CN107904208B - 细胞表型研究用的细胞克隆及其筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞表型研究用的细胞克隆及其筛选方法和应用。该细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法可主要用于从未受实验处理的细胞中检索出某种细胞表型的细胞群,其中gRNA条码载体既作为条码,又能作用于检索工具,因而简化了检索和筛选的流程;gRNA‑sensor检索载体本身的第一报告基因不会正常表达,只有与特异性的gRNA条码和用于结合gRNA条码的核酸酶作用后才发出信号,因而可以检索过程定性;只要有第一报告基因相关的信号,就能被捕捉到,从而易于筛选获得阳性细胞克隆。筛选出的阳性细胞可以用于单个研究其有应答或表型形成的能力,可广泛应用在研究细胞表型或在制备用于研究细胞表型的试剂中。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,尤其是涉及一种细胞表型研究用的细胞克隆及其筛选方法和应用。
背景技术
在生物体内,细胞会有不同的表型,研究其出现不同表型的根本原因是非常重要的。以癌细胞为例,在癌症患者中,肿瘤细胞群会表现出不同的表型,如有的肿瘤细胞能增殖,有的会迁移,还有些具有抗药性等,这些不同表型是癌症研究进展和治疗反应中出现许多不可预测性的主要原因,因此了解肿瘤发生的基本生物学对于改善治疗结果是非常重要的。肿瘤细胞具有不同表型的根本原因可以归因于两个相互非排他性的可能性:一是患者内所有肿瘤细胞具有相同的内在表型潜力,但患者机体本身或用药过程中存在很多因素变量等随机原因使得只有部分肿瘤细胞表现出了某种表型;二是患者的肿瘤细胞群体在其遗传和表观遗传学上是异质性的,注定只有部分细胞表现出相应的表型。传统的有一些用于研究不同细胞群(如肿瘤细胞)出现不同表型的原因的方法,如专利CN102203281A,其制作条码克隆的工具是慢病毒过表达载体,通过在报告基因的5’UTR或3’UTR上放置10个碱基长的随机条码,理论上会有410种组合,其使用的检索工具是慢病毒shRNA干扰载体,对制作条码工具上的报告基因进行特异性打靶,从而筛选出荧光报告基因变弱的目的细胞。然而传统的研究方法普遍存在诸多问题,如使用shRNA干扰载体工具来检索条码,报告基因检测信号是由强变弱的过程,而有些细胞在生长传代过程中由于生长条件等外在因素的改变而易使本身的荧光有变弱的倾向,较易混杂阴性细胞,不利于观察和筛选;并且要想进一步剔除混杂细胞,要使用强力霉素再次筛选,对细胞又进行多一次处理,操作复杂的同时又可能影响了细胞的原始特性;此外,检索过程是定量的过程,不易检索出那些含有多个拷贝条码载体的细胞。
发明内容
基于此,有必要提供一种易于观察和筛选且检索效率高、检索结果可靠的细胞表型研究用的细胞克隆及其筛选方法和应用。
一种细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法,包括如下步骤:
步骤一:构建gRNA条码载体,所述gRNA条码载体具有表达用作标记条码的gRNA的表达框,所述gRNA条码载体有多种,且不同的gRNA条码载体中gRNA编码片段的序列不同,多种所述gRNA条码载体构成gRNA条码载体库;
步骤二:将所述gRNA条码载体库转导待研究的细胞,得到由多种含不同gRNA编码片段的细胞构成的细胞群,将所述细胞群分成实验组和预留组;
步骤三:对所述实验组的细胞群进行实验处理,筛选具有特定表型的实验组阳性细胞,获取所述实验组阳性细胞中与所述特定表型相对应的特定的gRNA编码片段的序列;
步骤四:针对获取的特定的gRNA编码片段的序列,构建特异性的gRNA-sensor检索载体,所述gRNA-sensor检索载体的表达框中含有第一报告基因以及插入在所述第一报告基因中的左同源臂、特定的gRNA编码片段、PAM和右同源臂,所述左同源臂与所述右同源臂与所述第一报告基因的部分序列片段同源;
步骤五:将构建的特异性的gRNA-sensor检索载体与能够表达用于结合gRNA条码的核酸酶的载体共同转导预留组的细胞群后,根据所述第一报告基因的表达情况筛选出阳性细胞,即得。
在其中一个实施例中,所述构建gRNA条码载体是将所述gRNA编码片段插入在具有自杀基因的载体中,替换自杀基因。
在其中一个实施例中,所述gRNA编码片段的两端还分别连接有保护序列片段和/或酶切位点识别片段。
在其中一个实施例中,所述gRNA条码的长度为18-23bp,优选为20bp。
