CN1894402A - Flp介导的重组 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于将多核苷酸同源重组并稳定整合入宿主细胞的组合物和方法。本发明公开的组合物和方法提供了快速而有效的方法用于将外源多核苷酸稳定地整合入宿主细胞并选择已转化的细胞。
Description
技术领域
本发明涉及重组载体和重组盒，并更具体地涉及用于在生物体或宿主细胞中表达外源分子的方法、组合物和系统。
背景技术
将核酸分子、多肽和肽导入靶细胞和组织正被用作治疗递药系统以及用于治疗分子的体外产生。随着宿主细胞和细胞分裂、分化及表达机制的分子生物学的进一步了解，此法的适用性已增加。
已经证明，通过同源的外源DNA和外源染色体序列之间的同源重组的基因打靶(gene targeting)是极有价值的方法，可用于产生缺失或插入，设计突变，校正基因突变，导入转基因(transgene)，或产生其他基因修饰。
发明内容
本发明提供了重组盒，其包含启动子/增强子区；目标多核苷酸；polyA信号域；FRT重组域；和ahfr多核苷酸，其中所述启动子/增强子区、所述目标多核苷酸和所述polyA信号域可操作地连接。
本发明也提供了包含重组盒的重组载体，所述重组盒包含启动子/增强子区；目标多核苷酸；polyA信号域；FRT重组域；和dhfr多核苷酸，其中所述启动子/增强子区、所述目标多核苷酸和所述polyA信号域可操作地连接。在一个实施方案中，所述载体包含SEQ ID NO：1或2中所列的序列。在又一个实施方案中，所述重组载体，还包含第二个启动子/增强子区；第二个目标多核苷酸；和第二个polyA信号域，其中第二个启动子/增强子区、第二个目标多核苷酸和第二个polyA信号可操作地连接。
本发明进一步提供宿主细胞，其含有本发明的稳定整合的重组盒的一个或多个拷贝。在一个实施方案中，所述宿主细胞适宜在悬浮液中和/或在无血清培养基中生长。
本发明也提供重组系统。所述重组系统包含表达质粒，所述质粒含有一个或多个FRT重组域；和含有一个或多个FRT位点的宿主细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞，其包括，例如，CHO-DG44细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞适宜在悬浮液中和/或在无血清培养基中生长。
本发明还提供试剂盒，其包含本发明的载体和/或重组盒和含有FRT位点的宿主细胞。
本发明的一个或多个实施方案的细节在下面的附图和说明中列出。通过说明和附图及通过权利要求，本发明的其他特点、目的和优势将显而易见。
附图说明
图1显示FLP重组靶(FRT)位点和导入CHO宿主细胞的基因组的过程。可将含有目标多核苷酸的表达载体通过在所述FRT位点的FLP重组酶(recombinase)介导的DNA重组而被转染(稳定整合)入该基因组。
图2显示本发明的重组载体的谱图(对应于SEQ ID NO：1)。
图3显示本发明的重组载体的谱图(对应于SEQ ID NO：2)，其包含具有两个插入位点的载体(即，在1309和在6370开始的多克隆位点)。
图4显示pFRTlacZeo的质粒图，其用于产生CHO-DG44Flp-In细胞系。
图5显示pFRTlacZeo的质粒图，其显示用于在转染的宿主细胞中鉴定FRT存在的探针。
图6显示通过Southern印迹筛选的＞100个检验的细胞系中17个的代表性的照片。每条通道含有10μg来自转染的细胞系的基因组DNA。从不同大小的条带来看，明显这些候选宿主细胞系中许多具有在不同位点整合入CHO-DG44的FRT序列。此外，FRT的多重整合(multiple integration)位点的实例，从多重条带来看，在通道11中可见。
图7显示潜在的候选物，其被再次检测以确定FRT盒的单拷贝。通道1含有1ng pFRT/lacZeo，其作为阳性对照。显示了35个候选细胞系中9个的结果。每个通道含有10μg来自转染的细胞系的基因组DNA。只看到单条带，这证实了单整合(single integration)。而且，不同大小的条带提示FRT位点的不同整合位置。由于只有FRT序列的单拷贝存在于CHO-DG44基因组，杂交条带是非常弱的。
图8A和8B显示SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
图9A和9B显示SEQ ID NO：2的核苷酸序列。
发明详述
本发明提供重组盒和载体，其用于将所需的多核苷酸(即，目标多核苷酸)同源重组并稳定整合入宿主细胞。本发明提供多核苷酸构建体，其包含与足以允许在宿主细胞的染色体DNA中的位点进行同源重组的外源染色体多核苷酸同源的序列，编码可选标记和克隆位点的多核苷酸，并可进一步包含调控元件。本发明的方法、系统和组合物提供了强大的工具，用于以最少的工作产生大量蛋白质以产生稳定的细胞系。
在本发明的一个方面，提供了包含重组盒的多核苷酸，所述重组盒包括巨细胞病毒(cytomegalo virus)(CMV)转录调控区、可变长度的间插序列(intervening sequence)(例如，来自CMV的内含子A)、目标多核苷酸、重组域和多腺苷酸化(polyadenylation)信号域。本发明还涉及用于产生和回收来自宿主细胞的异源多肽的方法和表达载体。
在另一个方面，本发明的重组盒包括，可操作连接的以下序列：(i)CMV主要的早期速发(immediate early)1(IE1)启动子/增强子区和可变长度的间插序列(例如，内含子A的衍生物)，(ii)目标多核苷酸，(iii)第一个多腺苷酸化信号域(例如，BHG或hGH polyA)，(iv)重组域(例如，FRT位点)，(v)可选标记(例如，dhfr)和(vi)第二个多腺苷酸化信号(例如，SV40E polyA)。术语“可操作连接”指并置(juxtaposition)，其中所述组分为允许它们以它们预期的方式发挥功能的关系(例如，功能连接)。因此，例如，与目标多核苷酸可操作连接的启动子/增强子以一种方式与后者相关，以使在适合由启动子/增强子激活表达的条件下实现目标多核苷酸的表达。
在本发明的一个实施方案中，所述重组盒包括如SEQ ID NO：1中大约核苷酸1至大约核苷酸2704所示的序列(例如，大约1至2700，至2701，至2702，至2703，至2705，至2706，至2707，或至2708)。作为另一个实例，所述重组盒包含SEQ ID NO：2的大约核苷酸1至2635的序列(例如，大约1至2633，至2634，至2636，或至2637)。SEQ ID NO：1或2的核苷酸1至2704或1至2635所示的重组盒分别包括许多不同的域，诸如CMV IE1启动子/增强子区，其具有SEQ ID NO：1或2的大约x1至大约x2所示的序列，其中x1是位置1至位置70的核苷酸而x2是位置770至位置780(例如，SEQ ID NO：1或2的大约位置63至大约位置776)的核苷酸。重组盒的另一个域包括可变长度的间插序列(VLIVS)，其包含拼接供体(splice donor)和拼接受体(splice acceptor)位点。所述VLIVS长度上可为至少50bp(例如，长度上至少100、150、200或250bp)并可包括来自本领域已知的任何来源的拼接供体和受体。参见，例如，Varani等，Annu Rev Biophys Biomol Struct 27：407-45(1998)和Koning，Eur JBiochem 219：25-42(1994)。合适的间插域可包括任何菌株的CMV基因组的所有内含子A或可包括含有5’序列的较小片段，所述5’序列含有拼接供体位点，该拼接供体位点与含有拼接受体位点的3’序列连接。例如，所述VLIVS包括SEQ ID NO：1的大约x3至大约x4的核苷酸，其中x3是在位置770-780的核苷酸而x4是在位置1300-1310(例如，SEQ ID NO：1的776-1304)的核苷酸。作为另一个实例，所述VLIVS包括SEQ ID NO：2的大约x3至大约x4的核苷酸，其中x3是770-780的核苷酸而x4是1300-1310的核苷酸(例如，SEQ ID NO：2的776-1309)。所述CMV IE1启动子/增强子之后的间插序列在大小上可与来自SEQ ID NO：1或2中存在的间插序列相差多至317个核苷酸。所述VLIVS区之后(即，下游)可存在多克隆位点(例如，SEQ ID NO：1的核苷酸1310-1418，包括NH3I、BamHI、KpnI、EcoRI、PmeI、PstI、EcoRV、NotI、XhoI、ApaI和PmeI位点；SEQ ID NO：2的核苷酸1309-1332，包括EcoRV、NotI、XhoI位点)。使用本领域的那些技术人员已知的技术，可在所述重组盒中设计不同的或附加的限制位点。例如，图3图示了两个多克隆位点(参见，例如，在大约1309和6370开始的克隆位点)，其增加了在多个相关的或不相关的多核苷酸中克隆的能力。此载体包含双盒，如图3所示，也具有两盒之间的终止子。
而且，本领域的技术人员会认识到，可取代、添加或缺失一个或多个来自具体域的末端的核苷酸，而不背离该域和/或盒和/或载体作为整体的功能性。例如，在任一个本文中鉴定的域的任一末端1至10个核苷酸的变异将可能包含用于本发明的域、盒和/或载体的预期目的的功能域。
