JP2007508037A - Ｆｌｐ媒介性の組換え - Google Patents

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Abstract

宿主細胞の中へのポリヌクレオチドの相同組換えおよび安定組込みのために有用な組成物および方法が、提供される。その開示された組成物および方法は、宿主細胞の中へ外来性のポリヌクレオチドを安定に組込み、そして当該の形質転換がなされた細胞を選択するための、迅速かつ効果的な方法を提供する。本発明は、宿主細胞の染色体ＤＮＡ中のある部位に対する相同組換えを可能にするために、適切な内因性染色体ポリヌクレオチドに対して相同な配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供し、ポリヌクレオチドは、選択マーカーおよびクローニング部位をコードし、そして調節エレメントをさらに含み得る。

Description

（技術分野）
本発明は、生物または宿主細胞における、外来性分子の発現のための組換えベクターおよび組換えカセットに関し、より具体的には、生物または宿主細胞における、外来性分子の発現のための方法、組成物、およびシステムに関係する。
（背景）
核酸分子、ポリペプチド、およびペプチドを、標的細胞および標的組織の中に導入することは、治療用送達システムとして、ならびにインビトロにおける治療用分子の生成の両方において、用いられている。宿主細胞ならびに細胞分裂、細胞分化、および細胞発現の機序の分子生物学をさらに理解することで、このアプローチの適用性は増大する。
相同な外来性ＤＮＡと内因性染色体配列との間の相同組換えによる遺伝子ターゲッティングは、欠失、または挿入の作製、変異の設計、遺伝子変異の補正、トランスジーンの導入、もしくは他の遺伝子改変の作成のための、非常に役に立つ手段となることが証明されている。
（要旨）
本発明は、以下
プロモータ／エンハンサー領域；
関心のあるポリヌクレオチド；
ポリＡシグナルドメイン；
ＦＲＴ組換えドメイン；および
ｄｈｆｒポリヌクレオチド
を含む、組換えカセットを提供し、上記プロモータ／エンハンサー領域、上記関心のあるポリヌクレオチドおよび上記ポリＡシグナルドメインは、作動可能に連結されている。
本発明はまた、以下
プロモータ／エンハンサー領域；
関心のあるポリヌクレオチド；
ポリＡシグナルドメイン；
ＦＲＴ組換えドメイン；および
ｄｈｆｒポリヌクレオチド
を含む組換えカセットを含む、組換えベクターを提供し、上記プロモータ／エンハンサー領域、上記関心のあるポリヌクレオチドおよび上記ポリＡシグナルドメインは、作動可能に連結されている。１つの実施形態において、上記ベクターは、配列番号１または配列番号２において示される配列を含む。さらに別の実施形態において、上記組換えベクターは、以下
第二のプロモータ／エンハンサー領域；
第二の関心のあるポリヌクレオチド；および
第二のポリＡシグナルドメイン
をさらに含み、上記第二のプロモータ／エンハンサー領域、上記第二の関心のあるポリヌクレオチド、および上記第二のポリＡシグナルドメインは作動可能に連結されている。
本発明は、安定に組み込まれた本発明の組換えカセットの１つ以上のコピーを含む宿主細胞を、さらに提供する。１つの実施形態において、上記宿主細胞は、懸濁液中および／または無血清培地中における増殖に対して適応している。
本発明はまた、組換えシステムを提供する。上記組換えシステムは、以下
１つ以上のＦＲＴ組み換えドメインを含む発現プラスミド；および
１つ以上のＦＲＴ部位を含む宿主細胞
を含む。１つの実施形態において、上記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を含む）である。一部の実施形態において、上記宿主細胞は、懸濁液中および／または無血清培地中における増殖に対して適応している。
本発明はさらに、ベクターおよび／または本発明の組換えカセット、ならびにＦＲＴ部位を含む宿主細胞を含むキットを提供する。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の明細書において示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、本明細書および図面より、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
（詳細な説明）
本発明は、相同組換えおよび宿主細胞の中への所望のポリヌクレオチド（すなわち、関心のあるポリヌクレオチド）の安定な組み込みのために有用である、組換えカセットおよびベクターを提供する。本発明は、宿主細胞の染色体ＤＮＡ中のある部位に対する相同組換えを可能にするために、適切な内因性染色体ポリヌクレオチドに対して相同な配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供し、ポリヌクレオチドは、選択マーカーおよびクローニング部位をコードし、そして調節エレメントをさらに含み得る。本発明の方法、システムおよび組成物は、最小の作業で多量のタンパク質を作製するための、安定な細胞株を作製する強力なツールを提供する。
本発明の１つの局面において、組換えカセットを含むポリヌクレオチドが提供され、その組換えカセットを含むポリヌクレオチドは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の転写調節領域、可変長介在配列（例えば、ＣＭＶのイントロンＡより）、関心のあるポリヌクレオチド、組換えドメイン、およびポリアデニル化シグナルドメインを含む。本発明は、宿主細胞に由来する異種ポリペプチドの産生および回復のためのプロセスおよび発現ベクターに、さらに関係する。
別の局面において、本発明の組換えカセットは、作動可能に連結された
（ｉ）ＣＭＶの主な即時型初期１（ＩＥ１）プロモータ／エンハンサー領域および可変長介在配列（例えば、イントロンＡの誘導体）、
（ｉｉ）関心のあるポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）第一のポリアデニル化シグナルドメイン（例えば、ＢＨＧまたはｈＧＨ ポリＡ）、
（ｉｖ）組換えドメイン（例えば、ＦＲＴ部位）、
（ｖ）選択マーカー（例えば、ｄｈｆｒ）および
（ｖｉ）第二のポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０ Ｅ ポリＡ）
を含む。用語「作動可能に連結された」とは、構成成分が、それら自身が、それらの意図する方法で機能することを許容するような関係で並列されていること（例えば、機能的に連結されている）をいう。したがって、例えば、プロモータ／エンハンサーが、関心のあるポリヌクレオチドに作動可能に連結されていることは、それらが上記プロモータ／エンハンサーからの発現の活性化と適合する条件下で、上記関心のあるポリヌクレオチドの発現が達成されるような方向で、関心のあるポリヌクレオチドと結合しているということである。
本発明の１つの実施形態において、上記組換えカセットは、配列番号１の約第１ヌクレオチド〜約第２７０４ヌクレオチドに記載の配列（例えば、約第１ヌクレオチド〜第２７００ヌクレオチド、約第１ヌクレオチド〜第２７０１ヌクレオチド、約第１ヌクレオチド〜第２７０２ヌクレオチド、約第１ヌクレオチド〜第２７０３ヌクレオチド、約第１ヌクレオチド〜第２７０５ヌクレオチド、約第１ヌクレオチド〜第２７０６ヌクレオチド、約第１ヌクレオチド〜第２７０７ヌクレオチド、または約第１ヌクレオチド〜第２７０８ヌクレオチド）を含む。他の例の場合、上記組換えカセットは、配列番号２の約第１ヌクレオチド〜第２６３５ヌクレオチドの配列（例えば、約第１ヌクレオチド〜第２６３３ヌクレオチド、約第１ヌクレオチド〜第２６３４ヌクレオチド、約第１ヌクレオチド〜第２６３６ヌクレオチド、または約第１ヌクレオチド〜第２６３７ヌクレオチド）を含む。配列番号１または配列番号２の、それぞれ、第１ヌクレオチド〜第２７０４ヌクレオチドまたは第１ヌクレオチド〜第２６３５ヌクレオチドで示される上記組換えカセットは、多数の異なるドメイン（例えば、配列番号１または配列番号２の約ｘ１〜約ｘ２に記載の配列を有するＣＭＶ ＩＥ１プロモータ／エンハンサー領域であって、ｘ１は第１位〜第７０位のヌクレオチドであり、そしてｘ２は第７７０位〜第７８０位のヌクレオチドである（例えば、配列番号１または配列番号２の、約第６３位〜約第７７６位））を含む。上記組換えカセットの別のドメインは、スプライシング供与部位およびスプライシング受容部位を含む、可変長介在配列（ＶＬＩＶＳ）を含む。上記ＶＬＩＶＳは、長さが少なくとも５０ｂｐ（例えば、長さが少なくとも１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、または２５０ｂｐ）であり得、そして当該分野において公知である任意の供給源（ｓｏｕｒｃｅ）に由来するスプライシング供与部位およびスプライシング受容部位を含み得る。例えば、Ｖａｒａｎｉら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ ２７：４０７−４５（１９９８）およびＫｏｎｉｎｇ、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２１９：２５−４２（１９９４）を参照のこと。適切な介在ドメインは、任意の系統のＣＭＶゲノムのイントロンＡのすべてを含み得るか、またはスプライシング受容部位を含む３’配列に連結した、スプライシング供与部位を含む５’配列を含む、より小さなフラグメントを含み得る。例えば、上記ＶＬＩＶＳは、配列番号１の約ｘ３〜約ｘ４のヌクレオチド（ここで、ｘ３は第７７０位〜第７８０位のヌクレオチドであり、そしてｘ４は第１３００位〜第１３１０位のヌクレオチドである）（例えば、配列番号１の第７７６位〜第１３０４位）を含む。別の例の場合、上記ＶＬＩＶＳは、配列番号２の約ｘ３〜約ｘ４のヌクレオチド（ここで、ｘ３は第７７０位〜第７８０位のヌクレオチドであり、そしてｘ４は第１３００位〜第１３１０位のヌクレオチドである）（例えば、配列番号２の第７７６位〜第１３０９位）を含む。上記ＣＭＶ ＩＥ１プロモータ／エンハンサーに続く上記介在配列は、配列番号１または配列番号２の中に存在する配列から、３１７ヌクレオチドと同程度のサイズで変動し得る。上記ＶＬＩＶＳ領域の後（すなわち、下流）に、マルチクローニング部位が存在し得る（例えば、配列番号１の第１３１０ヌクレオチド〜第１４１８ヌクレオチドは、ＮＨ３Ｉ部位、ＢａｍＨＩ部位、ＫｐｎＩ部位、ＥｃｏＲＩ部位、ＰｍｅＩ部位、ＰｓｔＩ部位、ＥｃｏＲＶ部位、ＮｏｔＩ部位、ＸｈｏＩ部位、ＡｐａＩ部位、およびＰｍｅＩ部位を含み；配列番号２の第１３０９ヌクレオチド〜第１３３２ヌクレオチドは、ＥｃｏＲＶ部位、ＮｏｔＩ部位、ＸｈｏＩ部位を含む）。種々の制限酵素認識部位またはさらなる制限酵素認識部位は、当業者に公知の技術を使用して、上記組換えカセットの中で操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）され得る。例えば、図３を参照すると、複数の関係するかまたは関係しないポリヌクレオチドをクローニングする能力を加える２つのマルチクローニング部位（例えば、約第１３０９位および約第６３７０位で始まっている上記クローニング部位を参照のこと）が示されている。このベクターは、図３に示されるように、２つのカセットを含み、その２カセットの間にターミネータ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）もまた有する。
さらに、上記ドメインおよび／もしくは上記カセットの機能性部位ならびに／またはベクター全体から逸脱することなく、特定のドメインの末端から、１つ以上のヌクレオチドを置換、追加、または欠失させることが可能であることを、当業者は認識する。例えば、本明細書中で同定されるドメインの任意の１つのいずれかの端における１ヌクレオチド〜１０ヌクレオチドのばらつきは、恐らく、本発明のドメイン、カセット、および／またはベクターの意図する目的のための機能ドメインを含む。
上記組換えカセットは、ポリＡシグナルドメインをさらに含む。上記ポリＡシグナルドメインは、ヒト供給源由来（例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨポリＡ））、またはウシ供給源由来（例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨポリＡ））もしくは他の動物供給源由来であり得る。上記ポリＡシグナルドメインは、ｈＧＨ遺伝子に由来し得、その３’ＵＴＲ配列（例えば、対立遺伝子から対立遺伝子）において変化し得る。そのｈＧＨｖ遺伝子の１つの対立遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号第Ｋ００４７０号（配列番号３）において記載される。ＢＧＨポリＡシグナルドメインの例としては、配列番号１の約第１１４３ヌクレオチド〜約第１６６８ヌクレオチドに記載の配列、および配列番号２の約第１３７５ヌクレオチド〜約第１６００ヌクレオチドに記載の配列が挙げられる。上記ポリＡシグナルドメインの自然には存在しない改変体は、突然変異誘発技術によって作製され得、その突然変異誘発技術としては、ポリヌクレオチド、細胞または生物体に対して適用される突然変異誘発技術が挙げられる。ｈＧＨ遺伝子に由来するポリＡシグナルドメイン改変体は、野生型ｈＧＨポリＡシグナルドメインとは異なるポリＡシグナルドメインを含むが、転写終止を示す能力および／またはｍＲＮＡを安定化させる能力を、未だ保持している。例えば、上記ポリアデニル化シグナルドメインは、ｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメイン配列を含み得る。少なくとも１００ｎｔ（例えば、少なくとも２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔ、または６００ｎｔ）の連続したヌクレオチド配列を含む任意のポリＡシグナルドメインは、ｈＧＨｖ遺伝子が含む、規範的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ＡＡＴＡＡＡ部位を含む。
