KR101099380B1 - 진핵 세포에서의 서열 특이적 ｄｎａ 재조합 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 하나 이상의 재조합 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 DNA를 세포 내로 도입하는 단계, 하나 이상의 추가의 재조합 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 DNA를 세포 내로 도입하는 단계, 및 박테리오파아지 람다 인테그라제 Int에 의해 서열 특이적 재조합을 수행하는 단계를 포함하는, 진핵 세포에서의 DNA의 서열 특이적 재조합 방법에 관한 것이다.

서열 특이적 재조합 방법, attP, attB, attL, attR, 박테리오파아지 람다 인테그라제

Description

진핵 세포에서의 서열 특이적 ＤＮＡ 재조합{Sequence specific DNA recombination in eukaryotic cells}

본 발명은, 하나 이상의 재조합 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 DNA를 세포 내로 도입하는 단계, 하나 이상의 추가의 재조합 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 DNA를 세포 내로 도입하는 단계, 및 박테리오파아지 람다 인테그라제 (integrase) Int에 의한 서열 특이적 재조합을 수행하는 단계를 포함하는, 진핵 세포에서의 DNA의 서열 특이적 재조합 방법에 관한 것이다.

진핵생물 게놈의 조절된 조작 및 에피솜 벡터로 부터의 재조합 단백질의 발현은 살아있는 생물체 내에서 특이적 유전자의 기능(들)을 분석하는데 중요한 방법이다. 더우기, 이러한 조작은 의학 분야의 유전자 치료 방법에서 소정의 역할을 한다. 이러한 맥락에서, 유전자전이된 (transgenic) 동물의 생성, 유전자 또는 유전자 절편의 변화 (소위 "유전자 표적화") 및 외래 DNA의 고등 진핵생물의 게놈 내로의 표적화된 통합이 특히 중요하다. 최근에는, 이러한 기술이 서열 특이적 재조합 시스템의 특성화와 적용을 통하여 개선될 수 있었다.

또한, 목적하는 폴리펩티드/산물을 암호화하고 발현하는, 발현 카세트를 생물공학 관련 숙주 세포의 게놈 내로 서열-특이적으로 통합하는 것이 생물약제의 제조에 있어서 보다 중요하게 되었다. 안정한 형질전환된 세포주에서의 목적하는 폴리펩티드에 대한 발현 수준은 통합의 부위에 따라 달라진다. 서열 특이적 통합에 의해, 높은 전사 활성을 갖는 부위들이 바람직하게 사용될 수 있었다. 목적하는 폴리펩티드/산물을 발현하는 세포주를 생성하는 통상의 방법은, 숙주 세포의 게놈 내로의 재조합 발현 벡터의 무작위 통합을 토대로 한다. 안정한 형질전환된 세포주내에서 통합된 목적하는 유전자(들)의 발현 수준의 변동은 주로 염색체 위치 및 복사체 수의 차이로 인한 것이다. 이질 염색질에 근접한 무작위 통합은 다양한 수준의 전이유전자 (transgene) 발현을 유발한다. 통합된 목적하는 유전자(들)의 발현을 촉진하는 염색체의 위치는 진정 염색질의 전사 활성 영역인 것으로 여겨진다. 이러한 무작위 통합은 재조합 세포의 강건성, 생산성 및 질적 수준을 매우 다양하게 만들어서, 목적하는 폴리펩티드를 고수준으로 발현하는 적당한 세포 클론을 동정하고 분리하는데 정교한 스크리닝 과정을 필요로 한다. 또한, 이질성은, 각 클론에 대해 최적화된 생산 과정을 개발하여야 하므로, 적당한 생산 세포주의 개발이 시간 소모적이고, 노동 집약적이고, 비용이 드는 과정이 된다는 것을 의미한다.

보존적 서열 특이적 DNA 레콤비나제 (recombinase)는 2가지 계열로 분류되었다. 제1 계열 일원인 소위 "인테그라제" 계열은 2개의 규정된 뉴클레오티드 서열 (이는 아래에서 재조합 서열로 명명될 것이다) 간의 DNA 쇄를 절단하고 재결합시키는 것을 촉매한다. 이러한 재조합 서열은 2개의 상이한 DNA 분자 상에 존재하거나, 하나의 DNA 분자상에 존재하여, 각각 분자간 재조합 또는 분자내 재조합을 야기시킬 수 있다. 분자내 재조합의 경우, 반응의 결과는 서로에 대한 재조합 서열의 각각의 배향에 따라 결정된다. 재조합 서열이 역배향, 즉 반대 배향인 경우에는, 이러한 재조합 서열 사이에 놓여진 DNA 절편의 역위가 발생한다. DNA 기질 상의 상기 재조합 서열이 정배향, 즉 직렬 반복체인 경우에는, 결실이 발생한다. 분자간 재조합의 경우, 즉 양 재조합 서열이 2개의 상이한 DNA 분자 상에 위치하는 경우에는, 이러한 2개의 DNA 분자간에 융합이 일어날 수 있다. 인테그라제 계열의 일원이 통상적으로, 분자내 재조합 뿐만 아니라 분자간 재조합 모두를 촉매하지만, 소위 "인버타제 (invertase)/레졸바제 (resolvase)"로 불리우는 제2 계열의 레콤비나제는 분자내 재조합만을 촉매할 수 있다.

현재, 진핵생물 게놈의 조작에 주로 사용되고 있는 레콤비나제는 인테그라제 계열에 속한다. 상기 레콤비나제는 박테리오파아지 Pl의 Cre 레콤비나제 및 효모로부터의 Flp 레콤비나제이다[참조: Muller, U. (1999) Mech. Develop., 82, pp. 3]. Cre 레콤비나제가 결합되는 재조합 서열은 loxP로 명명된다. loxP는 2개의 13bp 길이의 역위 뉴클레오티드 서열과 이러한 역위 서열 사이에 놓여진 8bp 길이의 스페이서로 이루어진 34bp 길이의 뉴클레오티드 서열이다[참조: Hoess, R. et al. (1985) J. Mol. Biol., 181, pp. 351]. FRT로 명명된 Flp에 대한 결합 서열도 유사하게 구축된다. 그러나, 이들은 loxP와는 상이하다[참조: Kilby, J. et al. (1993) Trends Genet., 9, pp. 413]. 따라서, 상기 재조합 서열은 서로 대체될 수 없는데, 즉 Cre는 FRT 서열을 재조합시킬 수 없고, FLP는 loxP 서열을 재조합시킬 수 없다. 양 재조합 시스템은 장거리에 걸쳐 활성인데, 즉 역위되거나 결실되고 2종의 loxP 또는 FRT 서열에 의해 플랭킹될 DNA 절편은 길이가 수만 염기쌍일 수 있다.

예를 들면, 마우스 계통에서의 조직 특이적 재조합, 식물과 동물에서의 염색체 전좌, 및 유전자 발현의 조절된 유도는 상기 2가지 시스템을 이용하여 달성하였다[참조: Muller, U. (1999) Mech. Develop., 82, pp. 3]. DNA 폴리머라제 β는 이러한 방식으로 마우스의 특정 조직에서 결실되었다[참조: Gu, H. et al. (1994) Science, 265, pp. 103]. 추가의 예는 마우스 수정체에서 DNA 종양 바이러스 SV40 종양유전자를 특이적으로 활성화시켜, 이들 조직에서만 종양이 형성되도록 하는 것이다. Cre-loxP 전략은 또한 유도성 프로모터와 연계되어 사용되었다. 예를 들면, 레콤비나제의 발현은 인터페론-유도성 프로모터로 조절하여, 간에서 특이적 유전자를 결실시키고, 다른 조직에서는 전혀 결실시키지 않거나 저수준으로만 특이적 유전자를 결실시켰다[참조: Kuhn, R. et al. (1995) Science, 269, pp. 1427].

지금까지는, 인버타제/레졸바제 계열의 3가지 일원이 진핵생물 게놈의 조작에 사용되어 왔다. 박테리오파아지 Mu 인버타제 Gin의 돌연변이체가 조인자 없이도 식물 원형질체에서 DNA 단편의 역위를 촉매시킬 수 있다. 그러나, 이러한 돌연변이체가 과-재조합성이라는 사실이 밝혀졌는데, 즉 이는 또한 이의 천연 재조합 서열 이외의 서열에서의 DNA 쇄 절단을 촉매시키는 것으로 밝혀졌다. 이로써, 식물 원형질체 게놈에서 의도하지 않은 부분적으로 치명적인 재조합 현상이 일어난다. 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)로부터의 β-레콤비나제는 마우스 세포 배양물에서 정배향 반복체인 두 재조합 서열 사이의 재조합을 촉매하여, 상기 절편의 절단을 유도한다. 그러나, 이러한 결실과 동시에, 역위가 또한 검출되었는데, 이는 진핵생물 게놈을 조작하기 위한 시스템의 조절된 사용을 부적합하게 만든다. 이.콜라이로 부터의 γδ레졸바제의 돌연변이체가 에피솜 및 인공적으로 도입된 게놈 재조합 서열에서 활성인 것으로 밝혀졌지만, 후자의 반응의 효율은 여전히 저조하다.

Cre 및 Flp 레콤비나제 각각을 이용하는 진핵생물 게놈의 조작은 상당한 단점을 나타낸다. 결실의 경우, 즉 게놈 내의 2개의 직렬로 반복된 loxP 또는 FRT 재조합 서열을 재조합하는 경우에는, 이러한 직렬 반복체 사이에 놓여진 DNA 절편이 비가역적으로 결손된다. 따라서, 이러한 DNA 절편 상에 위치한 유전자는 상기 세포와 생물체에 대해 영구적으로 결손될 것이다. 따라서, 예를 들면, 생물체의 후기 발생 단계에서, 유전자 기능의 새로운 분석을 위해 본래 상태를 재작제하는 것이 불가능하다. 결실에 의해 유발된 DNA 절편의 비가역적인 결손은 각각의 DNA 절편을 역위시킴으로써 피할 수 있다. 유전자를 결손시키지 않고서도 역위시킴으로써 유전자를 불활성화시킬 수 있으며, 역 재조합을 통하여 적시에 조절된 레콤비나제 발현에 의해 성체 동물에서 또는 후기 발생 단계에서 상기 유전자를 다시 작동시킬 수 있다. 그러나, 이러한 변형된 방법에 Cre 레콤비나제와 Flp 레콤비나제 둘 다를 사용하는 것은, 상기 재조합 서열이 재조합 현상으로 인해 변화될 수 없을 것이기 때문에, 역위가 조절될 수 없다는 단점을 지니고 있다. 따라서, 표적 세포의 일부, 즉 50% 이하에서만 각각의 DNA 절편의 역위로 인해 각각의 유전자를 불활성화시키는 반복된 재조합 현상이 일어난다. 단일 재조합 후의 추가의 반응에 사용될 수 없는 돌연변이된 loxP 서열을 작제함으로써 적어도 부분적으로 이러한 문제점을 해결하고자 노력하여 왔다. 그러나, 이러한 단점은 상기 반응의 특유한 현상이며, 즉 역위에 의한 유전자의 불활성화 후에 역 재조합에 의한 후속 활성화가 전혀 이루어지지 않는다.