所述重组盒还包括polyA信号域。该polyA信号域可源自人来源(例如，人生长激素(hGH polyA))，或来自牛(例如，牛生长激素(BGH polyA))或其他动物来源。该polyA信号域可源自hGH基因，其可在它的3′UTR序列中变化，例如，从等位基因到等位基因。在GenBank Accession No.K00470(SEQ IDNO：3)中描述了hGHv基因的一个等位基因。BGH polyA信号域的实例包括SEQ ID NO：1的大约核苷酸1143至大约1668和SEQ ID NO：2的大约核苷酸1375至大约1600所示的序列。可通过诱变技术，包括应用于多核苷酸、细胞或生物体的那些，制备polyA信号域的非天然产生的变体。来自hGH基因的PolyA信号域变体包括polyA信号域，其由野生型hGH polyA信号域变化而来仍保持对于信号转录终止和/或稳定mRNA的能力。例如，多腺苷酸化信号域可包括hGHv多腺苷酸化信号域序列。本发明包括任何polyA信号域，该信号域包含hGHv基因的至少100nt(例如，至少200、300、400、500或600nt)的连续的核苷酸序列，包括常规的(canonical)AATAAA位点。
此外，本发明包含由前述序列变化多达8％的序列(例如，与SEQ ID NO：3或其不同的域具有92％同一性)。例如，本发明中包括与SEQ ID NO：1的核苷酸1-2704或SEQ ID NO：2的1-2635具有95％同一性的多核苷酸。
在本发明的另一个方面，提供了包含重组盒的载体。如本文使用的，“载体”是核酸分子(DNA或RNA)，其能在导入受体细胞(例如，细菌细胞或哺乳动物细胞如CHO细胞)后自主复制。质粒和病毒是载体的实例。由表达载体的“表达”方法是公知的，并包括利用细胞的酶和从目标多核苷酸产生表达产物的方法。表达载体是能够介导克隆的多核苷酸在宿主细胞中表达的载体，其可以与或可以不与用于使所述载体复制或增殖的细胞的类型相同。许多哺乳动物表达载体可在普通细菌(受体细胞)中增殖，但在哺乳动物细胞(宿主细胞)中而不在细菌中表达目标多核苷酸。
本发明的载体包括：用于接受目标多核苷酸的克隆位点；转录调控元件(例如，CMV IE1启动子/增强子区)，其足以允许在宿主细胞中转录插入该克隆位点的多核苷酸；翻译元件，其足以允许在宿主细胞中翻译所述多核苷酸的RNA转录物和(如果需要)复制元件，其足以允许在宿主细胞或别的用于增殖所述载体的受体细胞中复制所述载体。本发明的载体能够暂时地或稳定地在宿主细胞中介导所述表达(例如，通过所述宿主细胞基因组中的同源重组)。
在具体的实施方案中，本发明的载体包括(1)SEQ ID NO：1或2中所示的序列；(2)与SEQ ID NO：1或2中所示的序列互补的序列；(3)与SEQ ID NO：1或2或它们的互补物至少80％(或至少90％；95％；98％或99％)相同的序列；或(4)分别包含SEQ ID NO：1的大约核苷酸1至大约核苷酸2704或SEQ IDNO：2的大约核苷酸1至大约核苷酸2635，并包含目标多核苷酸和/或可选择标记的序列。
本发明的载体包含SEQ ID NO：1或2，或一个或多个下述域，只要它含有FRT位点。例如，该载体中存在CMV IE1启动子/增强子区，其具有如SEQID NO：1的大约x1至大约x2所示的序列，其中x1是核苷酸1-70而x2是核苷酸770-780(例如，SEQ ID NO：1的大约1至776位核苷酸)。在本发明的另一个方面，该载体中存在CMV IE1启动子/增强子区，其具有如SEQ ID NO：2的大约x1至大约x2所示的序列，其中x1是核苷酸1-60而x2是770-780位(例如，SEQID NO：1的大约1至776)的核苷酸。本发明的表达载体的另一个域包括可变长度的间插序列(VLIVS)，其含有拼接供体和拼接受体位点。例如，所述VLIVS包括SEQ ID NO：1的大约x3至大约x4的核苷酸，其中x3是770-780位的核苷酸而x4是1300-1310位的核苷酸(例如，SEQ ID NO：1的776-1304)。作为另一个实例，所述VLIVS包括SEQ ID NO：2的大约x3至大约x4的核苷酸，其中x3是770-780位的核苷酸而x4是1300-1310位的核苷酸(例如，SEQ ID NO：2的776-1309)。所述VLIVS区的后面(即，下游)可存在多克隆位点(例如，SEQ IDNO：1的核苷酸1310-1418，其包括NH3I、BamHI、KpnI、EcoRI、PmeI、PstI、EcoRV、NotI、XhoI、ApaI和PmeI位点；SEQ ID NO：2的核苷酸1309-1332，其包括EcoRV、NotI、XhoI位点)。使用本领域的那些技术人员已知的技术，可在所述表达载体中设计不同的或附加的限制位点。所述表达载体还包括polyA信号域。
所述polyA信号域可源自人来源(例如，人生长激素(hGH polyA))，或来自牛(例如，牛生长激素(BGH polyA))或其他动物来源。该polyA信号域可源自hGH基因，其可在它的3′UTR序列中变化，例如，从等位基因到等位基因。在GenBank Accession No.K00470(SEQ ID NO：3)中描述了hGHv基因的一个等位基因。BGH polyA的实例包括SEQ ID NO：1的核苷酸1143至1668和SEQID NO：2的核苷酸1375至1600所示的序列。本发明的载体中也存在一个或多个可选择的标记。
本发明的重组盒和载体相对于在先的重组盒和载体具有突出的优势。例如，本发明的盒和载体允许将目标多核苷酸稳定整合入包含一个或多个FRT位点并应用天然有营养缺陷型dhfr可选择标记的宿主细胞，并允许简单而有效地选择转化的宿主细胞。选择成功转染的细胞系通常依靠整合的可选择标记，其赋予对于细胞毒类药物的抗性(例如，抗生素抗性)。非营养缺陷的可选择标记赋予对于通常杀死生物体(例如，细胞)的物质的抗性。当将此细胞毒素物质施用于所述生物体时，只有那些具有所述可选择标记的将幸存。因此，通常的可选择标记要求必须加入外源物质以选择抗性的细胞。必须将合适浓度的细胞毒素物质加入培养物，这需要技师或研究者的方面的额外努力。例如，如果加入了过多的细胞毒素物质，那么包含可选择标记的生物体也可被杀死，因而减少转染/转化效率和产量。相比之下，本发明提供可选择标记，其中不加入细胞毒素物质，而是具有所述可选择标记(即，dhfr)的细胞能够在缺少具体添加剂的确定的培养基(defined medium)中生长，该添加剂对于缺少所述可选择标记的生物体来说是生长所必需的。二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase)(DHFR)是需要NADPH的酶(EC1.5.1.3)，其催化四氢叶酸的合成，四氢叶酸对于合成dTMP、甘氨酸和嘌呤来说是不可缺少的代谢物。缺乏编码DHFR的多核苷酸时，细胞必须在含有dTMP、甘氨酸和/或嘌呤的培养基上生长。当细胞中存在所述可选择标记DHFR时，可除去外源的嘌呤而且那些含有DHFR标记的细胞会继续生长和增殖，而缺少DHFR的那些将死亡。因此，本发明提供花费更少精力选择已被转染/转化的生物体(例如，细胞)。
本发明的FLP系统允许在任何需要的哺乳动物宿主细胞中具体的基因组位置上进行目标多核苷酸的稳定整合和表达。通过将单FLP重组目标(FRT)域转染到选择的宿主细胞系的基因组中建立FLP宿主细胞系；然后将此得到的宿主细胞系用于后续的FLP转染/重组。一旦产生所述宿主细胞系，可将任何目标多核苷酸通过FLP重组酶介导的DNA重组在FRT位点稳定地整合入所述宿主细胞基因组，参见图1。可将目标多核苷酸有效地“换入”宿主基因组，总是在相同的位置和方向。由于所有转染的细胞可具有整合入相同基因组位置的目标多核苷酸，避免了克隆细胞系的分离，因为所有转染的细胞是遗传上相同的。
本发明也提供通过用重组靶位点(例如，FRT重组位点)转染中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary)(CHO)-DG44细胞产生的宿主细胞系。此CHO-DG44细胞系缺少有功能的二氢叶酸还原酶(dhfr)基因，因此需要外源甘氨酸、嘌呤和胸腺嘧啶(thymidine)(一种嘧啶)用于生长。应将这样的细胞系保持在补加核苷的培养基中。用本发明的含有功能的dhfr基因的重组盒/载体转染后，通过在无嘌呤和胸腺嘧啶的培养基中培养细胞实现选择。随着所述宿主细胞系的建立，可以非常快地产生表达目标多核苷酸的稳定细胞系。
本发明还提供包含本发明的重组盒和/或载体和含有FRT位点的宿主细胞的重组系统。在本发明的一个方面，所述宿主细胞是CHO细胞或CHO-衍生的细胞，其包含重组插入宿主细胞的基因组的FRT位点。此系统(例如，CHO或CHO-衍生的细胞和所述重组盒/载体)提供强大的工具，用于在CHO宿主中在少于6周内产生10-40mg/L的重组蛋白质(例如，在10天的生物反应器运行期间具有15×107(细胞天)/ml的ICA)。而且，需要最少的工作以建立这些稳定的细胞系。
