CN104818253B - 靶向定点整合cho细胞系的改造及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种外源基因定点整合的FRT‑sCHO细胞系及其用途。该细胞系利用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)作为宿主细胞通过插入识别标签在其1号染色体长臂末端(1q12和1q13)区而获得。本发明的FRT‑sCHO细胞系支持外源基因的定点整合，并长期维持外源蛋白的高效和稳定表达。
Description
技术领域
本发明涉及细胞基因工程领域，具体涉及一种定点整合外源基因的FRT-sCHO细胞系及其在生物制药领域的用途。
背景技术
提高哺乳动物细胞外源基因表达水平和稳定性，一直是生物制药领域或基因工程领域不断发展的追求。尽管大多数商业化表达体系尤其表达载体都有针对性的优化设计，如选择强启动子，带有加压筛选系统等，但获得高表达外源蛋白的细胞仍然需要耗费巨大的精力和成本。通过常规技术引入外源基因的整合具有随机性，插入位置不支持强转录发生，并导致蛋白表达水平较低，即使短时的高水平表达，也不能维持其稳定性，并随传代次数增加表达水平逐渐下降。因此，外源基因插入染色体的“位置效应”以及整合位点是否在高转录活跃区等被提出是影响蛋白表达水平及其稳定性的重要因素。只有对目的基因实施定向整合如整合至基因组的特定位置，才可能实现外源基因的稳定整合和蛋白高水平表达。
基因定向整合有多种方法，如同源重组技术尤其位点特异性重组技术，其依靠位点特异性重组酶，在基因组和外源DNA上的重组酶特异识别位点间实现基因置换、基因敲出和敲入等遗传工程操作。基因定向整合由于能有效克服随机整合、靶向性低以及易受位置效应影响等缺点，位点特异性重组技术在基因工程中的应用已为外源基因定点整合奠定了良好基础。从八十年代发展至今，位点特异性重组技术已多达十余种，其中最主要的技术为FLP/FRT和Cre/loxP系统。FLP/FRT技术在哺乳动物细胞中的应用开始于九十年代初期。O’Gorman等应用FLP重组酶技术实现了将外源基因整合进入预先确定的哺乳动物细胞染色体位点(Science.1991 Mar 15；251:1351-5.Recombinase-mediated gene activation andsite-specific integration in mammalian cells)；Wiberg FC等应用FLP/FRT技术将编码抗体的基因整合进入CHO细胞基因组，首先在CHO细胞基因组特定位点插入1个FRT位点，建立含有单个FLP重组酶识别位点的宿主，然后将同样含有单个FRT位点的抗体表达载体以及FLP重组酶表达载体共转染宿主细胞，编码抗体的基因在FLP重组酶的作用下，定点整合在细胞基因组的相同位点，有效克服了位置效应对抗体表达水平的影响(BiotechnolBioeng.2006,94:396-405.Production of target-specific recombinant humanpolyclonal antibodies in mammalian cells.)。目前，通过FLP/FRT技术已推出系列商业化细胞系，包括Flp-InTM-293、Flp-InTM-CV-1、Flp-InTM-CHO、Flp-InTM-BHK和Flp-InTM-3T3等细胞系，这些细胞系均可借助重组酶体系完成细胞基因组与外源DNA的位点特异性重组。然而，所述细胞系均为贴瓶生长，作为产业化用途尤其在表达治疗性蛋白或治疗性单克隆抗体方面的运用具有很大的局限性。中国专利(申请号：200310115022.4)公开了一种CHO/dhfr-细胞定点整合表达系统,该系统能够实现外源基因在CHO/dhfr-细胞基因组中定点整合和有效表达。该系统通过随机筛选在基因组中转录活跃区整合FRT位点的CHO/dhfr-细胞系而获得，但基因组转录活跃区位点并没有确定。PCT专利(2012)公开了一种染色体着陆垫(chromosomal landing pad)及其相关用途，尤其公开了强转录活性位点位于宿主细胞的Ank2、Cpsf4、C-Mos、Nephrocystin-1/Mal基因之内或附近的染色体着陆垫，这些染色体“着陆垫”均借助FLP/FRT技术实现，并成功用于外源基因的定点整合。
