに特有であり、可変であってよい。公知または後に同定される任意のｔｒａｃｒ核酸を、本発明で用いることができる。
本明細書において用いられる、２つの核酸分子、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列の関連における語句「実質的に同一」または「実質的な同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて測定して、または目視検査により、最大一致に関して比較およびアライメントした場合、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する２以上の配列またはサブシーケンスを指す。本発明の一部の実施態様では、実質的な同一性は、少なくとも約５０残基～約１５０残基の長さである配列の領域にわたって存在する。したがって、本発明の一部の実施態様では、実質的な同一性は、少なくとも約３～約１５（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５残基の長さなど、またはその中の任意の値または任意の範囲）、少なくとも約５～約３０、少なくとも約１０～約３０、少なくとも約１６～約３０、少なくとも約１８～少なくとも約２５、少なくとも約１８、少なくとも約２２、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、またはそれよりも多くの残基の長さ、および、その中の任意の範囲である配列の領域にわたって存在する。代表的な実施態様では、配列は、少なくとも約２２個のヌクレオチドにわたって実質的に同一であることができる。一部の特定の実施態様では、配列は、少なくとも約１５０個の残基にわたって実質的に同一である。一部の実施態様では、本発明の配列は、少なくとも約１６個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチドにわたって約７０％～約１００％同一であることができる。一部の実施態様では、本発明の配列は、少なくとも約１６個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチドにわたって約７５％～約１００％同一であることができる。さらなる実施態様では、本発明の配列は、少なくとも約１６個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチドにわたって約８０％～約１００％同一であることができる。さらなる実施態様では、本発明の配列は、少なくとも約７個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチドにわたって約８０％～約１００％同一であることができる。一部の実施態様では、本発明の配列は、少なくとも約１８個のヌクレオチドにわたって約７０％同一であることができる。他の実施態様では、配列は、約２２個のヌクレオチドにわたって約８５％同一であることができる。さらに他の実施態様では、配列は、約１６個のヌクレオチドにわたって１００％同一であることができる。さらなる実施態様では、配列は、コード領域の全長にわたって実質的に同一である。さらに、例示的な実施態様では、実質的に同一のヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、実質的に同一の機能（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒ核酸、リピート配列、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ニッカーゼ、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＰＡＭ認識および結合）、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３’、Ｃａｓ３’’または任意の他のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能または活性）を発揮する。
配列比較のために、典型的に、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列としての役割がある。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列がコンピューターに入力され、必要な場合はサブシーケンス座標が指定されて、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。それから、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する試験配列（単数または複数）のパーセント配列同一性を計算する。
比較ウインドウを並べるための最適な配列アライメントは当業者に広く知られ、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎのローカル相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎの類似性検索方法などのツールにより、および場合により、ＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、および、ＴＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムのコンピューター実施により、行なってよい。試験配列および参照配列のアライメントされたセグメントの「同一性分数」は、２つの並べられた配列が共有する同一の構成要素の数を、参照配列セグメント（すなわち、参照配列全体または参照配列のより小さな規定部分）内の構成要素の全数で割った数である。パーセント配列同一性は、同一性分数に１００をかけて表される。１つまたは複数のポリヌクレオチド配列の比較は、全長ポリヌクレオチド配列またはその一部に対して、または、より長いポリヌクレオチド配列に対して、され得る。本発明の目的に関し、「パーセント同一性」は、翻訳ヌクレオチド配列のためのＢＬＡＳＴＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０およびポリヌクレオチド配列のためのＢＬＡＳＴＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０を用いて決定されてもよい。
ＢＬＡＳＴ解析を行なうためのソフトウェアは、国立生物工学情報センターを通じて一般に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードと並べた場合に、一部の正の値の閾値スコアＴと一致する、または満たす、クエリー配列内の長さＷのショートワードを特定することにより、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を最初に特定するステップを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるためのサーチを始める種として作用する。それから、ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸びる。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（一致する残基のペアに関する恩恵スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に関するペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向でのワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘ低下した場合は停止し、１つまたは複数の負のスコアの残基アライメントの蓄積、またはいずれかの配列が終わりに到達したことに起因して、累積スコアは０以下になる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９）を参照）。
パーセント配列同一性の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３ ５７８７ （１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの評価基準は最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間で一致が偶然に生じる確率の示度を提供する。例えば、参照ヌクレオチド配列に対する試験ヌクレオチド配列の比較における最小和確率が約０．１未満～約０．００１未満である場合に、試験核酸配列は参照配列と類似すると考えられる。したがって、本発明の一部の実施態様では、参照ヌクレオチド配列に対する試験ヌクレオチド配列の比較における最小和確率は、約０．００１未満である。
また、２つのヌクレオチド配列は、２つの配列がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする場合に、実質的に相補であると考えることができる。一部の代表的な実施態様では、実質的に相補であると考えられる２つのヌクレオチド配列は、高ストリンジェントな条件下で、互いにハイブリダイズする。
サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験の関連における、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、異なる環境パラメーターの下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ ｃｈａｐｔｅｒ ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）に見られる。一般に、高ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定のイオン強度およびｐＨでの特異的配列に関する融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。
Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする、（規定のイオン強度およびｐＨでの）温度である。非常にストリンジェントな条件は、特異的なプローブに関するＴｍと等しくなるように選択される。サザンまたはノーザンブロットでのフィルターにおける、１００よりも多い相補残基を有する相補ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、１ｍｇのヘパリンを含む５０％ホルムアミド（４２℃）であり、ハイブリダイゼーションは一晩行われる。高ストリンジェントな洗浄条件の例は、０．１ ５Ｍ ＮａＣｌ、７２℃、約１５分である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、０．２×ＳＳＣ洗浄、６５℃、１５分である（ＳＳＣバッファーの説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（以下）を参照）。バックグラウンドのプローブシグナルを除去するために、高ストリンジェンシーな洗浄の前に低ストリンジェンシーな洗浄を行うことが多い。例えば、１００個を超えるヌクレオチドのデュプレックスに関する、中ストリンジェンシーな洗浄の例は、１×ＳＳＣ、４５℃、１５分である。例えば、１００個を超えるヌクレオチドのデュプレックスに関する、低ストリンジェンシーな洗浄の例は、４～６×ＳＳＣ、４０℃、１５分である。短いプローブ（例えば、約１０～５０個のヌクレオチド）に関しては、ストリンジェントな条件は典型的に、約１．０Ｍ未満のＮａイオンの塩濃度、典型的に、約０．０１～１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）（ｐＨ７．０～８．３）を含み、温度は典型的に、少なくとも約３０℃である。また、ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成することができる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、関係のないプローブについて見られるものより２倍の（またはそれより高い）シグナル・ノイズ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしないヌクレオチド配列は、それらがコードするタンパク質が実質的に同一であるならば、依然として実質的に同一である。これは、例えば、遺伝子コードにより許容される最大コドン縮退を用いてヌクレオチド配列のコピーが作られる場合に生じ得る。
以下は、本発明の参照ヌクレオチド配列と実質的に同一である相同ヌクレオチド配列をクローニングするために用いられ得る、ハイブリダイゼーション／洗浄条件のセットの例である。一実施態様では、参照ヌクレオチド配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ（５０℃）中、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄（５０℃）で、「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズする。別の実施態様では、参照ヌクレオチド配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ（５０℃）中、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄（５０℃）で、または、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ（５０℃）中、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄（５０℃）で、「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズする。また、さらなる実施態様では、参照ヌクレオチド配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ（５０℃）中、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄（５０℃）で、または７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ（５０℃）中、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄（６５℃）で、「試験」ヌクレオチド配列とハイブリダイズする。
本発明の任意のヌクレオチド配列および／または異種核酸構築物は、目的の任意の種での発現のためにコドン最適化され得る。コドン最適化は当技術分野で広く知られていて、種特異的なコドン使用頻度を用いたコドン使用バイアスに関するヌクレオチド配列の改変を含む。コドン使用頻度は、目的の種に関して最も高く発現される遺伝子の配列解析に基づいて作られる。ヌクレオチド配列が核内で発現される場合、コドン使用頻度は、目的の種に関して高発現の核遺伝子の配列解析に基づいて作られる。ヌクレオチド配列の改変は、種特有のコドン使用頻度を、天然のポリヌクレオチド配列に存在するコドンと比較することにより決定される。当該分野において理解されるように、ヌクレオチド配列のコドン最適化は、ネイティブのヌクレオチド配列と１００％未満の同一性（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％など）を有するが、依然としてオリジナルのネイティブのヌクレオチド配列によりコードされるものと同一の機能を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を生じさせる。したがって、本発明の代表的な実施態様では、本発明のヌクレオチド配列および／または異種核酸構築物は、特定の目的の種での発現のためにコドン最適化され得る。
一部の実施態様では、本発明の異種または組み換え核酸分子、ヌクレオチド配列および／またはポリペプチドは、「単離される」。「単離された」核酸分子、「単離された」ヌクレオチド配列または「単離された」ポリペプチドは、人の手によりその天然環境から離れて存在し、したがって天然の産物ではない、核酸分子、ヌクレオチド配列またはポリペプチドである。単離された核酸分子、ヌクレオチド配列またはポリペプチドは、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造上の構成要素、またはポリヌクレオチドと関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、少なくとも部分的に切り離された、精製された形態で存在し得る。代表的な実施態様では、単離された核酸分子、単離されたヌクレオチド配列および／または単離されたポリペプチドは、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれよりも高い純度である。
他の実施態様では、単離された核酸分子、ヌクレオチド配列またはポリペプチドは、非天然の環境（例えば組み換え宿主細胞）内に存在し得る。したがって、例えばヌクレオチド配列に関しては、用語「単離された」は、それが天然に生じる染色体および／または細胞から切り離されることを意味する。また、ポリヌクレオチドは、それが天然に生じる染色体および／または細胞から切り離され、それから、それが天然に生じない遺伝的状況、染色体および／または細胞（例えば、異なる宿主細胞、異なる制御配列、および／または天然に見られるのと異なるゲノム内の位置）に挿入される場合もまた、単離される。したがって、異種核酸構築物、ヌクレオチド配列およびそれらのコードされるポリペプチドは、人の手により、それらの天然環境から離れて存在し、したがって、天然の産物ではない点で「単離される」が、一部の実施態様では、組み換え宿主細胞内に導入され存在することができる。
一部の実施態様では、本発明の異種または組み換え核酸構築物は、「合成」である。「合成」の核酸分子、「合成」のヌクレオチド配列または「合成」のポリペプチドは、天然に見られないが人の手によって作られて、したがって、天然の産物ではない、核酸分子、ヌクレオチド配列またはポリペプチドである。
本明細書に記載される任意の実施態様では、本発明のヌクレオチド配列および／または異種核酸構築物は、様々な生物細胞における発現に関する様々なプロモーターおよび他の調節エレメントと作動可能に関連することができる。したがって、代表的な実施態様では、本発明の核酸構築物は、１つまたは複数のヌクレオチド配列に動作可能に連結された１つまたは複数のプロモーターをさらに含むことができる。
本明細書において用いられる「動作可能に連結」または「動作可能に関連」は、示された因子が互いに機能的に関連し、また一般に、物理的にも関連することを意味する。したがって、本明細書において用いられる用語「動作可能に連結」または「動作可能に関連」は、機能的に関連がある単一核酸分子上のヌクレオチド配列を指す。したがって、第二のヌクレオチド配列に動作可能に連結された第一のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列が、第二のヌクレオチド配列と機能的関係で配置される状況を意味する。例えば、プロモーターがヌクレオチド配列の転写または発現を果たす場合に、プロモーターは前記ヌクレオチド配列と動作可能に関連する。当業者は、コントロール配列がその発現を方向付けるように機能する限り、コントロール配列（例えばプロモーター）は、それが動作可能に関連するヌクレオチド配列と隣接している必要はないことを理解するだろう。したがって、例えば、介在する非翻訳でなお転写される配列が、プロモーターとヌクレオチド配列との間に存在してよく、プロモーターは依然としてヌクレオチド配列に「動作可能に連結」していると考えることができる。
「プロモーター」は、プロモーターと動作可能に関連するヌクレオチド配列（すなわち、コード配列）の転写を制御または調節するヌクレオチド配列である。コード配列は、ポリペプチドおよび／または機能性ＲＮＡをコードし得る。典型的に、「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに関する結合部位を含むヌクレオチド配列を指し、転写の開始を管理する。一般に、プロモーターは、５’または対応するコード配列のコード領域のスタートに対して上流に見られる。プロモーター領域は、遺伝子発現のレギュレーターとして作用する他のエレメントを含んでよい。これらは、ＴＡＴＡボックスコンセンサス配列を含み、そして、ＣＡＡＴボックスコンセンサス配列を含むことが多い（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，（１９８１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：３４９）。植物では、ＣＡＡＴボックスはＡＧＧＡボックスで置き換えられ得る（Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｔ．Ｋｏｓｕｇｅ，Ｃ．Ｍｅｒｅｄｉｔｈ ａｎｄ Ａ．Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ（ｅｄｓ．），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．２１１－２２７）。
プロモーターは、異種核酸構築物（すなわち、「キメラ遺伝子」または「キメラポリヌクレオチド」）の調製で用いるための、例えば、構成的、誘導性、時間的に調節された、発生学的に調節された、化学的に調節された、組織－好適および／または組織－特異的なプロモーターを含んでよい。これらの様々なタイプのプロモーターは、当該分野で知られている。
プロモーターの選択は、発現のための時間的および空間的要求に応じて変化し、および、形質転換される宿主細胞にも応じて変化する。多くの異なる生物のためのプロモーターは、当該分野でよく知られている。当該分野に存在する広範囲の知識に基づき、適切なプロモーターを、目的の特定の宿主生物のために選択することができる。したがって、例えば、モデル生物において、高度に構成的に発現された遺伝子の上流のプロモーターについて多くが知られ、そのような知識は、必要に応じて、他のシステムで容易に利用および実施することができる。
一部の実施態様では、本発明の核酸構築物は、「発現カセット」であってよく、または、発現カセット内に構成することができる。本明細書において用いられる「発現カセット」は、目的のヌクレオチド配列（例えば、本発明の核酸構築物（例えば、合成のｔｒａｃｒ核酸構築物、合成のＣＲＩＳＰＲ核酸構築物、合成のＣＲＩＳＰＲアレイ、キメラ核酸構築物；目的のポリペプチド、Ｉ型ポリペプチド、ＩＩ型ポリペプチド、ＩＩＩ型ポリペプチド、ＩＶ型ポリペプチド、および／またはＶ型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列））を含む異種核酸構築物を意味し、ここで、前記ヌクレオチド配列は、少なくとも制御配列（例えばプロモーター）と動作可能に関連する。したがって、本発明の一部の態様は、本発明のヌクレオチド配列を発現するように設計された発現カセットを提供する。
目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであってよく、その構成要素の少なくとも１つは、その他の構成要素の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。また、発現カセットは、天然起源であるが異種発現に有用な組み換え体で得られたものであってもよい。
また、発現カセットは、場合により、選択された宿主細胞内で機能性の転写および／または翻訳終結領域（すなわち終結領域）を含んでもよい。様々な転写終結因子が発現カセットでの使用に利用可能であり、目的の異種ヌクレオチド配列を超えた（ｂｅｙｏｎｄ）転写の終結および正しい（ｃｏｒｒｅｃｔ）ｍＲＮＡのポリアデニル化に関与する。終結領域は、転写開始領域に対してネイティブであり得て、動作可能に連結された目的のヌクレオチド配列に対してネイティブであり得て、宿主細胞に対してネイティブであり得て、または、別の起源に由来し得る（すなわち、プロモーターに対して、目的のヌクレオチド配列に対して、宿主に対して、外因または異種、またはそれらの任意の組み合わせ）。
また、発現カセットは、形質転換された宿主細胞を選択するために用いることのできる選択可能なマーカーに関するヌクレオチド配列を含むこともできる。本明細書において用いられる「選択可能なマーカー」は、発現した場合に、マーカーを発現している宿主細胞に、明白な表現型を与え、したがって、そのマーカーを有さないものからそのような形質転換された細胞が区別されるのを可能にする、ヌクレオチド配列を意味する。そのようなヌクレオチド配列は、マーカーが、化学的手段により、例えば選択剤（例えば抗生物質など）を用いることにより、選択することのできる形質を与えるかどうか、または、マーカーが単に、例えばスクリーニング（例えば蛍光）による観察または試験を介して同定され得る形質であるかどうかに応じて、選択可能なマーカーまたはスクリーニング可能なマーカーのいずれかをコードし得る。もちろん、適切な選択可能なマーカーの多くの例が当該分野で知られていて、本明細書に記載の発現カセットにおいて用いることができる。
