CN108467864A - 一种icam-1基因敲除肿瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞生物学和分子生物学等相关研究领域，一种ICAM‑1基因敲除肿瘤细胞株及其应用，公开一种靶向人基因组ICAM‑1基因PAM位点的sgRNA，通过转染重组CRISPR质粒转染，高效的敲除HeLa细胞的ICAM‑1基因，并通过嘌呤霉素抗性筛选，在筛选过程中未使用传统的有限稀释法，而是一种更为方便简洁的单克隆挑取方法，从而大大缩短实验周期。ICAM‑1敲除的细胞株为探讨肿瘤细胞的粘附转移过程搭建了新的研究平台，实验验证HeLa敲除ICAM‑1后粘附能力明显降低，有利于研究ICAM‑1与各种细胞因子相互作用的分子机制，同时有助于探索抗转移药物相关的治疗机制及分子靶点。

Description

一种ICAM-1基因敲除肿瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，涉及分子生物学，具体而言是基于CRISPR/Cas9技术构建一种ICAM-1基因敲除肿瘤细胞株及其应用。

背景技术

肿瘤细胞术后复发转移是癌症患者高死亡率的主要原因，尚无有效防治方法。例如肝癌根治性切除术后的复发率高达60%-80%，其术后较高的复发率成为影响肝癌术后康复的主要障碍。

人乳腺癌(HeLa)细胞是肿瘤粘附转移研究的经典模式细胞，传统的基因编辑工具只能瞬时沉默或者敲减目标基因。利用CRISPR/Cas9技术敲除目标基因后，常用的有限稀释法过于繁琐与耗时。若能使用新的阳性单克隆挑取方法，有效构建一种稳定、完全敲除ICAM-1基因HeLa细胞株将大大有利于探索ICAM-1在肿瘤粘附转移中达到的关键作用，促进相互作用于ICAM-1相关细胞因子的研究发现，为肿瘤粘附转移搭建了新的研究平台。

发明内容

本发明旨在提供一种ICAM-1基因敲除肿瘤细胞株及其应用。包括构建有效的靶向人源ICAM-1基因sgRNA重组敲除质粒载体，以及筛选得到稳定传代的ICAM-1双拷贝敲除的HeLa细胞株的方法。

为了实现本发明的所述目的，采用以下实验技术方案：

采用CRISPR/Cas9技术敲除目标基因，CRISPR/Cas9是基于细菌和古细菌天然防御机制的一项技术，可广泛用于哺乳动物细胞基因编辑，在RNA的介导下，Cas9蛋白能够对识别的靶向目标序列进行切割 。该系统能特异识别目标基因原间隔序列的5'端和3'端延伸的几个碱基为NGG形式，称之为原间隔序列临近基序（Protospacer adjacentmotifs，PAM），Cas9蛋白形成复合物对该位点进行切割。本发明筛选提出一种有生物活性，高效且不易脱靶的PAM靶点sgRNA。

选取可表达CRISPR/Cas9基因编辑系统的敲除质粒为Px459 vector，此质粒同时带有puromycin抗性，可供阳性单克隆细胞筛选。

如上述的重组ICAM-1敲除重组Px459质粒载体的构建方法，如下步骤：

1） 使用NCBI检索人源ICAM-1基因核酸序列，选取CDS区进行靶向sgRNA序列设计，得靶向ICAM-1基因sgRNA，即ICAM-1-sgRNA，序列为TTTCTCGTGCCGCACTGAAC。

2） 合成ICAM-1-sgRNA正向及反向寡核苷酸序列，并在合成时两端加上BbsI酶切位点。将得到的互补正反向寡核苷酸序列在梯度PCR仪中完成退火反应从而形成双链寡核苷酸。

3） 将BbsI酶切后的Px459质粒载体回收，通过T4连接酶与双链ICAM-1-gRNA连接形成重组基因敲除载体。通过氨苄青霉素抗性的LB培养基扩大培养单克隆菌种，测序验证阳性菌种单克隆，提取质粒得到所需ICAM-1-gRNA/Cas9重组敲除CRISPR载体。

一种HeLa细胞敲除ICAM-1基因以及筛选阳性克隆的方法，具体操作如下：

1） 使用lipo 2000，质粒与lipo质量比例1:2，将上述所得重组敲除质粒转染六孔板中HeLa细胞。24h后，使用puromycin抗生素进行筛选。

2） 连续药筛三天，换为正常培养液培养，待长成各个一簇一簇单克隆细胞团。

3） 使用胰酶消化单克隆细胞团，弃去胰酶。使用枪头挑取各个单克隆细胞团进入96孔板已加入100μL培养液孔中，待贴壁后保持定期的换液。确保单克隆细胞的增殖生长。

设计并合成包含上述sgRNA序列的600-800bp的上下游引物，引物序列为：

Forward: TTCGTCTGTTAGGCAGGCAGCAAG；

Reverse: TGTGAGCAGACAGGGATGGAC。

4） 待96孔板中单克隆细胞增殖，移转入六孔板提取基因组。使用合成的引物PCR，通过胶回收得到目的片段DNA（见图1），测序比对野生型基因组，检测sgRNA序列的基因修饰。

