CN105112445B - 一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的miR-205基因敲除试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas9基因敲除技术的miR‑205基因敲除试剂盒。本发明通过靶标设计软件优选一定数量的miR‑205的CRISPR‑Cas9靶标序列，并体外合成sgRNA单链，经过处理得到插入片段，随后将sgRNA利用T4连接酶接入到质粒载体中，通过转染LNCap细胞株，持续药筛、荧光检测，得到miR‑205基因敲除细胞株。通过提取细胞DNA，PCR扩增miR‑205并纯化，将PCR产物变性，再退火的方式形成异源杂交双链，利用T7E1酶切试验确定CRISPR‑Cas9系统对miR‑205的剪切效率，获得验证优化的miR‑205基因敲除CRISPR‑Cas9靶序列，并以此构建应用试剂盒，可用于miR‑205基因的定向敲除。该试剂盒具有基因敲除效率高、速度快、简单经济的特点，在细胞、动物模型构建及医学临床研究应用方面前景广阔。

Description

一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的miR-205基因敲除试 剂盒

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种miR-205基因敲除试剂盒，特别是一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的miR-205基因敲除试剂盒。

背景技术

1987年，日本大阪大学(Osaka University)在对一种细菌编码的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在串联间隔重复的DNA序列。2002年正式被科学家被称作“规律间隔成簇短回文重复序列”(ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)。

CRISPR是一个特殊的DNA重复序列家族，广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats)组成，重复序列的长度通常21～48bp，重复序列之间被26～72bp间隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列与靶基因进行识别。Cas(CRISPR associated)存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在导向RNA(guide RNA，gRNA)的引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。

CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，这些序列在被转录成为RNA后，能够和细菌产生的一类称为Cas的蛋白质形成复合体，来对Cas蛋白起到导向作用，因此这段RNA也被称为导向RNA。当复合体检测到入侵的DNA和gRNA序列一致时，Cas蛋白就能够切割入侵的DNA，达到防御的目的。2013年以后，研究者们在包括《science》和《naturebiotechnology》等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确的基因修饰。

CRISPR-CAS9是一种最新基因组定向基因编辑技术，是来源于细菌获得性免疫的由RNA指导Cas9蛋白对靶向基因进行修饰的技术。在改造后的CRISPR-CAS9系统中，sgRNA通过与靶位点结合引导CAS9蛋白识别PAM序列，同靶基因结合在PAM区上游对基因组DNA进行切割，从而造成双链断裂，引发非同源末端连接修复。在修复过程中个别碱基的缺失或插入会造成移码突变，从而达到基因组定点编辑的目的。

miRNA是一组保守的非编码小RNA(non-coding small RNA)，长约22nt的非编码的单链RNA分子，广泛分布在病毒、植物到高等哺乳动物中，大约相当于每种生物体蛋白编码基因的1％。目前，miRNA已知的功能是在转录后水平调控基因的表达，主要作为基因表达的负调控因子，即通过抑制靶基因的翻译而起调控作用。

miRNAs的表达具有时空特异性，即miRNAs在处于不同的发育阶段的细胞中和处于同一发育阶段的不同细胞中的表达谱各不相同。同时，miRNAs的表达谱不仅仅指miRNAs的种类,也指各种miRNAs的丰度，直接反映了细胞组织的信号调控状态。近年的研究表明，miRNA表达失调与多种肿瘤相关,并且这些miRNA可能起肿瘤抑制基因或癌基因的作用。Brio等运用基因芯片及Northern blot等实验方法，检测到乳腺癌组织中miR2125b、miR2145、miR221和miR2155等多种miRNA的紊乱表达，其中miR210b、miR2125b和miR2145高表达，而miR221和miR2155低表达。这些miRNA与肿瘤的分期和雌、孕激素的表达、血管侵袭性及肿瘤细胞增殖均相关。因此人们推测miRNA表达改变与肿瘤发生密切相关，它们常常定位于肿瘤相关区域，可能同时具有癌基因和抑癌基因的双重作用。当miRNA过度表达时，抑制了抑癌基因的表达；而miRNA表达过少或缺失时，则不能有效地抑制癌基因。其中最为突出的成果表现在miR-21与肿瘤的关系，2006年Meng等确证了miR-21的一个靶基因是PTEN，PTEN是肿瘤抑制基因；同时miR-21是靶基因之一，miR-21通过直接抑制PTEN的表达，从而激活PI-3激酶信号传导通路，调节细胞凋亡。总之，miRNA广泛参于肿瘤的发生和发展。