加えて、本発明は、上記前述の配列から８％まで変化した（例えば、配列番号３またはその特徴的なドメインに対して９２％の同一性を有する）配列を含む。例えば、配列番号１の第１ヌクレオチド〜第２７０４ヌクレオチドまたは配列番号２の第１ヌクレオチド〜第２６３５ヌクレオチドに対して、９５％の同一性を有するポリヌクレオチドが、本発明の範囲内に含まれる。
本発明の別の局面において、組換えカセットを含むベクターが提供される。本明細書中で使用する場合、「ベクター」は、受容細胞（例えば、細菌細胞または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞））の中への導入によって、自己複製が可能である核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）である。プラスミドおよびウイルスは、ベクターの例である。発現ベクターからの「発現」のプロセスは周知であり、そして細胞酵素の使用および関心のあるポリヌクレオチドから発現産物を生成するためのプロセスを包含する。発現ベクターは、宿主細胞においてクローン化されたポリヌクレオチドの発現を媒介することが可能なベクターであり、この宿主細胞は、上記ベクターの複製または増殖のために使用された細胞と同一型であってもそうでなくてもよい。多くの哺乳動物用発現ベクターは、通常の細菌（受容細胞）において増殖し得るが、哺乳動物細胞（宿主細胞）中において上記関心のあるポリヌクレオチドを発現するが、細菌中においては発現しない。
本発明のベクターは、以下：
関心のあるポリヌクレオチドを受入れるためのクローニング部位；
宿主細胞における上記クローニング部位の中へ挿入されたポリヌクレオチドの転写を可能にするのに十分である、転写調節領域（例えば、ＣＭＶ ＩＥ１プロモータ／エンハンサー領域）；
宿主細胞における上記ポリヌクレオチドのＲＮＡ転写物の翻訳を可能にするのに十分である転写エレメント、および
（望まれる場合、）上記ベクターの増殖のために使用される宿主細胞または他の受容細胞における、上記ベクターの複製を可能にするのに十分である複製エレメント
を含む。本発明のベクターは、宿主細胞におけるこのような発現を一過性または安定に（例えば、上記宿主細胞ゲノム中における相同組換えによって）媒介し得る。
特定の実施形態において、本発明のベクターは、以下
（１）配列番号１または配列番号２に記載される配列；
（２）配列番号１または配列番号２に記載される上記配列に対して相補的な配列；
（３）配列番号１もしくは配列番号２またはそれらの相補体に対して少なくとも８０％（または少なくとも９０％；９５％；９８％、もしくは９９％）同一である配列；あるいは
（４）配列番号１の約第１ヌクレオチド〜約２７０４ヌクレオチド、または配列番号２の約第１ヌクレオチド〜約第２６３５ヌクレオチドを含み、そして関心のあるポリヌクレオチドおよび／または選択マーカーを含む配列
を含む。
本発明のベクターは、配列番号１もしくは配列番号２、または、ＦＲＴ部位を含むかぎり、以下のドメインの１つ以上を含む。例えば、配列番号１の約ｘ１〜約ｘ２に記載の配列（ここで、ｘ１は第１ヌクレオチド〜第７０ヌクレオチドであり、そしてｘ２は第７７０ヌクレオチド〜第７８０ヌクレオチド（例えば、配列番号１の約第１位〜約第７７６位））を有するＣＭＶ ＩＥ１プロモータ／エンハンサー領域が、上記ベクターの中に存在する。本発明の別の局面において、配列番号２の約ｘ１〜約ｘ２に記載の配列（ここで、ｘ１は第１ヌクレオチド〜第６０ヌクレオチドであり、そしてｘ２は第７７０ヌクレオチド〜第７８０ヌクレオチド（例えば、配列番号２の約第１位〜約第７７６位））を有するＣＭＶ ＩＥ１プロモータ／エンハンサー領域が、上記ベクターの中に存在する。本発明の発現ベクターの別のドメインは、スプライシング供与部位およびスプライシング受容部位を含む、可変長介在配列（ＶＬＩＶＳ）を含む。例えば、上記ＶＬＩＶＳは、配列番号１の約ｘ３〜約ｘ４のヌクレオチド（ここで、ｘ３は第７７０位〜第７８０位のヌクレオチドであり、そしてｘ４は第１３００位〜第１３１０位のヌクレオチドである（例えば、配列番号１の第７７６位〜第１３０４位））を含む。別の例の場合、上記ＶＬＩＶＳは、配列番号２の約ｘ３〜約ｘ４のヌクレオチド（ここで、ｘ３は第７７０位〜第７８０位のヌクレオチドであり、そしてｘ４は第１３００位〜第１３１０位のヌクレオチドである（例えば、配列番号２の第７７６位〜第１３０９位））を含む。上記ＶＬＩＶＳ領域の後（すなわち、下流）に、マルチクローニング部位が存在し得る（例えば、配列番号１の第１３１０ヌクレオチド〜第１４１８ヌクレオチドは、ＮＨ３Ｉ部位、ＢａｍＨＩ部位、ＫｐｎＩ部位、ＥｃｏＲＩ部位、ＰｍｅＩ部位、ＰｓｔＩ部位、ＥｃｏＲＶ部位、ＮｏｔＩ部位、ＸｈｏＩ部位、ＡｐａＩ部位、およびＰｍｅＩ部位を含み；配列番号２の第１３０９ヌクレオチド〜第１３３２ヌクレオチドは、ＥｃｏＲＶ部位、ＮｏｔＩ部位、ＸｈｏＩ部位を含む）。種々の制限酵素認識部位またはさらなる制限酵素認識部位は、当業者に公知の技術を使用して、上記発現ベクターの中で加工（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）され得る。上記発現ベクターは、ポリＡシグナルドメインをさらに含む。
上記ポリＡシグナルドメインは、ヒト供給源（例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ ポリＡ））、またはウシ（例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ ポリＡ））もしくは他の動物供給源由来であり得る。上記ポリＡシグナルドメインは、ｈＧＨｖ遺伝子由来であり得、その３’ＵＴＲ配列は（例えば、対立遺伝子から対立遺伝子で）可変であり得る。そのｈＧＨｖ遺伝子の１つの対立遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号第Ｋ００４７０号（配列番号３）に記載される。ＢＧＨ ポリＡの例としては、配列番号１の約第１１４３ヌクレオチド〜約第１６６８ヌクレオチドに記載の配列、および配列番号２の約第１３７５ヌクレオチド〜約第１６００ヌクレオチドに記載の配列が挙げられる。本発明のベクターの中には、１つ以上の選択マーカーもまた存在する。
本発明の組換えカセットおよびベクターは、従来の（ｐｒｉｏｒ）組換えカセットおよびベクターを上回る特有の利点を有する。例えば、本発明のカセットおよびベクターは、１つ以上のＦＲＴ部位を含み、そして自然状態において栄養要求性であるｄｈｆｒ選択マーカーを利用する宿主細胞の中への関心のあるポリヌクレオチドの安定な組み込みを可能にし、そして形質転換された宿主細胞の単純かつ効率的な選択を可能にする。首尾よく形質転換された細胞株の選択は、通常、細胞傷害性薬物に対する耐性（例えば、抗生物質耐性）を与える組み込まれた選択マーカーによるものである。非栄養素要求性選択マーカーは、生物体（例えば、細胞）を、通常は殺傷するであろう物質に対する耐性を与える。この細胞傷害性物質が上記生物体に適用された場合、上記選択マーカーを有するもののみが、生存する。したがって、代表的な選択マーカーは、耐性のある細胞を選択するために、外来性物質が添加されることを必要とする。適切な濃度の上記細胞傷害性物質が、培養物に添加されなくてはならず、技術者または研究者側の付加労力が要求される。例えば、過剰の細胞傷害性物質が添加された場合、選択マーカーを含む生物体も殺傷され得、その結果、トランスフェクト／組換えの効率および収率は減少する。対照的に、本発明は、細胞傷害性物質を添加するのではなく、上記選択マーカー（すなわち、ｄｈｆｒ）を有する細胞が、選択マーカーを欠く生物体にとって成長するために必要である特定の添加物を欠いた制限培地の中で成長することが可能である、選択マーカーを提供する。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）は、ＮＡＤＰＨ−要求酵素（ＥＣ １．５．１．３）であり、ｄＴＭＰ、グリシン、およびプリンの合成のために必須の代謝産物であるテトラヒドロ葉酸の合成を触媒する。ＤＨＦＲをコードするポリヌクレオチドを欠く場合、細胞は、ｄＴＭＰ、グリシン、および／またはプリンを含む培地上で成長させなくてはならない。選択マーカーであるＤＨＦＲが細胞の中に存在する場合、上記外来性のプリンは取り除かれ得、そしてＤＨＦＲマーカーを含むそれらの細胞は、ＤＨＦＲを欠く細胞が死ぬのに対し、成長および増殖を続ける。したがって、本発明は、トランスフェクトされた／形質転換された生物体（例えば、細胞）の選択における、より労力の少ない方法を提供する。
本発明のＦＬＰシステムは、任意の所望の哺乳動物宿主細胞において、特定のゲノム位置を狙った、関心のあるポリヌクレオチドの安定な組み込みおよび発現を可能にする。ＦＬＰ宿主細胞株は、選択された宿主細胞株のゲノムの中に、単一のＦＬＰ組換え標的（ＦＲＴ）ドメインをトランスフェクトすることにより樹立され；次いでその後のＦＬＰトランスフェクト／形質転換のために使用されるものが、この結果生じた宿主細胞株である。いったん上記宿主細胞株が作製されると、任意の関心のあるポリヌクレオチドは、上記ＦＲＴ部位におけるＦＬＰリコンビナーゼ媒介ＤＮＡ組換えを介して、上記宿主細胞ゲノムの中に安定に組み込まれ得る（図１を参照のこと）。関心のあるポリヌクレオチドは、上記宿主ゲノムの中に、常に同一の位置および配向で、効率的に「交換」され得る。すべてのトランスフェクトされた細胞は、同一のゲノム位置に上記関心のあるポリヌクレオチドが組み込まれているので、クローン性細胞株の単離は、除かれて（ｏｂｖｉａｔｅ）いる。なぜなら、すべての上記トランスフェクトされた細胞は遺伝的に同一であるからである。
本発明はまた、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）−ＤＧ４４細胞を組換え標的部位（例えば、ＦＲＴ組換え部位）でトランスフェクトすることにより作製された、宿主細胞株を提供する。このＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株は、機能的ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を欠いており、したがって増殖するためには外来性のグリシン、プリン、およびチミジン（ピリミジンの１種）を必要とする。このような細胞株は、ヌクレオシドが補充された培地中で維持されるべきである。機能的ｄｈｆｒ遺伝子を含む、本発明の組換えカセット／ベクターでのトランスフェクションにおいて、プリン類およびチミジンを含まない培地中で細胞を培養することによって、選択が達成される。上記宿主細胞株のこの樹立法に関して、関心のあるポリヌクレオチドを発現している安定な細胞株の作製は、非常に迅速なものとなり得る。
本発明はさらに、本発明の組換えカセットおよび／またはベクターならびにＦＲＴ部位を含む宿主細胞を含む、組換えシステムを提供する。本発明の１つの局面において、上記宿主細胞は、上記宿主細胞のゲノムの中に組換え的に（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ）挿入されたＦＲＴ部位を含む、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ由来細胞である。このシステム（例えば、上記ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ由来の細胞および上記組換えカセット／ベクター）は、６週間未満のうちにＣＨＯ宿主において１０ｍｇ／Ｌと４０ｍｇ／Ｌとの間の組換えタンパク質を生成するための、強力な手段を提供する（例えば、１０日間のバイオリアクター作動の間に１５×１０７（細胞日数）／ｍｌのＩＣＡを有する）。さらに、これらの安定な細胞株を樹立するために最小の労力が必要とされる。
本発明の方法および組成物は、宿主細胞における所定の外来性ポリヌクレオチド標的部位における、関心のあるポリヌクレオチドの容易な組み込みを可能にする。その外来性ポリヌクレオチド標的部位は、自然に存在するポリヌクレオチド（すなわち、上記宿主のゲノム中に存在し、かつ組換え的な挿入がなされていないポリヌクレオチド）であっても、上記宿主生物体における選択、発現、または組換えを達成するために、上記宿主生物体中で予め加工されたポリヌクレオチドであってもよい。本明細書中で使用する場合、用語「所定の外来性ポリヌクレオチド標的」および「所定の標的」とは、標的細胞の中に含まれるポリヌクレオチド配列をいう。このような所定の標的としては、例えば、染色体配列（例えば、構造遺伝子、イントロン配列、５’非コード配列または３’非コード配列、プロモータおよびエンハンサーを含む調節配列、組換えホットスポット、反復配列、組み込まれたプロウイルス配列、ヘアピン、パリンドローム）、ならびに葉緑体ＤＮＡ配列およびミトコンドリアＤＮＡ配列を含む、エピソーム配列または染色体外配列（例えば、複製可能なプラスミドもしくは複製可能なウイルスまたは寄生生物の複製媒介物）が挙げられる。「所定の」または「事前に選択した」について、それらは、上記標的配列が予想される配列情報に基づいて選択され得、そして、それらはある部位特異的なリコンビナーゼ（例えば、ＦＬＰリコンビナーゼまたはＣＲＥリコンビナーゼ）によって認識される特異的部位に制約されないことを意味する。一部の実施形態において、上記所定の外来性ポリヌクレオチド標的は、自然に存在する生殖系列ポリヌクレオチド以外のものである（例えば、外来性ポリヌクレオチド、寄生生物の配列、マイコプラズマ配列、またはウイルス配列）。外来性ポリヌクレオチドは、宿主細胞の中に移入（すなわち、組換え分子生物学的技術による）された、ポリヌクレオチドである。例えば、細胞の中にマイクロインジェクトまたはトランスフェクトされた外来性ポリヌクレオチドが、外来性ポリヌクレオチドである。用語「自然に存在する」とは、ある対象に適用するために本明細書中で使用される場合、自然状態で上記対象が見出され得るという事実をいう。例えば、自然中の供給源から単離され得、かつ人間によって改変されていない、ある生物体（ウイルスを含む）の中に存在するポリヌクレオチドが、自然に存在するものである。