発現カセットに加えて、本明細書に記載の核酸分子およびヌクレオチド配列は、ベクターとの関連で用いることができる。用語「ベクター」は、核酸（単数）（または核酸（複数））を細胞に移行、送達または導入するための構成物を指す。ベクターは、移行、送達または導入されるヌクレオチド配列（単数または複数）を含む核酸分子を含む。宿主生物の形質転換での使用のためのベクターは、当該分野でよく知られている。ベクターの全般的なクラスの非限定的な例は、限定されないが、二本鎖または一本鎖の直鎖または環状型の、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、バクテリオファージ、人工染色体、またはアグロバクテリウムバイナリーベクターを含み、自己で伝染または動員が可能であってよく、または不可能であってよい。本明細書に定義されるベクターは、細胞ゲノムへの組込みにより原核生物または真核生物宿主を形質転換することができ、または、染色体外に存在することができる（例えば複製起点を有する自己複製プラスミド）。天然にまたは設計により、放線菌および関連種、細菌および真核生物（例えば、より高度の植物、哺乳類、酵母または真菌細胞）から選択され得る２つの異なる宿主生物での複製が可能であるＤＮＡビヒクルを意味する、シャトルベクターがさらに含まれる。一部の代表的な実施態様では、ベクター内の核酸は、宿主細胞での転写のための適切なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下であり、作動可能に連結されている。ベクターは、複数の宿主内で機能する二機能性発現ベクターであり得る。ゲノムＤＮＡの場合は、これは、それ自身のプロモーターまたは他の調節エレメントを含み得て、ｃＤＮＡの場合は、これは、宿主細胞での発現のための適切なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下であり得る。したがって、本発明の核酸分子、および／または、発現カセットは、本明細書に記載され、当該分野で知られているように、ベクター内に含まれ得る。
目的のポリヌクレオチドの関連における、「導入する（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ）」、「導入する（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ）」、「導入した（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ）」（およびその文法的変形）は、目的のポリヌクレオチドを、宿主生物または前記生物の細胞（例えば、宿主細胞）に、ポリヌクレオチドが細胞内部へのアクセスを獲得する様式で、提供することを意味する。１よりも多いポリヌクレオチドが導入される場合は、これらのポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチドまたは核酸構築物の一部として、または、別個のポリヌクレオチドまたは核酸構築物として集めることができ、そして、同一または異なる発現構築物または形質転換ベクター上に配置することができる。
したがって、これらのポリヌクレオチドは、単一の形質転換イベントで、別個の形質転換／トランスフェクションイベントで、細胞に導入することができ、または、例えば、それらは、従来の繁殖プロトコルによって生物に組み込むことができる。したがって、一部の態様では、本発明の１つまたは複数の核酸構築物は、単一または組み合わせで、宿主生物または前記宿主生物の細胞に導入することができる。細胞の集団の関連における「導入する」は、集団を、本発明の異種核酸構築物と、本発明の異種核酸構築物が集団の１つまたは複数の細胞の内部へのアクセスを獲得する条件下で接触させて、それにより、集団の前記の１つまたは複数の細胞を形質転換することを意味する。
本明細書において用いられる用語「形質転換」または「トランスフェクション」は、細胞への異種核酸の導入を指す。細胞の形質転換は、安定的または一過的であってよい。したがって、一部の実施態様では、宿主細胞または宿主生物は、本発明の核酸構築物によって安定的に形質転換される。他の実施態様では、宿主細胞または宿主生物は、本発明の核酸構築物によって一過的に形質転換される。したがって、代表的な実施態様では、本発明の異種核酸構築物は、安定的および／または一過的に細胞に導入することができる。
ポリヌクレオチドの関連における「一過的な形質転換」は、ポリヌクレオチドが細胞に導入されて、細胞のゲノム中に組込まれないことを意味する。
ポリヌクレオチドの関連における「安定的に導入する」または「安定的に導入される」は、導入されたポリヌクレオチドが、細胞のゲノム中に安定的に組み込まれて、したがって、細胞が、ポリヌクレオチドによって安定的に形質転換されることを意味する。
本明細書において用いられる「安定した形質転換」または「安定的に形質転換された」は、核酸構築物が細胞内に導入されて、細胞のゲノム内に組み込まれることを意味する。したがって、組み込まれた核酸構築物は、その子孫により、より具体的には、複数の後に続く世代の子孫により、受け継がれることが可能である。本明細書において用いられる「ゲノム」は、核、ミトコンドリアおよびプラスチドゲノムを含み、したがって、例えばプラスミドまたはミトコンドリアゲノムへの核酸構築物の組込みを含んでよい。また、本明細書において用いられる安定した形質転換は、染色体外に例えばミニ染色体またはプラスミドとして維持される導入遺伝子も指し得る。
一過的な形質転換は、生物内に導入された１つまたは複数の導入遺伝子によりコードされるペプチドまたはポリペプチドの存在を検出することのできる、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはウエスタンブロットなどにより、検出され得る。細胞の安定した形質転換は、生物（例えば、細菌、古細菌、酵母、藻類など）に導入された導入遺伝子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を用いた、細胞のゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションアッセイなどにより、検出することができる。細胞の安定した形質転換は、植物または他の生物に導入された導入遺伝子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を用いた、細胞のＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーションアッセイなどにより、検出することができる。また、細胞の安定した形質転換は、例えば、導入遺伝子の標的配列（単数または複数）とハイブリダイズする特異的なプライマー配列を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当技術分野でよく知られている他の増幅反応により検出することもでき、導入遺伝子配列の増幅をもたらし、標準的な方法に従って検出することができる。また、形質転換は、当技術分野でよく知られているダイレクトシーケンスおよび／またはハイブリダイゼーションのプロトコルにより検出することもできる。
したがって、一部の実施態様では、ヌクレオチド配列、構築物、発現カセットは、一過的に発現することができ、および／または、それらは宿主生物のゲノム内に安定的に取り込まれ得る。
本発明の異種核酸構築物は、当業者に公知の任意の方法によって細胞中に導入することができる。本発明の一部の実施態様では、細胞の形質転換は、核の形質転換を含む。また、さらなる実施態様では、本発明の異種核酸構築物（単数または複数）は、従来の繁殖技術を介して細胞中に導入することができる。
真核生物および原核生物は両方とも、形質転換の手順は広く知られていて当該分野においてルーチンであり、文献全体を通して記載される（例えば、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３－２３９；Ｒａｎｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ８：２２８１－２３０８（２０１３）を参照）。
したがって、ヌクレオチド配列は、当該分野でよく知られている任意の数の方法で、宿主生物またはその細胞に導入することができる。本発明の方法は、それらが生物の少なくとも１つの細胞の内部に接近しさえすれば、１つまたは複数のヌクレオチド配列が生物内に導入されるための特定の方法に依存しない。１個よりも多いヌクレオチド配列が導入される場合は、それらは、単一の核酸構築物の一部として、または別個の核酸構築物として、集まることができ、同一または異なる核酸構築物上に位置することができる。したがって、ヌクレオチド配列は、単一の形質転換イベントで、または別個の形質転換イベントで、目的の細胞内に導入することができ、あるいは、関連する場合は、ヌクレオチド配列は、繁殖プロトコルの一部として生物内に取り込むことができる。
可動遺伝要素（ＭＧＥ）は、ゲノムの安定性に対する連続的なチャレンジを細菌に与えて、遺伝子水平伝播を通した進化を促進させる。用語ＭＧＥは、プラスミド、バクテリオファージ、転位性エレメント、ゲノムアイランド、および多くの他の特別な遺伝因子を包含する（１）。ＭＧＥは、高率の普及（ｈｉｇｈ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ）、宿主に対する適応性の利点、および、ゲノムの安定性を与える遺伝子を包含し、細菌ゲノムにおけるそれらのほぼ普遍的な存在をもたらす。捕食性のバクテリオファージおよび利己的な遺伝因子の永続的な脅威に立ち向かうために、細菌は、外因的な遺伝因子を標的化する先天性および適応性の両方の免疫系を進化させている。先天性の免疫は、細胞壁改変、制限／改変システム、および、未発達のファージ感染を含む（２）。Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子（Ｃａｓ）は、細菌における侵襲性遺伝因子に対して標的化された、適応性の免疫系である（３）。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓが仲介する免疫は、獲得（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）、発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、および干渉（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）として分類される別個の分子プロセスに依拠する（３）。獲得は、外来遺伝因子の分子「サンプリング」を介して生じて、そこからスペーサーと呼ばれる短い配列が、二極化された様式でＣＲＩＳＰＲアレイ中に組み込まれる（４）。ＣＲＩＳＰＲアレイの発現は構成的であり、その前のリーダー配列内のプロモーターエレメントによって誘導可能である（５～６）。干渉は、それぞれのリピート配列において選択的に処理される対応する転写から生じて、スペーサーに相補の標的ＤＮＡの配列特異的な認識および切断のためにＣａｓタンパク質をガイドするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を形成する（７）。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ技術は、株のタイピングおよび検出（８～１０）、可動遺伝要素に対する天然／操作された免疫性の開発（１１）、多様なバックグラウンドにおける、プログラム可能なゲノム編集（１２）、転写制御（１３～１４）、および、規定されたコンソーシアム内の微生物集団の操作（１５）での適用を有する。
様々なＣＲＩＳＰＲシステムが当技術分野で知られている。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．を参照し、それは、ＣＲＩＳＰＲすステムの全てのクラス、タイプおよびサブタイプに関する命名法を記載する（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１３：７２２－７３６（２０１５））；Ｒ．Ｂａｒｒａｎｇｏｕ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１６：２４７（２０１５）も参照）。
ＣＲＩＳＰＲアレイに対応する配列特徴が多くの生物で以前に記載されたが（１６～１７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは、特定のｃａｓ遺伝子およびＣＲＩＳＰＲアレイ構成要素の役割が解明された最初の微生物だった（４）。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは、ヨーグルトおよび様々なチーズの栄養共生的な（ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃ）生産においてラクトースを乳酸に異化するスターター培養として用いられる非病原の好熱性グラム陽性細菌である（１８）。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは、４つまでのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードし、それらのうちの２つ（ＳｔｈＣＲＩＳＰＲ１およびＳｔｈＣＲＩＳＰＲ３）は、獲得および干渉の両方において先天的に活性であるＩＩ－Ａ型システムとして分類される（４、１９）。したがって、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびそのバクテリオファージのゲノム解析は、ファージ／ＤＮＡ保護に関するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと同様のメカニズムを確立した。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの研究は、スペーサー起源の生物情報学的分析（４、２０）、プロト－スペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の発見（１９；２１）、ファージ－宿主動態の理解（２２～２３）、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ活性の証明（７、２４～２５）、および、最近になって、ＩＩ型システムのｔｒａｃｒＲＮＡ構造モチーフ管理機能および直交性の決定（２６）をもたらした。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノム解析は、炭水化物異化作用の喪失を通したミルクに対する進化的適応および病原性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに見られる病原性遺伝子を明らかにした（１８）。また、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは、例えば、低温ショックタンパク質、銅耐性タンパク質、プロテイナーゼ、バクテリオシン、およびラクトース異化作用タンパク質をコードするものを含むニッチ関連遺伝子の重大な獲得を受けた（１８）。挿入配列（ＩＳ）は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムにおいて高度に普及していて、そして、乳製品適応遺伝子と関連するアイランドの普及を促進することによって、株間の遺伝的異質性に寄与する（１８）。付随する、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおける機能性ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムおよびＭＧＥの存在は、ゲノムホメオスタシスが、これらの動的外力の相互作用によって少なくとも一部管理されることを示唆する。したがって、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは、ゲノムアイランドのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ標的化の遺伝的成果を研究するための理想的な宿主を構成する。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、最近になって、ゲノム編集の適用において熱烈な研究対象となっているが（１２）、最も内因性の微生物システムの進化的役割は未知のままである（２７）。外来ＤＮＡ取り込みの防止を超えて（ｂｅｙｏｎｄ）活性のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをハウジングする進化的成果（７）、スペーサー獲得イベント（４）、および、染色体の自己標的化に起因する突然変異（２８～３２）に関してさえ、ほとんど知られていない。したがって、本発明者らは、内因性ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いて、組み込まれたＭＧＥを標的化する成果を決定することを追求した。４つのアイランドがＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９において同定されて、長さは８～１０２ｋｂｐの範囲であり、合計およそ１３２ｋｂｐであり、またはゲノムの７％であった。ゲノムアイランドを標的化するために、自己標的化スペーサーを有する操作されたＣＲＩＳＰＲアレイの、プラスミドに基づく発現を、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９に形質転換した。まとめると、我々の結果は、自己標的化イベントの基礎的な遺伝的成果を解明し、そして、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが、細菌集団レベルで、ゲノム進化を指示することができることを示す。
これらの知見を利用して、本発明者らは、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団を、必須遺伝子、非必須遺伝子、および／または消費されてよい（ｅｘｐｅｎｄｉｂｌｅ）ゲノムアイランドに関してスクリーニングするための；細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団内の１つまたは複数の細胞を死滅させるための；細菌、古細菌、藻類または酵母遺伝子の表現型を特定するための；細菌、古細菌または酵母細胞の集団から、縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞を選択するための；および／または、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団において、そのゲノム内に突然変異（例えば、欠失）を有する少なくとも１つの単離物を同定するための、新規の方法を開発した。
したがって、一態様では、本発明者らは、標的化を免れる能力をそれらに与える変更された遺伝的内容を有する集団における遺伝的変異を特定するための方法を開発した。ここで、標的配列は改変されていて、その改変を有する残存物を探す（ｏｎｅ ｌｏｏｋｓ ｆｏｒ ｓｕｒｖｉｖｏｒｓ ｔｈａｔ ｈａｖｅ ｔｈａｔ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）。一部の態様では、改変（すなわち、突然変異）は、欠失である。さらに、標的配列が改変されている場合、その結果、野生型遺伝子型は必須ではない。
したがって、本発明の一態様では、必須遺伝子、非必須遺伝子、および／または消費されてよいゲノムアイランドに関して、細菌細胞の集団をスクリーニングする方法が提供され：細菌細胞の前記集団に、（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物を導入するステップ（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列のスペーサーは、前記集団の細菌細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、それにより、形質転換された細菌細胞の集団を生産する）；および、形質転換された細菌細胞の集団における欠失の存在または不存在を判定するステップを含む（ここで、形質転換された細菌細胞の集団における欠失の存在は、標的領域が、非必須遺伝子および／または消費されてよいゲノムアイランド内に含まれることを示し、集団における欠失の不存在は、標的領域が必須遺伝子内に含まれることを意味する）。本発明で有用なＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型またはＶ型ＣＲＩＳＰＲアレイであり得る。
さらなる態様では、本発明は、必須遺伝子、非必須遺伝子、および／または消費されてよいゲノムアイランドに関して、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団をスクリーニングする方法を提供し、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団に：（ａ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物、（ｂ）（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ（ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）を含む異種核酸構築物（ここで、スペーサーは、前記集団の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含む）、および、（ｃ）Ｃａｓ９ポリペプチドまたはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物、を導入するステップ（それにより、形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団を生産する）；および、形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団における欠失の存在または不存在を判定するステップを含む（ここで、形質転換された細菌、古細菌または酵母細胞の集団における欠失の存在は、標的領域が非必須遺伝子および／または消費されてよいゲノムアイランド内に含まれることを意味し、形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団における欠失の不存在は、標的領域が必須遺伝子内に含まれることを意味する）。
他の態様では、細菌細胞の集団に、リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ（ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）を含む異種核酸構築物を導入するステップを含む、細菌細胞の集団内の１つまたは複数の細菌細胞を死滅させる方法が提供され、ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列のスペーサーは、前記集団の細菌細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、それにより、集団内の標的領域を含む１つまたは複数の細菌細胞を死滅させる。本発明で有用なＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型またはＶ型ＣＲＩＳＰＲアレイであり得る。
さらなる態様では、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団内の１つまたは複数の細胞を死滅させる方法が提供され、当該方法は：細菌、古細菌または酵母細胞の集団に（ａ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物、（ｂ）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ（ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）を含む異種核酸構築物（ここで、前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列およびリピート－スペーサー－リピート配列のスペーサーは、前記集団の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含む）、および、（ｃ）Ｃａｓ９ポリペプチドおよび／またはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物、を導入するステップを含み、それにより、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団内のそれらのゲノム内の標的領域を含む１つまたは複数の細胞を死滅させる。