miR-205于2007年被证实了在人类细胞中存在，它的基因定位于人的第1号染色体的长臂上，长度为110个碱基。现已发现miR-205与多种肿瘤都有密切的关系，其中包括前列腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、子宫内膜及肾上腺皮质癌等。GanddliniP等在前列腺癌中发现：miR-205在发生上皮间质转化(Ephhelial-to-mesenchymal，EMT)的肿瘤细胞中下调，而miR-205表达的增加可以抑制EMT过程中的一些重要蛋白mRNA的翻译，从而抑制肿瘤的侵袭转移过程。ShahanaMajid等证实miR-205能够抑制Src激酶家族成员Src、Lyn和Yes的表达，从而抑制Src激酶家族碟酸化调节的ERK1/2通路，而ERK1/2通路可以对肿瘤的增殖进行调控，因此miR-205可以抑制肿癌细胞的增殖。最近有研究证实miR-205是抑制黑色素瘤细胞迁移的一个关键因素，而在人类胶质母细胞瘤中，miR-205通过靶向VEGF-A而发挥肿瘤抑制基因的作用。这些都表明miR-205与肿瘤的发生、发展存在密切的联系。

发明内容

本发明目的在于提供一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的miR-205基因敲除试剂盒，该试剂盒能高效、快速、方便地敲除miR-205基因，应用于miR-205基因敲除细胞、动物模型的构建、相关通路的研究及药物开发。

本发明所述的一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的miR-205基因敲除试剂盒，包括：(1)质粒miR-205-Cas9，其含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为特异识别序列如SEQ ID NO:2所示的miR-205基因的靶标序列的sgRNA(short guide RNA)，该sgRNA与trRNA(trans-activating RNA)构成特异的识别结构，从而引导Cas9酶特异地剪切miR-205基因对应序列；(2)检测试剂，用于检测miR-205基因的剪切效果，并可评估基因敲除效率。

根据本发明所述的miR-205基因敲除试剂盒的进一步特征，所述互补的DNA序列为：SEQ ID No:6和SEQ ID No:7。

根据本发明所述的miR-205基因敲除试剂盒的进一步特征，所述质粒miR-205-Cas9是用包括如下步骤的方法构建的：以PXC9-puro质粒为起始载体，先用Bbsl酶切并回收骨架；设计合成SEQ ID No:6和SEQ ID No:7两个带有接头的核苷酸序列，合成好后稀释并退火作为插入片段；用T4 DNA连接酶在16℃连接2h将骨架和接入片段接上，挑克隆测序鉴定，获得表达质粒PXC9--puro-miR205-sgRNA。

根据本发明所述的miR-205基因敲除试剂盒的进一步特征，所述检测试剂为T7E1酶切试剂，将PXC9--puro-miR205-sgRNA转染LNCap细胞，持续药筛、荧光检测，得到表达细胞株。提取细胞DNA，扩增引物miR-205并纯化，通过将PCR产物变性，再退火的方式形成异源杂交双链，利用T7E1酶切试验确定CRISPR-Cas9系统对miR-205的剪切效率。

本发明所述的基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的miR-205基因敲除试剂盒具有以下特点和优点：利用CRISPR-Cas9系统，设计了一段sgRNA来特异识别miR-205基因，最终导致其功能失活。

本发明所述的基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的miR-205基因敲除试剂盒可用于定向miR-205基因的敲除，具有高效、快速、简单经济等特点，对于miR-205基因敲除动物模型及相关通路的研究具有重要意义。

附图说明

图1是sgRNA和Cas9酶结合并特异识别剪切miR-205的作用示意图。

图2是miR-205-Cas9质粒示意图。

图3是PXC9-puro载体酶切电泳结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。

实施例1：载体构建

(1)miR-205靶标优化设计

针对miR-205基因(基因名MIR205，基因ID号:406988，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/406988)，在GeneBank网站检索并下载获得miR-205基因组序列(SEQ ID NO:1)：

5’-AAAGATCCTCAGACAATCCATGTGCTTCTCTTGTCCTTCATTCCACCGGAGTCTGTCTCATACCCAACCAGATTTCAGTGGAGTGAAGTTCAGGAGGCATGGAGCTGACA-3’