作为产业化应用的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，具有多种亚型或衍生细胞系，如CHO-K1，CHO-DG44以及CHO-S细胞系，这些细胞系各自的染色体总数以及结构畸变不尽相同，但均已发生大的变异，多数染色体已经发生重排(Deaven LL,Petersen DF,Chromosoma.1973,41:129-144The chromosomes of CHO,an aneuploid Chinese hamstercell line:G-band,C-band,and autoradiographic analyses；Derouazi M et al,Biochemical and Biophysical Research Communications.2006.340:1069-1077.Genetic characterization of CHO production host CHO-DG44and derivativerecombinant cell lines)，以CHO-K1和CHO-DG44细胞系为例，仅有少数染色体保留了其正常结构，如1、2、6、8、9号染色体、其中仅1号染色体成对保留了其遗传物质的完整，其余均为单条染色体，而且大部分染色体发生重排。发生重排的染色体是否影响外源基因整合及其表达水平和稳定性还不得而知，但在衍生的CHO细胞系中，未发生重排的染色体尤其1号染色体，即使经历各种处理，仍然保留了其染色体成对性和结构的完整，表明1号染色体的遗传变异性较小，基因结构趋于稳定。本发明人通过在CHO细胞实施电转染外源基因发现，整合至1号染色体的外源基因能高效稳定表达，与整合在其它染色体比较，蛋白表达水平稳定维持在传代100代以上，而整合至其它染色体上的外源基因，其蛋白表达的稳定性仅维持在传代10代以内。此结果表明，正常染色体尤其保留其完整成对的1号染色体，具有比其它染色体更为稳定的外源基因表达特征，此项研究尚未公开发表。由于1号染色体整合具有随机性，需通过大量的筛选才能获得，而且利用率非常有限，对于广泛和长期的产业化应用是十分有限的。本发明由此设计在悬浮生长的CHO细胞基因组中插入FRT位点，从中筛选出整合在1号染色体上的单个FLP重组酶识别位点的细胞，由此产生的本发明可接受任何含有同样单个FRT位点的蛋白或抗体表达载体，并用于后续产业化表达。
发明内容
本发明的目的是提供一种基因工程BAT-FRT-sCHO细胞系及其用途，包括：
(1)优选悬浮培养的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，包括(但不限于)CHO-K1、CHO-DG44以及CHO-S等细胞系；
(2)应用FLP/FRT技术将人工改造载体pBAT-FRT通过电转染方式插入悬浮培养的CHO细胞基因组；
(3)逐步提高博来霉素浓度加压选择Zeocin抗性克隆，获得pBAT-FRT随机整合的混合细胞；
(4)经有限稀释进行细胞亚克隆，结合荧光原位杂交技术筛选单个稳定整合FRT位点在1q13区(1号染色体长臂末端区，或称端粒区)的FRT-sCHO3细胞系作为本发明BAT-FRT-sCHO细胞系；
(5)应用Flp重组酶技术，在细胞内介导使外源基因插入本发明FRT-sCHO3细胞1号染色体长臂末端区，通过共转染Flp重组酶的质粒pBAT-Flp以及表达目的蛋白的质粒pBAT-VR1，使Flp重组酶在瞬时表达的同时，促使pBAT-VR1特异性在FRT位点实施同源重组，实现目的基因的定点整合。
附图说明
图1pBAT-dhfr质粒结构示意图
图2pBAT-VR1质粒结构示意图
图3pBAT-Flp质粒结构示意图
图4工程细胞系FRT-sCHO3定点整合的荧光原位杂交鉴定
图5工程细胞系外源蛋白表达水平比较(D：天)
图6工程细胞系外源蛋白表达稳定性比较(p：代次)
具体实施方式
提供以下实施例对本发明作进一步阐释。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而非对本发明有任何限制。
实施例1FRT在CHO细胞1号染色体的定位筛选
1、细胞培养
优选悬浮培养的CHO细胞，并在悬浮培养基中添加谷氨酰胺等，在5％CO2，37℃，130rpm/min的细胞摇床中进行培养。
2、质粒转染及细胞初步筛选
利用ScaI限制性内切酶将pBAT-FRT质粒进行线性化处理，酶切产物回收后，采用Lonza Cell LineKit V试剂盒并参照说明书进行pBAT-FRT质粒电转染。转入质粒的细胞分别置于摇瓶培养(5％CO2，37℃，130rpm/min)至48h，细胞计数仪检测细胞活率和细胞数。
转染48h后进行加压筛选：博来霉素浓度为50μg/ml，100μg/ml，250μg/ml，500μg/ml，750μg/ml和1000μg/ml，逐渐加压，获得初筛细胞。
3、单克隆细胞筛选