本発明の組換えカセット／ベクター中の組換えドメインは、上記組換えドメインと対応する所定の外来性ポリヌクレオチド標的との間に存在するその相同性のおかげで、上記カセット／ベクターを、宿主のゲノム内の特異的な染色体位置に方向付け、そして「相同組換え」と呼ばれるプロセスにより、上記所望の遺伝的改変を導入する。
「相同的な」または「相同性」は、同一であるか、または互いにハイブリダイズし得るかもしくは分子間交換を起こし得るのに十分に類似（例えば、９７％以上同一）しているかのいずれかである２つ以上の核酸配列を意味する。配列同一性の割合は、その参考配列の合計２５％未満の小規模の欠失または付加を除いて計算される。上記参照配列は、より大きな配列（例えば、遺伝子もしくは側方配列の一部分、または染色体の反復部分）の一部であり得る。しかしながら、上記参考配列は、少なくとも１２ヌクレオチド長〜１８ヌクレオチド長、少なくとも約３０ヌクレオチド長であり、そして少なくとも約５０ヌクレオチド長〜１００ヌクレオチド長であり得る。通常、組換え効率は、上記組換えドメインと上記所定の外来性ポリヌクレオチド標的との間の長さおよび／または相同性の割合が増加するにつれて、増加する。
２つ以上の核酸分子に関して、用語「同一の」または割合の「同一性」とは、比較アルゴリズムを使用するか、または手動整列化および目視検査によって測定するとき、比較画面（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）上で、最大に一致するように比較および整列された場合、それらが同一であるかまたはそれらが同一であると規定されたヌクレオチドの割合を有する、２つ以上の配列または部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）をいう。この定義はまた、配列の相補体（例えば、配列番号１に記載の配列または組換えカセットを含む配列番号１のフラグメントの相補体）にも言及する。例えば、上記組換えカセットおよびそのフラグメントは、配列番号１の限定された部分（例えば、配列番号１の第１ヌクレオチド〜第７１９ヌクレオチド、第１ヌクレオチド〜第１２５４ヌクレオチドなど）に対して、少なくとも約８０％、約９０％、および約９５％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるヌクレオチド配列同一性を有する。したがって、配列が配列番号１の全長配列またはそのドメインに対して同一である必須配列を有する場合、これらはまた、それぞれ、本発明の組換えカセットまたはドメインとしても機能し得る。
配列比較に関して、検査配列が比較される際、代表的に１つの配列が参照配列としての機能を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、検査配列および参照配列は、コンピュータに入力され、部分配列の座標が示され、そして、必要な場合、配列アルゴリズムプログラムパラメータが示される。デフォルトプログラムパラメータが使用され得るか、または代替パラメータが示され得る。上記配列比較アルゴリズムは、次いで、上記示されたプログラムパラメータまたはデフォルトプログラムパラメータに基づき、上記参照配列に対する上記検査配列についての配列同一性の割合を計算する。「比較画面」は、本明細書中で使用する場合、２５〜６００、通常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０からなる群より選択される連続した位置の、任意の１つの数のセグメントに対する参照を含み、この画面において、２つの配列が至適に整列された後に、これらの配列が連続した位置において、同一数の参照配列と比較され得る。比較を目的とした配列整列方法は、当該分野において周知である。種々のアルゴリズムが当該分野において公知であり、そしてその種々のアルゴリズムとしては、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列化アルゴリズムによるか、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９９８）の類似性検索方法によるか、これらのアルゴリズムの電算化された実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＰＩＬＥＵＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によるか、または手動整列化および目視検査によるものが挙げられる。
本発明に記載された配列同一性の割合（すなわち、実質的な類似性または同一性）を決定するという目的のために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、１９９０において記載される、ＢＬＡＳＴアルゴリズムが使用される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて、公に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース上で同じ長さの文字で整列された場合に、一致するか、またはいくつかの陽性値閾値スコアＴを満たすかのいずれかの、照会配列中の長さＷの中の短い文字（ｗｏｒｄ）を同定することによって、まず高スコア付け配列対（ＨＳＰ）を同定することを包含する。「Ｔ」とは、隣接文字スコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）をいう。これらの最初の隣接文字ヒットは、それらを含めたより長いＨＳＰを見出すための、初めの検索の種としての機能を果たす。ヒットした上記文字は、次いで、両方向に各々の配列に沿って、累積整列スコアが増加し得る限り、伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメータＭ（一致した残基対のための報酬スコア；通常は＞０）およびパラメータＮ（不一致残基に対する罰則スコア；通常は＜０）を使用して計算される。各々の方向における上記ヒットした文字の伸長は、以下：
上記累積性の整列スコアが最大に達した値から量Ｘだけ遠ざかった場合；
１つ以上の陰性スコア付け残基整列の蓄積が原因で、上記累積性の整列スコアが、０以下に及んだ場合；または
どちらかの配列が末端に達した場合
に停止する。上記ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＴ、およびＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＸは、感受性および上記整列の速度を決定し、そしてヌクレオチド比較に関し、以下のパラメータ：
文字の長さ（Ｗ）１１、
期待値（Ｅ）１０、
Ｍ＝５、
Ｎ＝４
を含む。アミノ酸配列に関し、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、文字の長さ（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリックス（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５、１９８９を参照のこと）を使用する。
上記ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の、類似性の統計的分析を実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７、１９９３を参照のこと）。上記ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供された類似性の１つの測定単位は、最小和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。上記最小和確率が０．１未満である場合、核酸は、参照配列に類似しているとみなされる。例えばそれは、約０．０１未満、または約０．００１未満であり得る。
本発明の中にはまた、配列番号１もしくは配列番号２に記載されるポリヌクレオチド配列またはそれらのドメインに対して特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれる。語句「選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、特定の参照ポリヌクレオチドに対して分子が結合、二重鎖化、またはハイブリダイズすることをいう。語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、あるプローブが、核酸の複雑な混合物中において、その標的配列に対して主にハイブリダイズするが、他の配列に対してはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況下において異なる（例えば、そのプローブの長さに依存する）。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての豊富なガイド（ｇｕｉｄｅ）は、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ」（１９９３）において見受けられる。一般に、ストリンジェントな条件は、確定したイオン強度およびｐＨでの上記特異的配列に対する熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃〜１０℃低くなるように選択される。上記Ｔｍは、標的に対して相補的である上記プローブの５０％が、平衡状態（上記標的配列が過剰に存在し、Ｔｍにおいて、上記プローブの５０％は平衡状態で占められている）で標的配列に対してハイブリダイズする（確定したイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下での）温度である。ストリンジェントな条件とは、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオンであり、代表的には、約０．０１Ｍ〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であって、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．３で、かつ短いプローブ（例えば、１０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド）に対しては少なくとも約３０℃であり、そして長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチドより長い）に対しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、不安定化剤（例えば、ホルムアミド）の付加で、達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションに関して、陽性シグナル（例えば、本発明の核酸の同定）は、バックグラウンドハイブリダイゼーションの約２倍である。本発明の目的のための、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、ハイブリダイゼーションが、２５ｍＭのＫＰＯ４（ｐＨ ７．４）、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、５０μｇ／ｍＬの変性・超音波処理済サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、および１ｎｇ／ｍＬ〜１５ｎｇ／ｍＬのプローブを含むハイブリダイゼーション溶液中で、約４２℃において実施され、洗浄は、約５０℃で、２×ＳＳＣおよび０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを含む洗浄溶液で実施される条件を意味する。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、ハイブリダイゼーションが、２５ｍＭのＫＰＯ４（ｐＨ ７．４）、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、５０μｇ／ｍＬの変性・超音波処理済サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、および１ｎｇ／ｍＬ〜１５ｎｇ／ｍＬのプローブを含むハイブリダイゼーション溶液中で約４２℃において実施され、洗浄は、約６５℃で、０．２×ＳＳＣおよび０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを含む洗浄溶液で実施される条件を意味する。