本发明的方法和组合物允许将目标多核苷酸容易地整合在宿主细胞中的预定的外源多核苷酸靶位点上。所述外源多核苷酸靶位点可以是天然存在的多核苷酸(即，存在于宿主的基因组而且不是重组插入的多核苷酸)或可以是先前设计到宿主生物体中以实现在宿主生物体中选择、表达或重组的多核苷酸。如本文使用的，术语″预定的外源多核苷酸靶″和″预定的靶″是指靶细胞中含有的多核苷酸序列。上述预定的靶包含，例如，染色体序列(例如，结构基因、基因内(intronic)序列、5′或3′非编码序列、调控序列包括启动子和增强子、重组热点(recombinatorial hotspot)、重复序列、整合的前病毒序列(integrated proviral sequence)、发卡、回文)，和游离的或附加的染色体序列(例如，可复制的质粒或者病毒的或寄生的复制中间物)，其包括叶绿体和线粒体的DNA序列。″预定的″或″预选择的″是指可基于预测的序列信息选择靶序列，而不是限制于被一些位点特异性的重组酶(例如，FLP重组酶或CRE重组酶)识别的具体位点。在一些实施方案中，所述预定的外源多核苷酸靶会不同于天然存在的种系(germline)多核苷酸(例如，外源多核苷酸，寄生的，支原体的或病毒的序列)。外源多核苷酸是转移(即，通过重组分子生物学技术转移)到宿主细胞的多核苷酸。例如，显微注射或转染到细胞的外源多核苷酸是外源多核苷酸。本文中使用的应用于对象的术语″天然存在″是指所述对象能在自然界存在的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的多核苷酸是天然存在的，所述的生物体可从天然的来源分离而且没有被人为修饰。
本发明的重组盒/载体中的重组域将所述盒/载体根据所述重组域和对应的预定的外源多核苷酸靶之间存在的同源性，定位到宿主的基因组的具体的染色体位置，并通过称为″同源重组″的过程导入所需的基因修饰。
″同源的″或“同源性”是指两种或更多种核酸序列，它们是同一的或足够相似(例如，97％或97％以上是相同的)，它们能够彼此杂交或经过分子间交换。计算序列同一性的百分比，除外总数小于参考序列的25％的小缺失或添加。所述参考序列可为较大序列的子序列，如基因或侧翼序列的一部分，或染色体的重复部分。然而，所述参考序列为至少12-18个核苷酸的长度，至少大约30个核苷酸的长度，并可为至少大约50至100个核苷酸的长度。通常，重组效率随着重组域和预定的外源多核苷酸靶之间同源性的长度和/或百分数增加而增加。
在两个或更多个核酸分子的上下文中，术语“同一的”或百分数“同一性”是指两个或更多个序列或子序列，当在比较窗口中比较和比对最大一致性时，所述序列或子序列为相同的或其相同核苷酸为规定的百分数，如使用比较算法或通过人工比对和目测观察测定的那样。此限定也指序列的补体(例如，包含重组盒的SEQ ID NO：1或其片段中所示的序列的补体)。例如，所述重组盒及其片段包括与SEQ ID NO：1的确定的部分(例如，SEQ ID NO：1的核苷酸1-719、1-1254等)具有至少大约80％、大约90％、和大约95％、大约97％、大约98％或大约99％同一性的核苷酸序列。因此，如果序列与SEQ IDNO：1或其域的全部序列具有必需的序列同一性，那么它也可分别起本发明的重组盒或域的作用。
对于序列比较而言，通常一个序列作为参考序列，将测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果需要标明子序列坐标(subsequence coordinate)，并标明序列算法程序参数。可使用默认的程序参数，或者可标明可替换的参数。然后所述序列比较算法基于所标明的或默认的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分数序列同一性。“比较窗口”，如本文中使用的，包括涉及具有选自25至600中任何一个数目的连续位置的区段，通常大约50至大约200，更通常大约100至大约150，其中可将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列进行最佳地比对然后进行比较。比对序列用于比较的方法是本领域公知的。本领域中已知各种各样的算法并包括，例如，Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性(local homology)算法，通过Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson & Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的搜索相似性方法(search for similaritymethod)，通过这些算法的计算机程序(威斯康星遗传软件包(WisconsinGenetics Software Package)中的GAP、PILEUP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)，或通过人工排列和目测。
为了所述发明的确定百分数序列同一性的目的(即，基本的相似性或同一性)，使用BLAST算法，其在Altschul，J.Mol.Biol.215：403-410，1990中描述。用于进行BLAST分析的软件通过生物技术信息国家中心(National Centerfor Biotechnology Information)(在环球网上的ncbi.nlm.nih.gov/)可公开得到。此算法包括首先通过识别查询序列中短字(short word)的长度W识别高得分序列对(HSPs)，当与数据库序列中同样长度的字比对时，所述长度W匹配或满足一些正值的阀值分数T。“T”称为相邻字分数阈值(neighborhood wordscore threshold)。这些初始的相邻字命中(hit)作为启动搜索的种子以发现含有它们的较长的HSPs。然后将所述的字命中沿着每个序列在两个方向延伸直到能够增加累积的比对分数。对于核苷酸序列而言，使用参数M(匹配残基对的奖励分数；总是＞0)和N(不匹配残基的罚分，总是＜0)计算累积的分数。当累积的排列分数从其获得的最大值减少数量X时，字命中在每个方向的延伸停止；由于一个或多个负分的残基比对的积累，累积的分数归于零或以下；或任一序列到达末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度并包括如下参数用于核苷酸比较：字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝4。对于氨基酸序列而言，BLASTP程序使用字长(W)为3，期望值(E)为10和BLOSUM62得分矩阵(参见，例如，Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1989)。
BLAST算法也进行两个序列之间的相似性的统计分析(参见，例如，Karlin，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787，1993)。由BLAST算法提供的一种相似性的测量方法是最小和概率(smallest sum probability)(P(N))，其提供概率的指示，由此两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配会偶然出现。如果最小和概率小于0.1，就认为核酸与参考序列相似。例如，最小和概率可小于大约0.01，或小于大约0.001。
本发明中也包括与SEQ ID NO：1或2或其域中所示的多核苷酸序列特异地杂交的多核苷酸。术语“与...选择地(或特异地)杂交”是指在严谨性杂交条件下分子与具体的参考多核苷酸的结合、双联(duplexing)或杂交。术语“严谨性杂交条件”指探针可在核酸的复杂混合物中主要与其靶子序列杂交，而不与其他序列杂交的条件。严谨性条件是依赖于序列的并在不同的环境中是不同的，例如，依赖于探针的长度。较长的序列在较高的温度特异地杂交。关于核酸杂交的详尽的指南见于Tijssen，Techniques in Biochemistry andMolecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of principlesof hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)。通常，选择严谨性条件为比具体序列在限定的离子强度和pH的热解链温度(thermalmelting point)(Tm)低大约5-10℃。Tm是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度)50％的与靶互补的探针与靶序列杂交处于平衡状态的温度(由于靶序列过量存在，在Tm，50％的探针在平衡时被占据)。严谨性条件可为在pH 7.0至8.3，盐浓度小于大约1.0M钠离子，通常大约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)的那些条件，和对于短探针(例如，10至大约50个核苷酸)来说所述温度为至少大约30℃和对于长探针(例如，大于大约50个核苷酸)来说所述温度至少大约60℃。严谨性条件也可通过加入去稳定剂如甲酰胺实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号(例如，本发明的核酸的鉴定)是背景杂交的大约2倍。为了本发明的目的，中等严谨性杂交条件是指杂交在大约42℃、在含有25mM KPO4(pH 7.4)、5X SSC、5X Denhart’s溶液、50μg/mL变性的、经超声处理的鲑精DNA、50％甲酰胺、10％葡聚糖硫酸酯(Dextran sulfate)和1-15ng/mL探针的杂交溶液中进行，而洗涤在大约50℃、在含有2X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠的洗涤溶液中进行。高度严谨性杂交条件是指杂交在大约42℃、在含有25mM KPO4(pH 7.4)、5X SSC、5X Denhart’s溶液、50μg/mL变性的、经超声处理的鲑精DNA、50％甲酰胺、10％葡聚糖硫酸酯和1-15ng/mL探针的杂交溶液中进行，而洗涤在大约65℃、用含有0.2X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠的洗涤溶液进行。