細菌ゲノム標的化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの形質転換を用いて、配列特異的な基準で細菌細胞を選択的に死滅させて、遺伝学的に別個の亜集団を差し引き、それにより、標的配列を欠く細菌集団を濃縮することができる。この区別は、遺伝学的に類似する集団内のオルトゴナルＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの不均一分配に基づいて生じ得る。したがって、一部の実施態様では、細胞の集団に導入されるＣＲＩＳＰＲアレイは、死滅される前記の１つまたは複数の細菌細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと適合することができるが（すなわち、機能性）、集団内の少なくとも１つまたは複数の細菌細胞のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムと適合しない（すなわち、機能性でない）。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、Ｉ－Ｅ型またはＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのいずれかを示すことができ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、Ｉ－Ｂ型システムをコードし、および、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの異なる株は、ＩＩ－Ａ型およびＩ－Ｅ型システムの両方またはＩＩ－Ａ型システムのみを示す。細菌の混合物中に形質転換された特定のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡに応じて、その同起源のシステムとのその機能性の適合性に基づいて、集団のそのサブセットを特異的に標的化することができる。これは、内因性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む多様な種、例えば、制限されないが：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．（例えば：Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．（例えば：Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｓ．ｓｏｍａｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ．（例えば：Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ．（例えば：Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば：Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｉｓ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐｐ．（例えば：Ｂ．ｍａｌｌｅｉ、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば：Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば：Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば：Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐｐ．（例えば：Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｉｅｒｉ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐｐ．（例えば：Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば：Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．（例えば：Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ．（例えば：Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば：Ｂ．ｑｕｉｎｔａｎａ）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば：Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば：Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．（例えば：Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば：Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば：Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．（例えば：Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば：Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．（例えば：Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｐｐ．（例えば：Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．（例えば：Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａ．ｂａｕｍａｎｉｉ）、Ｒｕｍｉｎｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｒ．ａｌｂｕｓ）、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば：Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば：Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば：Ｐ．ａｃｎｅｓ）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば：Ｂ．ｉｏｄｉｎｕｍ）、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）、および／または、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば：Ｐ．ｈｉｓｔｉｃｏｌａ）に適用することができる。
ＣＲＩＳＰＲ標的化は、混合された集団内の別個の遺伝的内容に基づいて、特定の細菌のサブセットを取り除くことができる。このクレームに関するサポートは、実施例４、５に示され、そこでは、Ｌａｃ－細菌が選択されているがＬａｃ＋は集団から取り除かれている。Ｌａｃ＋およびＬａｃ－株間の遺伝的区別は、実施例８および１０に示され、そこでは、残存しているクローンのシーケンシングは、参照の野生型Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株と比較して、遺伝的内容に５．５％までの違いを明らかにした。したがって、ＣＲＩＳＰＲ－標的化スペーサーは、保存されたまたは異なった遺伝子配列を標的化することにより、様々なレベルの細菌関連性に調和され得る。したがって、一部の実施態様では、集団内の細菌細胞は、同一のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムを含むことができ、導入されたＣＲＩＳＰＲアレイは、したがって、全体として細菌集団において機能性であり得るが、細菌集団を作り上げる異なる株または種の遺伝的内容は、導入されたＣＲＩＳＰＲアレイに関する標的領域が、死滅される集団の１つまたは複数の細菌種においてのみ見られるように十分に異なる。これは、内因性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む多様な種、例えば、制限されないが：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．（例えば：Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．（例えば：Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｓ．ｓｏｍａｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ．（例えば：Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ．（例えば：Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば：Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｉｓ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐｐ．（例えば：Ｂ．ｍａｌｌｅｉ、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば：Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば：Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば：Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐｐ．（例えば：Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｉｅｒｉ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐｐ．（例えば：Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば：Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．（例えば：Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ．（例えば：Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば：Ｂ．ｑｕｉｎｔａｎａ）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば：Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば：Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．（例えば：Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば：Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば：Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．（例えば：Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば：Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．（例えば：Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｐｐ．（例えば：Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．（例えば：Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａ．ｂａｕｍａｎｉｉ）、Ｒｕｍｉｎｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｒ．ａｌｂｕｓ）、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば：Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば：Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば：Ｐ．ａｃｎｅｓ）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば：Ｂ．ｉｏｄｉｎｕｍ）、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．（例えば：Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）、および／または Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば：Ｐ．ｈｉｓｔｉｃｏｌａ）に適用することができる。
本発明の方法を用いた、集団内の死滅程度は、標的領域が非必須遺伝子、必須遺伝子または消費されてよいアイランド内に含まれるかどうかに加えて、形質転換に対する特定の集団の従順さによって影響を受け得る。細菌、古細菌または酵母細胞の集団内の死滅程度は、例えば、生物、属および種によって変化し得る。したがって、本明細書において用いられる「死滅」は、集団内のの細胞２ ｌｏｇまたはそれよりも多くの除去を意味する（１％生存またはそれよりも低い）。１ ｌｏｇ未満の死滅は、集団内のわずかな縮小であり；一方で、２～３ ｌｏｇの死滅は、集団の著しい縮小をもたらし；および、３ ｌｏｇを超える死滅は、集団が実質的に全滅していることを示す。
別の態様では、細菌遺伝子と関連する表現型を同定する方法が提供され、細菌細胞の集団に、リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ（ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）を含む異種核酸構築物を導入するステップ（ここで、前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列およびリピート－スペーサー－リピート配列のスペーサーは、前記集団の細菌細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、ここで、標的領域は、ポリペプチドまたは機能性核酸をコードするオープンリーディングフレームの少なくとも一部を含み、それにより、標的領域を含む細胞を死滅させ、そして、標的領域を含まない形質転換された細菌細胞の集団を生産する）（すなわち、生き残った細胞は、標的領域を含まない）；および、（ｉ）細胞の集団の表現型を分析するステップ、または、（ｉｉ）形質転換された細菌細胞の集団から個々の細菌コロニーを増殖させるステップ、および、個々のコロニーの表現型を分析するステップ、を含む。本発明で有用なＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型またはＶ型ＣＲＩＳＰＲアレイであり得る。
別の態様では、細菌、古細菌、藻類、または酵母遺伝子の表現型を特定する方法が提供され、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団に、（ａ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物、（ｂ）（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ（ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）を含む異種核酸構築物（ここで、スペーサーは、前記集団の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含む）、および、（ｃ）Ｃａｓ９ポリペプチドおよび／またはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物、を導入するステップを含み（それにより、標的領域を含む細菌、古細菌、藻類または酵母細胞を死滅させて、そして、標的領域を有さない形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団を生産する）；および、（ｉ）細胞の集団の表現型を分析するステップ、および／または、（ｉｉ）形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団から、個々の細菌、古細菌、または酵母コロニーを増殖させるステップ；および、個々のコロニーの表現型を分析するステップ、を含む。
一部の実施態様では、当該分析は、ＰＣＲ、光学ゲノムマッピング、ゲノムシーケンシング、制限マッピングおよび／または突然変異を特定および特徴付けるための制限分析、および相補性分析および／または表現型を分析するための表現型分析を含む。
本発明の一部の実施態様では、集団における死滅または縮小の程度を判定するステップは、制限されないが、（１）細胞をプレーティングしてコロニーを計数するステップ、（２）光学濃度、（３）顕微鏡計数、（４）最確数、および／または、（５）メチレンブルー還元を含む、集団数を判定するための任意の方法を含むことができる。一部の実施態様では、１６ｓ ｒＤＮＡシーケンシングを用いて、混合された集団の組成をプロファイルすることができる。これは、例えば、全体としてのサンプルからＤＮＡを精製して、ハイスループット技術を用いた全ゲノムショットガンシーケンシングを行なうことにより、または、例えば、１６Ｓ遺伝子をＰＣＲ増幅して産物を同様の様式でシーケンシングすることによって、行なうことができる。それから、配列は、特定の細菌分類群にコンピューター的に割り当てられ得る。他の実施態様では、定量ＰＣＲ法を用いて細菌レベルを定量してもよい。そのような技術は当技術分野でよく知られている。例えば、ｑＰＣＲのためのプライマーは、配列を共有する生物の株 種、属、またはグループから特異的に増幅するように設計することができる。したがって、閾値数（ｃｔ）を用いて、前記生物または生物のグループを定量し得る。さらなる実施態様では、標的集団に特異的な任意の細菌活性（表現型）を測定基準として用いて、集団の枯渇を判定してもよい。
さらなる実施態様では、細菌細胞の集団から、縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌細胞を選択する方法が提供され、細菌細胞の集団に、（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ（ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）を含む異種核酸構築物を導入するステップを含み、ここで、スペーサーは、前記集団の１つまたは複数の細菌細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、ここで、標的領域を含む細胞は死滅して、それにより、細菌細胞の集団から、標的領域を有さない縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌細胞を選択する。本発明で有用なＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型またはＶ型ＣＲＩＳＰＲアレイであり得る。
一部の実施態様では、細菌細胞の集団から、縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌細胞を選択する方法は、細菌細胞の集団に：（ａ）（ｉ）前記細菌細胞のゲノム内に存在する少なくとも３００個の連続したヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、１つまたは複数の異種核酸構築物、または（ｉｉ）少なくとも１つのトランスポゾンを含む２以上の異種核酸構築物（それにより、ゲノム中に組み込まれた前記の１つまたは複数の異種核酸構築物およびゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、または、ゲノム中に組み込まれた第１および第２のトランスポゾンの間の、相同組み換えに関する非天然部位を含むトランスジェニック細菌細胞の集団を生産する）；および（ｂ）（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ（ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）を含む異種核酸構築物、を導入するステップを含む（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列のスペーサーは、前記集団の１つまたは複数の細菌細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、標的領域は、ゲノムに導入された前記の１つまたは複数の異種核酸構築物およびゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、および／または、第一のトランスポゾンおよび第二のトランスポゾンの間に位置し、ここで、標的領域を含む細胞は死滅して、そして、標的領域を含まない細胞は生き残り、それにより、トランスジェニック細菌細胞の集団から、標的領域を有さない縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌細胞を選択する）。本発明で有用なＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型またはＶ型ＣＲＩＳＰＲアレイであり得る。
当技術分野でよく知られているように、トランスポゾンは、例えば、ＰＣＲ増幅を介して、または、設計されたＤＮＡ合成を通して作ることができ、そして、形質転換の任意の方法を介して導入され得る。
一部の実施態様では、本発明は、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団から、縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞を選択する方法を提供し、細菌、古細菌または酵母細胞の集団に、（ａ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物、（ｂ）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ（ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）を含む異種核酸構築物（ここで、前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列および前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー－リピート配列のスペーサーは、前記集団の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含む）、および、（ｃ）Ｃａｓ９ポリペプチドおよび／またはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物、を導入するステップを含む（ここで、標的領域を含む細胞は死滅して、それにより、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団から、標的領域を有さない縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞を選択する）。
