CN104178512B - 一种雄激素受体基因敲除试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种雄激素受体基因敲除试剂盒。本发明所述的雄激素受体基因敲除试剂盒包括：质粒AR‑CAS9，其含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为SEQ ID No:1所示的RNA序列，该RNA序列能形成特异识别雄激素受体基因的外显子1部分序列的sgRNA，该sgRNA与trRNA构成特异的识别结构，从而引导CAS9酶特异地剪切雄激素受体基因的外显子1对应序列；以及检测试剂，用于检测雄激素受体基因的外显子1的剪切效果。本发明所述的雄激素受体基因敲除试剂盒可用于定向雄激素受体基因的敲除，具有效率高、速度快、简单经济的特点，在动物模型构建及医学临床应用方面前景广阔。

Description

一种雄激素受体基因敲除试剂盒

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及基于CRISPR-CAS9基因敲除技术的雄激素受体基因敲除载体的构建及试剂盒的开发和应用。

背景技术

雄激素是一种含19个碳原子的类固醇激素，主要有睾酮(testosterone，T)、二氢睾酮(dihydrotestosterone，DHT)、脱氢异雄酮(dehydroisoandrosterone，DHIA)和雄烯二酮(androstenedione，AD)，以睾酮为主，促进男性附性器官成熟及第二性征出现，并维持正常性欲及生殖功能。雄激素参与了体内许多生长发育和代谢的过程。

雄激素主要通过在其靶器官中的特异的雄激素受体(AR，androgenreceptor)发挥其各种生理效应。雄激素受体(androgenreceptor，AR)是一种核激素受体类转录因子，AR信号通路对于男性生殖器官的正常生长、终末分化和功能是必需的。在发育期间，AR在泌尿生殖窦的间质表达，当被其配体雄激素激活后便能诱导上皮细胞分化和器官的形态发生。

AR的作用机制：雄激素受体在胞质中能与热休克蛋白结合，当雄激素受体与雄激素结合后，雄激素受体被激活并与热休克蛋白解离。雄激素受体进入细胞核，通过与靶基因上的雄激素反应元件的顺式作用增强子作用，从而在转录水平上调节基因表达。雄激素受体的转录激活功能由核受体辅助激活因子介导，这些辅助因子通过多级作用催化组蛋白乙酰化和去甲基化而修饰染色质结构，促进RNA聚合酶Ⅱ转录起始复合物与启动子结合，激活基因转录，表达蛋白质，进而控制细胞生长。

前列腺是人体的最大性腺体，与雄激素通路密切相关。临床上主要是前列腺增生和前列腺癌。前列腺增生(BPH)是老年男性最常见的疾病，是引起中、老年男性排尿障碍性疾病的主因。近年来，随着我国国民生活水平和卫生条件的改善，平均寿命的延长，BPH的发生率也明显上升。另一方面，前列腺癌是西方国家最常见的恶性肿瘤之一，是引起老年男性死亡的第二位原因。我国的前列腺癌发病率远低于欧美国家，但近年来有上升趋势。雄激素受体(AR)是前列腺上皮细胞生长、分化及恶性转化等信号传递系统的交叉点，与前列腺癌(prostatecancer，Pca)的发生、发展有关的信息均要通过AR往下游或相互间传递。正常前列腺和前列腺癌发生发展过程中的细胞存活依赖于雄激素受体。DHT是睾酮的活性形式，它与AR结合后，使后者与部分热激蛋白分离，并发生构象变化，使其发生核转位，同时易位至细胞核。在细胞核内AR二聚化，招募一系列共激活因子，与RNA聚合酶Ⅱ等形成转录增强复合体，通过与靶基因启动子DNA反应单元结合，调控细胞的转录程序，从而激活与细胞生长和存活相关的基因转录。

近年来一些研究发现，在一些非性激素靶组织的肿瘤中存在一定的性激素依赖性，如甲状腺癌、肺癌、脑瘤、胰腺癌、肠癌和肝癌等。随着研究的深入，现在能够对这种现象在分子水平上作出解释。现在认为雄激素可通过AR的介导：①AR的N端具有某些转录活化因子，可与c-fos、e-jun、rag等与细胞增殖和分化有关的癌基因相互调节，促进细胞增殖；②AR可控制细胞的程序性死亡过程，导致转化细胞和肿瘤细胞生长优势；③刺激一些生长因子的表达而促进细胞增殖，如表皮生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子等；AR与雄激素结合后，通过旁分泌和自分泌机制使靶组织对生长因子的刺激更敏感，从而使细胞增殖旺盛。④调节与细胞周期有关的调节蛋白，eyclin—B2的表达，促进细胞分裂。而影响激素依赖性肿瘤细胞的增殖。