本发明的方法和组合物在使用本发明的盒/载体经同源重组通过插入、缺失或置换外源多核苷酸的宿主细胞的修饰中得到应用。
本发明的重组盒/载体可包含可选择标记。″标记″或″可选择标记″是选择标记，其允许从群体中大多数经处理的细胞分离表达所述标记的稀见的经转染的细胞。可选择标记的具体实例是编码赋予对于细胞抑制(cytostatic)药物或杀细胞的(cytocidal)药物的抗性的蛋白的那些标记，所述蛋白如DHFR蛋白，其赋予对于氨甲喋呤(methotrexate)的抗性(Wigler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：3567(1980)；O’Hare等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981))；GPF蛋白，其赋予对于麦考酚酸(mycophenolic acid)的抗性(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072(1981))；新霉素(neomycin)抗性标记，其赋予对于氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等，J.Mol.Biol.150：1(1981))；Hygro蛋白，其赋予对于潮霉素(hygromycin)的抗性(Santerre等，基因30：147(1984))；和ZeocinTM抗性标记(商业上可从Invitrogen得到)。此外，在tk-、hgprt-或aprt-细胞中可分别应用单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase)(Wigler等，Cell 11：223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase)(Szybalska&Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA48：2026(1962))和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(adenine phosphoribosyltransferase)(Lowy等，Cell 22：817(1980))。其他可选择标记编码嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(puromycin N-acetyl transferase)或腺苷脱氨酶(adenosine deaminase)。
所述dhfr标记是有特殊优势的。DHFR是嘧啶合成所需的酶。缺乏功能的DHFR或不表达DHFR的细胞生长需要嘧啶。可用dhfr载体转染dhfr-的宿主细胞，由此恢复合成嘧啶的能力。当移除含有外源嘧啶的培养基时，只有包含外源提供的dhfr基因的那些细胞会幸存。相比之下，基于在毒性药物存在的条件下生长的能力选择的标记是更难选择的。例如，在用“抗性基因，”转染细胞的情况中，提供不同浓度的细胞毒性药物来选择包含抗性基因的细胞。在一些情况中，会加入过多或不足的细胞毒性药物，在这些情况中选择是低效率的(inefficient)和/或不可靠的(unreliable)。
SEQ ID Nos：1和2包括二氢叶酸还原酶(dhfr)基因(例如，包含SEQ IDNO：1的大约核苷酸2007至大约核苷酸2567；和SEQ ID NO：2的大约核苷酸1939至大约核苷酸2499的序列)。本发明的重组盒/载体可包括附加的启动子/增强子元件和调控区(例如，多腺苷酸化域)。上述附加的调控元件和多腺苷酸化域可与选择标记或目标多核苷酸侧接(例如，紧邻其5’和3’)。这些载体中的dhfr基因侧接SV40多腺苷酸化区(例如，分别为SEQ ID NO：2的大约核苷酸2568至大约核苷酸2704和大约核苷酸2500至大约核苷酸2635)。
本发明的重组盒和/或载体包含至少大约10至100个核苷酸的重组域，其通常为至少大约20至100个核苷酸的长度，但可更长(例如，至少大约250至500个核苷酸的长度，或大约500至2000个核苷酸的长度，或更长)。重组域的长度可部分地基于与预定的内源多核苷酸靶的同源性。因此，专业人员可根据预定的内源多核苷酸靶序列的序列组成和复杂性和本领域中提供的指导进行判断，由此选择同源性的长度。所述重组域具有至少一个序列，其基本对应于，或基本互补于预定的外源多核苷酸(例如，位于靶宿主细胞中的多核苷酸的DNA序列，诸如染色体的、线粒体的、叶绿体、病毒、附加体(episomal)、或支原体的多核苷酸)。所述重组域核苷酸序列作为与预定的内源多核苷酸靶同源配对的模板。在将载体中的目标多核苷酸靶向至宿主细胞基因组的过程中，同源性的区域通常位于或邻近目标多核苷酸的5′和/或3′末端(Berinstein等(1992)Molec.Cell.Biol.12：360，其并入本文作为参考)。不期望受到任何具体理论的限制，认为重组酶的加入允许用具有短的(即，大约10至1000个碱基对长)同源性区段的重组域核苷酸序列进行有效的靶向。在本发明中，所述重组域是FRT位点。
通常所述重组域核苷酸序列可与预定的多核苷酸内源靶具有高度的同源性，并可通常为相同的。通常，本发明的重组域核苷酸序列为大约10至35个核苷酸的长度，但可以为大约20至100个核苷酸的长度，或大约100至500个核苷酸的长度，虽然重组域和预定的外源多核苷酸靶之间的序列同一性的程度可决定最佳且最小的长度(例如，G-C富含序列通常是热力学上更稳定的并通常需要更短的重组域长度)。因此，可根据具体的预定的序列确定重组域长度和序列同源性程度。
通常用至少一种重组酶蛋白(例如，Flp重组酶)，将本发明的重组盒和/或本发明的载体导入携带预定的外源多核苷酸靶的宿主细胞中。在一些情况下，将所述重组盒或载体在导入宿主细胞之前与Flp或其他重组酶温育，以使该重组酶蛋白可″装载″到所述重组盒或重组载体上。
重组酶是蛋白质，当其包含于含有重组域的目标多核苷酸时，使得目标多核苷酸和预定的内源多核苷酸靶之间的重组频率和/或局部化频率(localization frequency)的可测量的增加。因此，在一个实施方案中，可实现重组频率增加10至1000倍。
重组酶是RecA-样重组蛋白质的家族的成员，所述家族都具有基本上全部或大多数的相同功能，具体为：(i)重组酶蛋白正确结合于包含重组域的目标多核苷酸并将其定位在其同源靶上的能力和(ii)重组酶蛋白/靶向多核苷酸复合物有效发现并结合于互补的内源序列的能力。特性最优的recA蛋白来自大肠杆菌。除了所述野生型大肠杆菌蛋白质，已鉴定了许多突变的recA-样蛋白质(例如，recA803；参见Madiraju等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(18)：6592(1988)；Madiraju等，Biochem.31：10529(1992)；Lavery等，J.Biol.Chem.267：20648(1992))。此外，许多生物体含具有链-转移活性的recA-样重组酶(例如，Fugisawa等，Nucl.Acids Res.13：7473(1985)；Hsieh等，Cell 44：885(1986)；Hsieh等，J.Biol.Chem.264：5089(1989)；Fishel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：3683(1988)；Cassuto等，Mol.Gen.Genet.208：10(1987)；Ganea等，Mol.Cell Biol.7：3124(1987)；Moore等，J.Biol.Chem.19：11108(1990)；Keene等，Nucl Acids Res.12：3057(1984)；Kimeic，Cold Spring HarborSymp.48：675(1984)；Kimeic，Cell 44：545(1986)；Kolodner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5560(1987)；Sugino等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：3683(1985)；Halbrook等，J.Biol.Chem.264：21403(1989)；Eisen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：7481(1988)；McCarthy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5854(1988)；Lowenhaupt等，J.Biol.Chem.264：20568(1989)，其并入本文作为参考。这些重组酶蛋白质的实例包括，但不限于：recA、recA803、uvsX和其他recA突变体和recA-样重组酶(Roca，A.I.Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.25：415(1990))，sepl(Kolodner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5560(1987)；Tishkoff等，Molec.Cell.Biol.11：2593，(1991))，RuvC(Dunderdale等，Nature 354：506(1991))，DST2，KEM1，XRN1(Dykstra等，Molec.Cell.Biol.11：2583(1991))，STP.alpha./DST1(Clark等，Molec.Cell.Biol.11：2576(1991))，HPP-1(Moore等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9067(1991))，其他靶重组酶(Bishop等，Cell 69：439(1992)；Shinohara等，Cell 69：457(1992))，其全部并入本文作为参考。可由大肠杆菌，如大肠杆菌菌株JC12772和JC15369(其可商业购买)纯化RecA。这些菌株含有recA编码序列，其在以高拷贝数每个细胞存在″失控(runaway)″复制质粒载体上。所述recA803蛋白是野生型recA的高-活性突变体。本技术领域教导了重组酶蛋白质的若干实例，例如，来自果蝇、酵母、植物、人和非人的哺乳动物细胞，生物学性质与recA相似(即，recA-样重组酶)，如来自哺乳动物和酵母的Rad51和来自高嗜热的古生菌(archaeon)火球菌(Pyrococcus sp)的Pk-rec(参见Rashid等，Nucleic Acid Res.25(4)：719(1997)，由此并入作为参考)。重组酶实际上可为蛋白质的复合物。包括于重组酶的定义中的是保留重组酶生物活性的重组酶的部分或片段，以及保留生物活性的野生型重组酶的变体或突变体，如具有增强的重组酶活性的大肠杆菌recA803突变体。
RecA形成同源序列之间的同源接合(homologous joint)，并介导外源多核苷酸链(例如，包含重组域的目标多核苷酸)和内源的多核苷酸链(例如，预定的多核苷酸靶)之间的同源性搜索过程，其在高同源性的区域产生相对稳定的异源双链体(heteroduplex)。因此，重组酶可驱动显著同源而不是完全同源的链之间的同源重组反应。由此，可使用重组盒/载体将核苷酸取代、插入和缺失导入内源的DNA序列，并由此在由内源的DNA序列表达蛋白质中导入对应的氨基酸取代、插入和缺失。
在一个实施方案中，将recA或rad51用作重组酶。例如，通常从细菌菌株得到recA蛋白，所述细菌菌株过量产生野生型大肠杆菌recA蛋白或突变体recA803蛋白。可替换地，可从，例如，Pharmacia(Piscataway，N.J.)购买recA蛋白。
FLP重组酶是催化位点-特异性的重组反应的蛋白。所述FLP蛋白已经在大肠杆菌中克隆和表达(参见，例如，Cox，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，80：4223-4227，1983)，并已经纯化至接近的同质性(homogeneity)(参见，例如，Meyer-Leon等，Nucl.Acids Res.，15：6469-6488，1987)。FLP重组酶是商业上可得到的或可由本领域的技术那些人员，例如从酵母(Saccharomyces)属得到。
已将FRT位点鉴定为包含两个13碱基-对重复(repeat)，其由8碱基-对的间隔区(spacer)分离：例如，序列，其包含5′-GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC-3′(SEQ ID NO：1的核苷酸1966至1999和SEQ ID NO：21882至1937；斜体的序列代表间隔区)。可用任何其他组合的核苷酸替换间隔区中的核苷酸，只要两个13碱基-对重复被至少8个核苷酸分离。所述间隔区的实际核苷酸序列不是关键的，尽管本领域的那些技术人员认识到，对于一些应用而言，期望所述间隔区为不对称的，而对于另一些应用而言，可应用回文的(palindromic)间隔区。通常，宿主细胞的重组域和FRT位点中存在的间隔区可为彼此相同的。宿主细胞中本发明的重组域和FRT位点可包含如SEQ ID NO：1的核苷酸1966至核苷酸1999和SEQ ID NO：2的核苷酸1898至核苷酸1931所示的序列。
重组酶介导的方法还在如下出版物中描述：WO 00/63365；WO99/60108；WO 00/56872；WO 99/37755；U.S.Pat.Nos.5,948,653、6,074,853、5,763,240、5,929,043和5,989,879，它们全部整体并入本文作为参考。可以理解本发明的组合物和方法应用入本文中描述的那些重组酶以及本领域的那些技术人员已知的其他重组酶。
如上所述，重组盒和载体包含调控元件。在本发明的一个方面，这些启动子和任选的增强子元件来自巨细胞病毒(cytomegalovirus)的任何菌株，如本文中描述的或参考如美国专利No.5,658,759，其公开并入本文作为参考。例如，用于本发明的重组盒的合适的CMV早期速发启动子区可获自由CMV-促进的β-半乳糖苷酶表达载体，CMVβ(MacGregor等，Nucl.Acids Res.17：2365(1989))。
可以以裸露的核酸构建体的形式应用重组盒。可替换地，可将该重组盒作为核酸载体(例如，如上所述的那些重组载体)的部分导入。这样的载体包括质粒和病毒载体。
术语“目标多核苷酸”意图包括能被转录的核酸分子。所述分子相对于启动子可处于有义或反义方向。可使用反义构建体根据已知的技术抑制基因在细胞中的表达。所述目标多核苷酸可包括异源多核苷酸。异源多核苷酸相比重组盒或载体中与它可操作连接的调控元件来说通常来源于外来物种，或者如果来源于相同物种，它是由其原始形式被修饰的。因此，可操作连接于启动子的异源多核苷酸是来自与启动子的来源不同的来源，或，如果来源于相同的来源，那么它是由其原始形式修饰而来的。例如，通过将DNA用限制酶处理以产生能够与启动子可操作连接的DNA片段，从而由所述多核苷酸的原始形式修饰该多核苷酸，可发生所述异源多核苷酸的修饰。定点诱变(Site-directed mutagenesis)也用于修饰异源的多核苷酸。异源多核苷酸也可包括标记基因(例如，编码β-半乳糖苷酶或绿色荧光蛋白)或其产物调控其他基因表达的基因。由此，此定义中包括作为mRNA、tRNA和rRNA的模板的多核苷酸。所述异源基因可为野生型基因的任何等位基因变体，或它可为突变体基因。mRNA可任选地包括一些或全部天然5’和/或3’转录的但未翻译的侧翼区，或以另外的方式与翻译的编码序列相连。
所述目标多核苷酸还可任选地包括相连的转录控制元件，其通常与转录的分子相连，所述分子例如转录终止信号、多腺苷酸化域和下游增强子元件。所述目标多核苷酸可编码或作为治疗产品的模板，所述治疗产品可为例如肽、多肽、蛋白质或核糖核酸。所述目标多核苷酸通常为DNA序列(如cDNA或基因组DNA)，其编码多肽产品，诸如酶(例如β-半乳糖苷酶)；激素；细胞因子；白细胞介素；干扰素；TNF；生长因子(例如IGF-1)；可溶的受体分子(例如，可溶的TNF受体分子)；神经递质(neurotransmitter)或其前体；营养因子(trophic factor)诸如BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3和NT5；载脂蛋白(apolipoprotein)诸如ApoAI和ApoAIV；肌养蛋白(dystrophin)或小肌养蛋白(minidystrophin)；肿瘤-抑制蛋白(tumor-suppressingprotein)诸如p53、Rb、RaplA、DCC和k-rev；与凝结有关的因子诸如因子VII、VIII和IX；或可选地天然或人工免疫球蛋白的全部或部分(例如Fab和ScFv，或克隆的IgG的轻链或重链)。
目标多核苷酸也可包括用于产生反义分子的模板，所述反义分子在靶细胞中的转录能使基因表达或细胞mRNA的转录受到控制。这样的分子根据本领域已知的技术能，例如，在靶细胞中被转录为与细胞mRNA互补的RNA并能由此阻断它们翻译为蛋白。具体是，反义分子可用于阻断炎性或分解代谢性细胞因子的翻译以治疗由这些细胞因子引起的关节炎和组织损失。
所述目标多核苷酸通常可编码诊断或治疗用途的多肽。所述多肽可在生物反应器中使用含有本发明的重组盒的不同宿主细胞(例如，COS细胞或CHO细胞或其衍生物)在体外产生。
治疗用途是指一种用途，其可提供疾病或病症的缓解，治愈疾病或病症，和/或疾病或病症的严重程度的改善。诊断用途包括使用分子，所述分子能够确定或提供有关分子与疾病过程的起因或关系的信息或确定存在或不存在疾病或病症。诊断剂不直接有助于疾病或病症的改善。
目标多核苷酸也可编码抗原多肽用作疫苗。编码抗原多肽的多核苷酸源自病原性生物(pathogenic organism)诸如，举例来说，细菌或病毒。例如，抗原多肽包括病原性生物的多肽中存在的抗原决定簇(antigenicdeterminant)。因此，可得到导致例如，病毒性出血性败血症(viralhaemorrhagic septicemia)、细菌性肾病、弧菌病(vibriosis)和疖病(furunculosis)的生物体的疫苗。