在其中一个实施例中,所述保护序列片段的长度为40-50bp,优选为40bp。
在其中一个实施例中,所述gRNA条码载体还具有第二报告基因的表达框。
在其中一个实施例中,所述第二报告基因和/或所述第一报告基因是荧光蛋白基因和/或抗药性基因。
在其中一个实施例中,所述gRNA条码载体是慢病毒载体。
在其中一个实施例中,每个待研究的细胞转导有一种或两种gRNA条码载体。
在其中一个实施例中,在将所述细胞群分成实验组和预留组之前还包括对得到的细胞群进行扩大培养的步骤。
在其中一个实施例中,所述左同源臂和/或所述右同源臂的长度为180-300bp,优选为200bp。
在其中一个实施例中,所述能够表达用于结合gRNA条码的核酸酶的载体为能够表达Cas9或saCas9核酸酶的载体。
一种由上述任一实施例所述的细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法筛选得到的细胞克隆。
上述细胞克隆在研究细胞表型或在制备用于研究细胞表型的试剂中的应用。
本发明的细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法可主要用于从未受实验处理的细胞中检索出某种细胞表型(包括对某种实验处理有应答倾向)的细胞群,其中gRNA条码载体既作为条码,又能作用于检索工具,因而简化了检索和筛选的流程;其次,gRNA-sensor检索载体本身的第一报告基因不会正常表达,只有与特异性的gRNA条码和用于结合gRNA条码的核酸酶作用后才发出信号,因而可以检索过程定性;再次,只要有第一报告基因相关的信号,就能被捕捉到,从而易于筛选获得阳性细胞克隆。
筛选出的阳性细胞可以用于单个研究其有应答或表型形成的能力,以进一步确定细胞具有不同表型的根本原因,可广泛应用在研究细胞表型或在制备用于研究细胞表型的试剂中。
附图说明
图1为细胞表型研究用的细胞克隆的筛选流程示意图;
图2为gRNA条码载体的结构及构建流程示意图,图中,“NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN”即为gRNA条码的gRNA编码片段;
图3为gRNA-sensor检索载体的结构示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
CRISPR/Cas9(或其变体,如saCas9)核酸酶基因编辑技术(Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats)是一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。gRNA与Cas9、saCas9等核酸酶结合后,通过PAM(ProtospacerAdjacent Motif,NGG)序列指导核酸酶剪切DNA双链,造成DNA双链断裂。一实施方式的细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法,主要用于构建核酸酶辅助检索条码细胞克隆,筛选具有某种表型(包括对实验处理有应答倾向)的阳性细胞克隆,以对细胞表型进行深入研究。如图1所示,本实施方式的筛选方法包括如下步骤:
步骤一:构建gRNA条码载体,该gRNA条码载体具有表达用作标记条码的gRNA的表达框,所述gRNA条码载体有多种,且不同的gRNA条码载体中gRNA编码片段的序列不同,多种gRNA条码载体构成gRNA条码载体库。
gRNA条码即具有特定序列的gRNA序列片段,通过设计gRNA条码可以使得各gRNA条码载体以及后续转导有gRNA条码载体的细胞具有特定的基因标识。在一个具体的实施例中,gRNA条码的长度为18-23bp,优选为20bp(20bp长度的gRNA条码的序列可表示为“NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN”),也即理论上具有该长度的gRNA条码有420种不同组合。
gRNA条码载体至少具有一个用于表达gRNA条码的表达框,该表达框由gRNA条码的gRNA编码片段及相应的启动子、终止子等构成。在一个实施例中,用于表达gRNA条码的gRNA编码片段的两端还分别连接有保护序列片段和/或限制性内切酶位点片段。该保护序列片段和/或限制性内切酶位点片段可作为不同gRNA条码的通用扩增引物片段,用于PCR扩增和/或限制性内切酶酶切。保护序列片段的长度可以是但不限于40-50bp,优选为40bp。