将初筛细胞转入半固体培养基，通过检测转染细胞中lacZ基因产物β-半乳糖苷酶活性筛选单克隆细胞，β-半乳糖苷酶活性检测方法参照试剂盒(Life Tech,β-Gal AssayKit,货号K1455-01)提供的说明进行。经连续2次半固体培养基筛选，获得50余个高表达β-半乳糖苷酶活性的单克隆，并用于后续荧光原位杂交。
4、单克隆细胞染色体荧光原位杂交
a)染色体制片
优选15个高表达β-半乳糖苷酶活性的单克隆分别扩大培养，加入秋水仙素(终浓度为0.5μg/ml)孵育2h；取15ml离心管收集细胞，1000rpm离心5min，去上清；用37℃预热的KCl(0.075mol/L)溶液1ml重悬细胞，补加7ml KCl(0.075mol/L)溶液，37℃水浴低渗处理20min；加入2ml固定液(甲醇：冰乙醇(v:v)＝3:1)，轻轻吹打混匀后放置10min，1000rpm离心10min，去上清；加入1mL固定液重悬细胞，加3mL固定液混匀，室温放置10min，200g离心10min，去上清留约0.5mL体积；重悬细胞。取预冷的玻片，用玻璃吸管滴片(每片滴加40-50μL的细胞悬液)，室温放置24h。
b)探针制备
以pBAT-FRT质粒，利用HindIII和Bpu10I限制性内切酶进行双酶切处理，37℃条件反应过夜，切胶回收小片段用于探针标记，该小片段与整合的质粒互补，将小片段利用非放射性生物素进行标记，具体标记操作步骤按照Random Primed DNA Labeling Kit试剂盒说明书进行,获得探针。
c)荧光原位杂交
将室温放置24h的玻片分别在变性液(2×SSC/70％甲酰胺)中75℃变性2min，依次置入70％、90％、100％冰乙醇中各2-5min脱水，室温干燥；探针用杂交液稀释至终浓度10ng/μL，78℃变性8min，37℃复性45min，加在变性处理后的样本玻片上，封片，37℃湿盒中杂交过夜；去除封片，43℃水浴，2×SSC/50％甲酰胺15min；用2×SSC/0.01％Tween 20洗片三次，室温5min，2×SSC洗片两次，室温5min；玻片室温晾干后，暗室滴加30μL链霉亲和素-FITC，盖上盖玻片，37℃暗处温浴1h，去除盖玻片。用2×SSC/0.01％Tween 20洗片三次，室温5min，2×SSC洗片两次，室温5min；依次置入70％、90％、100％冰乙醇中各5min脱水，暗处室温挥干；加入自配含DAPI的抗淬灭液复染，覆盖玻片(乙醇预先处理)，10min后在荧光显微镜下观察。
原位杂交分析结果显示，外源标签随机插入CHO细胞基因组中，共计获得15个整合位点不同的单克隆(见表1)，选择其中4个用于同源重组，包括FRT插入位点在1q13的FRT-sCHO3、FRT插入位点在1q6的FRT-sCHO7细胞系以及FRT插入位点在2个非1号染色体的细胞系。
表1 FRT外源标签在CHO细胞的染色体插入位点
实施例2外源基因同源重组及蛋白表达
1、表达质粒构建
a)pBAT-dhfr表达载体构建
pBAT-dhfr载体通过人工改造获得，其可用于外源基因定点整合及蛋白表达。利用特异引物P1和P2通过PCR方法扩增获得基因片段。PCR反应体系1(总体积50μl)：5×Buffer10μl、dNTP 2μl、引物1μl(P1和P2)、模板为UCOE载体1μl、Phusion酶0.5μl，最后用双蒸水补至50μl；反应条件：98℃预变性60s，1个循环，98℃10s、55℃30s、72℃50s，30个循环，最后72℃7min。基因产物以琼脂糖凝胶电泳检测，获得基因片段命名为gene1。利用特异引物P3和P4通过PCR方法扩增获得基因片段DHFR。PCR反应体系1(总体积50μl)：5×Buffer 10μl、dNTP2μl、引物1μl(P1和P2)、模板为pCHO1.0载体1μl、Phusion酶0.5μl，最后用双蒸水补至50μl；反应条件：98℃预变性60s，1个循环，98℃10s、55℃30s、72℃50s，30个循环，最后72℃7min。基因产物以琼脂糖凝胶电泳检测，获得基因片段命名为gene2。利用特异引物P1和P4通过拼接PCR方法扩增获得基因片段。PCR反应体系1(总体积50μl)：5×Buffer 10μl、dNTP2μl、引物1μl(P1和P2)、模板为pCHO1.0载体1μl、Phusion酶0.5μl，最后用双蒸水补至50μl；反应条件：98℃预变性60s，1个循环，98℃10s、55℃30s、72℃50s，30个循环，最后72℃7min。基因产物以琼脂糖凝胶电泳检测，获得基因片段命名为gene3。Gene3包含了mPKG启动子、FRT位点和DHFR基因序列。将gene3和UCOE载体分别利用SalI和DraIII双酶切处理，前者利用产物回收试剂盒进行基因片段回收，后者利用胶回收试剂盒回收载体大片段，连接，构建pBAT-dhfr载体，转化Top10大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，提取质粒酶切及序列分析，结果pBAT-dhfr载体构建成功(见图1)。