Flp 레콤비나제의 추가의 단점은 이의 37℃에서의 열 안정성 저하인데, 이는 고등 진핵생물, 예를 들면, 체온이 약 39℃인 마우스에서 재조합 반응 효능을 상당히 제한한다. 따라서, 야생형 레콤비나제로서 보다 높은 열 안정성을 나타내는 Flp 돌연변이체를 작제하였다. 그러나, 이들 돌연변이체 Flp 효소도 여전히 Cre 레콤비나제 보다는 낮은 재조합 효율을 나타낸다.

서열 특이적 레콤비나제의 용도는 추가로, 의학 분야, 예를 들면, 상기 레콤비나제가 목적하는 DNA 절편을 안정하고도 조절된 방식으로 각각의 사람 표적 세포의 게놈 내로 통합시키는 유전자 요법에 있다. Cre와 Flp는 둘 다 분자간 재조합을 촉매할 수 있다. 이들 두개의 레콤비나제는 이의 각각의 재조합 서열 복사체를 보유하는 플라스미드 DNA를, 이전에 상동성 재조합을 통하여 진핵생물 게놈 내로 삽입시킨 상응하는 재조합 서열과 재조합시킨다. 그러나, 이러한 반응이 상기 진핵생물 게놈 내의 "천연" 재조합 서열을 포함하는 것이 바람직하다. loxP와 FRT는 길이가 각각 34개와 54개 뉴클레오티드이기 때문에, 상기 게놈의 일부로서의 이러한 재조합 서열의 정확한 일치는 통계적으로 거의 일어나지 않는다. 재조합 서열이 존재하는 경우일지라도, 전술된 역 반응의 단점이 여전히 존재하는데, 즉 Cre 레콤비나제와 Flp 레콤비나제 둘 다가, 분자내 재조합에 의한 성공적인 통합 후 삽입된 DNA 절편을 절단할 수 있다.

따라서, 본 발명의 한 가지 문제는 간단하고도 조절 가능한 재조합 시스템과 이에 요구되는 작업 수단을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가의 문제는 목적하는 DNA 서열의 안정적이고도 표적화된 통합을 수행할 수 있는 재조합 시스템과 이에 요구되는 작업 수단을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가의 문제는 이들 재조합 시스템 중의 하나를 기본으로 하는 개선된 단백질 발현 시스템의 제조를 가능케 하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 문제들은 본원의 청구의 범위에서 특징을 나타내는 대상에 의해 해결된다.

본 발명은 다음 예시와 함께 보다 상세히 설명될 것이다.

도 1은 재조합 반응, 즉 야생형 인테그라제 Int에 의해 촉매된 통합과 절단 과정을 도식적으로 나타낸 것이다. 재조합 서열 attP의 복사체를 보유하는 초나선형 플라스미드 DNA (상단)가 도시되어 있다. AttP는 Int에 대한 5개의 소위 아암 (arm) 결합 부위 (P1, P2, P1', P2', P3'), 2개의 코어 Int 결합 부위 (C 및 C'; 검은색 화살표로 표시됨), IHF에 대한 3개의 결합 부위 (H1, H2, H'), Xis에 대한 2개의 결합 부위 (X1, X2), 및 실제적인 DNA 쇄 교환이 이루어지는 소위 중복 영역 (흰색 사각형)으로 이루어진다. attP에 대한 파트너 서열인 attB가 선형 DNA 절편 아래에 도시되어 있고, 이는 Int에 대한 2개의 코어 결합 부위 (B 및 B'; 흰색 화살표로 표시됨)와 중복 영역으로 이루어진다. attB와 attP간의 재조합을 위해서는, attB를 보유하는 DNA 절편 내로 상기 플라스미드를 통합시키는 Int와 IHF가 필요하다. 이렇게 함으로써, 본 절단을 위한 표적 서열로서 작용하는, 2개의 새로운 하이브리드 재조합 서열 attL과 attR이 형성된다. 이러한 반응에는 야생형으로 존재하는 Int 및 IHF, 및 파아지 람다에 의해 암호화된 추가의 조인자 XIS가 요구된다.

도 2는 분자내 및 분자간 재조합 반응을 보여준다. (A) 분자내 통합 (attB x attP) 재조합. (B) 분자간 통합 (attB x attP) 재조합. (C) 분자내 절단 (attL x attR) 재조합. (D) 분자간 절단 (attL x attR) 재조합. 기질 벡터 및 예상된 재조합 생성물은 각 패널의 상단에 도시되어 있다. GFP-발현 세포의 분획은 기질 및 발현 벡터의 공동-형질감염 후 3회 시점에서 FACS에 의해 측정하였다. 본 발명자는 수직선에 의해 나타난 표준 편차와 함께 3회 분석의 평균 값을 보여준다.

도 3은 att 부위 내의 Int-암(arm)-결합 DNA 서열의 존재가 분자간 재조합을 자극한다는 것을 보여준다. (A) 분자간 재조합에 대한 기질 벡터의 쌍은 상이한 조합으로 attB 또는 attP를 함유하며, CMV 프로모터에 의해 구동되는 GFP를 발현하는 생성물을 수득케한다. (B) 기질 벡터의 각종 조합물은 야생형 Int, 돌연변이체 Int-h, 또는 Int-h/218에 대한 발현 벡터로 공동-형질감염되었다. 48시간 째에, 세포를 FACS로 분석하고, GFP-발현 세포의 비를 두 쌍의 기질에 대하여 측정하였다. attP와 attP 사이의 재조합은 표시된 바와 같이 참조로서 사용되었다. 본 발명자들은 수직선으로 나타낸 표준 편차와 함께 3회 분석의 평균 값을 보여준다. Int에 대한 GFP-발현 세포의 실제 평균 값 (%)은 0.08 (B x B), 1.24 (P x P), 및 0.81 (P x B) 이였다. Int-h에 대한 값은 1.15 (B xB), 8.07 (P x P), 및 9.90 (P x B)이였다. Int-h/218에 대한 값은 4.01 (B x B), 17.62 (P x P), 및 16.45 (P x B)이였다.

도 4는 정제된 IHF 단백질이 야생형 Int에 의한 분자내 및 분자간 통합 재조합을 자극함을 보여준다. (A) 야생형 Int 또는 Int-h를 일시적으로 발현하는 HeLa 세포 속으로 형질감염시키기 전에 IHF의 존재 또는 부재하에서 항온배양한 기질 벡터의 도식도. (B) 형질감염 후 48 시간 째에, GFP-발현 세포의 분획을 FACS에 의해 분석하였다. 이들 분획의 비는 IHF에 의한 재조합의 활성화로서 플로팅되었다. 그래프는 수직선으로 나타낸 표준 편차와 함께 3회 분석의 평균 값을 보여준다. IHF의 존재 및 부재하에 GFP-발현 세포의 실제 평균 값 (%)는 각각 분자내 재조합의 경우에 Int의 경우 (7.93/1.26)이고, Int-h의 경우 (17.57/13.14)이고, 분자내 재조합 분석에서 Int의 경우 13.94/3.47이고 Int-h의 경우 20.33/16.83이였다.

도 5는 CHO-DG44 세포에서의 서열 특이적 DNA 재조합을 위한 예시적인 발현 벡터 디자인을 개략적으로 보여준다. "P/E"는 인핸서와 프로모터 요소 즉 "P" 프로모터 요소 및 "T" 전사된 전령 RNA의 폴리아데닐화에 요구되는 전사 종결 부위를 둘다 함유하는 혼성 단위를 의미한다. "GOI"는 목적하는 유전자를 말하고, "dhfr"는 증폭가능한 선별 마커 디하이드로폴레이트 리덕타제를 말하고, "FP"는 ZsGreen과 같은 형광성 단백질을 말하고, "npt"는 선별 마커 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 말한다. 화살표는 전사 단위 내의 전사 개시 부위를 가리킨다. 제1 DNA 상에 위치한 재조합 부위 attP 또는 attB와 제2 DNA 상에 위치한 재조합 부위 attP 또는 attB 사이의 서열 특이적 재조합이 십자로 표시되었고 박테리오파아지 람다 인테그라제에 의해 매개된다. "att"는 제1 및 제2 DNA 상에 각각 위치한 attP와 attP, attP와 attB, attB와 attP, 또는 attB와 attB 사이의 예시적으로 도시된 재조합으로 부터 생성된 부착 부위를 말한다.

본원에 사용된 "형질전환" 또는 "형질전환시키는", 및 "형질감염" 또는 "형질감염시키는"이란 용어는 세포 내로 핵산 서열을 도입하여, 유전자 변형된 재조합, 형질전환된 또는 유전자전이된 세포를 생성하는 것을 모두 의미한다. 이러한 도입은 문헌[Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York or Ausubel, F.M. et al. (1994 updated) Current Protocols in Molecular Biology, New York: Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience]에 기술되고 당업계에 익히 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 방법에는 리포펙션 (lipofection), 전기천공, 다가양이온 (예: DEAE-덱스트란)-매개된 형질감염, 원형질 융합, 바이러스 감염 및 미세주사가 포함되나 이에 한정되지 않으며, 칼슘 방법, 전기쇽 방법, 정맥내/근육내 주사, 에어로졸 흡입 또는 난모세포 주사에 의해 수행될 수 있다. 형질전환은 숙주 세포의 일시적 또는 안정한 형질전환을 일으킬 수 있다. "형질전환" 또는 "형질전환시키는"이란 용어는 또한, 바이러스 핵산 서열을, 각각의 바이러스에 대해 천연 상태 방식으로 도입하는 것을 의미한다. 이러한 바이러스 핵산 서열은 나출형 핵산 서열로서 존재할 필요는 없으나, 바이러스 단백질 외피에 팩키징될 수 있다. 따라서, 상기 용어는 "형질전환" 또는 "형질전환시키는"이란 용어하에 통상적으로 공지된 방법에 관한 것이다. 최적의 형질감염 빈도 및 도입된 핵산의 발현을 제공하는 형질감염이 선호된다. 적합한 방법은 통상의 절차에 의해 결정될 수 있다. 안정한 형질감염체의 경우에, 작제물을 숙주 세포 게놈 또는 인공 염색체/미니-염색체 속에 통합시키거나, 또는 에피솜에 위치시켜, 숙주 세포 내에서 안정하게 유지시킨다.