进一步,在一个实施例中,用于构建该gRNA条码载体的空载体具有自杀基因如ccdB基因,该gRNA条码载体中gRNA条码的gRNA编码片段插入在自杀基因中。自杀基因可以降低没有插入目的基因的载体的影响,后续选择转染的细菌也选用不能抗该自杀基因的细菌。
更进一步,在一个实施例中,该gRNA条码载体还包括另一个用于表达第二报告基因的表达框。第二报告基因可以是但不限于如荧光蛋白基因和/或抗药性基因等。通过设计第二报告基团可以方便对插入有目的序列的载体进行标记和筛选。
如图2所示,在一个具体的实施例中,该gRNA条码载体为慢病毒载体,含有gRNA条码的gRNA编码片段的表达框的启动子是U6启动子,gRNA条码的gRNA编码片段插入在U6启动子下游,替换原来的自杀ccdB基因片段;另一个表达框的启动子是PGK启动子,第二报告基因是荧光蛋白基因如mCherry和抗药性基因如Puro,其中,荧光蛋白基因可以用于表达可视标记的荧光蛋白,抗药性基因使载体或转染的细胞具有耐药性,可以用于药物筛选和富集所需的表达载体或细胞。gRNA条码载体可以是但不限于慢病毒载体,gRNA条码的启动子可以是U6但不限于U6启动子,报告基因表达框的启动子可以是但不限于PGK启动子。
步骤二:将gRNA条码载体库转导待研究的细胞,得到由多种含不同gRNA编码片段的细胞构成的细胞群,将细胞群分成实验组和预留组。
根据待转细胞的数量,调整gRNA条码载体库中载体的使用量,使每个待研究的细胞随机转导有一种或两种gRNA条码载体。
在将细胞群分成实验组和预留组之前还包括对得到的细胞群进行扩大培养的步骤。得到的实验组细胞群和预留组细胞群中标记有各gRNA条码的细胞数量基本相同,且拥有多copy,如经过扩大培养,使每种gRNA条码标记的细胞都有约100个左右的姐妹细胞,便于后续分析。
步骤三:对实验组的细胞群进行实验处理,筛选具有特定表型的实验组阳性细胞,获取所述实验组阳性细胞中与该特定表型相对应的特定的gRNA编码片段的序列。
可通过但不限于PCR、测序的方法分别读取实验组阳性细胞中的gRNA条码对应的特定的gRNA编码片段的序列。
步骤四:针对获取的特定的gRNA编码片段的序列,构建特异性的gRNA-sensor检索载体,gRNA-sensor检索载体的表达框中含有第一报告基因以及插入在第一报告基因中的左同源臂、特定的gRNA编码片段、PAM和右同源臂,左同源臂与右同源臂与第一报告基因的部分序列片段同源。
在一个实施例中,左同源臂和/或右同源臂的长度为180-300bp,优选为200bp。
如图3所示,在一个具体的实施例中,该gRNA-sensor检索载体的启动子可以是EF1A,第一报告基因可以是绿色荧光蛋白(EGFP)基因等。
步骤五:将构建的特异性的gRNA-sensor检索载体与能够表达用于结合gRNA条码的核酸酶的载体共同转导预留组的细胞群后,根据第一报告基因的表达情况筛选出阳性细胞,即得。
在一个实施例中,能够表达用于结合gRNA条码的核酸酶的载体为能够表达Cas9或saCas9等核酸酶的载体。
以图3所示的gRNA-sensor检索载体为例,第一报告基因(如EGFP基因)的核苷酸被特定的gRNA条码的gRNA编码片段+PAM分成上下游两个部分,上游部分和下游部分有长度约200bp的左、右同源臂,此时,第一报告基因不能正常表达。当特异性的gRNA-sensor检索载体与能够表达用于结合gRNA条码的核酸酶的载体共同转到到预留组的细胞群后,与上述步骤三筛选得到的实验组阳性细胞具有相同gRNA条码的细胞中表达的gRNA能够与该核酸酶相结合,可以打靶特异性的gRNA-sensor检索载体,此时gRNA-sensor检索载体上第一报告基因的左、右同源臂发生同源重组,第一报告基因正常表达,如EGFP基因表达EGFP,发光绿色荧光信号,以用于筛选。
通过从无到有的第一报告基因的表达物的信号变化情况,可以从预留组中筛选出阳性细胞克隆,如可以通过流式细胞仪筛选出特定荧光信号的阳性细胞克隆,又如可以通过药物筛选出具有特定抗药性的阳性细胞克隆等,再将筛选出的阳性细胞克隆单个分别进行扩大培养,可用于进一步研究其应答或表型形成的能力,以用于研究细胞具有不同表型的原因。因此,上述筛选方法筛选得到的细胞克隆可应用在研究细胞表型或在制备用于研究细胞表型的试剂中。