5） 若测序图谱出现双峰，或者sgRNA序列区域出现碱基改变（见图2）。采用T-Acloning实验验证HeLa细胞ICAM-1的基因敲除。由于人染色体为二倍体，需验证双拷贝ICAM-1基因的敲除。

6） 通过T-Acloning实验测序检测到双拷贝ICAM-1基因皆为敲除型。如上述基因敲除方法，则得到纯种可稳定遗传的ICAM-1基因敲除HeLa细胞株。

本发明的优点在于：

1. 本发明所采用的sgRNA寡核苷酸序列具体良好的生物活性，能够高效的靶向人源肿瘤细胞中的ICAM-1基因。

2. 相比较传统的细胞单克隆有限稀释筛选法，本发明所采用适用于贴壁细胞的单克隆挑取法具有更强的实用性并且大大缩减了实验操作周期。

1）经胰酶孵育不重悬，能够直接挑取单克隆细胞团单一类型的细胞培养。

2）省去了有限稀释大量的实验操作。

3）能够保持原始单克隆细胞团的形态，当验证失败后可以重复挑取新的单克隆细胞。

4）此敲除细胞株具有明显的抗肿瘤粘附能力，提供了抗肿瘤转移研究新的研究平台。

5）可作为模式细胞，进行抗肿瘤药物的筛选与鉴定，并进行靶向分析。

附图说明

图1 目标片段PCR电泳图。

图2 单克隆细胞测序双峰及序列比对图。

图3 对比野生型细胞ICAM-1敲除株细胞粘附图。

具体实施方式

实施例1

1.CRISPR/Cas9系统敲除靶点sgRNA设计

选择张峰实验组的CRISPR Design：http://crispr.mit.edu/。选取ICAM-1的CDS区域序列，每次设计只使用其中一个外显子序列，避免设计的sgRNA跨越两个外显子，无法于基因组上匹配相应序列。通过设计得到一条20bp的Oligo DNA（sgRNA）：TTTCTCGTGCCGCACTGAAC。

在合成时，需在序列前后加上BbsI酶切后的互补碱基（加粗处），从而能够直接与酶切后的敲除载体连接。

正链 sgRNA：CACCG TTTCTCGTGCCGCACTGAAC；

负链 sgRNA：AAAC GTTCAGTGCGGCACGAGAAA C。

2.ICAM-1基因敲除重组载体的构建

1）合成2OD，溶解为100μM。各使用2μL，单链Oligo退火步骤如下：

各组分依次加入后轻轻混匀，之后低速离心。温度梯度95℃，10min；95℃-85℃，2.5℃/s；85℃-25℃，0.25℃/s；25℃ 5min。

2）双链gRNA与CRISPR/Cas9敲除载体Px459的连接体系：

低速离心混匀。16℃水浴过夜。然后放于4℃冰箱保存。

3）转化：

1.5μL离心管中加入感受态细胞（DH5α）50μL，然后温和的加入连接产物3μL混匀，冰浴30min；42℃水浴，45s之后冰上2min；加入800μL LB；37℃摇床培养1h；室温4000 rpm，离心5min；弃上清750μL；剩余菌液混匀涂板，采用AMP平板；封口，37℃倒置过夜。

4）挑取单克隆并测序比对：

挑选生长均匀的单克隆，每板挑选3个单克隆，加入3ml LB。37℃摇床培养14小时。再扩大培养后，吸取每个单克隆菌液300μL 送至测序公司使用U6启动子测序引物测序，使用bioedit软件进行比对分析，证实gRNA成功连接入载体质粒。

3.lipo2000转染HeLa细胞，具体步骤如下：

首先取状态良好的HeLa细胞铺于六孔板，待密度增殖至70%进行实验。之后取Opti-MEM转染培养基50μL 分别混合2.5μg敲除质粒与4μL lipo2000溶液。充分混匀后，将重组质粒溶液轻轻加入lipo2000溶液中，枪头来回吹打混匀，静置10min。最后均匀加入细胞培养液中。6h后换新鲜培养液，24h后即可进行抗生素筛选。

4.HeLa细胞嘌呤霉素（puro）抗性最小致死浓度筛选

HeLa细胞96孔板铺板，每孔5×10³个细胞，待细胞贴壁生长后，加入不同浓度的puro（0.1、0.5、1、2μg/mL），每个浓度三个复孔，每天换液并保持相同药物浓度，3天后显微镜观察细胞存活状况，选择细胞最低全致死浓度作为单克隆细胞puro药筛的标准浓度。经过实验得出结论，puro药物筛选浓度为1μg/mL。