综上所述，雄激素通路涉及众多的生理和病理过程，是临床研究的重要通路。早在1941年，美国著名医学家哈金斯就发现了前列腺癌的这种治疗方法，并荣获1966年的诺贝尔医学奖。目前针对雄激素受体通路的治疗对于前列腺增生(例如：5α还原酶抑制剂)和前列腺癌(例如：“去势”治疗)仍是临床的首选治疗。因此加强雄激素通路的研究具有重要的临床意义。

CRISPR-CAS9是一种最新基因组定向基因编辑技术，是来源于细菌获得性免疫的由RNA指导CAS9蛋白对靶向基因进行修饰的技术。在改造后的CRISPR-CAS9系统中，sgRNA通过与靶位点结合引导CAS9蛋白识别PAM序列，同靶基因结合在PAM区上游对基因组DNA进行切割，从而造成双链断裂，引发非同源末端连接修复。在修复过程中个别碱基的缺失或插入会造成移码突变，从而达到基因组定点编辑的目的。利用该技术可在局部实现非同源重组与同源重组，已成为高效的基因敲除工具。可在293T、K562、iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切。利用CAS9作为切口酶可以高效地介导基因定点敲入或是对基因组的点突变，大大降低了非同源末端连接风险和脱靶事件导致的基因组其他位置产生未知的突变。

CRISPR-CAS9主要包括以下三个部分，crRNA、tracrRNA和CAS9蛋白。在转录的过程中，CRISPR簇首先转录为前crRNA，然后逐渐被加工成小的crRNA(CRISPR RNA)。反式作用RNA即tracrRNA(transactivating crRNA)主要用来加工crRNA，crRNA通过碱基配对与tracrRNA结合，形成双链RNA。tracrRNA:crRNA二元复合体指导CAS9蛋白识别保守的间隔相邻基序(proto-spacer adjacent motifs，PAM基序)，在crRNA引导序列的特定位点剪切双链DNA。

传统对于基因组基因的定向改造非常困难，细胞水平一般采用RNAi技术以实现基因表达的抑制，但无法达到基因敲除。而动物水平则只能通过同源重组(homologousrecombination)方式来获得基因改造的子代，整个实验时间周期长。而CRISPR-CAS9可以直接在细胞水平实验对基因的改造(包括敲除)，从而大大加快基因敲除动物的实验进展。

编码AR的基因位于X染色体的q11-12区带，为单拷贝基因，总长度大于90kb，由8个外显子组成，外显子1最大，编码受体N端的残基也最不保守。其N端结构域与AR的转录激活有关，该区域包含2种多聚体，即多聚谷氨酸和多聚脯氨酸，它们被认为在转录激活方面起着重要作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种雄激素受体基因敲除试剂盒，可用于高效、快速、方便地定向敲除雄激素受体基因。

本发明所述的雄激素受体基因敲除试剂盒包括：(1)质粒AR-CAS9，其含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为SEQ ID No:1所示的RNA序列，该RNA序列能形成特异识别雄激素受体基因的外显子1部分序列的sgRNA(short guide RNA)，该sgRNA与trRNA(trans-activating RNA)构成特异的识别结构，从而引导CAS9酶特异地剪切雄激素受体基因的外显子1对应序列；(2)检测试剂，用于检测雄激素受体基因的外显子1的剪切效果。

根据本发明所述的雄激素受体基因敲除试剂盒的进一步特征，所述互补的DNA序列为SEQ ID No:2和SEQ ID No:3。

根据本发明所述的雄激素受体基因敲除试剂盒的进一步特征，所述质粒AR-CAS9是用包括如下步骤的构建方法构建的：以PX330质粒作为起始载体，先用Bbsl酶切并回收骨架；设计合成SEQ ID No:2和SEQ ID No:3两个带有接头的核苷酸序列，合成好后稀释并退火作为插入片段；用T4DNA连接酶在16℃连接2小时将骨架和接入片段接上，连接产物的转化，挑克隆测序鉴定，筛选出表达质粒AR-CAS9。