他の実施態様では、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団から、縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞を選択する方法が提供され、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団に：（ａ）（ｉ）前記の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム内に存在する少なくとも３００個の連続したヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、１つまたは複数の異種核酸構築物、または（ｉｉ）少なくとも１つのトランスポゾンを含む２以上の異種核酸構築物（それにより、ゲノム中に組み込まれた前記の１つまたは複数の異種核酸構築物およびゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、または、ゲノム中に組み込まれた第１および第２のトランスポゾンの間の、相同組み換えに関する非天然部位を含むトランスジェニック細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団を生産する）；および（ｂ）（ｉ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物、（ｉｉ）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ（ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）を含む異種核酸構築物（ここで、前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー－リピート配列のスペーサーは、前記集団の１つまたは複数の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補のヌクレオチド配列を含む）、および、（ｉｉｉ）Ｃａｓ９ポリペプチドおよび／またはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物、を導入するステップを含む（ここで、標的領域は、ゲノム中に組み込まれた前記の１つまたは複数の異種核酸構築物およびゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、および／または、第一のトランスポゾンおよび第二のトランスポゾンの間に位置し、ここで、標的領域を含む細胞は死滅して、そして、標的領域を含まない細胞は生き残り、それにより、トランスジェニック細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団から、標的領域を有さない縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞を選択する）。
一部の態様では、縮小されたゲノムサイズは、コントロールと比較して縮小され得る。一部の態様では、コントロールは、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の野生型集団、または、リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型またはＶ型ＣＲＩＳＰＲアレイ）を含む異種構築物によって形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団であってよく、ここで、前記のリピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列のスペーサーは、前記集団の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム内の標的領域に相補でないヌクレオチド配列を含む（すなわち、非自己標的化／「スクランブルスペーサー」）。さらなる態様では、コントロールは、リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種構築物によって形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団であってよく、ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列のスペーサーは、前記集団の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補であるがプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を欠くヌクレオチド配列を含む。
一部の実施態様では、細菌の集団において、そのゲノム内に欠失（例えば、染色体および／またはプラスミド欠失）を有する少なくとも１つの単離物を同定する方法が提供され、細菌細胞の集団に、（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ（ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）を含む異種核酸構築物を導入するステップ（前記のリピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列のスペーサーは、前記集団の１つまたは複数の細菌細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、そして、標的領域を含む細胞は死滅して、それにより、標的領域を含まない形質転換された細菌細胞の集団を生産する）；および、形質転換された細菌細胞の集団から個々の細菌コロニーを増殖させるステップを含み、それにより、形質転換された細菌の集団から、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する。本発明で有用なＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型またはＶ型ＣＲＩＳＰＲアレイであり得る。
さらなる実施態様では、本発明は、細菌の集団において、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する方法を提供し、細菌細胞の集団に：（ａ）（ｉ）前記細菌細胞のゲノム内に存在する少なくとも３００個の連続したヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、１つまたは複数の異種核酸構築物、または、（ｉｉ）少なくとも１つのトランスポゾンを含む２以上の異種核酸構築物（それにより、ゲノム中に組み込まれた前記の１つまたは複数の異種核酸構築物およびゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、または、ゲノム中に組み込まれた第１および第２のトランスポゾンの間の、相同組み換えに関する非天然部位を含むトランスジェニック細菌細胞の集団を生産する）；およびｂ）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ（ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）を含む異種核酸構築物、を導入するステップ（ここで、スペーサーは、前記集団の１つまたは複数の細菌細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、ここで、標的領域は、ゲノム中に導入された前記の１つまたは複数の異種核酸構築物およびゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、および／または、第１のトランスポゾンおよび第２のトランスポゾンの間に位置し、標的領域を含む細胞は死滅して［標的領域を含まない細胞は生き残る］、それにより、標的領域を含まない形質転換された細菌細胞の集団を生産する）；および、形質転換された細菌細胞の集団から、個々の細菌コロニーを増殖させるステップを含み、それにより、細菌の集団から、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する。本発明で有用なＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型またはＶ型ＣＲＩＳＰＲアレイであり得る。
さらなる実施態様では、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団において、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する方法が提供され、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団に：（ａ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物；（ｂ）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ（ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）を含む異種核酸構築物（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列のスペーサーは、前記集団の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム（例えば、染色体、ミトコンドリアおよび／またはプラスミドのゲノム）内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含む）；および（ｃ）Ｃａｓ９ポリペプチドまたはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物、を導入するステップ（ここで、標的領域を含む細胞は死滅して、それにより、標的領域を含まない形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団を生産する）；および形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団から、個々の細菌、古細菌または酵母コロニーを増殖させるステップを含み、それにより、形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団から、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する。
また、さらなる実施態様では、本発明は、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団において、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する方法を提供し、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団に：（ａ）（ｉ）前記の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム内に存在する少なくとも３００個の連続したヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、１つまたは複数の異種核酸構築物、または（ｉｉ）少なくとも１つのトランスポゾンを含む２以上の異種核酸構築物（それにより、ゲノム中に組み込まれた前記の１つまたは複数の異種核酸構築物およびゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、または、ゲノム中に組み込まれた第１および第２のトランスポゾンの間の、相同組み換えに関する非天然部位を含むトランスジェニック細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団を生産する）；および、（ｂ）（ｉ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物、（ｉｉ）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ（ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）を含む異種核酸構築物（ここで、スペーサーは、前記集団の１つまたは複数の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含む）；および、（ｉｉｉ）Ｃａｓ９ポリペプチドおよび／またはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物、を導入するステップ（ここで、標的領域は、ゲノム中に組み込まれた前記の１つまたは複数の異種核酸構築物およびゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、および／または、第１のトランスポゾンおよび第２のトランスポゾンの間に位置し、標的領域を含む細胞は死滅して、標的領域を含まない細胞は生き残り、それにより、標的領域を含まない形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団を生産する）；および、形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団から、個々の細菌、古細菌または酵母コロニーを増殖させるステップを含み、それにより、集団から、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する。
一部の実施態様では、適合性（ｆｉｔｎｅｓｓ）／増殖速度は、ゲノムサイズの縮小によって、または、転写および翻訳のために高いエネルギーインプットを必要とする選択遺伝子（ポリペプチドまたは機能性核酸（例えば、転写調節因子）をコードする）の欠失によって、増大され得る。したがって、一部の実施態様では、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団の適合性または増殖速度を増大させる方法が提供され、縮小されたゲノムサイズ（例えば、ゲノムの一部の不存在を選択する）および／または本明細書に記載の集団の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム内の欠失を選択するステップを含む。一部の実施態様では、欠失は、１つの遺伝子または１つよりも多い遺伝子を含んでよい。したがって、ゲノムサイズの縮小または特定の遺伝子（単数または複数）の欠失を通して、集団の細胞は、存在しないゲノムの部分または欠失した遺伝子（単数または複数）の転写／翻訳に、もはやエネルギーを消費せず、それにより、前記のゲノムの部分および／または前記の遺伝子（単数または複数）をまだ含んでいるコントロール集団と比較して、縮小されたエネルギー必要性および増大された適合性を有する。
他の実施態様では、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団から生産される産物の量を増大させる方法が提供されて、本明細書に記載の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞のゲノム内の欠失に関して選択することにより、細胞の適合性または増殖速度を増大させるステップを含む。一部の実施態様では、産物は、限定されないが、抗生物質、二次代謝物、ビタミン類、タンパク質、酵素、酸、および製剤を含むことができる。
一部の実施態様では、本発明で有用なＣＲＩＳＰＲアレイ（ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのいずれか由来のアレイであってよい。
先行する実施態様に関して、ｔｒａｃｒ核酸を含む異種核酸構築物およびＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物は、同一の構築物（例えば、発現カセットまたはベクター）中に、または、異なる構築物中に、含まれてよく、または導入されてよい。特定の実施態様では、ｔｒａｃｒ核酸を含む異種核酸構築物およびＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物は、場合によりＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでよい単一の構築物（例えば、発現カセットおよび／またはベクター）内に含まれてよい。一部の実施態様では、ｔｒａｃｒ核酸を含む異種核酸構築物およびＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物は、単一のプロモーターおよび／または別個のプロモーターに動作可能に連結されてよい。
一部の実施態様では、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物およびＣＲＩＳＰＲアレイ（ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）を含む異種核酸構築物は、ＣＲＩＳＰＲガイド（ｇＲＮＡ、ｇＤＮＡ）内に含まれてよい。一部の実施態様では、ＣＲＩＳＰＲガイドは、プロモーターに動作可能に連結されてよい。
一部の実施態様では、本発明で有用なＣａｓ９ポリペプチドは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列と、少なくとも７０％の同一性を含む（例えば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％など）。本発明で有用な、例示的なＣａｓ９ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおいてＤＮＡ切断を触媒することが知られる任意のＣａｓ９ヌクレアーゼであってよい。当技術分野で知られているように、そのようなＣａｓ９ヌクレアーゼは、ＨＮＨモチーフおよびＲｕｖＣモチーフを含む（例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２；ＷＯ／２０１３／１８８６３８を参照）。一部の実施態様では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの機能性フラグメントは、本発明で有用であり得る。
ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムおよびＣａｓ９ヌクレアーゼのグルーピングは、当技術分野でよく知られていて、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ １（ＳｔｈｎＣＲ１）グループ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ ３（Ｓｔｈ ＣＲ３）グループ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ＣＤ０３４（Ｌｂ）グループ、および、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ（Ｌｒｈ）グループを含む。さらなるＣａｓ９ヌクレアーゼは、限定されないが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ ＣＲＬ ７０５のものを含む。さらに、本発明で有用なさらなるＣａｓ９ヌクレアーゼは、限定されないが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ ＫＣＴＣ ３５０１およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ ＷＰ ０１００１８９４９．１由来のＣａｓ９を含む。
さらに、特定の実施態様では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、標的ＤＮＡを含む生物に関してコドン最適化されたヌクレオチド配列によってコードされ得る。さらに他の実施態様では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、少なくとも１つの核局在化配列を含むことができる。
一部の実施態様では、本発明で有用なＩ型ポリペプチドは、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３’ヌクレアーゼ、Ｃａｓ３’’ヌクレアーゼ、それらの融合変異体のアミノ酸配列と、少なくとも７０％の同一性を含む（例えば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％など）。一部の実施態様では、本発明で有用なＩ型Ｃａｓｃａｄｅポリペプチドは、Ｃａｓ７（Ｃｓａ２）、Ｃａｓ８ａ１（Ｃｓｘ１３）、Ｃａｓ８ａ２（Ｃｓｘ９）、Ｃａｓ５、Ｃｓａ５、Ｃａｓ６ａ、Ｃａｓ６ｂ、Ｃａｓ８ｂ（Ｃｓｈ１）、Ｃａｓ７（Ｃｓｈ２）、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ８ｃ（Ｃｓｄ１）、Ｃａｓ７（Ｃｓｄ２）、Ｃａｓ１０ｄ（Ｃｓｃ３）、Ｃｓｃ２、Ｃｓｃ１、Ｃａｓ６ｄ、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃａｓ７（ＣａｓＣ）、Ｃａｓ５（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６ｅ（ＣａｓＥ）、Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ２、Ｃａｓ７（Ｃｙｓ３）、Ｃａｓ６ｆ（Ｃｓｙ４）、Ｃａｓ６および／またはＣａｓ４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％の同一性を含む（例えば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％など）。
Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、当技術分野でよく知られていて、例えば、例示的なＩ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、例示的なＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ ＤＳＭ ５５５、例示的なＩ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むＢａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ Ｃ－１２５、例示的なＩ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むＣｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ８０２、例示的なＩ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２、例示的なＩ－Ｕ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むＧｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓおよび、例示的なＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＹＰＩＩＩを含む。
一部の実施態様では、本発明で有用なＩＩ型ポリペプチドは、Ｃａｓ９のアミノ酸配列と、少なくとも７０％の同一性を含む（例えば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％など）。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、当技術分野でよく知られていて、例えば、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ ｓｔｒ．Ｐａｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＮＲＺ１０６６、および、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ ０２０－０６を含む。
一部の実施態様では、本発明で有用なＩＩＩ型ポリペプチドは、Ｃａｓ６、Ｃａｓ１０（またはＣｓｍ１）、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、およびＣｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃａｓ１０（またはＣｍｒ２）、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、およびＣｍｒ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ７（Ｃｓｍ３）、Ｃａｓ５（Ｃｓｍ４）、Ｃａｓ７（Ｃｓｍ５）、Ｃｓｍ６、Ｃａｓ７（Ｃｍｒ１）、Ｃａｓ５（Ｃｍｒ３）、Ｃａｓ７（Ｃｍｒ４）、Ｃａｓ７（Ｃｍｒ６）、Ｃａｓ７（Ｃｍｒ６）、Ｃｍｒ５、Ｃａｓ５（Ｃｍｒ３）、Ｃａｓ５（Ｃｓ×１０）、Ｃｓｍ２、Ｃａｓ７（Ｃｓｍ３）、およびａｌｌ１４７３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％の同一性を含む（例えば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％など）。ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、当技術分野でよく知られていて、例えば、例示的なＩＩＩ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ＲＰ６２Ａ、例示的なＩＩＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＳＭ ３６３８、例示的なＩＩＩ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ｓｔｒ．Ｄｅｌｔａ Ｈ、および、例示的なＩＩＩ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むＲｏｓｅｉｆｌｅｘｉｓ ｓｐ．Ｒｓ－１を含む。