利用在线软件Feng Zhang lab's Target Finder(http://crispr.mit.edu/)及DNA2.0gRNA设计工具软件(https://www.dna20.com/eCommerce/cas9/input)设计sgRNA，输入上述miR-205序列，设置并检索获得最优的靶序列。选择两个软件均推荐的靶序列，共选择最优的4个靶序列，具体如下表：

表1

序列号	靶序列	位置
			SEQ ID NO:2	TCTCTTGTCCTTCATTCCAC	27-46
SEQ ID NO:3	CATACCCAACCAGATTTCAG	59-78
			SEQ ID NO:4	ATTTCAGTGGAGTGAAGTTC	72-91
SEQ ID NO:5	TCAGTGGAGTGAAGTTCAGG	74-94

(2)合成靶标片段

上述设计优化的靶标拟克隆到PXC9-puro载体，该载体来源Zhang Lab CRISPRPlasmids，购于Addgene公司(货号#52963)。将靶标序列加上载体Bbsl酶酶切的粘性连接未端。送上海捷瑞公司合成单链核苷酸链。

A.在SEQ ID NO:2序列加上接头，得到插入片段miR-205sgRNA1：

sgRNA1-F1：5’-caccgTCTCTTGTCCTTCATTCCAC-3’(SEQ ID No:6)

sgRNA1-R1：5’-aaacGTGGAATGAAGGACAAGAGAc(SEQ ID No:7)

含接头的miR-205-sgRNA引物

B.在SEQ ID NO:3序列加上接头，得到插入片段miR-205sgRNA2：

sgRNA2-F2：5’-caccgCATACCCAACCAGATTTCAG-3’(SEQ ID No:8)

sgRNA2-F2：5’-aaacCTGAAATCTGGTTGGGTATGc-3’(SEQ ID No:9)

C.在SEQ ID NO:4序列加上接头，得到插入片段miR-205sgRNA3：

sgRNA3-F3：5’-caccgATTTCAGTGGAGTGAAGTTC-3’(SEQ ID No:10)

sgRNA3-F3：5’-aaacGAACTTCACTCCACTGAAATc-3’(SEQ ID No:11)

D.在SEQ ID NO:5序列加上接头，得到插入片段miR-205sgRNA4：

sgRNA3-F4：5’-caccgTCAGTGGAGTGAAGTTCAGG-3’(SEQ ID No:12)

sgRNA3-F4：5’-aaacCCTGAACTTCACTCCACTGAc-3’(SEQ ID No:13)

将每组miR-205-sgRNA F与miR-205-sgRNA R分别等体积混合后，沸水浴中煮沸5min，然后72℃ 15min，自然冷却至室温，约60min。此时即可与载体连接，或-20℃保存。

(3)载体酶切

在无菌的0.2mL EP反应管，取PXC9-puro载体15μL，用Bbsl酶切，酶切体系如下：

混匀后，37℃反应2h以上。Bbsl购买于NEB公司，此酶说明书的酶切时间是15分钟，但我们延长酶切时间让其反应更充分。载体酶电泳结果见图3。

(4)酶切产物回收(DNA凝胶回收试剂盒，购于东胜科技)

1)酶切产物经1％凝胶电泳后，在紫外灯下，用手术刀切取载体的凝胶条带至干净的1.5mL EP管中，按100mg凝胶对应100μL溶液BD的比例向离心管中加入溶液BD。

2)60℃水浴10min至凝胶完全溶化，水浴期间振荡混合3次。

3)将溶液转移至DNA纯化柱中，静置2min，室温12 000rpm离心1min，弃滤液。

4)向柱上加入500μL溶液PE，室温12 000rpm离心1min，弃滤液。

5)重复上一操作一次。

6)空柱12 000rpm离心1min以彻底去除纯化柱中残留的液体。

7)将柱子置于新的1.5mL EP管上，向柱中央加入30μL 60℃预热的无菌水，13400g离心1min以洗脱出DNA。

(5)miR-205片段与PXC9-puro目的载体连接：

向0.2mL EP管中加入以下试剂(T4 DNA连接酶酶购于TaKaRa公司，货号：D2011A)