5.单克隆细胞的挑取与生长增殖

停止药物筛选后的细胞逐渐形成簇状单克隆细胞团，使用胰酶孵育单克隆细胞团，置入37℃培养箱1min，吸去胰酶（操作时尽量不碰触细胞）。传统的有限稀释法重悬细胞，通过不断的稀释细胞浓度至单个细胞。本发明中保持单克隆细胞团保持胰酶加入前的状态，采用10μL枪头轻触挑取单个单克隆细胞团进入96孔板已加入100μL培养液的小孔中，不要掺杂其他细胞团细胞。待增殖后胰酶消化转入6孔板，即可提取基因组作为模板。

6.敲除验证引物的设计及目标片段PCR

以本发明设计sgRNA前后序列600-800bp序列为目标片段设计引物，采用primer5引物设计软件。设计引物如下：

F-primer：TTCGTCTGTTAGGCAGGCAGCAAG；

R-primer：TGTGAGCAGACAGGGATGGA。

PCR扩增得到目标片段，PCR混合酶Premix Taq购至Takara。具体实验体系：

PCR反应流程： 95℃，3min；

95℃ 10s；55℃ 30s；72℃ 1min；重复35个循环；

72℃ 7min；

4℃ ∞.

实施例2 ICAM-1敲除的应用

ICAM-1作为细胞粘附因子，在肿瘤的转移初始步骤中起着重要的作用。通过肿瘤与血管内细胞粘附实验：使用血管内皮细胞HUEVC 先铺板于96 孔板，37 ℃，5% CO2 培养箱，贴壁12 h。分为两组，两组分别为添加与不加刺激因子TNF-α组（TNF-α能够诱导ICAM-1表达增高），两组同时各自加入100 μL 荧光染料标记的野生型肿瘤细胞与ICAM-1敲除肿瘤细胞(3×10⁴/mL) 培养基悬浮液，PBS 溶液清洗3 次，洗去未粘附的细胞。共四组于荧光显微镜下拍照，计算药物对细胞粘附抑制率。我们发现ICAM-1敲除肿瘤细胞粘附能力明显降低，加刺激因子后显著性降低，原因可能在于TNF-α也能够诱导其他粘附相关因子的表达，但粘附能力依旧较野生型细胞组降低（图3）。因此，我们认为ICAM-1基因敲除导致肿瘤细胞株的粘附能力下降，从而能够影响肿瘤侵袭转移方面的能力。ICAM-1敲除HeLa细胞株可用于作为肿瘤转移研究模型细胞，同时为将来的抗肿瘤转移药物筛选提供了极大的便利。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种ICAM-1基因敲除肿瘤细胞株及其应用

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttctcgtgc cgcactgaac 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttcgtctgtt aggcaggcag caag 24

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtgagcaga cagggatgga c 21

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caccgtttct cgtgccgcac tgaac 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaacgttcag tgcggcacga gaaac 25

Claims (6)

1.一种用于敲除人ICAM-1基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA序列为TTTCTCGTGCCGCACTGAAC。

2.利用权利要求1所述的sgRNA用于敲除人乳腺癌HeLa细胞ICAM-1基因的重组敲除载体的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1）选取人源ICAM-1基因全CDS区序列，设计靶向Oligo序列，即权利要求1所述的sgRNA；

2）设计两端BbsI酶切后碱基位点，并合成寡核苷酸正向及反向序列；

3）正反向Oligo寡核苷酸序列进行一步退火形成双链核苷酸；

4）酶切Px459敲除质粒，连接双链gRNA得到重组敲除载体。

3.权利要求2所述方法构建获得的重组敲除载体。

4.含有权利要求3所述的重组敲除载体的细胞株。

5.权利要求4所述的细胞株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）采用转染试剂lipo2000 转染重组敲除载体，24h后使用终浓度1μg/mL puro筛选杀死为成功转染重组敲除载体的野生型细胞；

2）同等药物浓度筛选3d后，停止药物处理；

3）待增殖生长成为单克隆细胞团，采用枪头挑取细胞至96孔板，培养生长至足够提取基因组；

4）设计敲除验证引物，在目标基因基因组上设计，包含sgRNA在内的600-800bp序列上下游引物；

5）提取单克隆细胞基因组，以所述引物进行PCR片段扩增；

6）测序所得片段，比对野生型细胞株基因组；

7）测序得到双峰的目标片段，进一步采用T-Acloning验证双拷贝两等位基因突变情况，检测到双拷贝ICAM-1基因皆为敲除型。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述验证引物序列为：

F: TTCGTCTGTTAGGCAGGCAGCAAG；

R: TGTGAGCAGACAGGGATGGAC。