一部の実施態様では、本発明で有用なＩＶ型ポリペプチドは、Ｃｓｆ４（ｄｉｎＧ）、Ｃｓｆ１、Ｃａｓ７（Ｃｓｆ２）および／またはＣａｓ５（ｃｓｆ３）のアミノ酸配列と、少なくとも７０％の同一性を含む（例えば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％など）。ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、当技術分野でよく知られていて、例えば、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ ＡＴＣＣ ２３２７０は、例示的なＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。
一部の実施態様では、本発明で有用なＶ型ポリペプチドは、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、またはＣａｓ４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％の同一性を含む（例えば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％など）。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、当技術分野でよく知られていて、例えば、例示的なＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｃｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｆｘ１を含む。
さらに本明細書において提供されるのは、本発明の核酸構築物、核酸アレイ、核酸分子および／またはヌクレオチド配列を含む発現カセットおよびベクターであって、本開示の方法で使用することができる。
さらなる態様では、本発明の核酸構築物、核酸アレイ、核酸分子、および／またはヌクレオチド配列は、宿主生物の細胞に導入することができる。本発明が有用である任意の細胞／宿主生物を使用することができる。例示的な宿主生物は、細菌、古細菌、藻類および菌類（例えば、酵母）を含む。
ここで、本発明は、以下の実施例に関して説明される。これらの実施例は、本発明に対する特許請求の範囲を制限することを意図しないが、むしろ、特定の実施態様の例示であることを意図すると理解されるべきである。当業者が想到する例示された方法における任意の変型は、本発明の範囲内であることが意図される。
実施例１．細菌株
全ての細菌株を表１に挙げる。細菌培養物を、２５％グリセロール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含む適切な増殖培地中で凍結保存して、－８０℃で保管した。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを、３７℃にて静的好気的条件下で１％牛肉エキス（ｗｔ／ｖｏｌ）および１．９％（ｗｔ／ｖｏｌ）β－グリセロールリン酸（Ｓｉｇｍａ）ブロスで補充されたＥｌｌｉｋｅｒ培地（Ｄｉｆｃｏ）中で、または、１．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）寒天（Ｄｉｆｃｏ）を含む固形培地上で繁殖させて３７℃にて４８時間嫌気的にインキュベートした。２μｇ／ｍＬの濃度のエリスロマイシン（Ｅｍ）および５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（Ｃｍ）（Ｓｉｇｍａ）を、適切な場合、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおけるプラスミド選択に用いた。Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＣ１０００を、好気的に３７℃にてＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（Ｄｉｆｃｏ）ブロス中、または、１．５％寒天で補充された脳心臓浸出物（ＢＨＩ）（Ｄｉｆｃｏ）固形培地上で繁殖させた。Ｅ．ｃｏｌｉの抗生物質選択を、適切な場合、４０μｇ／ｍＬカナマイシン（Ｋｎ）および１５０μｇ／ｍＬのＥｍを用いて、組み換えＥ．ｃｏｌｉについて維持した。β－ガラクトシダーゼ活性に関するＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ誘導体のスクリーニングを、合成のＥｌｌｉｋｅｒ培地を１％ラクトース、１．５％寒天、および０．０４％ブロモ－クレゾールパープル（ｐＨ指示薬として）で補充することによって、定性的に評価した。
全ての細菌株を表１に挙げる。細菌培養物を、２５％グリセロール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含む適切な増殖培地中で凍結保存して、－８０℃で保管した。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを、３７℃にて静的好気的条件下で１％牛肉エキス（ｗｔ／ｖｏｌ）および１．９％（ｗｔ／ｖｏｌ）β－グリセロールリン酸（Ｓｉｇｍａ）ブロスで補充されたＥｌｌｉｋｅｒ培地（Ｄｉｆｃｏ）中で、または、１．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）寒天（Ｄｉｆｃｏ）を含む固形培地上で繁殖させて３７℃にて４８時間嫌気的にインキュベートした。２μｇ／ｍＬの濃度のエリスロマイシン（Ｅｍ）および５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（Ｃｍ）（Ｓｉｇｍａ）を、適切な場合、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおけるプラスミド選択に用いた。Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＣ１０００を、好気的に３７℃にてＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（Ｄｉｆｃｏ）ブロス中、または、１．５％寒天で補充された脳心臓浸出物（ＢＨＩ）（Ｄｉｆｃｏ）固形培地上で繁殖させた。Ｅ．ｃｏｌｉの抗生物質選択を、適切な場合、４０μｇ／ｍＬカナマイシン（Ｋｎ）および１５０μｇ／ｍＬのＥｍを用いて、組み換えＥ．ｃｏｌｉについて維持した。β－ガラクトシダーゼ活性に関するＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ誘導体のスクリーニングを、合成のＥｌｌｉｋｅｒ培地を１％ラクトース、１．５％寒天、および０．０４％ブロモ－クレゾールパープル（ｐＨ指示薬として）で補充することによって、定性的に評価した。
実施例２．ＤＮＡ単離およびクローニング
全てのキット、酵素、および試薬は、製造元の説明書に従って用いた。ＤＮＡ精製およびクローニングを、以前に記載されたとおりに行なった（４１）。手短には、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのゲノムＤＮＡの精製は、ＺＲ Ｆｕｎｇａｌ／Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＭｉｎｉＰｒｅｐ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）を用いた。プラスミドＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉから、Ｑｉａｇｅｎ Ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。高い忠実度の、ＤＮＡのＰＣＲ増幅を、ＰＦＵ ＨＳ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行なった。日常的なＰＣＲは、Ｃｈｏｉｃｅ－Ｔａｑ Ｂｌｕｅポリメラーゼ（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ）を用いて行なった。ＰＣＲ増幅に関するプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入した。アガロースゲルからのＤＮＡ抽出は、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ ＤＮＡゲル回収キット（Ｚｙｍｏ）を用いて行なった。制限エンドヌクレアーゼは、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから取得した。ライゲーションは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｑｕｉｃｋ Ｔ４リガーゼを用いて行なった。シーケンシングは、Ｄａｖｉｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｉｎｃ．（Ｄａｖｉｓ，ＣＡ）によって行なった。凍結保存された塩化ルビジウムコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞は、前述したとおりに調製した（４１）。それぞれ、連続して（１）ＳｔｈＣＲＩＳＰＲ１またはＳｔｈＣＲＩＳＰＲ３に特異的なネイティブのリーダー配列（２）ＣＲＩＳＰＲ１またはＣＲＩＳＰＲ３に特異的なネイティブのリピート（３）ｌａｃＺの５’末端に特異的なスペーサー配列（４）別のネイティブリピート（図１）からなる、ｌａｃＺ標的化アレイを有するプラスミドを構築した。それぞれのプラスミドを作るために、上記に挙げた配列の特徴を伸長プライマーとしてオーダーして（表２）、オーバーラップエクステンションＰＣＲによるスプライシングを用いて組み合わせて（４２）、ｐＯＲＩ２８にクローニングした（図２）。
全てのキット、酵素、および試薬は、製造元の説明書に従って用いた。ＤＮＡ精製およびクローニングを、以前に記載されたとおりに行なった（４１）。手短には、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのゲノムＤＮＡの精製は、ＺＲ Ｆｕｎｇａｌ／Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＭｉｎｉＰｒｅｐ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）を用いた。プラスミドＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉから、Ｑｉａｇｅｎ Ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。高い忠実度の、ＤＮＡのＰＣＲ増幅を、ＰＦＵ ＨＳ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行なった。日常的なＰＣＲは、Ｃｈｏｉｃｅ－Ｔａｑ Ｂｌｕｅポリメラーゼ（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ）を用いて行なった。ＰＣＲ増幅に関するプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入した。アガロースゲルからのＤＮＡ抽出は、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ ＤＮＡゲル回収キット（Ｚｙｍｏ）を用いて行なった。制限エンドヌクレアーゼは、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから取得した。ライゲーションは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｑｕｉｃｋ Ｔ４リガーゼを用いて行なった。シーケンシングは、Ｄａｖｉｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｉｎｃ．（Ｄａｖｉｓ，ＣＡ）によって行なった。凍結保存された塩化ルビジウムコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞は、前述したとおりに調製した（４１）。それぞれ、連続して（１）ＳｔｈＣＲＩＳＰＲ１またはＳｔｈＣＲＩＳＰＲ３に特異的なネイティブのリーダー配列（２）ＣＲＩＳＰＲ１またはＣＲＩＳＰＲ３に特異的なネイティブのリピート（３）ｌａｃＺの５’末端に特異的なスペーサー配列（４）別のネイティブリピート（図１）からなる、ｌａｃＺ標的化アレイを有するプラスミドを構築した。それぞれのプラスミドを作るために、上記に挙げた配列の特徴を伸長プライマーとしてオーダーして（表２）、オーバーラップエクステンションＰＣＲによるスプライシングを用いて組み合わせて（４２）、ｐＯＲＩ２８にクローニングした（図２）。
実施例３．ＣＲＩＳＰＲスペーサーの選択および設計
染色体切断のプログラム可能な特異性は、標的対立遺伝子に特有の所望のスペーサー配列の選択で定まる（ｈｉｎｇｅｓ ｕｐｏｎ）。特異性は、標的配列内のプロト－スペーサーに近位でなければならない必須ＰＡＭ、短い保存配列によってさらに作り上げられる（ｃｏｍｐｏｕｎｄｅｄ ｂｙ）（２１、４３）。したがって、スペーサーの選択および設計に関する厳格な基準は、コンセンサスＰＡＭ配列の位置および外来ゲノムの遺伝子座に対する偶発的な配列同一性であった。推定のプロトスペーサーを、ｌａｃＺのセンス鎖およびアンチセンス鎖内の全ての推定のＰＡＭ配列の位置を最初に規定することにより構築した。３，０８１ｎｔ遺伝子内には、２２個のＣＲＩＳＰＲ１（ＡＧＡＡＷ）および３９個のＣＲＩＳＰＲ３（ＧＧＮＧ）ＰＡＭ部位が存在し、それらの生物情報学的に得られたコンセンサス配列と同一であった（２１）。潜在的スペーサーを同定した後に、完全なプロト－スペーサー、シード、およびＰＡＭ配列を、非特異的な遺伝子座のさらなる標的化を防ぐために、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９のゲノムに対するＢＬＡＳＴ分析に供した。ＣＲＩＳＰＲ１およびＣＲＩＳＰＲ３に関するスペーサーは、配列および対応するＰＡＭ部位が全く異なったが、ｌａｃＺの５’末端を標的化するように設計されて、６ｎｔ離れて存在する予測された切断部位をもたらした。したがって、それぞれのプラスミド上のリーダー配列、リピート、およびスペーサーは、それぞれ、ＣＲＩＳＰＲ１またはＣＲＩＳＰＲ３に特有のオルトゴナル特性を示した。標的遺伝子座依存性の突然変異を評価するために、さらなるＣＲＩＳＰＲ３プラスミドを、β－ガラクトシダーゼ活性に必須の金属カチオン結合残基に対するスペーサーを用いて作製した。非自己スペーサーを含むＣＲＩＳＰＲ１アレイプラスミドをコントロールとして用いて、自己標的化の致死性を定量化した。
染色体切断のプログラム可能な特異性は、標的対立遺伝子に特有の所望のスペーサー配列の選択で定まる（ｈｉｎｇｅｓ ｕｐｏｎ）。特異性は、標的配列内のプロト－スペーサーに近位でなければならない必須ＰＡＭ、短い保存配列によってさらに作り上げられる（ｃｏｍｐｏｕｎｄｅｄ ｂｙ）（２１、４３）。したがって、スペーサーの選択および設計に関する厳格な基準は、コンセンサスＰＡＭ配列の位置および外来ゲノムの遺伝子座に対する偶発的な配列同一性であった。推定のプロトスペーサーを、ｌａｃＺのセンス鎖およびアンチセンス鎖内の全ての推定のＰＡＭ配列の位置を最初に規定することにより構築した。３，０８１ｎｔ遺伝子内には、２２個のＣＲＩＳＰＲ１（ＡＧＡＡＷ）および３９個のＣＲＩＳＰＲ３（ＧＧＮＧ）ＰＡＭ部位が存在し、それらの生物情報学的に得られたコンセンサス配列と同一であった（２１）。潜在的スペーサーを同定した後に、完全なプロト－スペーサー、シード、およびＰＡＭ配列を、非特異的な遺伝子座のさらなる標的化を防ぐために、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９のゲノムに対するＢＬＡＳＴ分析に供した。ＣＲＩＳＰＲ１およびＣＲＩＳＰＲ３に関するスペーサーは、配列および対応するＰＡＭ部位が全く異なったが、ｌａｃＺの５’末端を標的化するように設計されて、６ｎｔ離れて存在する予測された切断部位をもたらした。したがって、それぞれのプラスミド上のリーダー配列、リピート、およびスペーサーは、それぞれ、ＣＲＩＳＰＲ１またはＣＲＩＳＰＲ３に特有のオルトゴナル特性を示した。標的遺伝子座依存性の突然変異を評価するために、さらなるＣＲＩＳＰＲ３プラスミドを、β－ガラクトシダーゼ活性に必須の金属カチオン結合残基に対するスペーサーを用いて作製した。非自己スペーサーを含むＣＲＩＳＰＲ１アレイプラスミドをコントロールとして用いて、自己標的化の致死性を定量化した。
実施例４．形質転換
プラスミドを、温度感受性ヘルパープラスミド、ｐＴＲＫ６６９を含むコンピテントＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに、以前に記載された方法（４４）に従ってエレクトロポレーションした。手短には、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの一晩培養物を、１％牛肉エキス、１．９％ β－グリセロリン酸およびＣｍ選択で補充された５０ｍＬのＥｌｌｉｋｅｒ培地中に、１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で接種した。培養物がＯＤ６００ｎｍ＝０．３を達成したときに、エレクトロポレーション効率を促進するために（４５）、ペニシリンＧを添加して、１０μｇ／ｍＬの終濃度を得た。遠心分離によって細胞を回収して、１０ｍＬの冷却エレクトロポレーションバッファー（１Ｍスクロースおよび３．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で３回洗浄した。細胞をエレクトロポレーションバッファー中に１００倍濃縮して、４０μＬの懸濁液を、０．１ｍｍエレクトロポレーションキュベット中に等分した。それぞれの懸濁液を、７００ｎｇのプラスミドと組み合わせた。エレクトロポレーション条件を、２，５００Ｖ、２５μＦｄ静電容量、および、２００ Ｏｈｍｓ抵抗に設定した。時定数を記録して、４．４～４．６ｍｓの範囲だった。懸濁液を９５０μＬの回復培地と直ちに組み合わせて、３７℃にて８時間インキュベートした。細胞懸濁液を選択培地上にプレーティングして、エレクトロポレーションキュベットを培地で洗浄して細胞の回復を確実にした。
プラスミドを、温度感受性ヘルパープラスミド、ｐＴＲＫ６６９を含むコンピテントＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに、以前に記載された方法（４４）に従ってエレクトロポレーションした。手短には、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの一晩培養物を、１％牛肉エキス、１．９％ β－グリセロリン酸およびＣｍ選択で補充された５０ｍＬのＥｌｌｉｋｅｒ培地中に、１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で接種した。培養物がＯＤ６００ｎｍ＝０．３を達成したときに、エレクトロポレーション効率を促進するために（４５）、ペニシリンＧを添加して、１０μｇ／ｍＬの終濃度を得た。遠心分離によって細胞を回収して、１０ｍＬの冷却エレクトロポレーションバッファー（１Ｍスクロースおよび３．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で３回洗浄した。細胞をエレクトロポレーションバッファー中に１００倍濃縮して、４０μＬの懸濁液を、０．１ｍｍエレクトロポレーションキュベット中に等分した。それぞれの懸濁液を、７００ｎｇのプラスミドと組み合わせた。エレクトロポレーション条件を、２，５００Ｖ、２５μＦｄ静電容量、および、２００ Ｏｈｍｓ抵抗に設定した。時定数を記録して、４．４～４．６ｍｓの範囲だった。懸濁液を９５０μＬの回復培地と直ちに組み合わせて、３７℃にて８時間インキュベートした。細胞懸濁液を選択培地上にプレーティングして、エレクトロポレーションキュベットを培地で洗浄して細胞の回復を確実にした。
実施例５．β－ガラクトシダーゼ表現型の確認
ＣＲＩＳＰＲ１およびＣＲＩＳＰＲ３の両方から生産された形質転換体を、はじめに、固形炭水化物源として１％ラクトースで補充された半合成のＥｌｌｉｋｅｒ培地上にコロニーを再ストリークすることによって、β－ガラクトシダーゼ欠失表現型についてスクリーニングした。β－ガラクトシダーゼ活性の喪失を、Ｍｉｌｌｅｒアッセイを行なうことによって確認した（ｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトシド（ＯＮＰＧ）（４６）。手短には、培養物を、５ｍＬの培地中で対数期後期（ＯＤ６００ｎｍ＝１．２）まで繁殖させて、遠心分離（４，０００ｘｇ、１０分間）によって回収した。細胞を洗浄して、０．５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に再懸濁した。それぞれの懸濁液を、１００ｕＬの０．１ｍｍガラスビーズ（Ｂｉｏｓｐｅｃ）と合わせて、それから、Ｍｉｎｉ－Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ）中で、５回の６０秒サイクルの均質化に供した。それからサンプルを遠心分離して（１５，０００ｘｇ、５分間）、デブリおよび無傷の細胞を除去した。細胞溶解物（１０μＬアリコート）を、６００μＬの基質溶液（６０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４；４０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４；１ｍｇ／ｍＬ ＯＮＰＧ；２．７μＬ／ｍＬ β－メルカプトエタノール）と組み合わせて、室温にて５分間インキュベートして、その時点で、７００μＬのストップ溶液を添加した（１Ｍ ＮａＣＯ３）。４２０ｎｍにおける吸光度を記録して、β－ガラクトシダーゼの活性をＭｉｌｌｅｒ単位として報告して、前述のとおりに計算した（４６）。
ＣＲＩＳＰＲ１およびＣＲＩＳＰＲ３の両方から生産された形質転換体を、はじめに、固形炭水化物源として１％ラクトースで補充された半合成のＥｌｌｉｋｅｒ培地上にコロニーを再ストリークすることによって、β－ガラクトシダーゼ欠失表現型についてスクリーニングした。β－ガラクトシダーゼ活性の喪失を、Ｍｉｌｌｅｒアッセイを行なうことによって確認した（ｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトシド（ＯＮＰＧ）（４６）。手短には、培養物を、５ｍＬの培地中で対数期後期（ＯＤ６００ｎｍ＝１．２）まで繁殖させて、遠心分離（４，０００ｘｇ、１０分間）によって回収した。細胞を洗浄して、０．５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に再懸濁した。それぞれの懸濁液を、１００ｕＬの０．１ｍｍガラスビーズ（Ｂｉｏｓｐｅｃ）と合わせて、それから、Ｍｉｎｉ－Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ）中で、５回の６０秒サイクルの均質化に供した。それからサンプルを遠心分離して（１５，０００ｘｇ、５分間）、デブリおよび無傷の細胞を除去した。細胞溶解物（１０μＬアリコート）を、６００μＬの基質溶液（６０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４；４０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４；１ｍｇ／ｍＬ ＯＮＰＧ；２．７μＬ／ｍＬ β－メルカプトエタノール）と組み合わせて、室温にて５分間インキュベートして、その時点で、７００μＬのストップ溶液を添加した（１Ｍ ＮａＣＯ３）。４２０ｎｍにおける吸光度を記録して、β－ガラクトシダーゼの活性をＭｉｌｌｅｒ単位として報告して、前述のとおりに計算した（４６）。
実施例６．増殖および活性評価
培養物を、ラクトースを含まない半合成のＥｌｌｉｋｅｒ培地中で、１２世代継代培養することによって、増殖アッセイのために事前に整えた。新鮮な培地に、一晩培養物を１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で接種して、３７℃で静的にインキュベートした。培養が定常期に達するまで、ＯＤ６００を１時間ごとにモニターした。ミルクの酸性化を、１０８ｃｆｕ／ｍＬのレベルまでの一晩培養物をスキムミルクに接種して４２℃でインキュベートすることによって評価した。続いて、ｐＨをＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ Ｓｅｖｅｎ Ｅａｓｙ ｐＨメーターおよびＡｃｃｕｍｅｔプローブを用いてモニターした。スキムミルクは、ＮＣＳＵ乳製品工場から取得して、８０℃で３０分間低温殺菌した。