根据本发明所述的雄激素受体基因敲除试剂盒的进一步特征，所述检测试剂为PCR检测试剂，包括用于扩增雄激素受体外显子1剪切区序列的一对引物，正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示。

本发明利用CRISPR-CAS9系统，设计了一段sgRNA来特异识别雄激素受体基因的外显子1部分序列，在sgRNA与trRNA构成特异的识别结构，从而引导CAS9酶特异的“剪切”雄激素受体基因的外显子1对应序列，最终导致雄激素受体蛋白的功能失活，影响雄激素信号通路的相关功能。

本发明所述的雄激素受体基因敲除试剂盒可用于定向雄激素受体基因的敲除，具有效率高、速度快、简单经济的特点，将大大的加快雄激素通路相关的动物模型构建及医学临床应用研究的进展。

附图说明

图1为sgRNA和CAS9酶结合并特异识别剪切AR外显子1的作用示意图

图2为本发明所构建的AR-CAS9质粒的图谱。

图3为PX330载体酶切电泳结果，其中，泳道M：1kbDNAMarker；泳道1：PX330载体酶切。

图4为PCR产物酶切前后电泳结果。

图5为AR剪切测序结果峰图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，包括载体的构建，AR基因剪切敲除试剂盒的使用和剪切效率的验证。实验中使用的技术，包括PCR扩增、电泳检测、酶切、分子克隆、测序等实验方法及相关仪器，均为本领域内技术人员已知的常规技术和常规仪器。可以理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。

雄激素通路与人体的众多生理和疾病相关，是一个重要的调控通路。雄激素通路中的AR对前列腺增生和前列腺癌的治疗是非常有临床应用价值的靶点。

本发明采用最新的基因组定向编辑技术CRISPR-CAS9，优化设计了针对AR外显子1区域的sgRNA靶序列。即本发明提供了一段小RNA能够特异识别并剪切AR的基因组DNA，最终导致AR的蛋白结构改变而功能失活，带特异识别序列的sgRNA作用显示图见图1所示。该段特异识别RNA的碱基序列为“ggcugggaagggucuacccucgg”(SEQ ID No:1)。

发明人将上述SEQ ID No:1对应的DNA序列，加上粘性接头，合成正反互补DNA单链(具体序列见SEQ ID No:2、SEQ ID No:3)，两互相单链变性退火，并克隆到含有CAS9酶和质粒基本元件的PX330载体系统中。因此本发明提供了一个质粒载体，其特征在于，所述的多核苷酸序列由权利要求1的对应的特异性DNA核苷酸序列构成，同时包括CRISPR-CAS9系统和常规的质粒复制元件，AR-CAS9质粒图如图2所示。

本发明采用CRISPR-CAS9技术，针对AR基因的外显子1，设计特异的靶向序列，并构建到含CRISPR-CAS9质粒载体中，并以此构建AR基因敲除试剂盒。为检验本发明的使用效果，发明人将上述构建好的质粒与转染试剂混合，转染人胚肾293T细胞连续培养3天后提取细胞的DNA。设计针对雄激素受体外显子1剪切区序列的PCR引物，所述的核苷酸序列分别为SEQ ID No:4、SEQ ID No:5所示的碱基序列。PCR扩增获得目标条带，DNA电泳和测序检测剪切效率。结果显示，连续培养3天后，AR基因的剪切效率达到80％，相比TALENS等基因定向剪切工具具有更好的剪切效率。同时也证明本发明构建的质粒非常方便使用。

实验例1：载体构建

1、扩增引物设计：(苏州金唯智公司合成PAGE纯化2OD):

针对AR外显子1的剪切位点序列：

ATGGAAGTGCAGTTAGGGCTGGGAAGGGTCTACCCTCGGCCGCCGTCCAAGACCTACCGAGGAGCTTTCCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGCGCGAAGTGATCCAGAACCCGGGCCCCAGGCACCCAGAGGCCGCGAGCGCAGCACCTCCCGGCGCCAGTTT