16℃连接2h。

(6)连接产物的转化

1)冰浴中将5μL连接产物分别加入至50μL DH5α感受态细胞中。轻轻旋转混匀，冰浴30min。

2)42℃水浴热休克90s。

3)快速将管转移至冰浴中，冰浴2min。

4)分别加入200μL LB培养基，混匀，37℃、200rpm振荡培养1h。

5)于超净工作台中，将菌液均匀涂布于含氨苄青霉素(Amp)(100μg/mL)的LB平板上，室温下放置，至液体吸收。

6)倒置平板，转移入37℃生化培养箱过夜培养。

(7)测序鉴定

1)从平板上随机挑取若干个单克隆于3mL LB管中摇床过夜培养；

2)质粒提取，(高纯质粒小量提取试剂盒，G-SHUN)

用1.5mL EP管收集3μL菌液，12 000rpm离心1min，去上清。

加入250μL溶液I/RNase A混合液，重悬菌体。

加入250μL溶液II，温和反复颠倒混匀6次，室温放置2min。

加入350μL溶液III，温和反复颠倒混匀6次。

12 000rpm离心10min，小心吸去上清至DNA纯化柱中，静置2min。

12 000rpm离心1min，弃滤液。

加入500μL溶液PB至柱中，12 000rpm离心1min，弃滤液。

加入500μL溶液W至柱中，12 000rpm离心1min，弃滤液。重复一次。

空柱12 000rpm离心3min。

将柱取出置于新的1.5mL EP管中，加入50μL无菌水(60℃预热)，静置2min，13400rpm离心1min以洗脱出质粒(共4管)。

这些质粒被分别命名为miR-205-Cas9-sgRNA1,miR-205-Cas9-sgRNA2,miR-205-Cas9-sgRNA3及miR-205-Cas9-sgRNA4。

(8)测序结果

将这些质粒送交上海捷瑞生物工程有限公司进行测序。测序结果的Blast分析表明，基因miR-205已成功克隆到载体PXC9-puro中，原始序列与已知序列Blast完全一致，可以用于后续实验。

实施例2：试剂盒使用及Knockout效率鉴定

(1)质粒转化与扩增

1)于-80℃冰箱取感受态细胞于冰盒中融化。

2)冰浴中将5uL连接产物加入至50μLDH5α感受态细胞中，轻轻旋转混匀，冰浴30min。

3)42℃水浴热休克90s(切勿让样品飘动)。

4)快速将管转移至冰浴中，冰浴3min。

5)加入500μLSOC培养基，混匀，放入摇床，37℃200rpm活化1h。

6)全部涂布于含Amp抗生素的LB平板，室温下放置10分钟，至液体吸收，同时加入适量的玻璃珠，来回左右震荡，使菌液涂的均匀。倒置平板，转移入37℃生化培养箱过夜培养。

7)将6mL灭菌过的LB液体(事先加过Amp抗生素)培养基倒于摇菌管中。

8)将含质粒的菌种接种于含有6mL LB抗生素培养液中，37℃摇床培养12-16h。

(2)质粒提取(Hipure Pladmid EF Micro Kit，Magen，货号P1111-02)

1)将含质粒的菌种接种于含有6mL LB抗生素培养液中，37℃摇床培养12-16h。

2)12000×g离心1min，收集6mL菌体。

3)倒弃培养基，并反扣于吸水纸轻轻拍打以吸尽残液；加入250uL缓冲液P1/RNaseA混合液，充分涡旋重悬细菌。

4)往重悬液中加入250uL缓冲液P2，轻轻颠倒混匀6-8次。

5)往裂解液中加入250uL缓冲液E3，立即颠倒10-15次让溶液彻底中和。

6)13000×g离心10min，收集上清液并转移至新的2mL离心管中，测量上清液的体积。

7)加入1/3倍体积缓冲液E4至上清液中，充分涡旋混匀30s。

8)将Hipure EF Mini Column装在收集管中，把上清液倒至柱子中，8000×g离心1min。

9)倒弃流出液，把柱子套回收集管中；加入600ul缓冲液E5至柱子中，8000×g离心1min，重复操作4次。

10)倒弃滤液，把柱子套回收集管中，12000×g离心2min。

11)把柱子套在灭菌的1.5ml离心管中，放置超净工作台中风干无水乙醇。

12)将上步骤的柱子与离心管一同取出，加入45uL灭菌水(60℃加热)至柱子的膜中央，静置10-20min，13000×g离心1min洗脱DNA。

13)弃去柱子，将质粒保存于-20℃。

(3)PXC9--puro-miR205-sgRNA转染LNCap细胞

1)将LNCap细胞以3×10⁵细胞/孔的密度铺于6孔板中，确保各孔细胞生长状态良好，密度相仿，待细胞为单层并处于对数中期，细胞汇合度达70％左右进行转染。

2)制备转染复合物：取无菌EP管，先加入200μL的无血清无抗生素的opti-men培养基，再加入4μg miR-205，温柔混合，最后加入18μL的Turbofect，Vortex 1-2秒，室温孵育15min。