本発明の方法および組成物は、本発明のカセット／ベクターを使用した相同組換えを介した、外来性ポリヌクレオチドの中への挿入、外来性ポリヌクレオチドの欠失、または外来性ポリヌクレオチドの置換による、宿主細胞の改変における使用を見い出した。
本発明の組換えカセット／ベクターは、選択マーカーを含み得る。「マーカー」または「選択マーカー」は、集団の中で処理された細胞の大部分から、上記マーカーを発現しているトランスフェクトされた稀な細胞の単離を可能にする、選択マーカーである。選択マーカーの特定の例は、細胞増殖抑制性の薬剤、または細胞を殺傷する薬剤（例えば、メトトレキサートに対する耐性を与える、ＤＨＦＲタンパク質（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５６７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７（１９８１））；真菌フェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）に対する耐性を与える、ＧＰＦタンパク質（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；アミノ配糖体Ｇ−４１８に対する耐性を与える、ネオマイシン耐性マーカー（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１））；ハイグロマイシンに対する耐性を与える、Ｈｙｇｒｏタンパク質（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））；およびＺｅｏｃｉｎＴＭ耐性マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより商業的に入手可能））に対する耐性を与えるタンパク質をコードする選択マーカーである。加えて、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２６（１９６２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））は、それぞれ、ｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞またはａｐｒｔ−細胞において使用され得る。他の選択マーカーは、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼまたはアデノシンデアミナーゼをコードする。
特に役立つのは、ｄｈｆｒマーカーである。ＤＨＦＲは、ピリミジン合成に必要とされる、酵素である。機能的ＤＨＦＲを欠くか、またはＤＨＦＲを発現していない細胞は、増殖するためにピリミジンを必要とする。ｄｈｆｒ−である宿主細胞が、ｄｈｆｒベクターでトランスフェクトされ得ることは、結果として、ピリミジンを合成する能力を回復することになる。外来性ピリミジンを含む培地が取り除かれた場合、上記の外来性に提供されたｄｈｆｒ遺伝子を含む細胞のみが、生き残る。対照的に、細胞傷害性薬物の存在下において細胞の増殖する能力に基づいて選択するマーカーは、選択することがより困難である。例えば、細胞が「耐性遺伝子」でトランスフェクトされた場合、様々な濃度の細胞傷害性薬物が、上記耐性遺伝子を含む細胞を選択するために用意される。一部の事例において、過剰な上記細胞傷害性薬物が添加され得るか、または十分に添加され得ない場合、その事例における選択というものは、非効率的な選択および／または信頼できない選択である。
配列番号１および配列番号２は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を含む（例えば、配列番号１の約第２００７ヌクレオチド〜約第２５６７ヌクレオチドの配列；および配列番号２の約第１９３９ヌクレオチド〜約第２４９９ヌクレオチドの配列を含む）。本発明の組換えカセット／ベクターは、さらなるプロモータ／エンハンサーエレメントおよび調節領域（例えば、ポリアデニル化ドメイン）を含み得る。このようなさらなる調節領域およびポリアデニル化ドメインは、選択マーカーまたは関心のあるポリヌクレオチドに隣接（例えば、５’および３’のすぐ近く）し得る。これらのベクター中の上記ｄｈｆｒ遺伝子は、ＳＶ４０ポリアデニル化領域の近くに隣接されている（例えば、それぞれ、配列番号２の、約第２５６８ヌクレオチド〜約第２７０４ヌクレオチド、および約第２５００ヌクレオチド〜約第２６３５ヌクレオチド）。
本発明の組換えカセットおよび／またはベクターは、少なくとも約１０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチド、代表的には、少なくとも約２０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの長さの組換えドメインを含むが、より長くなり得る（例えば、少なくとも約２５０ヌクレオチド〜５００ヌクレオチドの長さ、または約５００ヌクレオチド〜２０００ヌクレオチド以上の長さ）。上記組換えドメインの長さは、部分的に、所定の内因性ポリヌクレオチド標的との相同性に基づく。したがって、相同的である長さは、上記配列の組成および所定の内因性ポリヌクレオチド標的配列の複雑さならびに当該分野で提供されるガイダンスに基づいて、技術者の判断で選択され得る。上記組換えドメインは、所定の内因性ポリヌクレオチド（例えば、標的宿主細胞中に位置するポリヌクレオチドのＤＮＡ配列（例えば、染色体ポリヌクレオチド、ミトコンドリアポリヌクレオチド、葉緑体ポリヌクレオチド、ウイルスポリヌクレオチド、エピソームポリヌクレオチド、またはマイコプラズマポリヌクレオチド））に対して、実質的に一致するか、または実質的に相補的である、少なくとも１つの配列を有する。このような組換えドメインヌクレオチド配列は、上記所定の内因性ポリヌクレオチド標的との相同対形成のためのテンプレートとして役に立つ。ベクター中の関心のあるポリヌクレオチドの宿主細胞ゲノムへの標的化において、上記相同性領域は、代表的には、関心のあるポリヌクレオチドの５’末端および／もしくは３’末端、またはその付近に位置する（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎら（１９９２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：３６０、これは本明細書中に参考として援用される）。任意の特定の理論に束縛されることは望まないが、リコンビナーゼの付加は、短い（すなわち、長さ約１０塩基対〜１０００塩基対）相同性セグメントを有する組換えドメインヌクレオチド配列での効率的なターゲッティングを可能にすると考えられている。本発明において、上記組換えドメインは、ＦＲＴ部位である。
代表的に、上記組換えドメインヌクレオチド配列は、所定のポリヌクレオチド内因性標的に対する高程度の相同性を有しており、そして代表的には同一である。代表的に、本発明の組換えドメインヌクレオチド配列は、長さ約１０ヌクレオチド〜３５ヌクレオチドであるが、長さ約２０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチド、または長さ約１００ヌクレオチド〜５００ヌクレオチドになり得る。それにもかかわらず、上記組換えドメインと上記所定の内在性ポリペプチド標的との間の配列相同性の程度は、最適かつ最小の長さに決定される（例えば、Ｇ−Ｃリッチな配列は、代表的により熱力学的に安定であり、そして一般により短い組換えドメインの長さを必要とする）。したがって、組換えドメインの長さおよび配列相同性の程度の両方は、特定の所定の配列を参照することで、決定され得る。
本発明の組換えカセットおよび／または本発明のベクターは、通常、少なくとも１種のリコンビナーゼタンパク質（例えば、Ｆｌｐリコンビナーゼ）で、所定の内因性ポリヌクレオチド標的を有する（ｈａｒｂｏｒ）宿主細胞の中へ導入される。一部の状況下で、上記組換えカセットまたはベクターは、宿主細胞の中へ導入される前に、Ｆｌｐまたは他のリコンビナーゼとともにインキュベートされるので、上記リコンビナーゼタンパク質は、上記組換えカセットまたは組換えベクターの上に「ロード」され得る。
リコンビナーゼは、組換えドメインを含む関心のあるポリヌクレオチドとともにインキュベートされた場合、上記関心のあるポリヌクレオチドと所定の内因性ポリヌクレオチド標的との間の組換え頻度および／または限局化頻度における測定可能な増大を提供する、タンパク質である。このようにして、１つの実施形態において、組換え頻度において１０倍〜１０００倍の増大が、達成され得る。
リコンビナーゼは、本質的に、すべてが同様な機能のすべてまたは大半を有するＲｅｃＡ様の組換えタンパク質のファミリーのメンバーであり、この機能は、特に：
（ｉ）組換えドメインを含む関心のあるポリヌクレオチドを、関心のあるポリヌクレオチドと相同的な標的上に適切に結合させる、上記リコンビナーゼタンパク質の能力、および位置させる上記リコンビナーゼタンパク質の能力；ならびに
（ｉｉ）リコンビナーゼタンパク質／ターゲッティングポリヌクレオチド複合体の、相補的な内因性配列を効率的に見出しそして結合する能力
である。もっともよく特徴付けられたｒｅｃＡタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する。その野生型Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質に加えて、多くの変異型ｒｅｃＡ様タンパク質が、同定されている（例えば、ｒｅｃＡ８０３；Ｍａｄｉｒａｊｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１８）：６５９２（１９８８）；Ｍａｄｉｒａｊｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１：１０５２９（１９９２）；Ｌａｖｅｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２０６４８（１９９２）を参照のこと）。さらに、多くの生物体は、鎖−転入活性を備えるｒｅｃＡ様リコンビナーゼを有する（例えば、Ｆｕｇｉｓａｗａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：７４７３（１９８５）；Ｈｓｉｅｈら、Ｃｅｌｌ ４４：８８５（１９８６）；Ｈｓｉｅｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５０８９（１９８９）；Ｆｉｓｈｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３６８３（１９８８）；Ｃａｓｓｕｔｏら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０８：１０（１９８７）；Ｇａｎｅａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：３１２４（１９８７）；Ｍｏｏｒｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９：１１１０８（１９９０）；Ｋｅｅｎｅら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３０５７（１９８４）；Ｋｉｍｅｉｃ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．４８：６７５（１９８４）；Ｋｉｍｅｉｃ、Ｃｅｌｌ ４４：５４５（１９８６）；Ｋｏｌｏｄｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：５５６０（１９８７）；Ｓｕｇｉｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３６８３（１９８５）；Ｈａｌｂｒｏｏｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２１４０３（１９８９）；Ｅｉｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：７４８１（１９８８）；ＭｃＣａｒｔｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８５４（１９８８）；Ｌｏｗｅｎｈａｕｐｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２０５６８（１９８９）を参照のこと。これらは、本明細書中に参考として援用される）。このようなリコンビナーゼタンパク質の例としては：ｒｅｃＡ、ｒｅｃＡ８０３、ｕｖｓＸ、および他のｒｅｃＡ変異体およびｒｅｃＡ様リコンビナーゼ（Ｒｏｃａ、Ａ．Ｉ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２５：４１５（１９９０））、ｓｅｐ１（Ｋｏｌｏｄｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：５５６０（１９８７）；Ｔｉｓｈｋｏｆｆら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２５９３、（１９９１））、ＲｕｖＣ（Ｄｕｎｄｅｒｄａｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：５０６（１９９１））、ＤＳＴ２、ＫＥＭ１、ＸＲＮ１（Ｄｙｋｓｔｒａら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２５８３（１９９１））、ＳＴＰ．