划线部分为特异识别RNA的碱基序列(SEQ ID No:1)。

含接头的AR-sgRNA引物：

AR-sgRNA F：5’-CACCGGCTGGGAAGGGTCTACCCT-3’(SEQ ID No:2)。

AR-sgRNA R：5’-AAACAGGGTAGACCCTTCCCAGCC-3’(SEQ ID No:3)。

划线部分为接头。

合成后，用超纯水按100nM的浓度配好备用。

2、双链准备：

AR-sgRNA F与AR-sgRNA R分别等体积混合后，沸水浴中煮沸5min，然后72℃15min，自然冷却至室温，约60min。此时即可与载体连接，或-20℃保存。

3、载体酶切

在无菌的0.2mLEP反应管，取pX330载体15μL，用Bbsl酶切，酶切体系如下：

混匀后，37℃反应2h以上。(Bbsl购买于NEB公司，此酶说明书的酶切时间是15分钟，但本实验中延长酶切时间，让其反应更充分。)

载体酶电泳结果见图3。

4、酶切产物回收(DNA凝胶回收试剂盒，Dongsheng Biotech公司)

1)酶切产物经1％凝胶电泳后，在紫外灯下，用手术刀切取载体的凝胶条带至干净的1.5mLEP管中，按100mg凝胶对应100μL溶液BD的比例向离心管中加入溶液BD。

2)60℃水浴10min至凝胶完全溶化，水浴期间振荡混合3次。

3)将溶液转移至DNA纯化柱中，静置2min，室温12000rpm离心1min，弃滤液。

4)向柱上加入500μL溶液PE，室温12000rpm离心1min，弃滤液。

5)重复上一操作一次。

6)空柱12000rpm离心1min以彻底去除纯化柱中残留的液体。

7)将柱子置于新的1.5mLEP管上，向柱中央加入30μL60℃预热的无菌水，13400g离心1min以洗脱出DNA。

5、AR片段与PX330目的载体连接：

向0.2mLEP管中加入以下试剂(T4DNALigase酶购于TaKaRa公司，货号：D2011A)。反应体系如下：

16℃连接2h。

6、连接产物的转化

冰浴中将5μL连接产物分别加入至50μLDH5α感受态细胞中。轻轻旋转混匀，冰浴30min。

42℃水浴热休克90s。

快速将管转移至冰浴中，冰浴2min。

分别加入200μLLB培养基，混匀，37℃、200rpm振荡培养1h。

于超净工作台中，将菌液均匀涂布于含氨苄青霉素(Amp)(100μg/mL)的LB平板上，室温下放置，至液体吸收。

倒置平板，转移入37℃生化培养箱过夜培养。

7、测序鉴定；

1)从平板上随机挑取若干个单克隆于3mLLB管中摇床过夜培养；

2)质粒提取(高纯质粒小量提取试剂盒，G-SHUN)。

用1.5mLEP管收集3μL菌液，12000rpm离心1min，去上清。

加入250μL溶液I/RNaseA混合液，重悬菌体。

加入250μL溶液II，温和反复颠倒混匀6次，室温放置2min。

加入350μL溶液III，温和反复颠倒混匀6次。

12000rpm离心10min，小心吸去上清至DNA纯化柱中，静置2min。

12000rpm离心1min，弃滤液。

加入500μL溶液PB至柱中，12000rpm离心1min，弃滤液。

加入500μL溶液W至柱中，12000rpm离心1min，弃滤液。重复一次。

空柱12000rpm离心3min。

将柱取出置于新的1.5mLEP管中，加入50μL无菌水(60℃预热)，静置2min，13400rpm离心1min以洗脱出质粒。

该质粒命名为AR-CAS9

8、测序结果(金唯智基因公司测序)

质粒AR-CAS9的测序结果BLAST分析表明：基因AR已成功克隆入至载体pX330中，原始序列与已知序列进行BLAST完全一致，可以用于后续实验。

实施例2：试剂盒使用及Knockout效率鉴定

1、将质粒转染入293T包装细胞中。以下操作均以100mmdish，转染试剂采用Lipofectamine2000。

1)转染前2h将细胞培养基更换为Opti-MEM培养基。

2)取质粒DNA溶液16μg，与相应体积(1455μl)的Opti-MEM混合

均匀，总体积为1.5ml，在室温下温育5分钟。

3)将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀，取60ul Lipofectamine2000与1440μl的Opti-MEM混合均匀，总体积为1.5ml，在室温下温育5分钟。