引物如下所示：
P1:5-AGAGTCGACCCTAGGGATATCTTAATTAACTGCAGGCATGCAAGCTGGC-3
P2:5-CTTCGGAATAGGAACTTCGGTAAGCTGGTCGAAAGGCC-3
P3:5-GAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCATGGTTCGACCATTG-3P4:5-ATGCACCAGGTGTTAGTCTTTCTTCTCGTAGAC-3
b)pBAT-VR1质粒构建
pBAT-VR1载体通过人工改造获得，其在pBAT-dhfr载体中插入外源目的基因，用于外源基因定点整合及蛋白表达。全基因合成方法获得目的基因片段，获得基因片段命名为VR1。pBAT-dhfr和VR1分别进过AvrII和PacI酶切处理。在T4连接酶的作用下，将基因片段pBAT-dhfr、VR1基因片段连接。连接反应体系如下：在1.5ml EP管中加入如下成分pBAT-dhfr0.5μl，VR17.5μl，10×T4Buffer 1μl，T4DNA ligase 1μl，混匀后在室温(20℃左右)下反应4h以上，连接产物转化至Top10大肠杆菌感受态细胞中，涂布于2YT平板培养基上37℃静止过夜，平板编号pBAT-VR1。从pBAT-VR1平板中各挑取数个重组单菌落经过培养后做为PCR模板，分别进行PCR筛选鉴定。菌液PCR扩增反应体系(总体积20μL):2×Taq HS 10μL、菌液模板2μL、上下游引物各1μL(终浓度0.3μmol/L)，最后用双蒸水补至20μL；反应条件:95℃2min，一个循环；94℃60s、53℃60s、72℃120s，30个循环；最后72℃5min。通过菌落PCR鉴定正确的菌落接种后提取再进行酶切鉴定。首先进行重组菌的质粒提取，然后进行酶切分析，将通过菌落PCR、酶切鉴定及测序鉴定获得正确pBAT-VR1质粒(见图2)。
2、pBAT-Flp质粒构建
pBAT-Flp载体通过人工改造获得，用于特异性表达FLP重组酶。利用特异引物P5和P6通过PCR方法扩增获得基因片段。PCR反应体系(总体积50μl)：5×Buffer 10μl、dNTP 2μl、引物1μl(P1和P2)、模板为pOG44载体1μl、Phusion酶0.5μl，最后用双蒸水补至50μl；反应条件：98℃预变性60s，1个循环，98℃10s、55℃30s、72℃50s，30个循环，最后72℃7min。基因产物以琼脂糖凝胶电泳检测，获得基因片段命名为Flp。将Flp和pCI-neo载体分别利用NheI和SalI双酶切处理，前者利用产物回收试剂盒进行基因片段回收，后者利用胶回收试剂盒回收载体大片段，连接，构建pBAT-Flp载体，转化Top10大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，提取质粒酶切及序列分析，结果pBAT-Flp载体构建成功(见图3)。
引物如下所示：
P5:5-GCCGCTAGCATGCCACAATTTGATATATTATG-3
P6:5-GCCGTCGACTTATATGCGTCTATTTATG-3
3、质粒共转染
质粒pBAT-Flp含有FLP重组酶表达元件，通过与特定质粒的共转染，可实现特定质粒在基因组中FRT位点的定点整合。采用已筛选的FRT整合工程细胞系FRT-sCHO3、FRT-sCHO5FRT-sCHO7和FRT-sCHO15进行检测，按照Lonza Cell LineKit V试剂盒说明书分别进行pBAT-VR1和pBAT-Flp质粒共转染。转入质粒的细胞分别置于摇瓶培养(37℃、5％CO2、130rpm/min)至48h，细胞计数仪检测细胞活率和细胞数。
转染48h后进行加压筛选：即MTX浓度从100nM起逐渐加至200nM、500nM、700nM、和1000nM，并获得初筛细胞，再经有限稀释法进行单克隆细胞筛选，获得单克隆细胞FRT-sCHO3-VR1、FRT-sCHO5-VR1、FRT-sCHO7-VR1和FRT-sCHO15-VR1。
4、同源重组鉴定
a)荧光原位杂交
i.染色体制片
单克隆细胞系染色体制备方法参照实施例1中实验4a操作。
ii.探针制备
以pBAT-VR1质粒，利用AvrII和PacI限制性内切酶进行双酶切处理，37℃条件反应过夜，切胶回收小片段用于探针标记，该小片段与整合的质粒互补，将小片段利用非放射性生物素进行标记，具体标记操作步骤按照Random Primed DNA Labeling Kit试剂盒说明书进行,获得探针。