培養物を、ラクトースを含まない半合成のＥｌｌｉｋｅｒ培地中で、１２世代継代培養することによって、増殖アッセイのために事前に整えた。新鮮な培地に、一晩培養物を１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で接種して、３７℃で静的にインキュベートした。培養が定常期に達するまで、ＯＤ６００を１時間ごとにモニターした。ミルクの酸性化を、１０８ｃｆｕ／ｍＬのレベルまでの一晩培養物をスキムミルクに接種して４２℃でインキュベートすることによって評価した。続いて、ｐＨをＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ Ｓｅｖｅｎ Ｅａｓｙ ｐＨメーターおよびＡｃｃｕｍｅｔプローブを用いてモニターした。スキムミルクは、ＮＣＳＵ乳製品工場から取得して、８０℃で３０分間低温殺菌した。
実施例７．消費されてよいゲノム領域の同定
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ標的化に関する可動および消費されてよい遺伝子座のインシリコ予測を、ｉ）ＩＳエレメントの位置、方位、およびヌクレオチド同一性、およびｉｉ）必須ＯＲＦの位置に基づいて行なった。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓでは、２７１個の必須ＯＲＦが、ゲノムワイドの遺伝子ノックアウトの致死性を判定することによって同定された（３３）。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムを、アミノ酸配列に関するデフォルトのスコアリングマトリックスの下でＢＬＡＳＴｐ検索ツールを用いて、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の各必須遺伝子に対する相同体に関して検索要求した。約２３９個の必須ＯＲＦに対する相同体がＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいて同定されて、その全てが、染色体上にコードされていた（表４）。ＤＮＡ複製／ホメオスタシス、翻訳機構、およびコア代謝経路を含む、保存されている細胞プロセスに関与するタンパク質は、容易に同定された。シトクロム生合成／呼吸に対応する相同体は、発酵性細菌の代謝プロファイルに従って観察されなかった。それぞれの推定の必須ＯＲＦを、ＳｎａｐＧｅｎｅソフトウェアを用いて参照ゲノムにマッピングして、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９におけるそれらの位置および分配の可視化を容易にした（図３Ａ）。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ標的化に関する可動および消費されてよい遺伝子座のインシリコ予測を、ｉ）ＩＳエレメントの位置、方位、およびヌクレオチド同一性、およびｉｉ）必須ＯＲＦの位置に基づいて行なった。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓでは、２７１個の必須ＯＲＦが、ゲノムワイドの遺伝子ノックアウトの致死性を判定することによって同定された（３３）。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムを、アミノ酸配列に関するデフォルトのスコアリングマトリックスの下でＢＬＡＳＴｐ検索ツールを用いて、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の各必須遺伝子に対する相同体に関して検索要求した。約２３９個の必須ＯＲＦに対する相同体がＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいて同定されて、その全てが、染色体上にコードされていた（表４）。ＤＮＡ複製／ホメオスタシス、翻訳機構、およびコア代謝経路を含む、保存されている細胞プロセスに関与するタンパク質は、容易に同定された。シトクロム生合成／呼吸に対応する相同体は、発酵性細菌の代謝プロファイルに従って観察されなかった。それぞれの推定の必須ＯＲＦを、ＳｎａｐＧｅｎｅソフトウェアを用いて参照ゲノムにマッピングして、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９におけるそれらの位置および分配の可視化を容易にした（図３Ａ）。
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノム内のＩＳエレメントを、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ（登録商標）ソフトウェアを用いてトランスポゾンコード配列を並べることによってグループ化した（図４）。ファミリー指定を、ＩＳエレメントデータベース内のＢＬＡＳＴ分析に従って決定した（ｗｗｗ－ｉｓ．ｂｉｏｔｏｕｌ．ｆｒ／／）。組み換えによって仲介される染色体セグメントの切断に関する潜在性を予測するために、関連するＩＳエレメントの相対的位置をＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムに対してマッピングした（図３Ａ）。ＩＳエレメントのＩＳ１１９３およびＳｔｈ６ファミリーは、ゲノムにおいて最も頻出であり、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓにおいて共通して見られる（３４）。ＩＳ１１９３エレメントの普及性にかかわらず、これらの遺伝子座の多くは、いくらかの多型および縮退を示す小さなフラグメントであることが示されたが、高レベルの配列同一性で存在するいくつかのコピーも存在した（図５Ａ）。対照的に、Ｓｔｈ６ファミリーは、かなりの多型および高い縮退を示し、一部のコピーは、著しい内部欠失を保有した（図５Ｂ）。ＩＳ１１６７およびＩＳ１１９１エレメントは頻度がより低かったが、ゲノムにおいて同定されたコピー間でほぼ完全な忠実性を示した（図５Ｃおよび図５Ｄ）。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＩＳ１１６７およびＩＳ１１９１エレメントの長さおよび配列の保存、および、ミルク適応遺伝子に対するそれらの相対的近接に基づいて、我々は、これらの保存された／高い忠実性トランスポゾンは、ゲノムにおいて最近になって獲得されたと仮定する。
予測された必須ＯＲＦおよびＩＳエレメントの位置を組み合わせることによって、高い忠実性のＩＳエレメントが隣接する消費されてよいアイランドを同定した（図３Ａ）（表３）。第一のアイランドは、未知の特異性を有する推定のＡＴＰ－依存性オリゴヌクレオチド輸送システムをコードする、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９に特有のオペロンを含んだ（図３Ｂ）（３５）。第二は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの迅速な酸性化の表現型に寄与する細胞－エンベローププロテイナーゼＰｒｔＳを保有する（図３Ｃ）（３６）。とりわけ、ｐｒｔＳは、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムにおいてユビキタスでないが、ｐｒｔＳをコードするゲノムアイランドは、自然な能力を用いて株間で移行可能であることが示されている（３６）。第三のアイランドは、推定のＡＴＰ－依存性銅流出タンパク質を含み、全てのシーケンスされたＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株に存在する（図３Ｄ）。第四のアイランドは、長さが１０２ｋｂｐであり、ｌａｃオペロンを含む１０２個の予測されたＯＲＦを有する遺伝子内容という観点から、はるかに最も大きい（図３Ｅ）。このアイランドは、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの全ての株において見られるが、特定の遺伝子内容および長さは、株間で変化する。両方の内因性ＩＩ型システムを用いて大きなゲノムアイランドを標的化する成果を判定するために、リピート－スペーサーアレイをｌａｃＺコード配列に関して生産して（図３Ｅ）、ｐＯＲＩ２８にクローニングした（図２）。第四のアイランドを、そのサイズ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株における遍在性、および、β－ガラクトシダーゼ陰性の表現型に基づいてｌａｃＺ突然変異に関してスクリーニングする能力に起因して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ標的化のために選択した。
実施例８．ｌａｃＺのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ標的化は、大きな欠失イベントを選択する
ＩＩ型システムでは、Ｃａｓ９はＤＮＡを調べて、ｔｒａｃｒＲＮＡ：：ｃｒＲＮＡデュプレックスの形成を介して生じる標的で、Ｃａｓ９の活性化によって、可逆的にＰＡＭ配列に結合して（３７）、最終的にｄｓＤＮＡ切断をもたらす（図６Ａおよび図６Ｂ）（２５）。図１４Ａおよび図１４Ｂは、標的化された死滅のために内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを利用する一般的なアプローチを示す概略である。具体的には、これらの図１４Ａおよび図１４Ｂは、標的化された死滅のためにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおける内因性ＩＩ型システムを利用するアプローチを示す。したがって、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓでは、プログラムされた細胞死は、発現がネイティブまたは合成のプロモーターによって作動される、ネイティブのリピートが隣接したゲノム標的化スペーサー配列を設計することにより、ＣＲＩＳＰＲ－Ｓｔｈ１（Ａ）またはＣＲＩＳＰＲ－Ｓｔｈ３（Ｂ）ＩＩ型システムを用いて達成された。転写されたリピート－スペーサーアレイは、宿主がコードするＲＮＡａｓｅＩＩＩおよびＣａｓ９を介して処理されて、成熟ｃｒＲＮＡを生じさせて、Ｃａｓ９をゲノムに動員して、細胞死をもたらす二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こす。
ＩＩ型システムでは、Ｃａｓ９はＤＮＡを調べて、ｔｒａｃｒＲＮＡ：：ｃｒＲＮＡデュプレックスの形成を介して生じる標的で、Ｃａｓ９の活性化によって、可逆的にＰＡＭ配列に結合して（３７）、最終的にｄｓＤＮＡ切断をもたらす（図６Ａおよび図６Ｂ）（２５）。図１４Ａおよび図１４Ｂは、標的化された死滅のために内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを利用する一般的なアプローチを示す概略である。具体的には、これらの図１４Ａおよび図１４Ｂは、標的化された死滅のためにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおける内因性ＩＩ型システムを利用するアプローチを示す。したがって、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓでは、プログラムされた細胞死は、発現がネイティブまたは合成のプロモーターによって作動される、ネイティブのリピートが隣接したゲノム標的化スペーサー配列を設計することにより、ＣＲＩＳＰＲ－Ｓｔｈ１（Ａ）またはＣＲＩＳＰＲ－Ｓｔｈ３（Ｂ）ＩＩ型システムを用いて達成された。転写されたリピート－スペーサーアレイは、宿主がコードするＲＮＡａｓｅＩＩＩおよびＣａｓ９を介して処理されて、成熟ｃｒＲＮＡを生じさせて、Ｃａｓ９をゲノムに動員して、細胞死をもたらす二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こす。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによって染色体自己標的化を誘発するプラスミドを用いた形質転換は、非自己標的化プラスミドと比較した、残存する形質転換体の相対的な縮小によって測定されるように、細胞傷害性を示した（１５、２９）。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおけるｌａｃＺ遺伝子の標的化は、回収された形質転換体の約２．５－ｌｏｇ縮小をもたらし（図６Ｃ）、形質転換効率の限界に近づいた。二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）は、生物の生存に対して著しい脅威を継続する。対応する修復経路は、平滑末端ＤＮＡを修復するために末端切除を要求することが多い。Ｃａｓ９が影響するヌクレオチド鎖切断は、野生型への標的遺伝子座の復元が、その後のＣＲＩＳＰＲ標的化を回避しないので、ＤＳＢに起因する突然変異が生じる圧力をさらに悪化させる。乳酸菌内のスペーサー起源の特定は、２２％のスペーサーが自己に対して相補性を示すこと、および、対応するゲノム遺伝子座が変更されて、自然発生の自己標的化イベントの生存を促進している可能性があることを明らかにした（２８）。
標的遺伝子座が、Ｃａｓ９によって誘導された切断に応答して突然変異されたかどうか判定するために、形質転換体を、β－ガラクトシダーゼ活性の喪失について最初にスクリーニングした。活性が欠失したクローンは、ｌａｃＺ遺伝子座において遺伝子型決定された。古典的または代替の末端ジャンクションに起因する突然変異も、いかなる自然発生的な一塩基多型も、シーケンスされたどのクローンにおいても見られなかった。一塩基多型の不存在は、点突然変異の低発生率によって作り上げられる（ｃｏｍｐｏｕｎｄｅｄ ｂｙ）低い形質転換効率、および、非相同末端結合の不存在と相関するＫｕおよびＬｉｇａｓｅＩＶ相同体の不存在に起因し得る（３８）。ＰＣＲスクリーニングは、野生型ｌａｃＺが存在しないことを示したが、ＰＣＲアンプリコンはネイティブのｌａｃＺ遺伝子座に対応せず；むしろ、別のゲノム遺伝子座におけるＩＳエレメント隣接配列が増幅された。β－ガラクトシダーゼ活性の喪失の要因である遺伝子型を調べるために、Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅシーケンシングを、２つのクローンについて行なった（１つは、ｌａｃＺの５’末端を標的化するＣＲＩＳＰＲ３から生産され、１つは、β－ガラクトシダーゼ触媒作用に必要なイオン結合ポケットをコードする配列を標的化するＣＲＩＳＰＲ３から生産される）（図７Ａおよび図７Ｂ）。このシーケンシング戦略を、その長い解読長（ｒｅａｄ ｌｅｎｇｔｈ）について用いて、ゲノム内のＩＳエレメントの多い数に起因する、正確な遺伝子座に対して確実にマッピングする解読の困難性を回避した（３５）。解読は、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェアを用いて参照ゲノム配列に対してマッピングされて、そして、ｌａｃＺオープンリーディングフレームをコードする大きなセグメント（約１０２ｋｂｐ）の不存在を明らかにした（図７Ａおよび図７Ｂ）。シーケンスされた両方の株は、大きな欠失の境界（ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ）の再現性が確認されて、欠失は、ｌａｃＺスペーサー配列または標的化に用いられるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとは独立に起きることが示された。しかしながら、シーケンシングデータは、欠失の正確なジャンクションを確実には示さなかった。
欠失した１０２ｋｂｐセグメントは、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの１．８６Ｍｂｐゲノムのおよそ５．５％を構成する。領域は、ＡＢＣトランスポーター、２成分制御システム、バクテリオシン合成遺伝子、ファージ関連タンパク質、ラクトース異化作用遺伝子、および、注釈付けられた（ａｎｎｏｔａｔｅｄ）機能を持たないいくつかのクリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）遺伝子をコードする、１０２個の推定ＯＲＦ（ＳＴＥＲ＿１２７８－１３７９）を含んだ（３５）。増殖の表現型に対する、欠失の効果を、経時的にＯＤ６００ｎｍを測定することによって、ブロス培養において評価した（図７Ｃ）。欠失クローンは、より長い遅滞期（ｌａｇ ｐｈａｓｅ）、より低い最終ＯＤ（ｐ＜０．０１）を有することが分かり、野生型の６２分と比較して、対数期の間に、平均１０３分という、有意により長い世代時間を示した（ｐ＜０．００１）。欠失誘導体は、世代あたり、複製するために、５．５％少ないゲノム（５．５％ ｌｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｔｏ ｒｅｐｌｉｃａｔｅ ｐｅｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を有し、除去されたＯＲＦの転写または翻訳において資源を消費しないが、野生型と比較して適合性の明らかな増大は観察されなかった。β－ガラクトシダーゼ活性は、乳酸菌の産業用途に関するホールマーク特性であり、酸性化を通した食品システムの保存に必須である。したがって、ｌａｃＺ欠失Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株がミルクを酸化する能力を、ｐＨをモニタリングすることによって評価した（図７Ｄ）。予想通りに、欠失株は、野生型において見られる迅速な酸性化表現型と明らかに対照的に、実験全体においてミルクを酸化することができなかった。
実施例９．ゲノムの欠失は、相同ＩＳエレメント間の組み換えを通して生じる
欠失のメカニズムを調べるために、セグメントに隣接するヌクレオチド配列を決定した。ジャンクションに見られる唯一の相同配列は、全体的に７２７ｂｐにわたって９１％のヌクレオチド配列同一性を示す２つのトランケートされたＩＳ１１９３挿入配列であった。したがって、２つのＩＳエレメントに隣接するプライマーペアを、欠失を示している生き残ったクローンのゲノムＤＮＡを増幅するように設計した。欠失株のそれぞれは、予測されたサイズ（約１．２ｋｂ）の強いバンドを示し、大きなゲノムの欠失イベントが確認された（図８Ａ）。興味深いことに、染色体欠失に対応するわずかなアンプリコンが野生型において観察され、この領域は、野生型集団内で低い割合でゲノムから自然に切除され得ることを示した。ジャンクションアンプリコンのシーケンスを、ＣＲＩＳＰＲ３による染色体自己標的化によって生産された２０クローンについて行なった。遺伝子座の遺伝子型決定は、それぞれのクローン内に１つのキメラＩＳエレメントの存在を明らかにし、したがって、それぞれのクローンに関してキメラ内での上流エレメントから下流配列への移行を明らかにした（図８Ｂ）。観察された欠失のサイズは、１０１，８６５～１０２，１４６ｂｐの範囲だった。移行の正確な遺伝子座は可変であったが、クローン内ではランダムではなく、欠失メカニズムの潜在的傾向を暗示した。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは、ＲｅｃＡ（ＳＴＥＲ＿００７７）、デュアルのＡＴＰ－依存性ＤＮＡエキソヌクレアーゼとして機能するＡｄｄＡＢ相同体（ＳＴＥＲ＿１６８１およびＳＴＥＲ＿１６８２）、および、ＲｅｃＤファミリーのヘリカーゼ（ＳＴＥＲ＿１７４２）としてコードされる典型的な組み換え機構を保有した。隣接するＩＳエレメント間の高いヌクレオチド同一性、および、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが部位特異的な組み換えを行なう能力（４）は、ＲｅｃＡが仲介する組み換えが、ゲノムのセグメントの切断を仲介する潜在性を確認する（図８Ｃ）。
欠失のメカニズムを調べるために、セグメントに隣接するヌクレオチド配列を決定した。ジャンクションに見られる唯一の相同配列は、全体的に７２７ｂｐにわたって９１％のヌクレオチド配列同一性を示す２つのトランケートされたＩＳ１１９３挿入配列であった。したがって、２つのＩＳエレメントに隣接するプライマーペアを、欠失を示している生き残ったクローンのゲノムＤＮＡを増幅するように設計した。欠失株のそれぞれは、予測されたサイズ（約１．２ｋｂ）の強いバンドを示し、大きなゲノムの欠失イベントが確認された（図８Ａ）。興味深いことに、染色体欠失に対応するわずかなアンプリコンが野生型において観察され、この領域は、野生型集団内で低い割合でゲノムから自然に切除され得ることを示した。ジャンクションアンプリコンのシーケンスを、ＣＲＩＳＰＲ３による染色体自己標的化によって生産された２０クローンについて行なった。遺伝子座の遺伝子型決定は、それぞれのクローン内に１つのキメラＩＳエレメントの存在を明らかにし、したがって、それぞれのクローンに関してキメラ内での上流エレメントから下流配列への移行を明らかにした（図８Ｂ）。観察された欠失のサイズは、１０１，８６５～１０２，１４６ｂｐの範囲だった。移行の正確な遺伝子座は可変であったが、クローン内ではランダムではなく、欠失メカニズムの潜在的傾向を暗示した。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは、ＲｅｃＡ（ＳＴＥＲ＿００７７）、デュアルのＡＴＰ－依存性ＤＮＡエキソヌクレアーゼとして機能するＡｄｄＡＢ相同体（ＳＴＥＲ＿１６８１およびＳＴＥＲ＿１６８２）、および、ＲｅｃＤファミリーのヘリカーゼ（ＳＴＥＲ＿１７４２）としてコードされる典型的な組み換え機構を保有した。隣接するＩＳエレメント間の高いヌクレオチド同一性、および、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが部位特異的な組み換えを行なう能力（４）は、ＲｅｃＡが仲介する組み換えが、ゲノムのセグメントの切断を仲介する潜在性を確認する（図８Ｃ）。
次に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ標的化を、同一の遺伝的構造を有するそれぞれの遺伝子座に関する欠失の単離を促進する能力について評価した。この目的のために、３つのＣＲＩＳＰＲ３リピート－スペーサーアレイ（第一の遺伝子座内のオリゴヌクレオチドトランスポーター、第二の遺伝子座由来のｐｒｔＳ、および、第三の遺伝子座由来のＡＴＰアーゼ銅流出遺伝子を標的化するもの）を生産して、ｐＯＲＩ２８にクローニングした（図５）。欠失についてスクリーニングするために、それぞれの遺伝子座でＩＳエレメントに隣接するプライマーを、それぞれの欠失ジャンクションが増幅されるように設計した（図８Ｄ）。また、野生型遺伝子座の不存在も、それぞれのゲノムアイランドに関する内部プライマーを設計することによって、それぞれの場合において確認された（図８Ｅ）。標的化プラスミドを用いた形質転換の後に、それぞれの遺伝子座における欠失を単離して、野生型の不存在を確認した。欠失ジャンクションアンプリコンのシーケンシングは、単一のキメラＩＳエレメントフットプリントの残存を確認し、それぞれの遺伝子座における欠失に関する一般的なメカニズムを示した。興味深いことに、ＩＳエレメントに隣接するプライマーは、野生型ｇＤＮＡからも増幅されて、さらに驚くべきことに、それぞれの遺伝子座で自然に生じた集団異質性は、自然発生的なゲノムの欠失に起因した。これらの結果は、配列特異的なＣａｓ９切断が、標的化に必要なプロトスペーサーおよびＰＡＭの組み合わせを欠く変異を選択することを暗示する。したがって、自然発生的なゲノムの欠失は、これらのゲノムアイランドを既に失っている微生物変異に関する強い選択として、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ標的化を用いて単離することができる。
実施例１０．集団スクリーニング
本研究では、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに保有されるネイティブのＩＩＡ型システムを、大きなゲノムアイランドの自然発生的な欠失を定義するために再利用した。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ内の４つのアイランドを独立に標的化することによって、合わせてゲノムの合計７％を喪失している安定した突然変異体が生産された。欠失ジャンクションの特性化は、ＩＳ－依存性の組み換えメカニズムが集団異質性に寄与することを示唆し、８～１０２ｋｂｐの範囲の欠失イベントを明らかにした。キメラＩＳエレメントの正確なマッピングは、天然の組み換えイベントが、おそらく、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおける大きな染色体欠失の要因であり、標的化されたゲノム編集に潜在的に活用され得ることを示した。
本研究では、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに保有されるネイティブのＩＩＡ型システムを、大きなゲノムアイランドの自然発生的な欠失を定義するために再利用した。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ内の４つのアイランドを独立に標的化することによって、合わせてゲノムの合計７％を喪失している安定した突然変異体が生産された。欠失ジャンクションの特性化は、ＩＳ－依存性の組み換えメカニズムが集団異質性に寄与することを示唆し、８～１０２ｋｂｐの範囲の欠失イベントを明らかにした。キメラＩＳエレメントの正確なマッピングは、天然の組み換えイベントが、おそらく、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおける大きな染色体欠失の要因であり、標的化されたゲノム編集に潜在的に活用され得ることを示した。