본원에서 사용된 "재조합 서열"이란 용어는 attB, attP, attL 및 attR 서열 및 이의 유도체에 관한 것이다. attB 서열에 대한 예는 서열번호 13에 제시되어있고, attP 서열에 대한 예는 서열번호 14에 제시되어있고, attL 서열에 대한 예는 서열번호 15에 제시되어있고, attR 서열에 대한 예는 서열번호 16에 제시되어있다.

본원에서 사용된 "유도체"란 용어는, 천연적으로 존재하는 attB, attP, attL 및 attR 서열과는 달리, 중첩 영역 및/또는 코어 영역 내에 하나 이상의 치환, 바람직하게는 7개, 보다 바람직하게는 2, 3, 4, 5 또는 6개를 갖는 attB, attP, attL 및 attR 서열에 관한 것이다. 또한, "유도체"란 용어는 attB, attP, attL 또는 attR의 하나 이상의 코어 Int 결합 부위에 관한 것이다. 또한, "유도체"란 용어는, attP, attL 또는 attR의 하나 이상의 코어 Int 결합 부위, 및 Int에 대한 아암-결합 부위의 하나 이상의 복사체를 의미한다. 또한, "유도체"란 용어는 attP, attL 또는 attR의 하나 이상의 코어 Int 결합 부위, 및 IHF, FIS 또는 XIS 인자 결합 부위의 하나 이상의 복사체에 관한 것이다. "유도체"란 용어는 또한 이들 특징의 조합에 관한 것이다. 게다가, "유도체"란 용어는 상기의 모든 기능성 단편, 및 서열-특이적 재조합을 지지하는 진핵 세포 내에서의 내인성 뉴클레오티드, 예를 들면 사람 게놈에서 동정된 attH에 관한 것이다[참조문헌: WO 01/15345). "유도체"란 용어는 일반적으로 본 발명의 의도된 용도를 실현시키는데 적합한 attB, attP, attL 또는 attR 서열을 포함하는데, 이는 상기 서열이 서열-특이적 재조합 현상을 박테리오파아지 람다의 인테그라제 (야생형 또는 변형됨)에 의해 유도되는 서열 특이적 재조합을 매개한다는 것을 의미한다.

"기능성 단편"이란 용어는 치환, 결실, 및/또는 삽입 (야생형 또는 변형된 단백질 결합 부위를 포함)을 가진 attB, attP, attL 및 attR 서열을 말하며, 이는 박테리오파아지 람다의 야생형 또는 변형된 인테그라제에 의해 유도되는 재조합 현상에서 상기 서열의 용도에 현저한 영향을 주지 않는다. 기능성은, 동일한 조건 (예: 시험관내 또는 생체내 사용, 동일한 숙주 세포 유형, 동일한 형질감염 조건, 동일한 숙주 인자의 존재 또는 부재, 동일한 완충제 조건, 동일한 온도 등)하에 동일한 레콤비나제를 사용하는 경우, 상응하는 천연의 재조합 서열과 비교하여, 재조합 빈도가 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 100% 이상이다. 달리, attB, attP, attL 및/또는 attR 서열에서의 치환, 결실, 및/또는 삽입은, 박테리오파아지 람다의 야생형 또는 변형된 인테그라제에 의해 유도된 재조합 현상을 적어도 증강시키며, 이때, 이러한 증강은, 동일한 조건 (상기 참조)하에서 동일한 레콤비나제를 사용하는 상응하는 천연의 재조합 서열에 비해, 예를 들어 (i) 재조합 현상 (통합 및/또는 절단)의 효율의 증가, (ii) 재조합 특이성의 증가, (iii) 절단 재조합 현상의 선호, (iv) 통합 재조합 현상의 선호, (v) 숙주 인자에 일부 또는 전부에 대한 요구에 대한 완화로 이루어질 수 있다.

변형된 재조합 부위 또는 변형된 인테그라제의 기능성은, 목적하는 특징에 의존하며 당업계에 공지된 다양한 방법으로 입증될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 기술된 공동-형질감염 분석 (WO 01/16345의 결과 5.1 또는 실시예 3 참조)을 사용하여, 다양한 세포주에서 염색체외 DNA의 인테그라제-매개된 재조합의 특성을 규명할 수 있다. 요약하면, 세포를 인테그라제 단백질을 암호화하는 발현 벡터, 및 기능성/비-기능성 레포터 유전자 (예: GFP와 같은 형광성 단백질)을 암호화하고 그 속에 하나 이상의 재조합 서열을 함유하는, 레콤비나제의 기질인 기질 벡터로 공동-형질감염시킨다. 발현 벡터에 의한 인테그라제의 발현시, 레포터 유전자의 기능이 비-기능적/기능적으로 될 것이다. 따라서, 재조합 활성은, 재조합된 기질 벡터를 회수하고, (예를 들어, PCR, 재조합된 영역의 서열 분석, 제한 효소 분석, 서던 블롯 분석을 수행하여) DNA 수준에서 재조합의 증거를 찾아내거나, 또는 (예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯팅, 방사선면역분석, 면역침전, 면역염색, 형광성 단백질의 FACS-분석에 의해) 단백질 수준에서 재조합의 증거를 찾아내는 방법으로 분석될 수 있다.

본원에서 사용된 "중첩 영역"이란 용어는, DNA 쇄 절단 및 재결합을 포함하는 DNA 쇄 교환이 일어나는 재조합 서열의 서열로 정의되며, 야생형 att 부위의 컨센서스 DNA 서열 5'-TTTATAC-3' 또는 기능성 뉴클레오티드 치환을 갖는 상기 서열에 관한 것이다. 유일한 예비조건은 중첩 영역의 서열이 재조합 파트너 서열 간에 동일하다는 것이다.

"코어 결합 부위"란 용어는, 야생형 att 부위의 각 세트에서, 중첩 영역에 의해 분리되어 있는, 역위된 배향의 불완전하게 반복된 두 개의 복사체에 관한 것이다. 코어 결합 부위는 저 친화성에서 인테그라제를 결합시킴으로써 이루어진 재조합에 필수적이다. 각각의 코어 결합 부위는 9개의 연속 염기쌍으로 이루어지며, 야생형 att 부위 내의 뉴클레오티드 서열 5'-CTGCTTTTT-3'의 B-서열, 뉴클레오티드 서열 5'-CAAGTTAGT-3'의 B'-서열 (역 상보적 쇄), 뉴클레오티드 서열 5'-CAGCTTTTT-3'의 C-서열, 및 뉴클레오티드 서열 5'-CAACTTAGT-3'의 C'-서열 (역 상보적 쇄)로 이루어진 DNA 서열, 또는 기능적 뉴클레오티드 치환을 갖는 상기 서열에 관한 것이다.

본원에서 사용된 "Int에 대한 "암(arm)-결합 부위" 또는 "암-결합 부위"란 용어는 컨센서스 서열 5'-C/AAGTCACTAT-3' 또는 기능적 뉴클레오티드 치환을 갖는 상기 서열에 관한 것이다. Int에 대한 암-결합 부위는 코어 Int 결합 부위(들)의 상류 및/또는 하류에 다양한 거리로 위치할 수 있다.

재조합 서열, 암-결합 부위 및 숙주 인자 결합 부위와 관련하여 본원에서 사용된 "상동체" 또는 "상동성" 또는 "유사한"이란 용어는, 천연 재조합 서열, 암-결합 부위 및 숙주 인자 결합 부위와 약 70%, 바람직하게는 약 80%, 보다 바람직하게는 약 85%, 한층 더 바람직하게는 약 90%, 더 더욱 바람직하게는 약 95%, 가장 바람직하게는 약 99%가 동일한 핵산 서열에 관한 것이다. NCBI의 유사성 알고리즘 BLAST [Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al., Journal of Molecular Biology 215,403-410 (1990)]에서 표준 파라미터를 사용하는 경우에, 재조합 서열과 비교시 P < 10^-5의 확률을 나타내는 서열은 상동성 또는 유사한 것으로 간주된다.

본원에서 사용된 "벡터"란 용어는 세포 내에서 핵산의 흡수, 증식, 발현 또는 전달을 위한 천연 또는 합성의 작제물, 예를 들면, 플라스미드, 파아지미드, 코스미드, 인공 염색체/미니-염색체, 박테리오파아지, 바이러스 또는 레트로바이러스에 관한 것이다. 벡터를 작제하는데 사용된 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있고, 각종 문헌에 기술되어있다. 특히, 기능성 및 조절성 성분, 예를 들면 프로모터, 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 시그날, 선별 마커, 복제원, 및 스플라이싱 시그날의 설명을 포함하여, 적당하 벡터를 작제하는 기법이 문헌[참조: Sambrook, J. et al. (1989), supra] 및 당해 문헌에서 인용된 참조 문헌에 상세히 검토되고 있다. 진핵생물 발현 벡터는 전형적으로 세균 내에서 벡터의 증식을 용이하게 하는 원핵생물 서열, 예를 들면 복제원, 및 세균에서의 선별을 위한 항생물질 내성 유전자를 함유할 것이다. 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 클로닝 부위를 함유하는 각종 진핵생물 발현 벡터가 당업계에 익히 공지되어 있으며, 일부는 제조회사[Stratagene, La Jolla, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA; Promega, Madison,WI or BD Biosciences Clontech, Palo Alto,CA.]에서 시판되고 있다.

본원에서 사용된 "대상 유전자", "목적하는 서열" 또는 "목적하는 유전자"는 동일한 의미를 가지며, 목적하는 생성물을 암호화하는 임의의 길이의 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 선택된 서열은 전체 길이의 또는 절두된 (truncated) 유전자, 융합 또는 태그된 (tagged) 유전자 일수 있으며, cDNA, 게놈 DNA, 또는 DNA 단편, 바람직하게는 cDNA일 수 있다. 이는 천연 서열, 즉 천연으로 존재하는 형태(들)이거나, 또는 원하는 대로 돌연변이되거나 또는 달리 변형될 수 있다.

이들 변형은 선택된 숙주 세포에서의 코돈 사용을 최적화하는 코돈 최적화, 사람화 또는 태깅 (tagging)을 포함한다. 선택된 서열은 분비 폴리펩티드, 세포질 폴리펩티드, 핵 폴리펩티드, 막-결합된 폴리펩티드 또는 세포 표면 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. "목적하는 생성물"은, 선택된 숙주 세포 내에서 모두 발현될 수 있는, 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 단편, 펩티드, 안티센스 RNA를 포함한다.