如本文使用的，“分离的”，当涉及分子或组合物，例如，本发明的载体或重组盒，或目标多核苷酸时，是指所述分子或组合物与至少一种其他化合物分离，所述化合物如蛋白、DNA、RNA，或在体内结合的或以其天然状态存在的其他污染物。因此，当目标多核苷酸已从与其天然连接的任何其他组分中分离时，认为目标多核苷酸是分离的。分离的组合物可为基本上纯的。分离的组合物可处于均匀的状态。它可为干燥/冻干的或为水溶液的形式。可确定纯度和均匀性，例如，使用分析化学技术诸如，例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、琼脂糖凝胶电泳或高-压液相色谱(HPLC)。
如本文使用的，“重组体(recombinant)”指合成的或以其他方式在体外操纵的多核苷酸(例如，“重组多核苷酸”)，指使用重组多核苷酸在细胞或其他生物系统中产生产物的方法，或指由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白”)。重组多核苷酸包含连接入重组盒或载体的不同来源的核酸分子用于表达，例如，融合蛋白；或通过多肽的诱导型或组成型表达产生的那些(例如，本发明的重组盒或载体其可操作连接于异源多核苷酸，如多肽编码序列)。
在通常的表达系统中，自异源多核苷酸的多肽生成不受调控或通过调节位于编码所述异源多肽的多核苷酸上游的可操作连接的启动子的转录来调控。然而，调控也必须在下游适当地出现以提供适当的转录终止和mRNA稳定性。在本发明的一个方面，本发明的重组盒或载体中存在的目标多核苷酸的下游(3’)提供多腺苷酸化(polyA)信号域。在一个方面，使用hGHvpolyA信号域并包括源自人生长激素遗传序列的序列。所述hGHv多腺苷酸化信号域序列提供强的转录终止并在真核细胞中提供增加的mRNA稳定性。此hGHv多腺苷酸化信号域相对于包括可应用CMV启动子/增强子的那些在内的在先重组盒和/或载体提供了突出的优势。
也可存在翻译元件并意图包括专门的(specialized)序列(如核糖体结合位点和起始密码子)，所述序列是允许将RNA转录物翻译为蛋白质所必需的。翻译元件也可包括共有序列(consensus sequence)、前导序列(leadersequence)、剪接信号(splice signal)等，其用于促进或增强翻译的程度，或增加表达产物的稳定性。本发明的载体可具有辅助转录区(ancillarytranscription regions)，如内含子(intron)、多腺苷酸化信号(polyadenylationsignal)、Shine/Dalgarno翻译信号和Kozak共有序列(Shine等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)71：1342-1346(1974)；Kozak，Cell 44：283-292(1986))。
术语“复制元件”意图包括专门的序列(如复制起点)，所述序列是允许在受体细胞中复制载体所必需的。通常，所述载体将包含至少一个复制起点，其足够允许在受体细胞中自主而稳定地复制载体。
在又一个实施方案中，本发明涉及含有上述的构建体的宿主细胞(例如，本发明的重组盒或载体)。本发明的重组盒可用于通过转染宿主细胞或转化宿主细胞来重组地修饰宿主细胞以表达所需的目标多核苷酸。如本文使用的，术语“重组地修饰”指将本发明的重组盒或载体导入活细胞或表达系统。通常，包含目标多核苷酸的重组盒存在于载体(例如，质粒)中。表达系统包括已导入目标多核苷酸的活宿主细胞，所述目标多核苷酸的产物将被表达，如本文所述。
宿主细胞是这样的细胞，其中可增殖重组盒(包括含有重组盒的载体)并可表达多核苷酸编码产物。宿主细胞也包括对象宿主细胞(subiect host cell)或其衍生物的任何子代。可理解所有子代可与亲代细胞不相同，因为可能有在复制过程中发生的突变。然而，当使用术语“宿主细胞”时，包括所述的子代。用于本发明的宿主细胞包括细菌细胞(例如，大肠杆菌)、真菌细胞(例如，酵母细胞)、植物细胞和动物细胞。例如，宿主细胞可为高等的真核细胞，如哺乳动物细胞，或低等的真核细胞，如酵母细胞，或所述宿主细胞可为原核细胞，如细菌细胞。将构建体导入所述宿主细胞可通过磷酸钙转染、DEAE-Dextran介导的转染或电穿孔实现(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology(1986))。作为适合的宿主的代表性的实例，提及的有：真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如，果蝇S2和Spodoptera Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤(melanoma)；植物细胞等。选择适合的宿主被认为在本领域的技术人员由本文中的教导所知的范围内。
用于本发明的宿主细胞包括真核宿主细胞(例如，哺乳动物细胞)。在本发明的一个方面，宿主细胞为适于在细胞培养物中生长的哺乳动物生产细胞。通常用于工业的所述细胞的实例为CHO、VERO、BHK、HeLa、CV1(包括Cos；Cos-7)、MDCK、293、3T3、C127、骨髓瘤(myeloma)细胞系(尤其是鼠类(murine))、PC12和W138细胞。中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary)(CHO)细胞广泛地用于几种复合重组蛋白质的产生，所述重组蛋白质例如细胞因子(cytokine)、凝血因子(clotting factor)和抗体(antibody)(Brasel等，Blood88：2004-2012(1996)；Kaufman等，J.Biol Chem 263：6352-6362(1988)；McKinnon等，J Mol Endocrinol 6：231-239(1991)；Wood等，J.Immunol145：3011-3016(1990))。缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)的突变细胞系(Urlaub等，Proc Natl Acad Sci USA 77：4216-4220(1980))是优选的CHO宿主细胞系，因为有效的DHFR可选择且可扩增的基因表达系统允许在这些细胞中表达高水平的重组蛋白(Kaufman，Meth Enzymol 185：527-566(1990))。此外，这些细胞易于作为贴壁培养(adherent culture)或悬浮培养(suspension culture)操作，并显示相对良好的遗传稳定性。已经详尽地表征了CHO细胞和其中表达的重组蛋白并已被管理机构批准用于临床生产。此外，也可使用由前述细胞系中的任一种衍生的并具有所需表型的宿主细胞。例如，衍生的宿主细胞包括CHO细胞(例如，DG44细胞系)，其为了所需的表型已被选择性培养(例如，通过阳性和/或阴性选择过程)。在一个方面，CHO细胞适合于在无血清培养基中生长，而且可以同样地或单独地适合于在悬浮液(suspension)中生长(参见，例如，Sinacore等，Biotechnol.Bioengin，52：518-528(1996)；和Haldankar等，Biotechnol.Prog.15：336-346(1999))。适合悬浮液的细胞更易于操作并可获得更高的密度。适合无血清的细胞提供了易于从细胞培养物上清纯化重组蛋白的优势。
在本发明的一个方面，提供了用于体外产生由目标多核苷酸编码的物质(agent)的表达系统。如本文所讨论的，目标多核苷酸可编码具有药物、医疗、营养和/或工业价值的多肽。例如，目标多核苷酸可编码基于多肽的药物。通常上述多肽将被表达为细胞外产物。例如，可使用本发明的重组盒和/或载体制备的多肽包括，但不限于Flt3配体、CD40配体、红细胞生成素(erythropoeitin)、血小板生成素(thrombopoeitin)、降钙素(calcitonin)、Fas配体、NF-kappa B的受体激活剂的配体(RANKL)、TNF相关的诱导细胞凋亡的配体(TRAIL)、ORK/Tek、胸腺间质衍生的淋巴细胞生成素(thymicstroma-derived lymphopoietin)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colonystimulating factor)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony stimulating factor)、肥大细胞生长因子(mast cell growth factor)、干细胞生长因子、表皮生长因子、RANTES、生长激素、胰岛素、胰岛素调理素(insulinotropin)、胰岛素-样生长因子、甲状旁腺素(parathyroid hormone)、干扰素(interferon)(例如，beta干扰素)、神经生长因子、高血糖素(glucagon)、白细胞介素(interleukin)1至18、集落刺激因子、淋巴毒素-β(lymphotoxin-β)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor)、白血病抑制因子(leukemia inhibitoryfactor)、制瘤素-M(oncostatin-M)、细胞表面分子Elk和Hek的不同配体(如与eph-相关的激酶的配体或LERKS)，和抗体轻链或重链。