α．／ＤＳＴ１（Ｃｌａｒｋら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２５７６（１９９１））、ＨＰＰ−１（Ｍｏｏｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：９０６７（１９９１））、他の標的リコンビナーゼ（Ｂｉｓｈｏｐら、Ｃｅｌｌ ６９：４３９（１９９２）；Ｓｈｉｎｏｈａｒａら、Ｃｅｌｌ ６９：４５７（１９９２））が挙げられるが、これに限定されない。すべて、本明細書中に参考として援用される。ＲｅｃＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＪＣ１２７７２およびＪＣ１５３６９（これらは、商業的に購入され得る））より精製され得る。これらの菌株は、細胞あたり高いコピー数で存在する「上昇した（ｒｕｎａｗａｙ）」複製プラスミドベクター上に、上記ｒｅｃＡコード配列を含む。上記ｒｅｃＡ８０３タンパク質は、野生型ｒｅｃＡの高活性変異体である。当該分野では、リコンビナーゼタンパク質の種々の例が教示されている（例えば、ショウジョウバエ、酵母、植物、ヒト、および非ヒト哺乳動物細胞に由来し、ｒｅｃＡと類似した生物学的性質（すなわち、ｒｅｃＡ様リコンビナーゼ）であるリコンビナーゼタンパク質（例えば、哺乳動物および酵母に由来するＲａｄ５１ならびに超好熱性古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐに由来するＰｋ−ｒｅｃ（Ｒａｓｈｉｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２５（４）：７１９（１９９７）を参照のこと）、本明細書中に参考として援用される））。上記リコンビナーゼは、実際はタンパク質の複合体であり得る。リコンビナーゼの定義の中には、リコンビナーゼの生物学的活性を残したリコンビナーゼの一部分またはフラグメント、ならびに生物学的活性を残した野生型リコンビナーゼの改変体または変異体が含まれる（例えば、亢進されたリコンビナーゼ活性を有する、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅｃＡ８０３）。
ＲｅｃＡは、相同な配列の間に相同性ジョイントを形成し、そしてＲｅｃＡは、外来性ポリヌクレオチド鎖（例えば、組換えドメインを含む、関心のあるポリヌクレオチド）と内因性ポリヌクレオチド鎖（例えば、所定のポリヌクレオチド標的）との間の相同性検索プロセスを媒介することに関与し、高い相同性の領域で、比較的安定なヘテロ二重鎖を生成する。したがって、リコンビナーゼは、有意ではあるが、完全に相同的ではない鎖間の上記相同組換え反応を促進し得る。したがって、組換えカセット／ベクターは、ヌクレオチドの置換、挿入および欠失を、内因性ＤＮＡ配列中に導入するために使用され得、そしてこのようにして、対応するアミノ酸置換タンパク質、アミノ酸挿入タンパク質およびアミノ酸欠失タンパク質が、上記内因性ＤＮＡ配列より発現される。
１つの実施形態において、ｒｅｃＡまたはｒａｄ５１は、上記リコンビナーゼとして使用される。例えば、ｒｅｃＡタンパク質は、代表的には、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅｃＡタンパク質または変異型ｒｅｃＡ８０３タンパク質を過剰産生する菌種（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ）から得られる。あるいは、ｒｅｃＡタンパク質は、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）より購入され得る。
ＦＬＰリコンビナーゼは、部位特異的組換え反応を触媒するタンパク質である。上記ＦＬＰタンパク質は、クローニングされ、そしてＥ．ｃｏｌｉ内で発現され（例えば、Ｃｏｘ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、８０：４２２３−４２２７、１９８３を参照のこと）、そして、ほぼ均質になるように精製されている（例えば、Ｍｅｙｅｒ−Ｌｅｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１５：６４６９−６４８８、１９８７を参照のこと）。ＦＬＰリコンビナーゼは、市販されているか、または、例えば、当業者によってサッカロミセス属から得られ得る。
あるＦＲＴ部位は、８塩基対のスペーサーにより隔てられた２つの１３塩基対の反復を含むものとして同定された：例えば、以下
Figure 2007508037
 （配列番号１の第１９６６ヌクレオチド〜第１９９９ヌクレオチドおよび配列番号２の第１８８２ヌクレオチド〜第１９３７ヌクレオチド；イタリック体の配列は、上記スペーサーを表す）を含む配列である。上記２つの１３塩基対反復が少なくとも８ヌクレオチドによって隔てられている限り、そのスペーサー領域における上記ヌクレオチドは、任意の他のヌクレオチドの組み合わせで置換され得る。上記スペーサーの実際のヌクレオチド配列は重大ではないが、当業者は、一部の用途のために、上記スペーサーは非対称性であることを所望する一方で、他の用途のために、パリンドローム構造のスペーサーが使用され得ることも認識する。一般に、上記組換えドメインおよび上記宿主細胞中に存在する上記ＦＲＴ部位の中に存在する上記スペーサーは、互いに同一である。本発明の組換えドメインおよび宿主細胞中のＦＲＴ部位は、配列番号１の第１９６６ヌクレオチド〜第１９９９ヌクレオチドおよび配列番号２の第１８９８ヌクレオチド〜第１９３１ヌクレオチドに記載される配列を含み得る。
リコンビナーゼが媒介するプロセスは、以下の刊行物：ＷＯ ００／６３３６５；ＷＯ ９９／６０１０８；ＷＯ ００／５６８７２；ＷＯ ９９／３７７５５；米国特許第５，９４８，６５３号、同第６，０７４，８５３号、同第５，７６３，２４０号、同第５，９２９，０４３号、および同第５，９８９，８７９号においてさらに記載され、これらのすべては、本明細書中に参考としてその全体が援用される。本発明の組成物および方法は、リコンビナーゼ（例えば、本明細書中に記載されるリコンビナーゼ、および当業者に公知である他のリコンビナーゼ）を利用することが理解される。
上述のように、上記組換えカセットおよびベクターは、調節エレメントを含む。本発明の１つの局面において、これらのプロモータおよび必要に応じたエンハンサーエレメントは、サイトメガロウイルスの任意の系統（例えば、本明細書中または参考文献（例えば、米国特許第５，６５８，７５９号）中に記載され、これらの開示は、本明細書中に参考として援用される）に由来する。例えば、本発明の組換えカセットにおいて有用である適切なＣＭＶ即時型初期プロモータ領域は、ＣＭＶ促進β−ガラクトシダーゼ発現ベクターであるＣＭＶβ（ＭａｃＧｒｅｇｏｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：２３６５（１９８９））より得られ得る。
上記組換えカセットは、核酸構築物そのままの（ｎａｋｅｄ）形態で使用され得る。あるいは、上記組換えカセットは、核酸ベクターの一部分（例えば、上述したような組換えベクター）として導入され得る。このようなベクターは、プラスミドベクターおよびウイルスベクターを含む。
用語「関心のあるポリヌクレオチド」は、転写可能な核酸分子を包含することを意味する。上記分子は、プロモータに対してセンス方向またはアンチセンス方向であり得る。アンチセンス構築物は、周知の技術によって細胞内での遺伝子の発現を阻害するために使用され得る。上記関心のあるポリヌクレオチドは、異種ポリペプチドを含み得る。異種ポリヌクレオチドは、代表的には、上記組換えカセットもしくはベクターの中のプロモータに作動可能に連結された上記調節エレメントに対して外来異種に由来するか、または同一の供給源に由来する場合、それはその本来の形態から改変される。したがって、プロモータに作動可能に連結した異種ポリヌクレオチドは、プロモータが誘導されたその形態とは異なった供給源に由来するか、または同一の供給源に由来する場合、それはその本来の形態より改変される。上記異種ポリヌクレオチドの改変（例えば、上記プロモータに作動可能に連結されることが可能なＤＮＡフラグメントを生成するために、ＤＮＡを制限酵素で処理し、これにより上記ポリヌクレオチドをその本体の形態から改変することによる改変）は、生じ得る。部位指向型突然変異誘発もまた、異種ポリヌクレオチドの改変のために有用であり得る。異種ポリヌクレオチドはまた、マーカー遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼまたは緑色蛍光タンパク質をコードする）またはその生成物が他の遺伝子の発現を調節する遺伝子を含み得る。したがって、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡのためのテンプレートとして役立つポリヌクレオチドは、この定義の範囲内に含まれる。上記異種遺伝子は、野生型遺伝子の任意の対立遺伝子の改変体であるか、またはそれは変異遺伝子であり得る。ｍＲＮＡは、自然状態では５’および／または３’が転写されているが、翻訳されないフランキング領域の一部またはすべてを、またそうでなければ、翻訳されたコード配列に関する配列を、必要に応じて含む。
上記関心のあるポリヌクレオチドは、必要に応じて、転写された分子に正常に結びつく関連した転写制御エレメント（例えば、転写終止シグナル、ポリアデニル化ドメインおよび下流エンハンサーエレメント）をさらに含み得る。上記関心のあるポリヌクレオチドは、治療用製品のためのテンプレートをコードするか、またはこのテンプレートとして役に立ち得、それは例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはリボ核酸であり得る。上記関心のあるポリヌクレオチドは、代表的には、ポリペプチド生成物（例えば、酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ））をコードするＤＮＡ配列（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）；ホルモン；サイトカイン；インターロイキン；インターフェロン；ＴＮＦ；成長因子（例えば、ＩＧＦ−１）；可溶性レセプター分子（例えば、可溶性ＴＮＦレセプター分子）；神経伝達物質またはそれらの前駆体；栄養因子（例えば、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３およびＮＴ５）；アポリポタンパク質（例えば、ＡｐｏＡＩおよびＡｐｏＡＩＶ）；ジストロフィンもしくはミニジストロフィン（ｍｉｎｉｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）；腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣおよびｋ−ｒｅｖ）；凝固に関する因子（例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子）；あるいは天然のまたは人工の免疫グロブリンのすべてまたは一部（例えば、ＦａｂおよびＳｃＦｖ、またはクローン化されたＩｇＧのＬ鎖またはＨ鎖）である。
関心のあるポリヌクレオチドはまた、標的細胞内におけるその転写が、遺伝子発現または細胞のｍＲＮＡの転写の制御を可能にするアンチセンス分子を産生するためのテンプレートも含み得る。このような分子は、例えば、当該分野において公知である技術により、標的細胞において、細胞のｍＲＮＡに対して相補的なＲＮＡに転写され得、そしてその結果、それらのタンパク質への翻訳をブロックし得る。特に、アンチセンス分子は、関節炎、および炎症性のサイトカインまたは異化作用のサイトカインにより引き起こされる実質欠損の処置において、この炎症性のサイトカインまたは異化作用のサイトカインの翻訳をブロックするために使用され得る。
上記関心のあるポリヌクレオチドは、代表的に、診断上または治療的に使用するポリペプチドをコードしている。上記ポリペプチドは、バイオリアクターにおいてインビトロで、本発明の組換えカセットを含む種々の宿主細胞（例えば、ＣＯＳ細胞もしくはＣＨＯ細胞またはそれらの誘導体）を使用して生成され得る。
治療的な使用とは、疾患もしくは障害からの軽減、疾患もしくは障害の治療、および／または重症度の疾患もしくは障害の寛解を提供し得る使用を意味する。診断上の使用は、疾患のプロセス、または疾患もしくは障害の存在もしくは非存在の判定に対する、分子の原因または関連性に関する情報を、判定または提供することを可能にする分子の使用を、包含する。診断剤は、上記疾患または障害の改善に直接的に寄与しない。
関心のあるポリヌクレオチドはまた、ワクチンとして使用するための抗原性ポリペプチドもコードし得る。抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、病原性の生物体（例えば、細菌またはウイルス）に由来する。例えば、抗原性ポリペプチドは、病原性の生物体のポリペプチド中に存在する抗原性決定因子を含む。したがって、例えば、ウイルス性出血性敗血症、細菌性腎臓疾患、ビブリオ症、およびせつ多発症を引き起こす、このような生物体のためのワクチンが、得られ得る。