3)将上述转染复合物加入到6孔板中，来回轻柔摇晃细胞培养板，将细胞放回37℃5％CO2培养箱继续培养。

4)加10mg/ml嘌呤霉素(puromycin)，来回轻柔摇晃细胞培养板，将细胞放回37℃5％CO2培养箱继续培养。

5)荧光显微镜下观察各孔细胞，荧光率均达95％以上。换液后继续加嘌呤霉素持续培养。

(3)DNA提取(DNA/RNA/Protein共提取试剂盒，TIANGEN公司)

1)收集细胞：

用胰酶消化细胞，并用PBS冲洗下消化脱落的细胞。3000RPM/min离收10分钟收集细胞。

2)裂解处理：

对离心得到的细胞沉淀：轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散，加入600μL裂解液RL，旋涡离心30s

3)将所有溶液转移至DNA吸附柱CB3，12000rpm离心1min，收集滤液用于RNA提取用。

4)向DNA吸附CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前先检查是否已加入乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

5)向吸附柱CB3加入500μl漂洗液PW(使用前先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

6)重复步骤4.

7)12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于温室放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

8)将吸附柱CB3转入一个新的1.5ml RNase-Free离心管中，加入50μl洗脱缓冲溶液TB，室温放置2min，12000rpm离心2min。

9)继续向吸附柱CB3加入50μl洗脱缓冲溶液TB，室温放置2min，12000rpm离心2min。得到DNA溶液。取5ul DNA，稀释100倍，作为后续PCR模板使用。

(4)PCR扩增

miR-205F引物：5’-TGAACTAGCTCTCTGCAGCC-3’(SEQ ID No:14)

miR-205R引物：5’-CCTCTGAAGAAGCACGCACA-3’(SEQ ID No:15)

PCR反应体系(50uL)：

(5)CRISPR/Cas9敲除效率验证

1)将上述扩增产物纯化，各取500ng纯化后PCR产物，95℃变性5min，再室温慢慢复性形成异源杂交双链。

2)上述反应体系中分别加入0.5μL T1E1酶37℃消化15min。

3)跑2％的琼脂凝胶电泳检测分析酶切效果。

由结果可见，PXC9-puro-miR205-sgRNA1实验组具有最高的基因剪切敲除效率，可以用于前列腺癌LNCap细胞的基因敲除实验。而其他三个实验组的质粒PXC9-puro-miR205-sgRNA2，PXC9-puro-miR205-sgRNA3及PXC9-puro-miR205-sgRNA4的结果为阴性。

依据上述实验结果，本发明确定PXC9-puro-miR205-sgRNA1质粒作为试剂盒的Cas9质粒。实验证明，该试剂盒可以有效用于细胞水平的基因敲除，为后续的细胞、动物建模，生物医药的机理和应用研究提供了方便的应用工具。

Claims (2)

1.一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的miR-205基因敲除试剂盒，包括：

1）质粒miR-205-Cas9，其含有一段互补的DNA序列，其序列为SEQ ID No:6和SEQ IDNo:7；该DNA序列能被转录为特异识别序列如SEQ ID NO:2所示的miR-205基因的靶标序列的sgRNA，该sgRNA能与trRNA构成特异的识别结构，以致引导Cas9酶特异地剪切miR-205基因对应序列；

2）以及配套的检测试剂，用于检测miR-205基因的剪切效果和评估基因敲除效率。

2.根据权利要求1所述的miR-205基因敲除试剂盒，其特征在于，所述质粒miR-205-Cas9是用包括如下步骤的方法构建的：

以PXC9-puro质粒为起始载体，先用Bbsl酶切并回收骨架；

设计合成SEQ ID No:6和SEQ ID No:7两个带有接头的核苷酸序列，合成好后稀释并退火作为插入片段；

用T4 DNA 连接酶在16℃连接2 h将骨架和接入片段接上，连接产物的转化，挑克隆测序鉴定，获得表达质粒PXC9--puro-miR205-sgRNA。