也可使用有发明的方法和组合物表达上述蛋白中任一种的受体(或其可溶性片段)，其包括两种形式的肿瘤坏死因子受体(称为p55和p75)、白细胞介素-1受体(1型和2型)、白细胞介素-4受体、白细胞介素-15受体、白细胞介素-17受体、白细胞介素-18受体、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体、粒细胞集落刺激因子受体、制瘤素-M和白血病抑制因子的受体、NF-kappa B(RANK)的受体激活子、TRAIL的受体、BAFF受体、淋巴毒素beta受体、TGFβ受体I和II型，和包括死亡结构域(death domain)的受体，如Fas或诱导细胞凋亡的受体(Apoptosis-Inducing Receptor)(AIR)。
能使用本发明的重组盒和/或载体表达的其他蛋白包括分化抗原簇(cluster ofdifferentiation antigen)(称为CD蛋白)：例如，在白细胞分型VI中公开的那些(Proceedings of the VIth International Workshop和Conference；Kishimoto，Kikutani等，eds.；Kobe，Japan，1996)，或在后续的学术讨论会中公开的CD分子。上述分子的实例包括CD27、CD30、CD39、CD40及其上的配体(ligand)(CD27配体、CD30配体和CD40配体)。这些分子中有几个是TNF受体家族的成员，其也包括41BB和OX40；所述配体是TNF家族常见的成员(often member)(作为41BB配体和OX40配体)；因此，也可使用本发明表达TNF和TNFR家族的成员。
根据本发明也可表达酶活性的多肽。实例包括金属蛋白酶-解聚素(metalloproteinase-disintegrin)家族成员、各种激酶、葡糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)、组织纤维蛋白溶酶原激活蛋白(tissue plasminogen activator)、因子VIII、因子IX、载脂蛋白(apolipoprotein)E、载脂蛋白A-I、珠蛋白(globin)、IL-2拮抗剂(antagonist)、alpha-1抗胰蛋白酶(antitrypsin)、TNF-alpha转化酶(TACE)和许多其他酶。也可使用本发明的盒和载体表达酶活性蛋白的配体。
发明的组合物和方法也用于表达其他类型的重组蛋白和多肽，其包括免疫球蛋白分子或其部分和嵌合抗体(chimeric antibody)(例如，具有与鼠类抗原结合区连接的人恒定区的抗体)或其片段。已知许多方法可用来操作编码免疫球蛋白分子的DNA以获得编码重组蛋白的DNA，所述重组蛋白诸如单链抗体、具有增强的亲和性的抗体或其他基于抗体的多肽(参见，例如，Larrick等，Biotechnology 7：934-938(1989)；Reichmann等，Nature 332：323-327(1988)；Roberts等，Nature 328：731-734(1987)；Verhoeyen等，Science239：1534-1536(1988)；Chaudhary等，Nature 339：394-397(1989))。克隆的人源化的抗体包括特异地与淋巴毒素beta-受体和整联蛋白(integrin)如VLA-1、VLA-4和αvβ6结合的那些，所述抗体可为激动剂(agonist)或拮抗剂。
也可使用发明的方法和组合物表达多种融合蛋白(fusion protein)。所述融合蛋白的实例包括表达为与免疫球蛋白分子的一部分的融合物的蛋白，表达为与拉链部分(zipper moiety)的融合蛋白的蛋白，和新的多功能蛋白如细胞因子和生长因子的融合蛋白(例如，GM-CSF和IL-3，MGF和IL-3)。WO93/08207和WO 96/40918描述了多种可溶性寡聚形式的称为CD40L的分子的制备，其分别包括免疫球蛋白融合蛋白和拉链融合蛋白；其中讨论的方法适用于其他蛋白质。
一旦目标多核苷酸被表达，可使用本领域中的标准方法纯化表达产物(例如，蛋白或多肽)。例如，当目标多核苷酸编码包含纯化标签(purificationtag)的融合多肽时，可使用与该标签特异性结合的抗体来纯化所述的多肽。在一个方面，将编码标签分子的寡核苷酸连接在编码所需多肽的目标多核苷酸的5’或3’端；寡核苷酸可编码polyHis(如6His)，或其他“标签”如FLAG、HA(血凝素流感病毒(hemaglutinin Influenza virus))或myc，因此存在商业上可得到的抗体。通常多肽一表达，此标签就融合于多肽，并能作为从宿主细胞亲和纯化所需多肽的手段。例如，可通过柱层析(column chromatography)使用抗标签的抗体作为亲和基质(affinity matrix)来完成亲和纯化。可选地，可通过多种手段如蛋白裂解切割(proteolytic cleavage)将标签随后从纯化的多肽中去除。
本发明的重组盒和载体可用于提供目标多核苷酸到宿主细胞的稳定转移。稳定转移指将目标多核苷酸持续地保留在宿主中。
可通过公知的方法将含有目标多核苷酸的载体转移到宿主细胞中，这依赖于细胞宿主的类型。例如，显微注射(micro-injection)通常用于靶细胞，尽管也可以使用磷酸钙处理、电穿孔(electroporation)、脂转染(lipofection)、生物射弹(biolistics)或基于病毒的转染(viral-based transfection)。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用Polybrene、原生质体融合(protoplast fusion)和其他方法(参见，一般地，Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2d ed.，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，其在此并入作为参考)。
在另一个方面，本发明涉及试剂盒。该试剂盒包括本发明的重组盒和/或载体。该试剂盒还可包括含有靶位点(例如，FRT位点)的宿主细胞。所述宿主细胞通常在一个或多个密封容器(例如，小包(packet)、小瓶(vial)、管(tube)或微孔滴定板(microtiter plate))中提供，其在一些实施方案中，也可包含营养培养基。试剂盒通常包括描述宿主性质(例如，其基因型)的文献和/或有关其转化用途的说明。在一些实施方案中，试剂盒包括含有本发明的重组盒和/或载体的一种或多种多核苷酸，并也可包括独立容器中的酶(例如，Flp重组酶)。
实施例
产生重组盒/载体。用SapI限制性核酸内切酶(1单位SapI核酸内切酶每1μg质粒)将质粒pFRT/lacZeo(Invitrogen Inc.，catalog #V6015-20；参见图4)线性化并在37℃消化大约16小时。用于转染的宿主是二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷的中国仓鼠卵巢细胞系DG44(Urlaub等，Cell 33，405-412(1983))。每次转染操作使用大约2×106活的CHO-DG44宿主细胞。每次转染使用500ng线性化的pFRT/lacZeo质粒在280V、960μF将宿主细胞电穿孔。
在含有200μg/ml ZeocinTM抗生素(Invitrogen，Inc.cat.#R250-01)的培养基中选择成功的转染子。将在选择性培养基中成功生长的菌落通过挑入24-孔细胞培养板来分离。然后将这些分离物在6孔培养板中扩展，直到它们充分茁壮以将转染的细胞转移到T225摇瓶。从转染的细胞(5×106个细胞)中收获基因组DNA。
用Southern印迹检测＞100个细胞系的基因组DNA以验证单拷贝的FRT序列的存在。探针的序列跨越所述FRT序列和beta-半乳糖苷酶融合基因的5’端(参见图5)。选择在＞100个细胞系中筛出的仅仅35个具有单FRT整合位点的细胞系用于蛋白表达研究(参见图6和7)。
报道基因的克隆。将包括CMV IE1、内含子A片段和polyA信号域的重组盒/载体与商业上可得到的重组载体进行比较。
将分泌的碱性磷酸盐(SEAP)用作分泌的蛋白的模型以测定使用CHO-DG44Flp-In宿主细胞系的表达水平。使用聚合酶链式反应(PCR)扩增从pSEAP2表达质粒(Clontech，Palo Alto，CA)得到SEAP编码序列。将5’引物设计为具有KpnI位点，并将3’引物设计为具有BglII位点。
5’引物：
TTTTGGTACCATGCTGCTGCTGCTG(起始密码子为黑体)(SEQ ID NO：4)
KpnI
3’引物：
TTTTAGATCTCATGTCTGCTCGAAGCGGCC(终止密码子为黑体)(SEQ IDNO.：5)
BglII
如下进行PCR：3μg pSEAP2质粒(Clontech，Palo Alto，CA)；1μM每种5’和3’引物(参见上面)；0.25mM dNTPs(Promega，Madison，WI)；2单位Vent聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)；1X Vent聚合酶反应缓冲液(New England Biolabs，Beverly，MA)。以100μl反应进行PCR。PCR进行95℃30秒、55℃45秒和75℃2分钟的30个循环，然后是75℃10分钟并保持在4℃。得到对应于SEAP编码区的大约1.6kb的PCR产物。使用WizardPCR纯化试剂盒(Promega，Madison，WI)从PCR混合物中纯化PCR产物并在dH2O中洗脱。先用限制性内切酶KpnI(New England Biolabs，Beverly，MA)，然后用BglII(New England Biolabs，Beverly，MA)消化PCR产物。