本明細書で使用される場合、「単離された」は、分子または組成物（例えば、本発明のベクターもしくは組換えカセット、または関心のあるポリヌクレオチド）に言及した場合、上記分子または組成物が、少なくとも１種の他の化合物（例えば、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の夾雑物）から分離されることを意味し、これらの他の化合物はインビボにおいてか、またはそれらが自然に起こる状態に関連する。したがって、関心のあるポリペプチドは、それが本来関連している他の任意の成分から単離された場合、単離されたとみなされる。単離された組成物は、実質的に純粋であり得る。単離された組成物は、均質的な状態であり得る。それは、乾燥物／凍結乾燥物または水溶液であり得る。純度および均質性は、例えば、分析化学的技術（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、アガロースゲル電気泳動または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））を使用して決定され得る。
本明細書で使用する場合、「組換え」とは、インビトロにおいて合成もしくは別に操作されたポリヌクレオチド（例えば、「組換えポリヌクレオチド」）、細胞もしくは他の生物学的システムにおいて生成物を産生するために組換えポリヌクレオチドを使用する方法、または組換えポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（「組換えタンパク質」）をいう。組換えポリヌクレオチドは、例えば、融合タンパク質の発現のための組換えカセットまたはベクターの中に連結された、種々の供給源に由来する核酸分子；またはポリペプチド（例えば、異種ポリヌクレオチド（例えば、ポリペプチドコード配列）に作動可能に連結された本発明の組換えカセットまたはベクター）の誘導性または恒常的な発現により産生されるものを包含する。
代表的な発現システムにおいて、異種ポリヌクレオチドに由来するポリペプチドの産生は、制御されないか、または異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流に作動可能に連結された転写プロモータからの転写を調節することによって制御されるかのいずれかである。しかしながら、制御はまた、適切な転写終結およびｍＲＮＡ安定性を提供するためには、適切に順に下流に起こらなくてはならない。本発明の１つの局面において、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルドメインは、本発明の組換えカセットまたはベクター中の、関心のあるポリヌクレオチドの下流（３’）に提供される。１つの局面において、ｈＧＨｖ ポリＡシグナルドメインが使用され、そしてｈＧＨｖポリＡシグナルドメインは上記ヒト成長ホルモン遺伝子配列に由来する配列を含む。上記ｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメイン配列は、強い転写終結を提供し、そして真核細胞において増大したｍＲＮＡ安定性を提供する。このｈＧＨｖポリアデニル化シグナルドメインは、ＣＭＶプロモータ／エンハンサーを利用し得る、従来の組換えカセットおよび／またはベクターを越える、特有の利点を提供する。
翻訳エレメントもまた存在し得、そして、ＲＮＡ転写物のタンパク質への翻訳を可能にするために必要な配列（例えば、リボソーム結合部位および開始コドン）を含むことが意図される。翻訳エレメントはまた、コンセンサス配列、リーダー配列、スプライシングシグナルなどを含み得、翻訳エレメントは、翻訳の程度を促進または亢進するため、またはその発現生成物の安定性を増大させるために役立つ。本発明のベクターは、付属的な転写領域（例えば、イントロン、ポリアデニル化シグナル、シャイン／ダルガーノ翻訳シグナルおよびコザックコンセンサス配列（Ｓｈｉｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７１：１３４２−１３４６（１９７４）；Ｋｏｚａｋ、Ｃｅｌｌ ４４：２８３−２９２（１９８６）））を有し得る。
用語「複製エレメント」は、レシピエント細胞中の上記ベクターの複製を可能にするために必要である、上記特殊化した配列（例えば、複製起点）を含むことが意図される。一般に、このようなベクターは、レシピエント細胞中の上記ベクターの自律的な安定した複製を可能にするために十分である、少なくとも１つの複製起点を含む。
さらなる実施形態において、本発明は、前述された構築物（例えば、本発明の組換えカセットまたはベクター）を含む宿主細胞に関する。本発明の組換えカセットは、本発明の所望のポリヌクレオチドを発現させるように、宿主細胞をトランスフェクトすること、または宿主細胞を形質転換することによって、宿主細胞を組換え的に改変するために使用され得る。本明細書で使用する場合、用語「組換え的に改変された」は、本発明の組換えカセットまたはベクターを、生きた細胞または発現システムの中に導入することを意味する。通常、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えカセットは、ベクター（例えば、プラスミド）の中に存在する。発現システムは、本明細書中に記載されるように、その生成物が発現される、関心のあるポリヌクレオチドが導入された、生きた宿主細胞を包含する。
宿主細胞は、その中にある組換えカセット（組換えカセットを含むベクターを含む）が増殖され得、そしてポリヌクレオチドがコードする生成物が発現され得る、細胞である。宿主細胞はまた、上記被験宿主細胞（ｓｕｂｊｅｃｔ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）またはその派生物の任意の子孫を含む。複製の間に変異が生じ得るので、すべての子孫はその親細胞と同一ではない可能性があると理解されている。しかしながら、用語「宿主細胞」が使用された場合、このような子孫は含まれる。本発明において有用である宿主細胞としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、植物細胞および動物細胞が挙げられる。例えば、宿主細胞は、高等な真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）、または下等な真核細胞（例えば、酵母細胞）、もしくは上記宿主細胞は、原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。上記宿主細胞の中への上記構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、または電気穿孔法（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．、Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．、Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））によって影響され得る。適切な宿主の代表的な例を、ここで述べておく：真菌細胞（例えば、酵母）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫）；植物細胞など。適切な宿主のの選択は、本明細書より享受される当業者の範囲内において判断され得る。
本発明において使用する宿主細胞は、真核宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）を含む。本発明の１つの局面において、上記宿主細胞は、細胞培養において増殖することに適応している哺乳動物が産生する細胞である。この業界で一般に使用されるこのような細胞の例は、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ１細胞（Ｃｏｓ細胞；Ｃｏｓ−７細胞を含む）、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、（特に、マウスの）骨髄腫細胞株の細胞、ＰＣ１２細胞およびＷ１３８細胞である。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、種々の複雑な組換えタンパク質（例えば、サイトカイン、凝固因子、および抗体）の生成のために広く用いられる（Ｂｒａｓｅｌら、Ｂｌｏｏｄ ８８：２００４−２０１２（１９９６）；Ｋａｕｆｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３：６３５２−６３６２（１９８８）；ＭｃＫｉｎｎｏｎら、Ｊ Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６：２３１−２３９（１９９１）；Ｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４５：３０１１−３０１６（１９９０））。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）−欠乏性変異細胞株（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０（１９８０））は、最適なＣＨＯ宿主細胞株である。なぜならば、その効率的なＤＨＦＲ選択性および増幅性遺伝子発現システムが、これらの細胞内での高度なレベルの組換えタンパク質発現を可能にするからである（Ｋａｕｆｍａｎ、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８５：５２７−５６６（１９９０））。さらに、これらの細胞は、接着培養または懸濁培養としての操作が簡易であり、そして比較的良い遺伝的安定性を示す。ＣＨＯ細胞およびそれらの中で発現される組換えタンパク質は、広く特徴付けられ、そして監督官庁によって臨床的使用における製造が認められている。さらに、上述の細胞株のいずれかに由来し、所望の表現型を有する宿主細胞もまた使用され得ることが意図される。例えば、派生した宿主細胞としては、（例えば、陽性および／または陰性選択工程により）所望の表現型について選択的に培養された、ＣＨＯ細胞（例えば、上記ＤＧ４４細胞株）を含む誘導された宿主細胞が挙げられる。１つの局面において、上記ＣＨＯ細胞は、無血清培地中における増殖に対して適応しており、そしてまた、あるいは独立的に、懸濁液中における増殖に対して適応していてもよい（例えば、Ｓｉｎａｃｏｒｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ、５２：５１８−５２８（１９９６）；およびＨａｌｄａｎｋａｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１５：３３６−３４６（１９９９）を参照のこと）。懸濁液適応細胞は、より容易に取り扱えて、かつより高い密度を達成し得る。無血清培地適応細胞は、その細胞培養上澄み液からの組換えタンパク質の精製の容易さという利点を提供する。
本発明の１つの局面において、関心のあるポリヌクレオチドによってコードされる因子のインビトロ生成のための発現システムが、提供される。本明細書中で議論する場合、上記関心のあるポリヌクレオチドは、薬学的に、医薬的に、栄養的に、および／または産業的に価値のあるポリペプチドをコードし得る。例えば、上記関心のあるポリヌクレオチドは、ポリペプチドベースの薬物をコードし得る。代表的に、このようなポリペプチドは、細胞外生成物として発現される。例えば、本発明の組換えカセットおよび／またはベクターを使用して生成され得るポリペプチドとしては、Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４０リガンド、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、Ｆａｓリガンド、ＮＦ−κＢのレセプターアクチベーターに関するリガンド（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦに関連したアポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＯＲＫ／Ｔｅｋ、胸腺支質に由来するリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、肥満細胞増殖因子、幹細胞増殖因子、上皮増殖因子、ＲＡＮＴＥＳ、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）、インスリン様増殖因子、副甲状腺ホルモン、インターフェロン（例えば、インターフェロンβ）、神経増殖因子、グルカゴン、インターロイキン１〜インターロイキン１８、コロニー刺激因子、リンフォトキシンβ、腫瘍壊死因子、白血病抑制因子、オンコスタチンＭ、細胞表面分子Ｅｌｋおよび細胞表面分子Ｈｅｋに対する種々のリガンド（例えば、ｅｐｈに関連したキナーゼ、またはＬＥＲＫＳ）、および抗体Ｌ鎖または抗体Ｈ鎖が挙げられるが、これらに限定されない。
任意の上述されたタンパク質に対するレセプター（またはその可溶性フラグメント）もまた、本発明の方法および組成物を使用して発現され得る。そのレセプターとしては、（ｐ５５およびｐ７５と呼ばれる）腫瘍壊死因子レセプターの両方の形態、インターロイキン１レセプター（１型および２型）、インターロイキン４レセプター、インターロイキン１５レセプター、インターロイキン１７レセプター、インターロイキン１８レセプター、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子レセプター、顆粒球コロニー刺激因子レセプター、オンコスタチンＭおよび白血病抑制因子に対するレセプター、ＮＦ−κＢのレセプターアクチベーター（ＲＡＮＫ）、ＴＲＡＩＬに対するレセプター、ＢＡＦＦレセプター、リンフォトキシンβレセプター、ＴＧＦβレセプターＩ型およびＴＧＦβレセプターＩＩ型、およびデスドメイン（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）を含むレセプター（例えば、Ｆａｓまたはアポトーシス誘導レセプター（ＡＩＲ））が挙げられる。