iii.荧光原位杂交
荧光原位杂交实验方法参照实施例1中实验4c操作。
原位杂交分析结果显示，FRT-sCHO3-VR1细胞系外源基因特异性整合至1号染色体1q13处，FRT-sCHO5-VR1细胞系外源基因特异性整合至5号染色体Z-5q处，FRT-sCHO7-VR1细胞系外源基因特异性整合至1号染色体1q12处，FRT-sCHO15-VR1细胞系外源基因特异性整合至6号染色体Z-6q6处(见图4)，说明外源基因VR1与细胞系的FRT位点实现了同源重组并达到了定点整合的目的。
b)外源蛋白表达
从96孔板扩至24孔板生长筛选阳性克隆细胞，然后扩至6孔板生长，之后扩至50mL摇瓶生长。分别收集培养3天、5天、7天、9天、11天细胞培养上清，离心并除去细胞碎片，上清液进行蛋白鉴定与蛋白浓度检测。应用Western blot技术检测结果显示VR1蛋白分子量大小符合理论值，表明通过同源重组的外源VR1蛋白正确表达。进一步对插入位点分别在1q13、1q12和Z8q4、Z9q7的4个细胞系进行了外源蛋白表达水平比较，结果显示，在染色体1q13和1q12位点实现同源重组或定点整合VR1基因的细胞，其蛋白表达水平明显高于同源重组或定点整合在染色体Z8q4、Z9q7的细胞(见图5)，其中在1q13定点整合的FRT-sCHO3-VR1细胞在培养11天时，外源蛋白表达量达到2.226g/L。
5、外源蛋白表达稳定性考察
对4种单克隆细胞系FRT-sCHO3-VR1、FRT-sCHO5-VR1、FRT-sCHO7-VR1和FRT-sCHO15-VR1进行了长期传代培养，培养至第10代、20代、30代、50代、70代和100代时分别转入50mL摇瓶培养，并于第7天收集细胞培养上清，测定蛋白浓度。经比较外源蛋白表达水平发现，经过长期传代培养，定点整合在染色体1q13和1q12的细胞，其外源蛋白表达水平维持在稳定且高水平状态，而定点整合在染色体Z8q4、Z9q7细胞系从传代0代至10代，外源基因呈低水平表达，第10代之后外源基因表达稳定性呈明显下降趋势。以传代100代次的蛋白表达量与0代次相比，定点整合在染色体1q13和1q12的细胞其下降幅度小于20％；而定点整合在染色体Z8q4、Z9q7细胞，其外源蛋白表达稳定性较差，100代次的表达量与0代相比下降幅度大于50％(见图6)。
Claims (5)
1.定点整合外源基因的FRT-sCHO细胞系，所述细胞系是通过在悬浮的CHO细胞1号染色体上插入接受外源基因稳定整合的识别标签而获得，其特征在于，所述1号染色体为CHO细胞内未发生变异的染色体，其插入识别标签的位点为1号染色体1q12和1q13区域。
2.根据权利要求1所述的FRT-sCHO细胞系，其特征在于母本细胞株选自悬浮培养的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
3.根据权利要求1所述的FRT-sCHO细胞系，其特征在于能利用位点特异性重组方法实现外源基因的定点整合和蛋白表达。
4.根据权利要求3所述的FRT-sCHO细胞系，其特征在于重组特异性位点为FRT，重组酶为FLP。
5.根据权利要求1所述的FRT-sCHO细胞系用于各类外源基因的稳定表达的用途，其特征在于包括治疗性重组蛋白、治疗性单克隆抗体和疫苗的表达及工业生产，其中，所述细胞系是通过在悬浮的CHO细胞1号染色体上插入接受外源基因稳定整合的识别标签而获得，并且所述1号染色体为CHO细胞内未发生变异的染色体，其插入识别标签的位点为1号染色体1q12和1q13区域。
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-
2015
- 2015-03-24 CN CN201510130235.7A patent/CN104818253B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN1618955A (zh) * | 2003-11-20 | 2005-05-25 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种CHO/dhfr－细胞定点整合表达系统 |
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|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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