我々の結果は、野生型クローンが集団から除去され、一方で、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓによって標的化される機構のない突然変異体は生き残ったことを示す。したがって、適応性のアイランドが同定および確認されて、内因性Ｃａｓ９による正確な標的化を、混合された集団における大きな欠失変異株を単離するために活用することができることを示した。
細菌のゲノム進化は、遺伝子水平伝播、内因性の突然変異、および、ゲノム再構築を通して生じる。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株のゲノムシーケンシングおよび比較分析は、有意なゲノム減衰を明らかにしているが、栄養豊富な食料環境に対する適応がニッチ特異的な遺伝子獲得を通して生じたことも示す（１８；３５）。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノム内の、組込みおよびコンジュゲートエレメント、プロファージ、およびＩＳエレメントを含む、ＭＧＥの存在は、乳製品環境に対する迅速な進化を示す（３８～３９）。可動遺伝機構は、遺伝子獲得、および反対に、非必須配列の不活性化または喪失を促進する。その結果として、ＭＧＥは、適合性を増大または生態学的生活様式を変更する手段として、ゲノムの可塑性を与える。我々の結果は、これらのエレメントのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ標的化は染色体再配列およびホメオスタシスに影響し得ることを強く示す。これは、必須の機構を標的化する実験とは対照的であり、不活化されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ機構を有する変異体の選択をもたらす（Ｊｉａｎｇ ２０１３）。必須ＯＲＦの突然変異は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ標的化の回避のための生存可能な道ではなく、したがって、不活化されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを有するクローンのみが残る。高頻度可変性および消費されてよいと予測される遺伝因子を標的化して設計することによって、変更された遺伝子座を有する変異体が生存可能であることが示されて、活性のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、自己標的化イベントのあいだ維持された。
細菌ゲノム内でのＩＳエレメントのほぼユビキタスな分配にもかかわらず、それらは、機能におけるそれらの多様性および可塑性に主に起因して、不可解な遺伝的物質を維持する（３４）。我々の結果は、関連するＩＳエレメント間の組み換えを、それらの位置、方位、および配列保存を分析することによって予測することが可能であることを示唆する（図４および図５）。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ標的化を用いて、それぞれの予測された遺伝子座における集団異質性を実験的に確証することができ、および同時に、低い発生率の突然変異体の回収を増大させることができる。乳酸菌、および特にＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおけるＭＧＥの高い普及性は、ゲノム進化を通したこれらの過剰に適合された細菌の種分化におけるそれらの役割に従う（３９～４０）。さらに、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ標的化を用いたゲノム欠失突然変異体の回収は、機能未知の遺伝子の表現型特性化を促進することができる。ｌａｃオペロンをコードする１０２ｋｂアイランドの欠失を示す突然変異体は、野生型と比較して有意に増大した世代時間を有し、より低い最終ＯＤを達成した。その中に１０２個の予測されたＯＲＦがあるので、さらなる表現型が影響を受けて、遺伝子の多くは注釈付けられた機能を有さないと考えられる。ｐｒｔＳのようなニッチ特異的な遺伝子の産業的関連性を考慮すると、この方法は、アイランドによってコードされる遺伝子がミルクにおいて増殖するための適合にどのように寄与するかについて、直接的な評価を可能にする。さらに、それらはおそらく分離したアイランドとして獲得されたのだろうと考えられるので、それは、これらの水平的に獲得された形質の天然のゲノム的および生態学的コンテキスト内にある。これらの結果は、転位、ＤＮＡ修復メカニズム、およびゲノム可塑性を調べるための細菌における自己標的化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの適用に関する新たな道を確立する。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、一般に、遺伝因子との干渉を通して遺伝的多様性を制限するが、獲得されたＭＧＥは、宿主細菌に対して適応性の利点を与えることもできる。したがって、ゲノム的に組み込まれたＭＧＥを維持する利点は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ標的化にかかわらず、ゲノムホメオスタシスの重要なドライバーである。まとめると、我々の結果は、インシリコでのＧＥＩの予測を、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ標的化と結び付けて、大きなゲノム欠失を示しているクローンを単離することができることを確立した。それぞれの欠失ジャンクションにおけるキメラ挿入配列フットプリントは、４つのアイランド全てに関する欠失の共通したメカニズムを示した。ゲノム遺伝子座に対する同一性を示している自己標的化スペーサーの高い普及性は、ゲノム変化の実験的論証と組み合わせて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ自己標的化は、細菌のゲノム進化に著しく寄与し得ることを示唆する（２８；３０）。まとめると、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓによって誘導される大きな欠失に関する研究は、注釈を欠いている遺伝子クラスターの必須性および機能性を評価するための迅速かつ効果的な手段としてこのアプローチを具体化し、および、転位性エレメントを通して生じる染色体欠失に基づいて、最小細菌ゲノムを定義する。
図９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９のゲノムの標的化を介してＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに基づく致死性を評価するための規定された遺伝子座を示す。この分析を行なうための方法は、当技術分野で知られている。Ｓｅｌｌｅ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ ＰＮＡＳ．１１２（２６）：８０７６－８０８１（２０１５）を参照。
オルトゴナルＩＩ型システム（ＣＲＩＳＰＲ１およびＣＲＩＳＰＲ３）の両方とも試験した；ＣＲＩＳＰＲ１は濃い灰色において標的化し、ＣＲＩＳＰＲ３は薄い灰色において標的化する。特異的な遺伝的特徴を選択して、（ｉ）遺伝子間領域（ＩＮＴ）、（ｉｉ）可動遺伝要素（ＩＳ、ＧＥＩ１－ＧＥＩ３、ＰＲＯ、ｌａｃＺ、ＥＰＳ）、（ｉｉｉ）必須遺伝子（ｄｌｔＡ、ＬＴＡ）、（ｉｖ）レプリコアのポール（ＯＲＩ、ＴＥＲ）、および、ＤＮＡのフォワード、対、リバース鎖（外側標的、対、内側標的）を試験した。
図１０は、図９で定義された領域を標的化することによって得られた、ＣＲＩＳＰＲに基づく致死性を示す。ＣＦＵのＬｏｇ減少を、非標的化プラスミドコントロール；ｐＯＲＩ２８の形質転換に関して計算した。致死性は、染色体位置、コード配列、または必須性にかかわらず、試験されたすべての標的に関して、２～３ ｌｏｇ減少の範囲だった。
図１１は、ＣＲＩＳＰＲが仲介するゲノムアイランド欠失株の転写プロファイルを示す。ゲノムアイランド１～４のＣＲＩＳＰＲ標的化を生き残る細胞の回収および遺伝子型決定は、それぞれの実験において、標的化されたゲノムアイランドを欠いている安定的な非依存性突然変異体の同定をもたらした。続いて、細胞を繁殖させて、それらの全ＲＮＡを単離してシーケンシングした。このアプローチを用いて、転写プロファイルを、参照ゲノムに対してシーケンシング解読をマッピングすることによって生産した。それぞれの場合において、予測されたゲノムアイランド遺伝子座に対するシーケンシング解読の不存在は、残りのゲノムの至る所に、コア遺伝子の発現に対して最小限の影響を有しながら、標的の遺伝的物質の喪失をさらに示唆した。
さらに、ＲＮＡシーケンシングデータは、解読範囲および転写値比較を用いることにより、欠失の境界をサポートし、そして、同一のデータセットを用いて生産された比較トランスクリプトミクスを用いて、表現型の識別をさらにサポートする。具体的には、ハイスループットＲＮＡシーケンシングを用いた、予測された欠失領域に存在する転写活性の喪失は、図１２に示されるように確認される。図１２は、ゲノムアイランド欠失株の、ｌｏｇ２形質転換されたＲＮＡシーケンシング解読範囲を示し、それぞれのゲノムアイランド株（ＧＥＩ１～ＧＥＩ４）に関して、予測されたゲノムアイランド遺伝子座に対するシーケンシング解読の不存在は、残りのゲノムの至る所に、コア遺伝子の発現に対して最小限の影響を有しながら、標的の遺伝的物質の喪失をさらに示唆した。
図１３は、欠失した遺伝子に関する転写活性の喪失をさらに確認する。ゲノムアイランド欠失株のそれぞれについて（ＧＥＩ１～ＧＥＩ４）、標的アイランド（黒）のそれぞれの上にコードされる遺伝子の発現は、最小限であった。ＧＥＩ１内にコードされる遺伝子を上の左パネルに示し、ＧＥＩ２内にコードされる遺伝子を上の右パネルに示し、ＧＥＩ３内にコードされる遺伝子を下の左パネルに示し、ＧＥＩ４内にコードされる遺伝子を下の右パネルに示す。概して、ゲノムアイランド欠失１および２は、他の遺伝子の転写に最小限の影響を有し（灰色）、一方で、ゲノムアイランド３および４は、アイランド上にコードされない他の遺伝子の転写に影響を及ぼすようだった。
加えて、ＲＮＡシーケンシングデータを用いて、欠失したアイランド（ＧＥＩ４）上にコードされない遺伝子、すなわち、染色体にまだ存在する他の遺伝子の転写レベルを比較して、ゲノムの欠失と関連する表現型を特定した。欠失株において示差的に転写される遺伝子は、失われた遺伝子によって細胞プロセスが影響を受けたこと、または、これらの遺伝子の活性の喪失に関する代償が存在することを示唆する。したがって、これらの遺伝子またはゲノム領域が関連する経路について推論することができる。表５は、欠失株ＧＥＩ４において同定された示差的に発現される遺伝子のリストを提供する。示差的に発現されることが観察された遺伝子の多くは、芳香族アミノ酸およびプリン生合成を含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの生合成能力に関する。
実施例１１．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いた、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉの標的化した死滅
Ｌ．Ｃａｓｅｉの例示的なＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＩＩ型ガイドを図１５に提供する。上のパネルは、予測されたガイドを提供し、一方で、下の左パネルは、例示的なデュアルガイド構造を示し、下の右パネルは、例示的な単一ガイド構造を示す。
Ｌ．Ｃａｓｅｉの例示的なＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＩＩ型ガイドを図１５に提供する。上のパネルは、予測されたガイドを提供し、一方で、下の左パネルは、例示的なデュアルガイド構造を示し、下の右パネルは、例示的な単一ガイド構造を示す。
実施例１２．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いた、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉの標的化した死滅
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの標的化した死滅のための例示的なＩＩ型ガイドを図１６に提供する。上のパネルは、予測されたガイドを提供し、一方で、下の左パネルは、正確なデュアルガイドｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡを提供し（ＲＮＡシーケンスによって確認した）、下の右パネルは、例示的な予測された単一ガイドを提供する。
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの標的化した死滅のための例示的なＩＩ型ガイドを図１６に提供する。上のパネルは、予測されたガイドを提供し、一方で、下の左パネルは、正確なデュアルガイドｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡを提供し（ＲＮＡシーケンスによって確認した）、下の右パネルは、例示的な予測された単一ガイドを提供する。
プラスミドを、それぞれ以下の異なる構築物を保有するＬ．ｇａｓｓｅｒｉに形質転換した：空のｐＴＲＫ５６３ベクター、正確なプロトスペーサーであるが不正確なＰＡＭを有する構築物、正確なＰＡＭであるがアレイ内でないプロトスペーサー、および、ＰＡＭを有する正確なプロトスペーサー。結果を図１９に示す。正確なプロトスペーサーおよび正確なＰＡＭを有するプラスミドは、有意により多くの干渉の標的化および細胞死を示した。
実施例１３．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いた、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓの標的化した死滅
Ｌ．ｐｅｎｔｏｓｕｓの標的化した死滅のための例示的なＩＩ型ガイドを図１７に提供する。上のパネルは、予測されたガイドを示す。下の左のパネルは、正確なデュアルガイドｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡであり（ＲＮＡシーケンシングによって確認した）、下の右パネルは、例示的な予測された人工の単一ガイドである。
Ｌ．ｐｅｎｔｏｓｕｓの標的化した死滅のための例示的なＩＩ型ガイドを図１７に提供する。上のパネルは、予測されたガイドを示す。下の左のパネルは、正確なデュアルガイドｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡであり（ＲＮＡシーケンシングによって確認した）、下の右パネルは、例示的な予測された人工の単一ガイドである。
プラスミドをＬ．ｐｅｎｔｏｓｕｓに形質転換して、それぞれのプラスミドは、以下の異なる構築物を保有した：正確なプロトスペーサーであるが不正確なＰＡＭを有する構築物、正確なＰＡＭであるがアレイ内でないプロトスペーサーを有する構築物、空のｐＴＲＫ５６３ベクター、および、正確なＰＡＭを有する正確なプロトスペーサー。結果を図２０に示す。正確なプロトスペーサーおよび正確なＰＡＭを有するプラスミド（Ｌｐｅ１ ｇｔｔａａｔ）は、有意により多くの干渉の標的化および細胞死を示した。
実施例１４．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いた、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉの標的化した死滅
図１８は、例示的なＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＩＩ型ガイドを提供する。左のパネルは、ＲＮＡシーケンスによって確認された正確なデュアルガイドｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡであり、右のパネルは、例示的な予測された人工の単一ガイドである。
図１８は、例示的なＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＩＩ型ガイドを提供する。左のパネルは、ＲＮＡシーケンスによって確認された正確なデュアルガイドｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡであり、右のパネルは、例示的な予測された人工の単一ガイドである。
プラスミドを、それぞれ以下の異なる構築物を保有するＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉに形質転換した：空のｐＴＲＫ５６３ベクターを含む構築物、正確なプロトスペーサーであるが不正確なＰＡＭを有する構築物、正確なＰＡＭであるがアレイ内でないプロトスペーサーを有する構築物、および、正確なＰＡＭと正確なプロトスペーサーを有する構築物。結果を図２２に示す。正確なプロトスペーサーおよび正確なＰＡＭを有するプラスミドは、実質的により多くの干渉の標的化および細胞死を示した。
実施例１５．Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いた、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＮＣＫ １２５の標的化した死滅
図２１は、Ｌ．ｃａｓｅｉの例示的なＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓガイドを提供し、それは、Ｌ．ｃａｓｅｉ ＮＣＫ １２５に見られるネイティブのＩ型リーダーおよびリピートの配列を含む。ＰＡＭ５’－ＹＡＡ－３’は、生物におけるネイティブのスペーサー配列を用いて予測された。人工的なアレイは、宿主ゲノム内の１６ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を標的化するスペーサーを含む。結果を図２２に提供し、それは、空のベクターおよび２つの異なる人工的アレイの間の有意な縮小を示す：その１つは、１６ｓ遺伝子の＋鎖を標的化する単一スペーサーを含み（１－２ ａｌｔ）、他方は、＋鎖を標的化するオリジナルのスペーサーを含むが、１６ｓ遺伝子の－鎖を標的化するさらなるスペーサーを含む（１、２－３）。
図２１は、Ｌ．ｃａｓｅｉの例示的なＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓガイドを提供し、それは、Ｌ．ｃａｓｅｉ ＮＣＫ １２５に見られるネイティブのＩ型リーダーおよびリピートの配列を含む。ＰＡＭ５’－ＹＡＡ－３’は、生物におけるネイティブのスペーサー配列を用いて予測された。人工的なアレイは、宿主ゲノム内の１６ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を標的化するスペーサーを含む。結果を図２２に提供し、それは、空のベクターおよび２つの異なる人工的アレイの間の有意な縮小を示す：その１つは、１６ｓ遺伝子の＋鎖を標的化する単一スペーサーを含み（１－２ ａｌｔ）、他方は、＋鎖を標的化するオリジナルのスペーサーを含むが、１６ｓ遺伝子の－鎖を標的化するさらなるスペーサーを含む（１、２－３）。
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、例えば、（ｉ）いずれかの医学的介入（例えば、病原体、制限されないが、菌類、線虫類、原虫類（例えば、マラリア）、条虫類、球虫類（微胞子虫類）、吸虫類、舌形動物、鈎頭虫類、節足動物などを含む）の場合における病原体の標的化された縮小のため；（ｉｉ）消耗品（食品システム、動物、作物）の保護のため；（ｉｉｉ）産業的発酵プロセス（生の材料、処理装置、スターター培養）からの好ましくない生物の制御および／または除去のため、および、（ｉｖ）エコシステムおよび／または化学サイクルに影響を与える環境微生物コンソーシアムの制御のため、ならびに、治療のために、用いてよい。
参考文献
前述は本発明の例示であり、その制限と解釈されるべきでない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲の同等物はそれに含まれる。
Claims (31)
- 必須遺伝子、非必須遺伝子、および／または消費されてよい（ｅｘｐｅｎｄａｂｌｅ）ゲノムアイランドに関して、細菌細胞の集団をスクリーニングする方法であって、
細菌細胞の前記集団に、（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物を導入するステップ（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列の前記スペーサーは、前記集団の前記細菌細胞の前記ゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、それにより、形質転換された細菌細胞の集団を生産する）；および
形質転換された細菌細胞の前記集団における欠失の存在または不存在を判定するステップ（ここで、形質転換された細菌細胞の前記集団における欠失の存在は、前記標的領域が非必須遺伝子および／または消費されてよいゲノムアイランド内に含まれることを示し、および、前記集団における欠失の不存在は、前記標的領域が必須遺伝子内に含まれることを意味する）
を含む、
方法。 - 必須遺伝子、非必須遺伝子、および／または消費されてよいゲノムアイランドに関して、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団をスクリーニングする方法であって、
細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記集団に、（ａ）トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物、（ｂ）（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列の前記スペーサーは、前記集団の前記の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記ゲノム（染色体および／またはプラスミド）内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含む）、および、（ｃ）Ｃａｓ９ポリペプチドまたはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物、を導入するステップ（それにより、形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団を生産する）；および
形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記集団における欠失の存在または不存在を判定するステップ（ここで、形質転換された細菌、古細菌または酵母細胞の前記集団における欠失の存在は、前記標的領域が非必須遺伝子および／または消費されてよいゲノムアイランド内に含まれることを意味し、形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記集団における欠失の不存在は、前記標的領域が必須遺伝子内に含まれることを意味する）、
を含む、
方法。 - 細菌細胞の集団内の１つまたは複数の細菌細胞を死滅させる方法であって、
細菌細胞の前記集団に、（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイ（ｃｒＲＮＡ、ｃｒＤＮＡ）を含む異種核酸構築物を導入するステップを含み、
ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列の前記スペーサーは、前記集団の前記細菌細胞の前記ゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、それにより、細菌細胞の前記集団内の前記標的領域を含む１つまたは複数の細菌細胞を死滅させる、
方法。 - 細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団内の１つまたは複数の細胞を死滅させる方法であって、
細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記集団に、（ａ）トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物、（ｂ）（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列の前記スペーサーは、前記集団の前記の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記ゲノム（染色体および／またはプラスミド）内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含む）、および、（ｃ）Ｃａｓ９ポリペプチドおよび／またはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物、を導入するステップを含み、