上述细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法可主要用于从未受实验处理的细胞中检索出某种细胞表型(包括对某种实验处理有应答倾向)的细胞群,其中gRNA条码载体既作为条码,又能作用于检索工具,因而简化了检索和筛选的流程;其次,gRNA-sensor检索载体本身的第一报告基因不会正常表达,只有与特异性的gRNA条码和用于结合gRNA条码的核酸酶作用后才发出信号,因而可以检索过程定性;再次,只要有第一报告基因相关的信号,就能被捕捉到,从而易于筛选获得阳性细胞克隆。
以下为具体实施例部分。
研究发现,小鼠乳腺癌细胞TM40D-MB植入到小鼠乳腺脂肪垫之后,能够转移到骨骼并形成次代肿瘤,这个细胞系是由TM40母细胞在BALB/c小鼠体内经过一系列的连续移植实验获得的。为了在活体内实时观察癌症细胞的转移,将Luc荧光素酶报告基因整合到TM40D-MB(Li,Z.,C.Schem,Y.H.Shi,D.Medina,and M.Zhang,Increased COX2expressionenhances tumor-induced osteoclastic lesions in breast cancer bonemetastasis.Clin Exp Metastasis,2008.25(4):p.389-400.)中,形成TM40D-MB-Luc细胞。原发性肿瘤具有转移能力有可能是随机原因造成的,也有可能是遗传因素决定的。已有研究表明,来源于次代肿瘤的细胞具有更强的转移能力,想要弄清楚其具有更强转移潜能的根本原因是什么,本实施例利用“核酸酶辅助检索条码克隆”的方法从未经过移植的小鼠乳腺癌细胞TM40D-MB-Luc中获得可以形成次代肿瘤的姐妹细胞,并分析形成次代肿瘤是随机的还是这些细胞本身就具有更大的转移潜力,具体步骤如下。
1、gRNA条码载体库的构建
如图2所示,在慢病毒载体中有两个表达框,表达框1为U6启动子介导gRNA的gRNA编码片段的表达;表达框2则驱动红色荧光蛋白mCherry和嘌呤霉素Puro药物筛选基因,红色荧光蛋白是可视的标记,因而gRNA条码载体进入细胞后可以观察到,嘌呤霉素则可以剔除掉不含有gRNA条码载体的细胞。
将gRNA条码的gRNA编码片段克隆到空条码慢病毒载体上的步骤如下:
1)利用芯片合成技术合成单链寡核苷酸gRNA编码片段库,每条gRNA编码片段用于编码长度为20nt的gRNA条码,并在gRNA编码片段的两端设有额外的扩增区,该扩增区含有克隆所述gRNA编码片段所需酶切位点和保护碱基(两端分别为40个碱基);
所用的gRNA编码片段库中部分gRNA的序列示例如下:
gRNA1:TACGTCCCTGTGCAGCTGCA(SEQ ID NO.1)
gRNA2:ACGTCCCTGTGCAGCTGCAA(SEQ ID NO.2)
gRNA3:CGTCCCTGTGCAGCTGCAAG(SEQ ID NO.3)
gRNA4:TACGTCCCTGTGCAGCTGCA(SEQ ID NO.4)
gRNA5:GCACTACCAGAGCTAACTCA(SEQ ID NO.5)
gRNA6:GGGGCCACTAGGGACAGGAT(SEQ ID NO.6)
两端的酶切位点和保护碱基序列:
5’端序列:TATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCTTCGGCAGGTG(SEQ ID NO.7)
3’端序列:CACCTGCACCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAA(SEQ ID NO.8)
2)将单链寡核苷酸gRNA编码片段库转变成双链gRNA编码片段分子库,以单链寡核苷酸gRNA编码片段库作为模板,利用高保真酶进行PCR扩增,使用PAGE纯化的方法回收长度为100bp的扩增产物;
PCR扩增的引物如下:
F:TATATATCTTGTGGAAAGGACG(SEQ ID NO.9)
R:TTTTAACTTGCTATTTCTAGCTC(SEQ ID NO.10)
3)将图2中的空条码慢病毒载体(该载体在将要克隆gRNA条码的gRNA编码片段的区域含有ccdB自杀基因,使用ccdB基因可降低空条码慢病毒载体背景)和扩增产物放在一起并进行通用的GoldenGate无缝酶切和连接反应,然后将反应后的连接产物转化到不能抗ccdB自杀基因的大肠杆菌感受态中,以构建获得最终的gRNA条码载体库。
2、将gRNA条码载体包装成慢病毒载体,并根据TM40D-MB-Luc细胞个数调整病毒使用量,使得每个细胞都能随机含有一个或两个gRNA条码。使用红色荧光蛋白mCherry来观察病毒转导质量,使用嘌呤霉素Puro来筛选获得gRNA条码的克隆,扩大培养含有gRNA条码库的细胞6-7代,以使得每个细胞都能含有约100个姐妹细胞。