본원에서 사용된 "핵산 서열", "뉴클레오티드 서열", 또는 "DNA 서열"이란 용어는 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 및 이의 단편 및 부분, 및 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있고 센스 또는 안티센스 쇄를 나타내는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 말한다. 당해 서열은 비-암호화 서열, 암호화 서열 또는 이 둘의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 코돈이 이의 동일한 코돈으로 대체되어진 핵산 영역을 포함한다.

본 발명의 핵산 서열은 당업자에게 익히 공지된 표준 기법을 사용하여 제조될 수 있다. "암호화하는" 또는 "암호화"란 용어는, 염색체 중의 유전자 또는 mRNA와 같은 핵산 내의 특정 뉴클레오티드 서열이 생물학적 과정에서 한정된 서열의 뉴클레오티드 (즉, rRNA, tRNA, 기타 RNA 분자) 또는 아미노산을 갖는 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는 고유의 특성 및 이로 부터 발생된 생물학적 특성을 말한다. 따라서, 유전자에 의해 생성된 mRNA의 전사 및 해독이 세포 또는 다른 생물학적 계에서 단백질을 생성하는 경우에, 그 유전자는 단백질을 암호화한다. 암호화 쇄 (이의 뉴클레오티드 서열은 mRNA 서열과 동일하고 통상적으로 서열 목록에 제공된다), 및 비-암호화 쇄 (유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용됨)은 둘다 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 기타 생성물을 암호화한다고 말할 수 있다. 단백질을 암호화하는 핵산은 상이한 뉴클레오티드 서열을 가지나, 유전자 코드의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해 단백질의 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 핵산을 포함한다. 단백질을 암호화하는 핵산 및 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.

"폴리펩티드"란 용어는 아미노산 잔기 서열 또는 단백질과 상호교환적으로 사용되며, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 말한다. 이들 용어는 또한 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 또는 단백질 프로세싱 등을 포함하는 반응을 통하여 해독후 변형되어진 단백질을 포함한다. 변형 및 변화, 예를 들면 다른 단백질과의 융합, 아미노산 서열 치환, 결실 또는 삽입이 폴리펩티드의 구조 내에 생길 수 있으며, 이때 당해 분자는 이의 생물학적 기능 활성을 유지한다. 예를 들면, 특정 아미노산 서열 치환이 폴리펩티드 또는 이의 내재적 핵산 암호 서열에 생길 수 있으며, 유사한 특성을 가진 단백질이 수득될 수 있다. 아미노산 변형은 예를 들면 이의 내재적인 핵산 서열에 대한 부위-특이적 돌연변이유발 또는 폴리머라제 연쇄 반응-매개된 돌연변이유발을 수행함으로써 제조될 수 있다.

본원에서 사용된 "발현"이란 용어는 숙주 세포 내에서 이종성 핵산의 전사 및/또는 해독을 말한다. 숙주 세포내에서 목적하는 생성물의 발현 수준은, 당해 세포 내에 존재하는 상응하는 mRNA의 양, 또는 선택된 서열에 의해 암호화된 목적하는 폴리펩티드의 양을 기초로 하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 선택된 서열로 부터 전사된 mRNA는 노던 블롯 하이브리드화, 리보뉴클리아제 RNA 보호, 세포 RNA에 대한 원위치 (in situ) 하이브리드화 또는 PCR [참조 문헌: Sambrook, J. et al. (1989), supra ; Ausubel, F. M. et al. (1994 updated), supra]에 의해 정량화될 수 있다. 선택된 서열에 의해 암호화된 단백질은 각종 방법, 예를 들면 ELISA, 웨스턴 블롯팅, 방사선면역분석, 면역침전, 단백질의 생물학적 활성에 대한 분석, 또는 단백질의 면역염색 후의 FACS 분석 PCR [참조 문헌: Sambrook, J. et al. (1989), supra ; Ausubel, F. M. et al. (1994 updated), supra]에 의해 정량화될 수 있다.

"발현 카세트"는 전사될 하나 이상의 유전자를 함유하며, 이때 절편내에 함유된 당해 유전자는 서로 작동가능하게 연결되어 단일 프로모터로 부터 전사되고, 결과적으로 상이한 유전자가 적어도 전사단계에서 연결되는, 작제물 내의 영역으로 정의된다. 하나 이상의 단백질 또는 생성물은 각 전사 단위로 부터 전사되고 발현될 수 있다. 각각의 전사 단위는, 단위 내에 함유된 임의의 선택된 서열의 전사 및 해독에 필요한 조절 요소를 포함할 것이다.

"작동가능하게 연결된"이란 용어는 2개 이상의 핵산 서열 또는 서열 요소가 이들이 의도된 바대로 작용할 수 있도록 위치된다. 예를 들면, 프로모터 및/또는 인핸서는, 이들이 시스 (cis) 방식으로 작용하여 연결된 서열의 전사를 제어하거나 조절하는 경우에, 암호 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 반드시 그런 것은 아니나, 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 연속적이며, 경우에 따라 두 개의 단백질 암호 영역을 연결하거나, 또는 분비 리더의 경우에 연속적이고 판독 프레임을 유지한다.

"선별 마커 유전자"란 용어는, 당해 유전자를 보유하는 세포만이 상응하는 선별 시약의 존재하에서 이에 의해 특이적으로 선별될 수 있도록 하는 유전자를 말한다. 예시의 방법으로, 항생물질 내성 유전자가, 당해 유전자로 형질전환되어진 숙주 세포가 상응하는 항생물질의 존재하에서 양성적으로 선별될 수 있도록 하는 양성 선별 마커 유전자로서 사용될 수 있으며; 비-형질전환된 숙주 세포는 선별 배양 조건하에서 성장 또는 생존할 수 없을 것이다. 선별 마커는 양성, 음성, 또는 이중기능성일 수 있다. 양성 선별 마커는, 약물에 대한 내성, 또는 숙주 세포에서의 대사 또는 이화 결손에 대한 보충을 제공하는 방식으로 마커를 보유하는 세포의 선별을 가능케 한다. 대조적으로, 음성 선별 마커는 당해 마커를 보유하는 세포가 선별적으로 제거되도록 한다. 예를 들면, HSV-tk 유전자를 마커로서 사용하는 경우에, 세포가 아시클로비르 (acyclovir) 및 간사이클로비르 (gancyclovir)와 같은 시약에 대해 민감해 질 것이다. 본원에서 사용된, 증식가능 선별 유전자를 포함하는 선별 마커 유전자는, 암호화된 생성물이 선별 특성을 보유하는 한, 재조합으로 조작된 돌연변이체 및 변이체, 천연 선별 유전자의 단편, 기능적 등가물, 유도체, 동족체 및 융합물을 포함할 것이다. 유용한 유도체는 일반적으로, 선별 특성과 관련된 선별 마커의 영역 또는 도메인에서 실질적인 서열 유사성 (아미노산 수준)을 가진다. 이중기능성 (즉, 양성/음성) 마커 (참조: WO 92/08796 및 WO 94/28143; 본원에 참조로서 인용)를 포함한 각종 마커 유전자가 기술되어있다. 예를 들면, 진핵 세포와 통상적으로 사용되는 선별 마커는 포름아미노글리코시드 포스트랜스퍼라제 (APH), 하이드로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HYG), 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 티미딘 키나제 (TK), 글루타민 신테타제, 및 아스파라긴 신테타제에 대한 유전자, 및 네오마이신 (G418), 푸로마이신, 히스티디놀 D, 벨로마이신 및 플레오마이신에 대한 내성을 암호화하는 유전자를 포함한다.

선별은 또한, 예를 들면 세포 표면 마커, 세균 P-갈락토시다제 또는 형광성 단백질 (예: 녹색 형광 단백질 (GFP)) 및 애쿠오레아 빅토리아 (Aequorea victoria) 및 레닐라 레니포르미스 (Renilla renformis) 또는 가타 종으로 부터의 이의 변이체; 적색 형광성 단백질, 형광 단백질, 및 비-생물발광성 종{예: 디스코스마 종 (Discosoma sp.), 아네모니아 종 (Anemonia sp.), 클라불라리아 종 (Clavularia sp.) , 조안틀스 종 (Zoanthlls sp.)}으로 부터의 이들의 변이체를 사용하여, 형광성 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 재조합 세포를 선별함으로써 이루어질 수 있다.

"선별제"란 용어는 특정 선별 유전자가 결핍된 숙주 세포의 성장 또는 생존에 관여하는 물질을 말한다. 예를 들면, 형질감염된 세포에서 APH (아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제)와 같은 항생물질 내성 유전자의 존재에 대해 선별하기 위하여, 항생물질 게네티신 (G418)을 사용한다.

박테리오파아지 람다의 인테그라제 (본원에서 통상적으로 "Int"로 명명됨)는 Cre 및 Flp와 같이, 서열 특이적 보존적 DNA 레콤비나제의 인테그라제 계열에 속한다. 이의 본래의 기능으로, Int는 2개의 상이한 재조합 서열, 즉 attB와 attP간의 통합성 재조합을 촉매한다. attB는 21개 뉴클레오티드를 포함하고, 최초로 이. 콜라이 게놈으로부터 분리하였다[참조: Mizuuchi, M. and Mizuuchi, K. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 3220]. 또 다른 한편, 243개 뉴클레오티드를 갖는 attP는 훨씬 더 길고, 박테리오파아지 람다의 게놈에서 천연적으로 존재한다[참조: Landy, A. and Ross, W. (1977) Science, 197, pp. 1147]. Int 레콤비나제는 attP 중의 전체 7개의 결합 부위와 attB에서의 2개의 결합 부위를 가진다. Int의 생물학적 기능은 환상 파아지 게놈을 이. 콜라이 염색체 상의 유전자좌 attB 내로 서열 특이적 통합시키는 것이다. Int는 이러한 통합성 재조합을 위한 단백질 조인자, 소위 통합 숙주 인자 (integration host factor) (본원에서 통상적으로 "IHF"로 명명됨)를 필요로 한다[참조: Kikuchi, Y. and Nash, H. (1978) J. Biol. Chem., 253, 7149]. IHF는 attP와의 기능적 재조합 복합체의 어셈블리에 필요하다. 통합 반응에 대한 제2 조인자는 attP의 DNA 음성 초나선화이다. 최종적으로, attB와 attP간의 재조합으로 인해, 2개의 새로운 재조합 서열, 즉 attL과 attR이 형성되는데, 이는 추가의 재조합 반응인 절단 반응에 대한 기질 및 인식 서열로서 작용한다. 박테리오파아지 람다 통합에 관한 포괄적인 요약이 문헌[참조예: Landy, A. (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, pp. 913]에 제공되어 있다.