4)把稀释后的包装体系与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀(共3ml)，不要振荡。在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物。

5)将转染体系混合物转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

6)培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每盘细胞加入10ml的PBS液，轻轻洗涤残余的转染混和物，然后倒去。

7)每盘细胞中加入含10％血清的DMEM细胞培养基12ml，于37℃、5％CO₂培养箱内继续培养3天。

2、DNA提取(DNA/RNA/Protein共提取试剂盒，TIANGEN公司)

1)收集细胞：

用胰酶消化细胞，并用PBS冲洗下消化脱落的细胞。3000RPM/min离收10分钟收集细胞。

2)裂解处理：

对离心得到的细胞沉淀：轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散，加入600μL裂解液RL，旋涡离心30s

2)将所有溶液转移至DNA吸附柱CB3，12000rpm，1min，收集滤液用于RNA提取用。

3)向DNA吸附CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前先检查是否已加入乙醇)，12000rpm，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

4)向吸附柱CB3加入500μl漂洗液PW(使用前先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12000rpm，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

5)重复步骤4.

6)12000rpm，2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于温室放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

7)将吸附柱CB3转入一个新的1.5mlRNase-Free离心管中，加入50μl洗脱缓冲溶液TB，室温放置2min，12000rpm，2min。

8)继续向吸附柱CB3加入50μl洗脱缓冲溶液TB，室温放置2min，12000rpm，2min。得到DNA溶液。取5ulDNA，稀释100倍，作为后续PCR模板使用。

3、PCR扩增

ARF引物：5’-ccgggttctggatcacttcg-3’(SEQ ID No:4)。

ARR引物：5’-cagccaagctcaaggatgga-3’(SEQ ID No:5)。

PCR反应体系(50ul)：

4、PCR产物酶切和电泳分析

基因组PCR产物酶切：ARAR(KpnI)37℃消化PCR产物1小时。

电泳分析：电泳结果见图4。酶切前，可以看到野生组(WT)与CRISPR剪切组的DNA大小稍有不同，提示基因组有被剪切，因此PCR产物变短。酶切后，可以看到野生组(WT)基因被限制性内切酶切下部分片段。而CRISPR基因剪切组因酶切位点已被CAS9定向敲除，因此限制性内切酶未能切下PCR产物。从电泳条带的浓度来看，打靶效率已达到80％以上。

5、测序结果(送公司测序)

将PCR产物送广州英潍捷基公司测序。

测序峰图(图5)解读和对比，发现AR对应的剪切位点后，出现明显的杂峰，并且后续测序结果均紊乱。表明AR对应的剪切位点是明显发生了CAS9特异靶向的剪切。

通过上述实施例表明：采用上述质粒制备的雄激素受体基因敲除试剂盒使用方便，可以获得80％以上的AR基因剪切效率，可以用于临床医学研究应用。

Claims (4)

1.一种雄激素受体基因敲除试剂盒，包括：

(1)质粒AR-CAS9，其含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为SEQ ID No:1所示的RNA序列，该RNA序列能形成特异识别雄激素受体基因的外显子1部分序列的sgRNA，该sgRNA与trRNA构成特异的识别结构，从而引导CAS9酶特异地剪切雄激素受体基因的外显子1对应序列；

(2)检测试剂，用于检测雄激素受体基因的外显子1的剪切效果。

2.根据权利要求1所述的雄激素受体基因敲除试剂盒，其特征在于：所述互补的DNA序列为SEQ ID No:2和SEQ ID No:3。

3.根据权利要求2所述的雄激素受体基因敲除试剂盒，其特征在于，所述质粒AR-CAS9是用包括如下步骤的构建方法构建的：

以PX330质粒作为起始载体，先用Bbsl酶切并回收骨架；

设计合成SEQ ID No:2和SEQ ID No:3两个带有接头的核苷酸序列，合成好后稀释并退火作为插入片段；

用T4DNA连接酶在16℃连接2小时将骨架和插入片段接上，连接产物的转化，挑克隆测序鉴定，筛选出表达质粒AR-CAS9。

4.根据权利要求1所述的雄激素受体基因敲除试剂盒，其特征在于，所述检测试剂为PCR检测试剂，包括用于扩增雄激素受体外显子1剪切区序列的一对引物，正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示。