3、将扩增后的细胞分成两部分,一个作为实验组,一个作为预留组。
实验组经过以下处理:将2×107个TM40D-MB-Luc细胞分别移植到20只品系为BALB/c的小鼠乳腺组织中,平均每只小鼠移植1×106个细胞。在4周内,使用光学显微成像系统观察荧光素酶Luc的表达情况,每周对肿瘤的大小进行3次监测,发现TM40D-MB-Luc细胞在乳房形成约0.2厘米的原发性肿瘤。4-8周后,有一半的小鼠出现了肿瘤转移到骨骼的现象,每周对骨骼上的次代肿瘤进行监测,记录次代肿瘤的大小、个数以及小鼠的寿命等参数。
4、读取实验组阳性细胞的gRNA条码
将这些次代肿瘤从小鼠体内分离下来,这些能形成次代肿瘤、具有转移潜能的细胞就是要研究的实验组阳性细胞。理论上,每个次代肿瘤细胞都是由一个具有转移潜能的细胞发育而来的,分离每个次代肿瘤细胞并分别扩大培养,抽提基因组DNA,使用PCR扩增的方法扩增出gRNA编码片段,通过测序来确认具体的gRNA条码的编码序列。
PCR扩增引物:
F:GAGGGCCTATTTCCCATGATTC(SEQ ID NO.11)
R:AGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTG(SEQ ID NO.12)
5、gRNA-sensor检索工具的构建
根据具体的gRNA条码的序列,将gRNA+PAM序列片段克隆到绿色荧光蛋白EGFP的中间,具体包括如下步骤:
1)使用BsaI酶切入门克隆载体pDown-DR-EGFP-BsaI-ccdB-Cm-BsaI,并回收目的片段pDown-DR-EGFP;
2)合成gRNA+PAM正反向两条片段,通过退火连接的方式把gRNA+PAM序列克隆到pDown-DR-EGFP上,获得pDown-DR-EGFP-gRNA-PAM载体;
gRNA+PAM正反两条引物示例:
gRNA1-F:ctaaTACGTCCCTGTGCAGCTGCAAGG(SEQ ID NO.13)
gRNA1-R:cgggCCTTGCAGCTGCACAGGGACGTA(SEQ ID NO.14)
gRNA2-F:ctaaACGTCCCTGTGCAGCTGCAAGGG(SEQ ID NO.15)
gRNA2-R:cgggCCCTTGCAGCTGCACAGGGACGT(SEQ ID NO.16)
3)利用Gateway技术将启动子质粒(如pUp-EF1A)、报告质粒(pDown-DR-EGFP-gRNA-PAM)和目标质粒(pRp)进行LR反应获得特异性的gRNA-sensor检索工具,如图3。
6、从预留组中检索出实验组阳性细胞的姐妹阳性条码细胞
分别将特异性的gRNA-sensor载体与表达Cas9蛋白的载体共同转导到预留组的细胞,通过流式细胞仪(FACS)筛选出有绿色荧光信号的细胞克隆,这些克隆就是具有转移潜能的姐妹阳性条码细胞,并筛选出一些没有荧光信号的克隆作为实验阴性对照。
7、分别扩大培养这些姐妹阳性条码细胞,并通过PCR的方法进一步确定这些细胞的gRNA条码序列。
8、每个姐妹阳性条码细胞群都分别以相同数目(1×106个)的细胞移植到20只品系为BALB/c的小鼠乳腺组织中,并记录原发性肿瘤的大小、次代肿瘤的个数和大小、小鼠的寿命等数据,并以没有转移能力(没有荧光)的细胞作为阴性对照。将这些数据与实验组的数据进行比较,分析这些细胞是否具有更强的转移能力。
若只有小部分阳性细胞具有转移能力或跟阴性对照表现出相同的特点,则可以确定这种转移能力是随机原因造成的;若出现的原发性肿瘤更快、更大、且转移到骨骼上的次代肿瘤越多或越快或越大,则可以认为这种转移能力是由遗传因素决定的,进而可以开展分子生物学如全基因组测序、DNA甲基化分析等基因型分析工作。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 云舟生物科技(广州)有限公司
<120> 细胞表型研究用的细胞克隆及其筛选方法和应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<400> 10
ttttaacttg ctatttctag ctc 23
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gagggcctat ttcccatgat tc 22