세균 게놈으로부터의 파아지 게놈의 절단은 또한 Int 레콤비나제에 의해 촉매된다. 이를 위해, 박테리오파아지 람다로부터 암호화되는, Int 및 IHF 이외에, 추가의 조인자가 필요하다. 이는 attR에서 2개의 결합 부위를 갖는 엑시지오나제 (excisionase) (본원에서 통상적으로 "XIS"로서 명명됨)이다[참조: Gottesman, M. and Weisberg, R. (1971) The Bacteriophage Lambda, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 113]. 통합성 재조합과는 대조적으로, 재조합 서열의 DNA 음성 초나선화가 절단성 재조합에는 필수적인 것은 아니다. 그러나, DNA 음성 초나선화는 재조합 반응의 효율을 증대시킨다. 절단 반응의 효율을 추가로 개선시키는 것은 XIS와 연계하여 작용하는 제2 조인자, 즉 FIS (역위 자극을 위한 인자: factor for inversion stimulation)를 사용하여 달성할 수 있다[참조: Landy, A. (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, pp. 913]. 이러한 절단은 유전적으로 통합의 정확한 역반응인데, 즉 attB 및 attP가 다시 생성된다. 박테리오파아지 람다 절단에 관한 포괄적인 요약이 문헌[참조예: Landy, A. (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, pp. 913]에 제공되어 있다.

본 발명의 일 양상은,

a) 제1 attB, attP, attL 또는 attR 서열 또는 이의 유도체를 세포 내로 도입하는 단계,

b) 제2 attB, attP, attL 또는 attR 서열 또는 이의 유도체를 세포 내로 도입하는 단계 [이때, 상기 제1 DNA 서열이 attB 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 경우에 상기 제2 서열은 attB, attL 또는 attR 서열 또는 이의 유도체를 포함하거나, 또는 제1 DNA 서열이 attP 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 경우에 상기 제2 서열은 attP, attL 또는 attR 서열 또는 이의 유도체를 포함하거나, 또는 상기 제1 DNA 서열이 attL 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 경우에 상기 제2 서열은 attB, attP 또는 attL 서열 또는 이의 유도체를 포함하거나, 또는 상기 제1 DNA 서열이 attR 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 경우에 상기 제2 서열은 attB, attP 또는 attR 서열 또는 이의 유도체를 포함한다], 및

c) 박테리오파아지 람다 인테그라제 Int에 의한 서열 특이적 재조합을 수행하는 단계를 포함하는, 진핵 세포에서의 DNA의 서열 특이적 재조합 방법에 관한 것 이다.

단계 c)에서, 서열-특이적 재조합이 Int에 의해, 또는 Int 및 XIS, FIS, 및/또는 IHF에 의해 수행되는 방법이 바람직하다. 단계 c)에서 서열-특이적 재조합이 Int에 의해 또는 Int 및 XIS 인자에 의해, 또는 Int 및 IHF에 의해, 또는 Int 및 XIS 및 IHF에 의해 수행되는 방법이 가장 바람직하다. 또한, 단계 c)에서 서열-특이적 재조합이 변형된 Int, 바람직하게는 Int-h 또는 Int-h/218에 의해 수행되는 방법이 바람직하다. 이와 관련하여, XIS, FIS 및/또는 IHF와 함께 변형된 Int를 사용하는 것도 또한 본 발명의 범위 내이다.

본 발명의 보다 바람직한 태양에서, 진핵 세포에서의 DNA의 서열-특이적 재조합은 동일하거나 거의 동일한 재조합 부위 사이에서 수행될 것이다. 따라서, 본 발명은, 제1 DNA 서열이 attB 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 때에 제2 서열이 attB 서열 또는 이의 유도체를 포함하거나, 또는 제1 DNA 서열이 attP 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 때에 제2 서열이 attP 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 경우, 또는 제1 DNA 서열이 attL 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 때에 제2 서열이 attL 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 경우, 또는 제1 DNA 서열이 attR 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 때에 제2 서열이 attR 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 경우인 상기와 같은 서열 특이적 재조합의 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 천연의 attB, attP, attL, 및/또는 attR 서열 뿐만 아니라, 변형된, 예를 들어 치환된 attB, attP, attL, 및/또는 attR 서열을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, attP와 attB 상동 서열 사이에서의 박테리오파아지 람다 및 이. 콜라이의 통합성 재조합 (야생형 서열의 돌연변이체)이 attB에 하나 이상의 치환을 갖는다는 것이 관찰되었다[참조 문헌: Nash, H. (1981) Annu. Rev. Genet., 15, pp. 143; Nussinov, R. and Weisberg, R. (1986) J. Biomol. Struct. Dynamics, 3, pp 1134) 및/또는 in attP (Nash, H. (1981) Annu. Rev. Genet. , 15, pp. 143].

따라서, 본 발명은, 사용된 attB, attP, attL, 및/또는 attR 서열이, 천연의 attB, attP, attL, 및/또는 attR 서열에 비해, 하나 이상의 치환을 갖는 방법에 관한 것이다. attB, attP, attL, 및/또는 attR 서열이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의 치환을 갖는 방법이 바람직하다. 치환은 중첩 영역 및 코어 영역 둘 모두에서 일어날 수 있다. 7개의 뉴클레오티드를 포함하는 완전한 중첩 영역이 또한 치환될 수 있다. 치환이 코어 영역 또는 중첩 영역의 attB, attP, attL, 및/또는 attR 서열에 도입되는 방법이 보다 바람직하다. 중첩 영역에서의 치환의 도입과 동시에 코어 영역에서의 1 또는 2개의 치환의 도입이 바람직하다. 또한, 본 발명은, 사용된 attB, attP, attL, 및/또는 attR 서열이, 천연의 attB, attP, attL, 및/또는 attR 서열에 비해, 상기 재조합 부위의 유도체 (이의 기능성 단편 포함)인 방법에 관한 것이다.

재조합 서열 내로의 하나 이상의 치환(들) 형태의 변형이, 재조합이 변형(들)에도 불구하고 수행될 수 있도록 선택된다. 이러한 치환의 예는 문헌[참조: Nash, H. (1981), supra and Nussinov, R. and Weisberg, R. (1986), supra]에 기재되어 있으며, 이에 제한되는 것으로 생각되지 않는다. 또 다른 변형이 예를 들어 돌연변이유발 방법[다수의 이들 방법은 문헌 (Ausubel, F. M. et al. (1994 updated), supra)에 기재되어있다]에 의해 용이하게 도입될 수 있고, 예를 들어 본 발명의 실시예 (실시예 1 및 2, 결과 5.1)에 기술된 시험 재조합에 의해 이들의 용도에 대해 시험될 수 있다.

게다가, 본 발명은, 사용된 attB, attP, attL, 및/또는 attR 서열이 각각의 코어 Int 결합 부위 중의 하나만을 포함하는 방법에 관한 것이지만, 2 이상의 코어 Int 결합 부위도 또한 바람직하다. 바람직한 태양에서, 본 발명은 사용된 attB, attP, attL, 및/또는 attR 서열이 각각의 코어 Int 결합 부위 중의 하나만으로 이루어진 방법에 관한 것이다. 또 다른 태양에서, 사용된 attB, attP, attL, 및/또는 attR 서열은 2 이상의 코어 Int 결합 부위로 이루어진다.

추가로, 본 발명은 사용된 attP, attL, 및/또는 attR 서열이, 코어 Int 결합 부위 이외에, 하나 이상, 바람직하게는 2, 3, 4, 5 또는 5 이상의 Int에 대한 암(arm)-결합 부위의 복사체를 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 결합 부위는 서열 5'-C/AAGTCACTAT-3' (서열번호 1)을 갖는 컨센서스 모티브, 또는 뉴클레오티드 치환을 가지며 Int 결합에 관하여 기능성인 이의 변형된 서열을 포함한다. Int에 대한 암-결합 부위(들)은 코어 Int 결합 부위(들)의 상류 및/또는 하류의 다양한 거리에 위치할 수 있다.

본 발명의 방법을 수행하기 위하여, 제1 재조합 서열은, 예를 들면 진핵 세포의 게놈 또는 인공염색체/미니염색체 내의 목적하는 표적 유전자좌로의 통합을 가능케하는 추가의 DNA 서열을 포함한다. 이러한 재조합은 예를 들면 세포 내부 재조합 기전에 의해 매개되는 상동성 재조합을 통해 일어날 수 있다. 상기 재조합의 경우에, 추가의 DNA 서열은 표적 유전자좌의 DNA에 대해 상동성이어야 하며, attB, attL, attP, 또는 attR 서열 또는 이의 유도체의 3' 및 5' 둘다에 각각 위치한다. 당업자는 상동성의 정도가 얼마나 크고, 각각의 3' 및 5' 서열이 얼마나 길어야 상동성 재조합이 충분한 가능성으로 일어나는지 알고있다[참조 문헌: Capecchi, M. (1989) Science, 244, pp. 1288].

그러나, 기타 임의의 기전에 의해, 예를 들어 무작위 통합 (이 또한 내부 세포 재조합 현상에 의해 매개된다)을 통하여, 제1 재조합 서열을 진핵생물의 게놈 또는 인공염색체/미니염색체 속으로 통합시킬 수 있다. 통합되는 것과는 상이한 부위를 사용하여, 예를 들어 loxP/FRT 서열을 사용하여, 서열-특이적 재조합을 통해 상기 제1 재조합 부위를 통합키는 것이 또한 고려된다.

또한, 제2 재조합 서열은 상동성 재조합을 통해 목적하는 표적 유전자좌로 통합시키는 데 필요한 DNA 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법의 경우에, 제1 및/또는 제2 재조합 서열은 둘다 추가의 DNA 서열을 포함할 수 있다. 두 DNA 서열이 추가의 DNA 서열을 포함하는 방법이 바람직하다.

추가의 DNA 서열을 포함하거나 포함하지 않는 제1 및 제2 재조합 서열의 도입은, 재조합 서열이 2개의 상이한 DNA 분자에 존재하는 경우에 연속적으로 및 공동-형질전환 모두로 수행될 수 있다. 추가의 DNA 서열을 포함하거나 포함하지 않는 제1 및 제2 재조합 서열이 단일 DNA 분자에 존재하고 진핵 세포로 도입되는 방법이 바람직하다. 또한, 제1 재조합 서열은 세포로 도입될 수 있고, 제2 재조합 서열이 또 다른 세포로 도입될 수 있고, 이때 당해 세포는 추후에 융합된다. 융합이란 용어는 생물체의 교배 뿐만 아니라 가장 넓은 의미에서 세포 융합을 의미한다.