将先前已用KpnI和BamHI消化的10ng pFRT/dhfr-1质粒与消化的SEAPPCR产物连接。将SEAP编码区和连接点进行测序。正如所料，结果与推测的序列文件相符。将该质粒命名为pFRT/SEAP。
通过电穿孔完成SEAP报道基因到Flp-In宿主细胞系的转染。将10μgpFRT/SEAP与90μg的表达Flp重组酶的质粒pOG44(Invitrogen，Carlsbad，CA)组合。将DNA进行乙醇沉淀，在70％乙醇中洗涤并干燥。将细胞系的2×106活细胞用于转染。将细胞和DNA无菌地组合到800μL无菌HeBS(20mMHepes pH＝7.05，137mM NaCl，5mM KCl，0.7mM Na2HPO4，6mM葡萄糖)并转移到0.4cm小池(BioRad，Hercules，CA)。使用设定在0.28kV和950μFd的Gene Pulser(Biorad，Hercules，CA)完成电穿孔。在电穿孔脉冲后，使细胞在小池中在室温温育5-10min。然后将它们转移到包含具有10％透析的胎牛血清(fetal bovine serum)(dFBS)(Hyclone，Logan，UT)的10ml加核苷的alpha-MEM(Gibco，Gaithersburg，MD)的离心管并在1000RPM沉淀(pellet)5min。将重悬的沉淀接种到含10％dFBS的无核苷的alpha-MEM中的6-孔板并在36℃以5％CO2在增湿的培养箱中温育大约2周，在其中点菌落已经形成。
将稳定的转染子作为分离群(isolates)进行分析。通过“挑取”来自转染的菌落得到分离群。通过用设置在50μl的P200PipetmanTM对菌落直接抽吸(aspirate)完成“挑取”。将抽吸的菌落首先转移到24孔板。一旦孔是＞50％铺满的，就将培养基交换为补加4mM L-谷氨酰胺(Cambrex，Walkersville，MD)的化学成分确知的(chemically-defined)ProCHO4培养基(Cambrex，Walkersville，MD)，并将细胞转染入6孔板。在6孔板中铺满(confluence)或接近铺满时评估比生产率。
通过用新鲜培养基交换培养基，然后对培养基采样并在4天后计数细胞在SEAP试验中评估比生产率。将产物效价对4天结束时的细胞数进行标准化(normalize)，并将生产率表达为每个细胞的SEAP活性。
使用Great EscAPeTM SEAP Reporter System 3(Clontech，Palo Alto，CA)分析经调节的培养基。此试验使用荧光底物测定经调节的培养基中的SEAP活性。根据制造商的说明在96孔模式(format)中使用试剂盒。在新鲜培养基中而不是提供的稀释缓冲液中稀释所有的标准物和样品。读数在10分钟和40分钟进行，而不是在60分钟后进行一次读数(reading)，而数据用于将SEAP活性表示为相对荧光单位每分钟(RFU/min)。与Cytofluor IITM平板阅读器(PerSeptive Biosystems，Framingham，MA)一起使用的发射光滤光器(emissionfilter)为460nm而不是推荐的449nm。
基于与试剂盒一起提供的标准物，将RFU/min值对标准曲线进行标准化。因为提供的标准物不是定量的，所有值都是相对的。将这些相对值对于细胞数和温育时间进行标准化以产生相对的比生产率(specificproductivity)(SEAP活性每个细胞每天)。
A1 Flp-In CHO-DG44宿主细胞中的SEAP表达
| 细胞系 | 第0天初始密度(细胞/mL) | 第4天最终密度(细胞/mL) | 积分的细胞面积(细胞*天)/mL | RFU/min | 标准化的SEAP活性/细胞/天(*1E6) |
| 1 | 2.0E+05 | 6.2E+05 | 1.5E+06 | 0.75 | 0.5 |
| 234567891011121314151617181920 | 2.0E+052.0E+052.0E+052.0E+052.0E+052.0E+052.0E+052.0E+052.0E+052.0E+052.0E+052.0E+052.0E+052.0E+052.0E+052.0E+052.0E+052.0E+052.0E+05 | 6.3E+055.3E+058.3E+057.5E+057.8E+051.5E+065.6E+054.8E+054.7E+055.3E+053.8E+057.6E+055.2E+055.4E+054.9E+055.0E+051.4E+065.2E+056.6E+05 | 1.5E+061.4E+061.8E+061.7E+061.7E+062.5E+061.4E+061.3E+061.3E+061.4E+061.1E+061.7E+061.3E+061.4E+061.3E+061.3E+062.4E+061.3E+061.5E+06 | 0.710.750.750.710.740.740.750.720.750.740.730.740.740.720.740.730.750.760.75 | 0.50.60.40.40.40.30.50.60.60.50.70.40.60.50.60.60.30.60.5 |
| 平均RFU/min＝0.74±0.01平均SEAP活性/细胞/天*1E6＝0.5±0.1 | |||||
已描述了本发明的许多实施方案。尽管如此，可以理解的是在不背离本发明的精神和范围的前提下可进行各种更改。因此，其他实施方案在如下权利要求的范围之内。
Claims (30)
1.重组盒，其包含
启动子/增强子区；
目标多核苷酸；
polyA信号域；
FRT重组域；和
dhfr多核苷酸，
其中所述的启动子/增强子区、目标多核苷酸和polyA信号域可操作地连接。
2.权利要求1的重组盒，其中所述启动子/增强子区包含人CMV早期速发1(hCMV IE1)。
3.权利要求2的重组盒，其中所述hCMV IE1启动子/增强子区包含如SEQ ID NO：1或2的大约x1至大约x2所示的序列，其中x1是位置1至位置70的核苷酸而x2是位置770至位置780的核苷酸。
4.权利要求1的重组盒，其还包含可变长度的间插序列(VLIVS)，该序列包含拼接供体位点和拼接受体位点。
5.权利要求4的重组盒，其中所述VLIVS包含hCMV IE1基因的内含子A。
6.权利要求4的重组盒，其中所述VLIVS包含hCMV IE1基因的内含子A，其在所述内含子A的拼接供体位点和拼接受体位点之间具有缺失。
7.权利要求6的重组盒，其中所述VLIVS包含SEQ ID NO：1的大约x3至大约x4的序列，其中x3是SEQ ID NO：1的核苷酸770-780而x4是SEQ IDNO：1的核苷酸1300-1310；或所述VLIVS包含SEQ ID NO：2的大约x5至大约x6的序列，其中x5是SEQ ID NO：2的核苷酸770-780而x6是SEQ ID NO：2的核苷酸1300-1310。
8.权利要求1的重组盒，其中所述目标多核苷酸编码治疗剂。
9.权利要求1的重组盒，其中所述polyA信号域包含SEQ ID NO：3的至少100个连续的核苷酸。
10.权利要求9的重组盒，其中所述polyA信号域包含SEQ ID NO：3。
11.重组载体，其包含权利要求1的重组盒。
12.权利要求11的重组载体，其还包含
第二个启动子/增强子区；
第二个目标多核苷酸；和
第二个polyA信号域，
其中所述的第二个启动子/增强子区、第二个目标多核苷酸和第二个polyA信号可操作地连接。
13.权利要求12的重组载体，其还包含在第二个启动子/增强子区和第二个目标多核苷酸之间的间插域。
14.宿主细胞，其包含权利要求11的重组载体。
15.权利要求14的宿主细胞，其中所述宿主细胞适宜在悬浮液中生长。
16.权利要求14的宿主细胞，其中所述宿主细胞适宜在无血清培养基中生长。
17.权利要求15的宿主细胞，其中所述宿主细胞适宜在无血清培养基中生长。
18.宿主细胞，其包含权利要求1的重组盒。
19.权利要求18的宿主细胞，其中所述宿主细胞适宜在悬浮液中生长。
20.权利要求18的宿主细胞，其中所述宿主细胞适宜在无血清培养基中生长。
21.权利要求19的宿主细胞，其中所述宿主细胞适宜在无血清培养基中生长。
22.重组系统，其包含：
权利要求1的重组盒；和
包含FRT位点的宿主细胞。
23.权利要求22的重组系统，其中所述宿主细胞是CHO细胞。
24.权利要求23的重组系统，其中所述CHO细胞是CHO-DG44细胞。
25.权利要求22的重组系统，其中所述宿主细胞适宜在悬浮液中生长。
26.权利要求22的重组系统，其中所述宿主细胞适宜在无血清培养基中生长。
27.权利要求22的重组系统，其中所述宿主细胞源自CHO-DG44细胞。
28.权利要求22的重组系统，其中所述宿主细胞是dhfr-宿主细胞。
29.试剂盒，其包含权利要求10的载体和含有FRT位点的宿主细胞。
30.权利要求29的试剂盒，其中所述宿主细胞是dhfr-CHO宿主细胞，该细胞的基因组包含FRT位点。
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