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agcctgcttt tttgtacaaa cttg 24
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctaatacgtc cctgtgcagc tgcaagg 27
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgggccttgc agctgcacag ggacgta 27
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctaaacgtcc ctgtgcagct gcaaggg 27
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgggcccttg cagctgcaca gggacgt 27
Claims (9)
1.一种细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一:构建gRNA条码载体,所述gRNA条码载体具有表达用作标记条码的gRNA的表达框,所述gRNA条码载体有多种,且不同的gRNA条码载体中gRNA编码片段的序列不同,多种所述gRNA条码载体构成gRNA条码载体库;
步骤二:将所述gRNA条码载体库转导待研究的细胞,得到由多种含不同gRNA编码片段的细胞构成的细胞群,将所述细胞群分成实验组和预留组;
步骤三:对所述实验组的细胞群进行实验处理,筛选具有特定表型的实验组阳性细胞,获取所述实验组阳性细胞中与所述特定表型相对应的特定的gRNA编码片段的序列;
步骤四:针对获取的特定的gRNA编码片段的序列,构建特异性的gRNA-sensor检索载体,所述gRNA-sensor检索载体的表达框中含有第一报告基因以及插入在所述第一报告基因中的左同源臂、特定的gRNA编码片段、PAM和右同源臂,所述左同源臂与所述右同源臂与所述第一报告基因的部分序列片段同源;
步骤五:将构建的特异性的gRNA-sensor检索载体与能够表达用于结合gRNA条码的核酸酶的载体共同转导预留组的细胞群后,根据所述第一报告基因的表达情况筛选出阳性细胞,即得。
2.如权利要求1所述的细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法,其特征在于,所述构建gRNA条码载体是将所述gRNA编码片段插入在具有自杀基因的载体中,替换自杀基因。
3.如权利要求1所述的细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法,其特征在于,所述gRNA编码片段的两端还分别连接有保护序列片段和/或酶切位点识别片段。
4.如权利要求3所述的细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法,其特征在于,所述gRNA条码的长度为18-23bp;和/或所述保护序列片段的长度为40-50bp。
5.如权利要求1所述的细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法,其特征在于,所述gRNA条码载体还具有第二报告基因的表达框。
6.如权利要求1~5中任一项所述的细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法,其特征在于,每个待研究的细胞转导有一种或两种gRNA条码载体。
7.如权利要求1~5中任一项所述的细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法,其特征在于,所述左同源臂和/或所述右同源臂的长度为180-300bp。
8.如权利要求1~5中任一项所述的细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法,其特征在于,所述能够表达用于结合gRNA条码的核酸酶的载体为能够表达Cas9或saCas9核酸酶的载体。
9.采用如权利要求1~8中任一项所述的细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法筛选得到的细胞克隆在研究细胞表型或在制备用于研究细胞表型的试剂中的应用。
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