본 발명의 방법을 사용하여, 예를 들어 분자내 재조합에서 역배향된 재조합 서열 사이에 놓여있는 DNA 절편을 역위시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 방법을 사용하여 분자내 재조합에서 정배향된 재조합 서열 사이에 놓여있는 DNA 절편을 결실시킬 수 있다. 재조합 서열이 각각 5'-3' 또는 3'-5' 배향으로 도입되는 경우에, 이들은 정배향으로 존재한다. 예를 들어 attB 서열이 5'-3' 배향으로 통합되고 attP 서열이 3'-5' 배향으로 통합되는 경우에 재조합 서열은 역배향으로 존재한다. 재조합 서열이 예를 들어 상동성 재조합을 통해 엑손의 5' 및 3' 인트론 서열로 각각 도입되고 재조합이 인테그라제에 의해 수행되는 경우에, 당해 엑손은 각각, 역배향된 재조합 서열에서는 역위될 것이고, 정배향된 재조합 서열에서는 결실될 것이다. 이러한 방법에 의해, 각각의 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드를 이의 활성 또는 기능을 상실할 수 있거나, 전사가 역위 또는 결실에 의해 중단되어 전사체가 전혀 생성되지 않을 수 있다. 이러한 경우에, 예를 들어 암호화된 폴리펩티드의 생물학적 기능이 연구될 수 있다. 더구나, 역위 또는 결실 반응을 사용하여, 예를 들어 암호화된 폴리펩티드의 개방 판독 프레임을 암호화된 폴리펩티드의 전사 및/또는 해독을 가능케하는 조절 요소와 기능적 연결함으로써, 목적하는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있다. 이들 조절 요소는, 다양한 진핵생물 발현계에서 익히 공지된 프로모터 또는 프로모터/인핸서 요소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

그러나, 제1 및/또는 제2 재조합 서열은 목적하는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 추가의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 구조 단백질, 효소 또는 조절 단백질을 상기 재조합 서열을 통하여, 분자내 재조합 후에 일시적으로 또는 안정적으로 발현되는 게놈 내로 도입할 수 있다. 이와 같이 도입된 폴리펩티드/생성물은 내인성이거나 외인성 폴리펩티드일 수 있다. 추가로, 마커 단백질 또는 생물약제학적으로 관련있는 치료용 폴리펩티드를 도입할 수도 있다. 당업자는 이와 같이 열거하는 본 발명에 따르는 방법의 적용 예가 단지 예시적이며, 이에 제한되지 않는다는 것을 인지한다. 지금까지 사용된 Cre 및 Flp 레콤비나제를 이용하여 수행된 본 발명에 따르는 적용 예는 문헌[참조: Kilby, N. et al., (1993), Trends Genet., 9, pp. 413]에서 찾아볼 수 있다.

더우기, 본 발명의 방법을 사용하여, 에피좀 기질 상에서의 분자내 재조합에 의해 벡터 상의 DNA 절편을 결실시키거나 역위시킬 수 있다. 결실 반응을 이용하여, 예를 들면, 소위 헬퍼 바이러스로부터 팩키징 서열을 결실시킬 수 있다. 이러한 방법은 유전자 요법 적용을 위한 바이러스 벡터의 산업적 생산에 광범위하게 적용된다[참조: Hardy, S. et al., (1997), J. Virol., 71, pp. 1842].

분자내 재조합을 통해, attB, attP, attL 또는 attR, 또는 att 서열의 다양한 조합 또는 이의 유도체의 복사체를 각각 갖는 두 개의 DNA 분자가 융합된다. 예를 들면, attB 또는 이의 유도체가 세포의 공지되고, 익히 특성이 규명된 게놈 유전자좌 또는 인공염색/미니염색체에서 상동재조합을 통해 1차로 도입될 수 있다. 후속적으로, attB, attP, attL, 또는 attR 보유 벡터 또는 DNA-절편이 분자간 재조 합을 통해 상기 게놈성 attB 서열로 통합될 수 있다. 이러한 방법에서, 재조합이 일어나는 진핵생물 내에서 돌연변이 인테그라제, 예를 들어 Int-h 또는 Int-h/218의 공동-발현이 바람직하다. 돌연변이 인테그라제 Int-h/218의 공동-발현이 가장 바람직하다. 이들 돌연변이 인테그라제를 암호화하는 유전자가, 형질감염되거나, 바람직하게는 공동-형질감염되는 제2 DNA 벡터 상에, 또는 attP, attL, attR 또는 attB 서열을 보유하는 벡터 또는 DNA-절편 또는 이의 유도체 상에 위치할 수 있다. 추가의 서열이 attB, attP, attL, 또는 attR 보유 벡터 또는 DNA-절편, 예를 들어 loxP/FRT 서열이 플랭킹된 특정 마커 단백질에 대한 유전자 상에 위치할 수 있다. 이러한 연구법을 이용하여, 예를 들어 세포 유형 중의 상이한 유전자의 비교 발현 분석에서, 상기 유전자가 각각의 게놈 통합 유전자좌의 포지티브 또는 네가티브 영향에 의해 영향받지 않는다는 것을 알 수 있다. 게다가, 본 발명의 방법을 사용하여, 에피솜 기질 상에 분자간 재조합에 의해 벡터 상에 DNA 절편을 융합시킬 수 있다. 융합 반응을 이용하여, 예를 들어 재조합 단백질 또는 관련 도메인을 발현시켜 표현형을 스크리닝할 수 있다. 이러한 방법은 진핵 세포에서의 단백질 기능의 고효율 분석에 사용될 수 있으므로, 중요하게 여겨질 수 있다.

위에서 언급된 바와 같이, 분자간 재조합을 사용하여, 하나 이상의 목적하는 폴리펩티드(들)/생성물(들)을 암호화하는 하나 이상의 유전자(들)을 예를 들어 에피솜 기질, 인공염색체/미니염색체, 또는 제1 재조합 서열을 함유하는 각종 숙주 세포 게놈 속에 도입할 수 있다. 이와 관련하여, 제2 DNA는 하나 이상의 재조합 서열, 예를 들어 attP, attB, attL, attR 또는 이의 모든 유도체 이외에, 목적하는 하나 이상의 단백질(들)/생성물(들)의 발현을 위한 하나 이상의 발현 카세트(들)을 포함한다. 상기 발현 카세트는 재조합 서열을 통해 목적하는 표적 유전자좌로 도입되어, 제2 재조합 서열 및 발현 카세트를 포함하는 DNA와 앞서 상기 에피솜 기질, 인공염색체/미니염색체, 또는 숙주 세포 게놈 속으로 도입되어진 제1 재조합 서열 사이의 서열-특이적 재조합을 가능케한다. 이러한 태양은, 생산에 적합한 고발현 세포주를 확립하는데 있어서 매우 중요하다.

이와 관련하여, 하나 이상의 재조합 서열을 포함하는 제1 DNA가 무작위 통합에 의해 숙주 세포의 게놈, 인공염색체/미니염색체, 또는 숙주 세포 내에 함유된 에피솜 기질 속에 도입되어져야 한다. 달리, 숙주 세포는 상응하는 하나 이상의 재조합 부위(들)를 포함하는 인공염색체/미니염색체 또는 에피솜 기질로 형질전환될 수 있다. 재조합 서열(들)을 박테리오파아지 람다 인테그라제에 의해 인식되는 목적하는 표적 유전자좌로 통합하는 또 다른 방법은 상기한 바와 같은 상동성 재조합 기법을 사용하는 것이다.

재조합 서열(들)을 목적하는 표적 유전자좌로 도입한 안정한 형질감염체에 대한 선별을 용이하게 하기 위하여, 선별 마커 유전자를 동시에 동일한 표적 유전자좌에 공동-도입한다. 이는, 예를 들어, 재조합 서열(들) 및 선별 마커 유전자가 예를 들어 상기한 임의의 방법 (상동성 재조합, 무작위 통합 등)에 의해 표적 유전자좌로 도입되는 동일한 벡터 또는 DNA 절편상에 공동-위치하는 경우에 달성될 수 있다. 선별 마커 유전자의 발현 수준은 통합 부위에서의 전사 활성과 관련이 있기 때문에, 통합 부위에서 고 발현 수준, 세포의 강건함, 및 예를 들어 생물반응기에서 양호한 성장 특징을 보이는 세포가 매우 효과적으로 동정될 수 있다. 선별 마커 유전자의 발현 수준은, 예를 들어 세포내에 존재하는 상응하는 mRNA의 양 또는 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 양을 토대로 하여, 당업계에 익히 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 도입된 유전자 서열로 부터 전사된 mRNA는 노던 블롯 하이브리드화, 리보뉴클리아제 RNA 보호, 세포 RNA에 대한 원 위치 하이브리드화, 또는 PCR [참조 문헌: Sambrook et al. , 1989; Ausubel et al. , 1994, supra]에 의해 정량화될 수 있다. 선택된 서열에 의해 암호화된 단백질은 각종 방법, 예를 들면 ELISA, 웨스턴 블롯팅, 방사선면역분석, 면역침전, 단백질의 생물학적 활성에 대한 분석, 또는 단백질의 면역염색 후의 FACS 분석, 형광성 단백질의 형광 시그날의 측정 [참조 문헌: Sambrook et al. (1989), Ausubel, F. M. et al. 1994 updated, supra]에 의해 정량화될 수 있다. 이러한 방법에 의해 생물약제의 생산을 위한 생산 세포주의 탁월한 후보가 수득될 수 있다.

통합된 재조합 서열(들) (제1 재조합 서열(들))은 추가의 DNA 분자, 예를 들어 하나 이상의 추가의 재조합 서열 (제2 재조합 서열)을 보유하는 벡터 또는 DNA 절편을 박테리오파아지 람다 인테그라제 Int에 의해 서열-특이적 재조합을 통해 전사 활성 유전자좌 속으로 통합시킬 수 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 제2 재조합 서열을 포함하는 상기 추가의 DNA 분자는, 생물약제학적으로 관련있는 목적하는 유전자의 발현을 위한 발현 카세트를 추가로 포함한다. 이 경우에, 아마도 전사 활성화 유전자좌에서 숙주 세포 게놈 속에 먼저 통합된 재조합 서열을 포함하는 숙주 세포를 박테리오파아지 람다 인테그라제 Int에 대한 제2 재조합 서열을 포함하는 DNA로 형질감염시키고, 제1 및 제2 재조합 서열 사이의 서열-특이적 재조합, 바람직하게는 제1 재조합 서열을 포함하는 숙주 세포 속으로의 제2 재조합 서열을 포함하는 DNA의 통합을 허용하는 조건하에서 배양한다. 제1 및 제2 재조합 서열은 attP, attB, attL, attR 또는 이의 모든 유도체일 수 있으며, 이는 박테리오파아지 람다 인테그라제 Int 또는 이의 기능적 돌연변이체에 의한 서열-특이적 재조합을 가능케한다. 예를 들면, 제1 재조합 서열이 attP 또는 이의 유도체를 포함하는 경우에, 제2 서열은 attP, attB, attL, attR 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다.