それにより、それらのゲノム内の前記標的領域を含む細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団内の１つまたは複数の細胞を死滅させる、
方法。 - 請求項３または４の方法であって、
前記標的領域は、必須遺伝子または非必須遺伝子内にある、
方法。 - 細菌遺伝子と関連する表現型を同定する方法であって、
細菌細胞の集団に、（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物を導入するステップ（ここで、前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列およびリピート－スペーサー－リピート配列の前記スペーサーは、前記集団の前記細菌細胞の前記ゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、ここで、前記標的領域は、ポリペプチドまたは機能性核酸をコードするオープンリーディングフレームの少なくとも一部を含み、それにより、前記標的領域を含む前記細胞を死滅させ、そして、前記標的領域を含まない形質転換された細菌細胞の集団を生産する）；および、
前記集団の表現型を分析するステップ、
を含む、
方法。 - 請求項６の方法であって、
分析するステップの前に、形質転換された細菌細胞の前記集団から個々の細菌コロニーを増殖させるステップ；および
前記の個々のコロニーの表現型を分析するステップ、
を含む、
方法。 - 細菌、古細菌、藻類または酵母遺伝子の表現型を同定する方法であって、
細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団に、（ａ）トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物、（ｂ）（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列の前記スペーサーは、前記集団の前記の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記ゲノム（染色体および／またはプラスミド）内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含む）、および、（ｃ）Ｃａｓ９ポリペプチドおよび／またはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物、を導入するステップ（それにより、前記標的領域を含む前記の細菌、古細菌または酵母細胞を死滅させ、そして、前記標的領域を含まない形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団を生産する）；および
形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記集団の表現型を分析するステップ、および／または、（ｉ）形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記集団から、個々の細菌、古細菌、藻類または酵母コロニーを増殖させるステップ、および、（ｉｉ）前記の個々のコロニーの表現型を分析するステップ、
を含む、
方法。 - 請求項１、３、６、または７のいずれか一項の方法であって、
前記ＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲアレイである、
方法。 - 請求項９の方法であって、
前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列は、野生型Ｉ型ＣＲＩＳＰＲアレイ、野生型ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイ、野生型ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイ、野生型ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲアレイ、または、野生型Ｖ型ＣＲＩＳＰＲアレイ由来のリピートと同一のリピートを含む、
方法。 - 請求項２、４、５または８のいずれか一項の方法であって、
前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列は、野生型ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイ由来のリピートと同一のリピートを含む、
方法。 - 請求項１から１１のいずれか一項の方法であって、
前記標的領域は、無作為に選択される、または、特異的に選択される、
方法。 - 請求項１２の方法であって、
無作為に選択される標的領域は、細菌、古細菌または酵母ゲノム内のＰＡＭ配列に隣接して配置された、任意の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドから選択される、
方法。 - 請求項１２の方法であって、
特異的に選択される標的領域は、細菌、古細菌、藻類または酵母ゲノム内のＰＡＭ配列に隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む、遺伝子、オープンリーディングフレームまたは推定のオープンリーディングフレームから選択される、
方法。 - 請求項２、４、５、８、１１から１４のいずれか一項の方法であって、
トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む前記異種核酸構築物およびＣＲＩＳＰＲアレイを含む前記異種核酸構築物は、場合によりＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物をさらに含むＣＲＩＳＰＲガイド（ｇＲＮＡ、ｇＤＮＡ）内に含まれる、
方法。 - 請求項１５の方法であって、
前記ＣＲＩＳＰＲガイドは、プロモーターに動作可能に連結される、
方法。 - 細菌細胞の集団から、縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌細胞を選択する方法であって、
細菌細胞の集団に、（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物を導入するステップ（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列の前記スペーサーは、前記集団の１つまたは複数の細菌細胞の前記ゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、ここで、前記標的領域を含む細胞は死滅して、それにより、細菌細胞の前記集団から、前記標的領域を含まない縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌細胞を選択する）、
を含む、
方法。 - 細菌細胞の集団から、縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌細胞を選択する方法であって、
細菌細胞の集団に、
（ａ）（ｉ）前記細菌細胞の前記ゲノム内に存在する少なくとも３００個の連続したヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、１つまたは複数の異種核酸構築物、または、（ｉｉ）少なくとも１つのトランスポゾンを含む２以上の異種核酸構築物（それにより、前記ゲノム中に組み込まれた前記の１つまたは複数の異種核酸構築物および前記ゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、または、前記ゲノム中に組み込まれた第１および第２のトランスポゾンの間の、相同組み換えに関する非天然部位を含むトランスジェニック細菌細胞の集団を生産する）；および
（ｂ）（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物、を導入するステップ（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列の前記スペーサーは、前記集団の１つまたは複数の細菌細胞の前記ゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、ここで、前記標的領域は、前記ゲノム中に導入された前記の１つまたは複数の異種核酸構築物および前記ゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、および／または、前記の第１のトランスポゾンおよび第２のトランスポゾンの間に位置し、前記標的領域を含む細胞は死滅して、それにより、トランスジェニック細菌細胞の前記集団から、前記標的領域を含まない縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌細胞を選択する）、
を含む、
方法。 - 細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団から、縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞を選択する方法であって、
細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団に、
（ａ）トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物、
（ｂ）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物（ここで、前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列および前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー－リピート配列の前記スペーサーは、前記集団の前記の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記ゲノム（染色体および／またはプラスミド）内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含む）、および
（ｃ）Ｃａｓ９ポリペプチドおよび／またはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物、を導入するステップ（ここで、前記標的領域を含む細胞は死滅して、それにより、細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記集団から、前記標的領域を含まない縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞を選択する）、
を含む、
方法。 - 細菌、古細菌または酵母細胞の集団から、縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞を選択する方法であって、
細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団に、
（ａ）（ｉ）前記の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記ゲノム内に存在する少なくとも３００個の連続したヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、１つまたは複数の異種核酸構築物、または、（ｉｉ）少なくとも１つのトランスポゾンを含む２以上の異種核酸構築物（それにより、前記ゲノム中に組み込まれた前記の１つまたは複数の異種核酸構築物および前記ゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、または、前記ゲノム中に組み込まれた第１および第２のトランスポゾンの間の、相同組み換えに関する非天然部位を含むトランスジェニック細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団を生産する）；および
（ｂ）（ｉ）トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物、（ｉｉ）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物（ここで、前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列および前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー－リピート配列の前記スペーサーは、前記集団の１つまたは複数の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記ゲノム（染色体および／またはプラスミド）内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含む）、および、（ｉｉｉ）Ｃａｓ９ポリペプチドおよび／またはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物、を導入するステップ（ここで、前記標的領域は、前記ゲノム中に組み込まれた前記の１つまたは複数の異種核酸構築物および前記ゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、および／または、前記の第１のトランスポゾンおよび第２のトランスポゾンの間に位置し、および、前記標的領域を含む細胞は死滅して、それにより、トランスジェニック細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記集団から、前記標的領域を含まない縮小されたゲノムサイズを有する１つまたは複数の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞を選択する）、
を含む、
方法。 - 細菌の集団において、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する方法であって、
細菌細胞の集団に、（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物を導入するステップ（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列の前記スペーサーは、前記集団の１つまたは複数の細菌細胞の前記ゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、ここで、前記標的領域を含む細胞は死滅して、それにより、前記標的領域を含まない形質転換された細菌細胞の集団を生産する）；および
形質転換された細菌細胞の前記集団から個々の細菌コロニーを増殖させるステップ（それにより、形質転換された細菌の前記集団から、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する）、
を含む、
方法。 - 細菌の集団において、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する方法であって、
細菌細胞の前記集団に、
（ａ）（ｉ）前記細菌細胞の前記ゲノム内に存在する少なくとも３００個の連続したヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、１つまたは複数の異種核酸構築物、または、（ｉｉ）少なくとも１つのトランスポゾンを含む２以上の異種核酸構築物（それにより、前記ゲノム中に組み込まれた前記の１つまたは複数の異種核酸構築物および前記ゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、または、前記ゲノム中に組み込まれた第１および第２のトランスポゾンの間の、相同組み換えに関する非天然部位を含むトランスジェニック細菌細胞の集団を生産する）；および
ｂ）（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物、を導入するステップ（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列の前記スペーサーは、前記集団の１つまたは複数の細菌細胞の前記ゲノム内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含み、ここで、前記標的領域は、前記ゲノム中に導入された前記の１つまたは複数の異種核酸構築物および前記ゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、および／または、前記の第１のトランスポゾンおよび第２のトランスポゾンの間に位置し、前記標的領域を含む細胞は死滅して、それにより、前記標的領域を含まない形質転換された細菌細胞の集団を生産する）；および
形質転換された細菌細胞の前記集団から個々の細菌コロニーを増殖するステップ（それにより、細菌の前記集団から、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する）、
を含む、
方法。 - 細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団において、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する方法であって、
細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団に、
（ａ）トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物、
（ｂ）（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列の前記スペーサーは、前記集団の前記の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記ゲノム（染色体および／またはプラスミド）内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含む）、および
（ｃ）Ｃａｓ９ポリペプチドまたはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物、を導入するステップ（ここで、前記標的領域を含む細胞は死滅して、それにより、前記標的領域を含まない形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団を生産する）；および
形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記集団から、個々の細菌、古細菌または酵母コロニーを増殖させるステップ（それにより、形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記集団から、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する）、
を含む、
方法。 - 細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団において、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する方法であって、
細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記集団に、
（ａ）（ｉ）前記の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記ゲノム内に存在する少なくとも３００個の連続したヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、１つまたは複数の異種核酸構築物、または、（ｉｉ）少なくとも１つのトランスポゾンを含む２以上の異種核酸構築物（それにより、前記ゲノム中に組み込まれた前記の１つまたは複数の異種核酸構築物および前記ゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、または、前記ゲノム中に組み込まれた第１および第２のトランスポゾンの間の、相同組み換えに関する非天然部位を含むトランスジェニック細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団を生産する）；および
（ｂ）（ｉ）トランスコード化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）核酸を含む異種核酸構築物、（ｉｉ）（５’から３’に）リピート－スペーサー－リピート配列または少なくとも１つのリピート－スペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含む異種核酸構築物（ここで、前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列の前記スペーサーは、前記集団の１つまたは複数の細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記ゲノム（染色体および／またはプラスミド）内の標的領域に実質的に相補なヌクレオチド配列を含む）、および、（ｉｉｉ）Ｃａｓ９ポリペプチドおよび／またはＣａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物、を導入するステップ（ここで、前記標的領域は、前記ゲノム中に組み込まれた前記の１つまたは複数の異種核酸構築物および前記ゲノム内に存在する前記の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドの間、および／または、前記の第１のトランスポゾンおよび第２のトランスポゾンの間に位置し、前記標的領域を含む細胞は死滅して、それにより、前記標的領域を含まない形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の集団を生産する）；および
形質転換された細菌、古細菌、藻類または酵母細胞の前記集団から、個々の細菌、古細菌または酵母コロニーを増殖させるステップ（それにより、前記集団から、そのゲノム内に欠失を有する少なくとも１つの単離物を同定する）、
を含む、
方法。 - 請求項１７、１８、２１、または２２のいずれか一項の方法であって、
前記ＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲアレイである、
方法。 - 請求項２５の方法であって、
前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列は、野生型Ｉ型ＣＲＩＳＰＲアレイ、野生型ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイ、野生型ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイ、野生型ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲアレイ、または、野生型Ｖ型ＣＲＩＳＰＲアレイ由来のリピートと同一のリピートを含む、
方法。 - 請求項１９、２０、２３、または２４のいずれか一項の方法であって、
前記リピート－スペーサー－リピート配列または前記の少なくとも１つのリピート－スペーサー配列は、野生型ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲアレイ由来のリピートと同一のリピートを含む、
方法。 - 請求項１５から２７のいずれか一項の方法であって、
前記標的領域は、無作為に選択される、または、特異的に選択される、
方法。 - 請求項２８の方法であって、
無作為に選択される標的領域は、細菌、古細菌または酵母ゲノム内のＰＡＭ配列に隣接して配置された任意の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドから選択される、
方法。 - 請求項２８の方法であって、
特異的に選択される標的領域は、細菌、古細菌、藻類または酵母ゲノム内のＰＡＭ配列に隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む、遺伝子、オープンリーディングフレームまたは推定のオープンリーディングフレームから選択される、
方法。 - 請求項３から５または請求項９から１５のいずれか一項の方法であって、
前記の導入されるＣＲＩＳＰＲアレイは、死滅される前記の１つまたは複数の細菌細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと適合し、細菌細胞の前記集団内の少なくとも１つまたは複数の細菌細胞の前記ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムと適合しない、
方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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