本発明の組換えカセットおよび／またはベクターを使用して発現され得る他のタンパク質は、分化抗原のクラスター（ＣＤタンパク質と呼ばれる）を含む：例えば、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＶＩ（第６回 国際ワークショップおよびカンファレンスの要旨；Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ、Ｋｉｋｕｔａｎｉら編；神戸、日本国、１９９６年）において開示されたＣＤ分子、またはその後のワークショップにおいて開示されたＣＤ分子である。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０、およびそれらに対するリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンドおよびＣＤ４０リガンド）が挙げられる。これらのうちのいくつかは、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーである（４１ＢＢおよびＯＸ４０をまた含む）；そのリガンド（例えば、４１ＢＢリガンドおよびＯＸ４０リガンド）もまた、上記ＴＮＦファミリーのメンバーである；したがって、ＴＮＦファミリーおよびＴＮＦＲファミリーのメンバーもまた、本発明を使用して発現され得る。
酵素学的に活性であるポリペプチドもまた、本発明に従って発現され得る。例としては、メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリン（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）ファミリーのメンバー、種々のキナーゼ、グルコセレブシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノゲンアクチベーター、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、グロビン、ＩＬ−２アンタゴニスト、α−１アンチトリプシン、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）、および多数の他の酵素が挙げられる。酵素学的に活性であるタンパク質についてのリガンドもまた、本発明のカセットおよびベクターを使用して発現され得る。
本発明の組成物および方法はまた、組換えタンパク質および組換えポリペプチドの他の型（免疫グロブリン分子またはその一部およびキメラ抗体（例えば、マウス抗原結合領域が結合したヒト定常領域を有する抗体）もしくはそのフラグメントを含む）の発現のために有用である。免疫グロブリン分子をコードするＤＮＡが、組換えタンパク質（例えば、単鎖抗体、親和性が増強された抗体、または他の抗体ベースのポリペプチド）をコードするＤＮＡが得られるように操作され得る、非常に多くの技術が公知である（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４−９３８（１９８９）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１−７３４（１９８７）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９４−３９７（１９８９）を参照のこと）。クローン化されたヒト化抗体は、リンフォトキシンβレセプターおよびインテグリン（例えば、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−４、およびαｖβ６）に対して特異的に結合する抗体を含む。このような抗体は、アゴニストまたはアンタゴニストであり得る。
種々の融合タンパク質もまた、本発明の方法および組成物を使用して発現され得る。このような融合タンパク質の例としては、免疫グロブリン分子の一部との融合物として発現されるタンパク質、ジッパー（ｚｉｐｐｅｒ）部分との融合物として発現されるタンパク質、および新規の多機能タンパク質（例えば、サイトカインと増殖因子の融合タンパク質（例えば、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３、ＭＧＦとＩＬ−３））が挙げられる。ＷＯ ９３／０８２０７およびＷＯ ９６／４０９１８は、それぞれ、免疫グロブリン融合タンパク質およびジッパー融合タンパク質を含む、ＣＤ４０Ｌと呼ばれる分子の種々の可溶性オリゴマー形態の調製を記載する；それらの中で議論されるその技術は、他のタンパク質に対しても適用可能である。
いったん関心のあるポリヌクレオチドが発現されると、その発現生成物（例えば、タンパク質またはポリペプチド）は、当該分野における標準技術を使用して、精製され得る。例えば、上記関心のあるポリヌクレオチドが精製タグを含む融合ポリペプチドをコードする場合、そのポリペプチドは、上記タグに対して特異的に結合する抗体を使用して精製され得る。１つの局面において、タグ分子をコードするポリヌクレオチドは、所望のポリペプチドをコードする関心のあるポリヌクレオチドの５’末端または３’末端に連結される；上記ポリヌクレオチドは、ポリＨｉｓ（例えば、ヘキサＨｉｓ）、または他の「タグ」（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（血球凝集素インフルエンザウイルス）、または市販の抗体としてあるｍｙｃ）、をコードし得る。このタグは、代表的には、上記ポリペプチドを発現する際に、そのポリペプチドに融合し、そして上記宿主細胞からの上記所望のポリペプチドの親和性精製のための手段として役に立ち得る。親和性精製は、例えば、親和性マトリックスとしての上記タグに対する抗体を使用した、カラムクロマトグラフィーによって達成され得る。必要に応じて、上記タグは、精製されたポリペプチドから種々の手段（例えば、タンパク質分解性開裂）により引き続いて除去され得る。
本発明の組換えカセットおよびベクターは、宿主細胞中への上記関心のあるポリヌクレオチドの安定な移入を提供するために使用され得る。安定な移入は、上記関心のあるポリヌクレオチドが、上記宿主の中で持続的に維持されることを意味する。
上記関心のあるポリヌクレオチドを含むベクターは、細胞宿主の型に依存した、周知の方法によって上記宿主細胞の中に移入され得る。例えば、マイクロインジェクションが、標的細胞に対して一般に利用されるが、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション、微粒子銃またはウイルスベースのトランスフェクションもまた、使用され得る。哺乳動物細胞を形質転換するために使用される他の方法としては、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合などが挙げられる（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと。これは、本明細書中に参考として援用される）。
別の局面において、本発明は、キットとしての機能を有する。上記キットは、本発明の組換えカセットおよび／またはベクターを含む。上記キットは、標的部位（例えば、ＦＲＴ部位）を含む宿主細胞をさらに含得る。このような宿主細胞は、代表的には、１種以上の密封された容器（例えば、小包、バイアル、チューブ、またはマイクロタイタープレート）において提供される。これらはまた、一部の実施形態において、栄養培地を含み得る。キットは、代表的に、上記宿主の特質（例えば、その遺伝子型）を記載する文献および／または形質転換のためのキットの使用に関する使用説明書を含む。一部の実施形態において、キットは、本発明の組換えカセットおよび／またはベクターを含む１つ以上のポリヌクレオチドを含み、そして別個の容器中に酵素（例えば、Ｆｌｐリコンビナーゼ）をまた含み得る。
（組換えカセット／ベクターの作製）
プラスミドｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｖ６０１５−２０；図４を参照のこと）を、ＳａｐＩ制限酵素（１μｇプラスミドあたり１ユニットＳａｐＩ制限酵素）で直鎖状にして、そしてそれを３７℃で約１６時間消化した。トランスフェクションのために使用した宿主細胞は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠乏性チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＤＧ４４（Ｕｒｌａｕｂら、Ｃｅｌｌ ３３、４０５−４１２（１９８３））であった。約２×１０６個の生存可能なＣＨＯ−ＤＧ４４宿主細胞を、１回のトランスフェクションで使用した。１回のトランスフェクションあたり５００ｎｇの直鎖状ｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏプラスミドを使用し、上記宿主細胞を２８０Ｖ、９６０μＦでエレクトロポレートした。
成功した形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎＴＭ抗生物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．カタログ番号Ｒ２５０−０１）を含んだ培地中で選抜した。選択培地中において首尾よく増殖したコロニーを、２４ウェル細胞培養プレートの中に採集することにより単離した。これらの単離物を、次いで、トランスフェクトした細胞をＴ２２５フラスコに移すために、それらが十分にしっかりとするまで、６ウェル培養プレート中に拡大した。ゲノムＤＮＡを、そのトランスフェクトした細胞（５×１０６個の細胞）から収集した。
１００細胞株より多くのゲノムＤＮＡを、ＦＲＴ配列の単一のコピーの存在を立証するために、サザンブロットによって試験した。そのプローブの配列は、上記ＦＲＴ配列およびβ−ガラクトシダーゼ融合遺伝子の５’末端に及ぶ（図５を参照のこと）。その１００細胞株より多くの細胞株のうち、単一のＦＲＴ組込み部位を有する３５細胞株のみをスクリーニングし、タンパク質発現研究のために選択した（図６および図７を参照のこと）。
（レポーター遺伝子のクローニング）
ＣＭＶ ＩＥ１、イントロンＡフラグメント、およびポリＡシグナルドメインを含む上記組換えカセット／ベクターを、市販の組換えベクターと比較した。
ＣＨＯ−ＤＧ４４ Ｆｌｐ−Ｉｎ宿主細胞株を使用し、発現レベルを決定するために、分泌されたタンパク質のモデルとして、分泌されたアルカリンホスフェート（ＳＥＡＰ）を使用した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を使用して、上記ＳＥＡＰコード配列を、ｐＳＥＡＰ２発現プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）より獲得した。その５’プライマーをＫｐｎＩ部位とともに設計し、そしてその３’プライマーをＢｇｌＩＩ部位とともに設計した。
Figure 2007508037
 上記ＰＣＲを、以下のようにして行った：３μｇのｐＳＥＡＰ２プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）；各１μＭの５’プライマーおよび３’プライマー（上記を参照のこと）；０．２５ｍＭのｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；２ユニットのＶｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）；１×Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ反応緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）。上記ＰＣＲを、１００μｌ反応液量において実施した。ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、５５℃で４５秒間、および７５℃で２分間を３０サイクル、続いて７５℃で１０分間行い、そして４℃で保った。上記ＳＥＡＰコード領域に相当する、約１．６ｋｂのＰＣＲ生成物を得た。Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、上記ＰＣＲ生成物をＰＣＲ混合物から精製し、そしてｄＨ２Ｏ中に溶解した。上記ＰＣＲ生成物を、制限酵素ＫｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）で最初に消化し、続いてＢｇｌＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）で消化した。
１０ｎｇの前もってＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化した上記ｐＦＲＴ／ｄｈｆｒ−１プラスミドを、上記の消化したＳＥＡＰ ＰＣＲ生成物と結合した。そのＳＥＡＰコード領域および接合点を、配列決定した。予想通り、結果は仮想上の配列ファイルと一致した。上記プラスミドを、ｐＦＲＴ／ＳＥＡＰと命名した。