서열-특이적 재조합이 Int에 의해, 또는 Int 및 XIS, FIS 및/또는 IHF에 의해 수행되는 방법이 바람직하다. 서열-특이적 재조합이 Int에 의해 또는 Int 및 XIS 인자에 의해, 또는 Int 및 IHF에 의해, 또는 Int 및 XIS 및 IHF에 의해 수행되는 방법이 가장 바람직하다. 서열-특이적 재조합이 변형된 Int, 바람직하게는 Int-h 또는 Int-h/218에 의해 수행되는 방법이 또한 바람직하다. 이와 관련하여, XIS 및/또는 IHF와 함께 변형된 Int를 사용하는 것도 또한 본 발명의 범위 내이다.

이러한 연구법에 의해, 박테리오파아지 람다 인테그라제 Int에 대한 제2의 재조합 서열을 포함하는 모든 DNA 서열(들)이 공지되고, 익히 특징이 규명되고, 규정된 숙주 세포의 유전자좌 속에 통합된다. 서열-특이적 재조합이 일어난 세포를 선별하기 위하여, 예를 들어 프로모터 또는 프로모터/인핸서를 함유하지 않는 선별 마커 유전자, 또는 유전자의 암호 영역의 단지 일부만을 포함하는 비-기능성 발현 카세트를 도입할 수 있다. 단지 서열-특이적 재조합이 일어난다면, 선별 마커 유전자의 효율적인 발현으로 완전한 기능성 발현 카세트가 생성될 것이며, 이로써 서열-특이적 재조합을 통해 목적하는 유전자가 통합된 세포가 선별될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해, 생산 세포주가, 한정된 통합 부위에, 예를 들어 게놈 유전자좌 속에 통합된 DNA 서열의 실체에 의해 단지 숙주 세포와 다르게 수득될 수 있다. 상이한 세포 클론 사이의 유전자 변이가 덜하기 때문에, 생산 세포주의 개발을 위한 보다 일반적인 방법이 사용될 수 있으므로, 클론 선별 및 최적화된 생산 공정의 개발을 위한 시간 및 노력이 절약된다. 생산 세포주는 목적하는 폴리펩티드(들)을 제조하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은,

a) attB, attP, attL 또는 attR 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 제1 DNA를 세포 내로 도입하는 단계;

b) attB, attP, attL 또는 attR 서열 또는 이의 유도체, 및 하나 이상의 목적하는 유전자를 포함하는 제2 DNA를 세포 내로 도입하는 단계;

c) 상기 세포를 박테리오파아지 람다 인테그라제 Int와 접촉시키는 단계;

d) 박테리오파아지 람다 인테그라제 Int에 의해 서열 특이적 재조합을 수행하여, 제2 DNA가 제1 DNA 속에 통합되는 단계; 및

e) 상기 세포를 목적하는 유전자가 발현되는 조건하에서 배양하는 단계를 포함하는, 진핵 세포에서 하나 이상의 목적하는 폴리펩티드(들)/생성물(들)을 암호화하는 하나 이상의 목적하는 유전자를 발현시키는 방법에 관한 것이다.

제1 DNA 서열이 attB 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 경우에 제2 서열은 attB, attL 또는 attR 서열을 포함하거나, 또는 제1 DNA 서열이 attP 또는 이의 유 도체를 포함하는 경우에 제2 서열은 attP, attL 또는 attR 서열 또는 이의 유도체를 포함하거나, 또는 제1 DNA 서열이 attL 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 경우에 제2 서열은 attB, attP 또는 attL 서열 또는 이의 유도체를 포함하거나, 또는 제1 DNA 서열이 attR 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 경우에 제2 서열은 attB, attP 또는 attR 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 방법이 바람직하다.

상기 방법의 보다 바람직한 태양에서, 제2 DNA가 숙주 세포로 도입되기 전에, 제1 DNA가 숙주 세포의 게놈, 인공염색체/미니염색체 또는 에피솜 요소 속에 통합되어진다.

본 발명은,

a) attB, attP, attL 또는 attR 서열 또는 이의 유도체, 및 하나 이상의 목적하는 유전자를 포함하는 DNA를 세포 내로 도입하는 단계;

b) 상기 세포를 박테리오파아지 람다 인테그라제 Int와 접촉시키는 단계;

c) 박테리오파아지 람다 인테그라제 Int에 의해 서열 특이적 재조합을 수행하여, 제2 DNA가 제1 DNA 속에 통합되는 단계; 및

d) 상기 세포를 목적하는 유전자가 발현되는 조건하에서 배양하는 단계를 포함하여, 숙주 세포의 게놈 통합된 attB, attP, attL 또는 attR 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 숙주 세포에서 하나 이상의 목적하는 유전자를 발현시키는 방법에 관한 것이다.

본 방법은, 숙주 세포의 유전공학에 의해 숙주 세포의 게놈 속에 통합된 attB, attP, attL 또는 attR 서열 또는 이의 유도체 뿐만 아니라, 게놈의 천연 재 조합 서열, 예를 들면 문헌[WO 01/16345]에 기재된 attH-부위 (5'-GAAATTCTTTTTGATACTAACTTGTGT-3'; 서열번호 17) 또는 Int 또는 이의 임의의 기능적 돌연변이체에 의해 매개된 서열-특이적 재조합을 허용하는 기타 재조합 서열을 사용하여 수행할 수 있다.

이들 방법은, 상기 서열-특이적 재조합이 Int에 의해 또는 Int 및 XIS 인자에 의해, 또는 Int 및 IHF에 의해, 또는 Int 및 XIS 및 IHF에 의해 수행되는 경우가 바람직하다. 추가로, 서열-특이적 재조합이 변형된 Int, 바람직하게는 Int-h 또는 Int-h/218에 의해 수행되는 방법이 바람직하다. 이와 관련하여, XIS 및/또는 IHF와 함께 변형된 Int를 사용하는 것도 본 발명의 범위 내이다. Int, Int-h 또는 Int-h/218, XIS 및/또는 IHF가 정제된 형태로 세포에 첨가될 수 있거나, 서열-특이적 재조합이 수행되는 상기 숙주 세포에 의해 공동-발현될 수 있다.

위에서 언급된 방법의 또 다른 태양은, 목적하는 유전자(들)에 의해 암호화되고 숙주 세포에서 발현되는 폴리펩티드(들)/생성물(들)이 세포로 분리된, 또는 배양 배지로 분비되는 경우에는 세포 배양 상청액으로 부터 분리되는 방법에 관한 것이다.

상기 생산 세포는, 목적하는 유전자(들)의 발현, 및 세포 및/또는 세포 배양 상청액으로 부터의 목적하는 단백질의 분리를 가능케하는 조건하에서, 무혈청 배지 및 현탁 배양액 내에서 우선적으로 배양된다. 바람직하게는, 목적하는 단백질은 분비된 폴리펩티드로서 배양 배지로 부터 회수되거나, 또는 분비 시그날 없이 발현되는 경우에는 숙주 세포 용해물로 부터 회수될 수 있다. 목적하는 단백질의 실질적으로 균질한 제제가 수득되도록, 다른 재조합 단백질, 숙주 세포 단백질 및 오염물질로 부터 목적하는 단백질을 정제하는 것이 필요하다. 제1 단계로서, 종종 세포 및/또는 미세한 세포 부산물이 배양 배지 또는 용해물로 부터 제거된다. 이후, 목적하는 생성물을, 오염물질인 가용성 단백질, 폴리펩티드, 및 핵산으로 부터, 예를 들면 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼 상에서의 분별화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지 상에서의 Sephadex 크로마토그래피에 의해 정제한다. 일반적으로, 숙주 세포에 의해 발현된 이종성 단백질을 어떻게 정제하는지를 교시하는 방법이 당업계에 익히 공지되어있다. 이러한 방법은 예를 들면 문헌[참조: Harris et al. (1995) Protein Purification: A Practical Approach, Pickwood and Hames, eds., IRL Press and Scopes, R. (1988) Protein Purification, Springer Verlag]에 기재되어 있다. 따라서, 하나 이상의 목적하는 유전자를 발현하는 전술한 방법에 추가적 정제 단계가 추가되어, 목적하는 폴리펩티드가 숙주 세포로 부터 또는 배양 배지로 분비되는 경우에는 세포 배양물로 부터 정제된다.

본 발명의 방법은 모든 진핵세포에서 수행될 수 있다. 세포 및 세포주는 예를 들면 세포 배양물에 존재할 수 있으며, 진핵 세포, 예를 들면 효모, 식물,곤충 또는 포유동물 세포를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 세포는 난모세포, 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 또는 기타 유형의 분화 세포일 수 있다. 진핵 세포가 포유동물 세포인 방법이 바람직하다. 포유동물 세포가 사람, 유인원, 쥐, 랫트, 토끼, 햄스터, 염소, 소, 양 또는 돼지 세포인 방법이 보다 바 람직하다. 생물약제의 생산을 위한 바람직한 세포주 또는 "숙주 세포"는 사람, 마우스, 랫트, 원숭이 또는 설치류 세포주이다. 보다 바람직한 세포주는 햄스터 세포, 바람직하게는 BHK21, BHK TK^-, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKXBl 및 CHO-DG44 세포 또는 이러한 세포주의 임의의 유도체/자손이다. 특히 바람직한 세포주는 CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 및 BHK21이고, 보다 더욱 바람직한 것은 CHO-DG44 및 CHO-DUKX 세포이다. 또한, 쥐 골수종 세포, 바람직하게는 NSO 및 Sp2/0 세포 또는 이러한 세포주의 임의의 유도체/자손이 또한 생산 세포주로서 공지되어있다.