Ｆｌｐ−Ｉｎ宿主細胞株の中への上記ＳＥＡＰレポーター遺伝子のトランスフェクションを、エレクトロポレーションによって達成した。１０μｇのｐＦＲＴ／ＳＥＡＰを、９０μｇの上記Ｆｌｐリコンビナーゼを発現しているプラスミドｐＯＧ４４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と混合した。そのＤＮＡをエタノール沈殿し、７０％のエタノールで洗浄し、そして乾かした。上記細胞株の２×１０６個の生存可能な細胞を、トランスフェクションのために使用した。その細胞およびＤＮＡを、８００μＬの滅菌ＨｅＢＳ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ＝７．０５、１３７ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．７ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、６ｍＭのブドウ糖）と無菌的に混合し、そして０．４ｃｍのキュベット（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）の中に移した。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用し、０．２８ｋＶおよび９５０μＦｄに設定して行った。そのエレクトロポレーションパルス後、上記細胞を、上記キュベット中において５分間〜１０分間、室温でインキュベートしておいた。それらを次いで、１０ｍｌのα−ＭＥＭ＋ヌクレオシド（Ｇｉｂｃｏ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）と１０％の透析されたウシ胎仔血清（ｄＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を含んだ遠心チューブ中に移し、そして１０００ＲＰＭで５分間ペレット化した。再懸濁したペレットを、６ウェルプレートのヌクレオシドを含まないα−ＭＥＭと１０％のｄＦＢＳ中に蒔き、加湿したインキュベーター中で、３６℃にて５％のＣＯ２とともに、約２週間インキュベートし、この時点でコロニーが形成された。
安定なトランスフェクト体を、単離体として分析した。単離体を、上記トランスフェクション物より「採集（ｐｉｃｋｉｎｇ）」することによって得た。「採集」を、コロニー上を５０μｌに設定したＰ２００ ＰｉｐｅｔｍａｎＴＭで直接吸い込む工程により、達成した。その吸い込まれたコロニーを、最初に２４ウェルプレートに移した。いったんそのウェルが＞５０％コンフルエントになったら、上記培地を、４ｍＭのＬ−グルタミン（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を補充した化学限定ＰｒｏＣＨＯ４培地（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に交換し、そして上記細胞を６ウェルプレートに移した（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）。特異的生産性を、６ウェルプレートにおいて、コンフルエントかそれに近い点で、評価した。
上記特異的生産性を、上記培地を新鮮な培地と交換することによって上記ＳＥＡＰアッセイで評価し、次いでその培地をサンプリングし、そして４日後に細胞を数えた。生成物力価を、４日間の終わりにその細胞数で標準化し、そして上記生産性を、細胞あたりのＳＥＡＰ活性として表した。
馴化培地を、Ｇｒｅａｔ ＥｓｃＡＰｅＴＭ ＳＥＡＰレポーターシステム３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して分析した。このアッセイは、上記馴化培地におけるＳＥＡＰ活性を検出するために、蛍光基質を使用する。このキットを、製品の使用説明書に従い、９６ウェルフォーマットにおいて使用した。すべての標準物質および試料を、提供された希釈緩衝液ではなく新鮮な培地において希釈した。６０分間の後に１回の測定（ｒｅａｄ）を実施する代わりに、測定を１０分間の時点および４０分間の時点において行い、そしてそのデータを、１分間あたりの相対的蛍光単位（ＲＦＵ／分）としてＳＥＡＰ活性を表すために使用した。Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ ＩＩＴＭプレートリーダー（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）とともに使用した発光フィルターは、推奨の４４９ｎｍに代わり、４６０ｎｍであった。
上記ＲＦＵ／分値を、上記キットとともに提供された標準物質に基づいた標準曲線に対して標準化した。その提供された標準物質は定量化されていなかったので、すべての値は、相対値である。これらの相対値を細胞数および、インキュベーション期間に対して標準化し、相対的特異的生産性（１日あたりの細胞１個あたりのＳＥＡＰ活性）を生成した。
Figure 2007508037
 本発明の多くの実施形態を、記載した。それにもかかわらず、種々の改変が、本発明の精神および範囲を逸脱することなくなされ得ることが理解される。したがって、他の実施形態は、特許請求の範囲の範囲内である。
図１は、ＦＬＰ組換え標的（ＦＲＴ）部位およびＣＨＯ宿主細胞のゲノム中への導入のプロセスを示す。関心のあるポリペプチドを含む発現ベクターは、上記ＦＲＴ部位において、ＦＬＰリコンビナーゼ媒介性のＤＮＡ組換えを介して、上記ゲノム中にトランスフェクトされ（安定に組み込まれ）得る。 図２は、本発明の組換えベクターのマップを示す（配列番号１に対応）。 図３は、２つの挿入部位（すなわち、第１３０９位および第６３７０位から始まるマルチクローニング部位）を有するベクターを含む、本発明の組換えベクターのマップを示す（配列番号２に対応）。 図４は、ＣＨＯ−ＤＧ４４ Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞株を作製するために使用した、ｐＦＲＴｌａｃＺｅｏのプラスミドマップを示す。 図５は、トランスフェクトした宿主細胞におけるＦＲＴの存在を同定するために使用したプローブを示している、ｐＦＲＴｌａｃＺｅｏのプラスミドマップを示す。 図６は、サザンブロットによりスクリーニングした、＞１００の試験した細胞株のうちの１７細胞株の代表的な写真を示す。各々のレーンは、トランスフェクトした細胞株に由来する１０μｇのゲノムＤＮＡを含む。種々のサイズのバンドに見られるように、これは、多くのこれらの候補宿主細胞株は上記ＣＨＯ−ＤＧ４４中の種々の部位に組込まれた上記ＦＲＴ配列を有しているという、証拠である。さらに、複数のバンドに見られるように、上記ＦＲＴの複数の組込み部位の例が、第１１レーンにおいて見られる。 図７は、単一コピーのＦＲＴカセットを確認するために再試験した、有力候補を示す。第１レーンは、ポジティブコントロールとして役に立つ、１ｎｇのｐＦＲＴ／ｌａｃＺｅｏを含む。３５の候補細胞株のうちの９細胞株の結果を示す。各々のレーンは、トランスフェクトされた細胞株に由来する、１０μｇのゲノムＤＮＡを含む。単一のバンドのみが見られるものは、単一の組込みの確認となる。さらに、上記種々のサイズのバンドは、上記ＦＲＴ部位の種々の組込み位置を示唆する。そのハイブリダイゼーションバンドは、上記ＣＨＯ−ＤＧ４４ゲノム中に存在している、上記ＦＲＴ配列がわずか一コピーである結果として、非常に弱くなっている。 図８Ａおよび図８Ｂは、配列番号１のヌクレオチド配列を示す。 図８Ａおよび図８Ｂは、配列番号１のヌクレオチド配列を示す。 図９Ａおよび図９Ｂは、配列番号２のヌクレオチド配列を示す。 図９Ａおよび図９Ｂは、配列番号２のヌクレオチド配列を示す。

Claims (30)

  1. 組換えカセットであって、該組換えカセットは、以下
    プロモータ／エンハンサー領域；
    関心のあるポリヌクレオチド；
    ポリＡシグナルドメイン；
    ＦＲＴ組換えドメイン；および
    ｄｈｆｒポリヌクレオチド
    を含み、該プロモータ／エンハンサー領域、該関心のあるポリヌクレオチドおよび該ポリＡシグナルドメインは作動可能に連結されている、組換えカセット。
  2. 請求項１に記載の組換えカセットであって、前記プロモータ／エンハンサー領域は、ヒトＣＭＶ即時型初期遺伝子１（ｈＣＭＶ ＩＥ１）を含む、組換えカセット。
  3. 請求項２に記載の組換えカセットであって、前記ｈＣＭＶ ＩＥ１プロモータ／エンハンサー領域は、配列番号１または配列番号２の約ｘ１〜約ｘ２に記載の配列を含み、ｘ１は１位〜７０位のヌクレオチドであり、そしてｘ２は７７０位〜７８０位のヌクレオチドである、組換えカセット。
  4. 請求項１に記載の組換えカセットであって、スプライシング供与部位およびスプライシング受容部位を含む可変長介在配列（ＶＬＩＶＳ）をさらに含む、組換えカセット。
  5. 請求項４に記載の組換えカセットであって、前記ＶＬＩＶＳは、ｈＣＭＶ ＩＥ１遺伝子のイントロンＡを含む、組換えカセット。
  6. 請求項４に記載の組換えカセットであって、前記ＶＬＩＶＳは、前記イントロンＡの前記スプライシング供与部位と前記スプライシング受容部位との間に欠失を有するｈＣＭＶ ＩＥ１遺伝子のイントロンＡを含む、組換えカセット。
  7. 請求項６に記載の組換えカセットであって、前記ＶＬＩＶＳは、配列番号１の約ｘ３〜約ｘ４の配列；または配列番号２の約ｘ５〜約ｘ６の配列を含み、ｘ３は配列番号１の第７７０位〜第７８０位のヌクレオチドであり、そしてｘ４は配列番号１の第１３００位〜第１３１０位であり、ｘ５は配列番号２の第７７０位〜第７８０位のヌクレオチドであり、そしてｘ６は配列番号２の第１３００位〜第１３１０位のヌクレオチドである、組換えカセット。
  8. 請求項１に記載の組換えカセットであって、前記関心のあるポリヌクレオチドは、治療因子をコードする、組換えカセット。
  9. 請求項１に記載の組換えカセットであって、前記ポリＡシグナルドメインは、配列番号３のうちの少なくとも１００個の連続したヌクレオチドを含む、組換えカセット。
  10. 請求項９に記載の組換えカセットであって、前記ポリＡシグナルドメインは、配列番号３を含む、組換えカセット。
  11. 請求項１に記載の組換えカセットを含む、組換えベクター。
  12. 請求項１１に記載の組換えベクターであって、前記組換えベクターは、以下
    第二のプロモータ／エンハンサー領域；
    第二の関心のあるポリヌクレオチド；および
    第二のポリＡシグナルドメイン
    をさらに含み、該第二のプロモータ／エンハンサー領域、該第二の関心のあるポリヌクレオチド、および該第二のポリＡシグナルは作動可能に連結されている、組換えベクター。
  13. 請求項１２に記載の組換えベクターであって、前記第二のプロモータ／エンハンサー領域と前記第二の関心のあるポリヌクレオチドとの間に介在ドメインをさらに含む、組換えベクター。
  14. 請求項１１に記載の組換えベクターを含む、宿主細胞。
  15. 請求項１４に記載の宿主細胞であって、前記宿主細胞は、懸濁液中における増殖に対して適応している、宿主細胞。
  16. 請求項１４に記載の宿主細胞であって、前記宿主細胞は、無血清培地中における増殖に対して適応している、宿主細胞。
  17. 請求項１５に記載の宿主細胞であって、前記宿主細胞は、無血清培地中における増殖に対して適応している、宿主細胞。
  18. 請求項１に記載の組換えカセットを含む、宿主細胞。
  19. 請求項１８に記載の宿主細胞であって、前記宿主細胞は、懸濁液中における増殖に対して適応している、宿主細胞。
  20. 請求項１８に記載の宿主細胞であって、前記宿主細胞は、無血清培地中における増殖に対して適応している、宿主細胞。
  21. 請求項１９に記載の宿主細胞であって、前記宿主細胞は、無血清培地中における増殖に対して適応している、宿主細胞。
  22. 組換えシステムであって、該組換えシステムは、以下：
    請求項１に記載の組換えカセット；および
    ＦＲＴ部位を含む宿主細胞
    を含む、組換えシステム。
  23. 請求項２２に記載の組換えシステムであって、前記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である、組換えシステム。
  24. 請求項２３に記載の組換えシステムであって、前記ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞である、組換えシステム。
  25. 請求項２２に記載の組換えシステムであって、前記宿主細胞は、懸濁液中における増殖に対して適応している、組換えシステム。
  26. 請求項２２に記載の組換えシステムであって、前記宿主細胞は、無血清培地中における増殖に対して適応している、組換えシステム。
  27. 請求項２２に記載の組換えシステムであって、前記宿主細胞は、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞由来である、組換えシステム。
  28. 請求項２２に記載の組換えシステムであって、前記宿主細胞は、ｄｈｆｒ−である、組換えシステム。
  29. 請求項１０に記載のベクターおよびＦＲＴ部位を含む宿主細胞を含む、キット。
  30. 請求項２９に記載のキットであって、前記宿主細胞は、ｄｈｆｒ− ＣＨＯ宿主細胞であり、該ｄｈｆｒ− ＣＨＯ宿主細胞のゲノムは、ＦＲＴ部位を含む、キット。
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