무혈청 조건하에서, 및 임의로 동물 기원의 단백질/펩티드가 부재인 배지에서 확립되고, 적응되고, 완전히 배양된 숙주 세포가 가장 바람직하다. 시판되는 배지, 예를 들면 Ham's F12 (Sigma,Deisenhofen, Germany), RPMI-1640 (Sigma), 둘베코 변형된 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM; Sigma), 이스코브 변형된 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM ; Sigma)), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S-SFMII (Invtirogen), 무혈청 CHO 배지 (Sigma), 및 단백질-부재 CHO 배지 (Sigma)가 적당한 영양 용액으로 예시된다. 모든 배지는 필요하면 각종 화합물로 보충될 수 있으며, 이러한 화합물의 예로는 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예를 들면, 인슐린, 트랜스페린, 표피 성장 인자, 인슐린형 성장 인자), 염 (예를 들면, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 포스페이트), 완충제 (예; HEPES), 뉴클레오시드 (예; 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코스 또는 기타 동응한 에너지원, 항생물질, 미량 원소가 있다. 기타 임의의 필요한 보충물이 적당한 농도로 포함될 수 있으며, 이는 당업자에게는 공지되어 있다. 본 발명에서, 무혈청 배지를 사용하는 것이 바람직하지만, 적당한 양의 혈청이 보충된 배지도 숙주 세포의 배양을 위해 사용될 수 있다. 선별 유전자를 발현하는 유전자 변형된 세포에 대해, 적당한 선별제를 배양 배지에 첨가한다.

본 발명의 "목적하는 단백질/폴리펩티드" 또는 "원하는 단백질/폴리펩티드의 예로는, 인슐린, 인슐린형 성장 인자, hGH, tPA, 사이토킨, 예를 들면 인터루킨 (IL) (예: IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18), 인터페론 (IFN) 알파, IFN 베타, IFN 감마, IFN 오메가 또는 IFN tau, 종양 괴사인자 (TNF), 예를 들면 TNF 알파 및 TNF 베타, TNF 감마, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 및 VEGF가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 에리트로포이에틴 또는 기타 호르몬 성장 인자, 및 효능제 또는 길항제로서 작용하고/하거나 치료적 또는 진단적 용도를 갖는 기타 폴리펩티드의 생산도 포함된다. 본 발명에 따른 방법은 또한 항체, 예를 들어, 모노클로날, 폴리클로날, 다중특이적 및 단일 쇄 항체, 또는 이의 단편, 예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및 Fc'-단편), 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 및 이의 불변 영역, 가변 영역, 또는 초가변 영역 뿐만 아니라, Fv- 및 Fd-단편의 생산하는데도 유리하게 사용된다[참조 문헌: Chamov, S. M. et al. (1999) Antibody Fusion Proteins, Wiley-Liss Inc.].

Fab 단편 (단편 항원-결합 = Fab)는 인접 불변 영역에 의해 서로 유지된 두 쇄의 가변 영역으로 이루어진다. 이들은 통상의 항체로 부터 프로테아제 분해, 예를 들면 파파인에 의해 생성될 수 있으나, 유사한 Fab 단편은 유전공학에 의해 평균 시간에 제조될 수 있다. 또한, 항체 단편은 F(ab')2 단편을 포함하는데, 이는 펩신을 사용한 단백질용해 절단에 의해 제조될 수 있다.

유전공학 방법을 사용하여, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역만으로 이루어진 단축 항체 단편을 제조하는 것이 가능하다. 이들은 Fv 단편 (단편 가변 = 가변부의 단편)으로 불린다. 이들 Fv-단편은 불변 쇄의 시스테인에 의한 두 쇄의 공유결합이 없기 때문에, Fv 단편은 종종 안정화된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을, 예를 들어 10 내지 30개 아미노산, 바람직하게는 15개 아미노산의 짧은 펩티드 단편으로 연결시키는 것이 유리하다. 이러한 방법에서, 펩티드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL로 이루어진 단일 펩티드 쇄가 수득된다. 이러한 종류의 항체 단백질은 단일-쇄-Fv (scFv)로서 공지되었다. 당업계에 공지된 이러한 종류의 scFv-항체 단백질의 예가 문헌[참조: Huston C. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 16, pp. 5879]에 기재되어 있다.

최근에는, scFv를 다량체 유도체로서 제조하기 위한 다양한 방법이 개발되었다. 이는 특히, 개선된 약동학 특성 및 생체분포 특성을 가질 뿐만 아니라, 증가된 결합력을 가진 재조합 항체를 유도하고자 하는 것이다. scFv의 다량체화 (multimerisation)를 달성화기 위하여, scFv를 다량화 도메인을 가진 융합 단백질로서 제조하였다. 다량체화 도메인은 예를 들면 IgG의 CH3 영역 또는 루이신-지퍼 (Leucin-zipper) 도메인과 같은 코일형성 코일 구조 (나선 구조)일 수 있다. 그러나, 또한, scFv의 VH/VL 영역 사이의 상호작용이 다량체화 (예: 이원체 (diabody) 삼원체 (triabody) 및 오원체 (pentabody))에 사용되는 전략이 있다. 당업자는 이원체를 이가의 동종이량체성 scFv 유도체로 이해한다. scFv 분자 내의 링커를 5 내지 10개 아미노산으로 줄이면, 쇄 사이의 VH/VL-중첩이 일어난 동종이량체가 형성된다. 이원체는 디설피드 가교를 도입함으로써 추가로 안정화될 수 있다. 종래의 기술로 부터의 이원체-항체 단백질의 예는 문헌[참조: Perisic,O. et al. (1994) Structure, 2, pp. 1217]에서 찾아 볼 수 있다.

당업자는 소형체 (minibody)를 이가의 동종이량체성 scFv 유도체로 이해한다. 이는 힌지 (Hinge) 영역 (예를 들면, IgG1로 부터 기원)을 통해 scFv에 연결된 이원체화 영역으로서의 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG1의 CH3 영역, 및 링커 영역을 함유하는 융합 단백질로 이루어진다. 종래의 기술로 부터의 소형체-항체 단백질의 예는 문헌[참조: Hu, S. et al. (1996) Cancer Res., 56, pp. 3055]에서 찾아볼 수 있다.

당업자는 삼원체를 삼가의 동종삼량체성 scFv 유도체 [참조 문헌: Kortt A. A. et al. (1997) Protein Engineering,10, pp. 423]로 이해한다. VH-VL이 링커 서열 없이 직접 융합된 scFv 유도체는 삼량체의 형성을 유도한다.

당업자는 또한 이가-, 삼가- 또는 사가의 구조를 가지며 scFv로 부터 유도되는 소위 미니항체 (miniantibody)를 잘 알고 있다. 다량체화는 이량체, 삼량체 또는 사량체의 코일형성 코일 구조에 의해 달성된다[참조 문헌: Pack, P. et al. (1993) Biotechnology, 11, pp. 1271; Lovejoy, B. et al. (1993) Science, 259, pp. 1288; Pack, P. et al. (1995) J. Mol. Biol. , 246, pp. 28]. 본 발명의 바람직한 태양에서, 목적하는 유전자는 위에서 언급된 목적하는 폴리펩티드, 바람직하게는 모노클로날 항체, 이의 유도체 또는 단편 중의 하나를 암호화한다.

본 발명의 임의의 태양을 수행하기 위해서는, 인테그라제가 재조합 서열 상에서 작용해야만 한다. 인테그라제 또는 인테그라제 유전자 및/또는 조인자 또는 조인자 유전자, 예를 들면 Xis 인자 또는 Xis 인자 유전자 및/또는 IHF 또는 IHF 유전자는 당해 제1 및 제2 재조합 서열을 도입하기 이전에 이미 진핵 세포 내에 존재할 수 있다. 이들은 또한 제1 및 제2 재조합 서열을 도입하는 사이에 도입할 수 있거나, 제1 및 제2 재조합 서열을 도입한 후에 도입할 수 있다. 레콤비나제 및 숙주 인자 단백질의 정제는 당업계에 공지되어 있다[참조 문헌: Nash, H. A. (1983) Methodsof Enzymology, 100, pp. 210; Filutowicz, M. et al. (1994) Gene, 147, pp. 149]. 이들이 공지되지 않은 경우에, 세포 추출물을 사용하거나, 또는 예를 들어 Int 또는 Cre 레콤비나제에 대해 기술된 방법을 사용하여 효소를 부분적으로 정제할 수 있다. 정제된 단백질은 표준 기법, 예를 들면 주사 또는 미세주사에 의해, 또는 IHF에 대한 본 발명의 실시예 2에 기술된 바와 같은 리포펙션에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 서열-특이적 재조합에 사용된 인테그라제는 바람직하게는 당해 반응이 수행되는 세포 내에서 발현된다. 이러한 목적을 위하여, 인테그라제를 포함하는 제3 DNA 서열이 세포 내로 도입된다. 서열-특이적 재조합이 예를 들어 attL/attR를 사용하여 수행하는 경우에, XIS 인자 유전자 (제4 DNA 서열)이 추가로 세포내로 도입될 수 있다. 제3 및/또는 제4 DNA 서열이 상동재조합을 통해 또는 무작위로 진핵세포의 게놈 또는 인공염색체/미니염색체 속으로 도입되는 방법이 가장 바람직하다. 추가로, 제3 및/또는 제4 DNA 서열이 조절 서열을 포함하여, 인테그라제 유전자 및/또는 XIS 인자 유전자의 공간적 및/또는 시간적 발현을 일으키는 방법이 바람직하다.

이러한 경우, 공간적 발현은 레콤비나제, Xis 인자 및/또는 IHF 인자 각각이 세포 유형 특이적 프로모터의 사용에 의해 특정 세포 유형에서만 발현되고 단지 이들 세포, 예를 들면, 간 세포, 신장 세포, 신경 세포 또는 면역계 세포에서만 재조합을 촉매한다는 것을 의미한다. 인테그라제/XIS 인자/IHF 발현의 조절에서는, 시간적 발현이 활성 형태의 프로모터에 의해 달성되거나, 특정한 발생 단계 또는 성체 생물체에서의 특정 시점의 프로모터에 의해서 달성될 수 있다. 더우기, 시간적 발현은 유도성 프로모터, 예를 들면, 인터페론 또는 테트라사이클린 의존된 프로모터를 사용함으로써 달성할 수 있다[참조: Muller, U. (1999), Mech. Develop., 82, pp. 3].

본 발명의 방법에 사용된 인테그라제는 박테리오파아지 람다의 야생형 및 변형된 (돌연변이된) 인테그라제 둘 다일 수 있다. 야생형 인테그라제는 조인자, 즉 IHF를 사용하여 고효율로 재조합 반응만을 수행할 수 있기 때문에, 본 발명의 방법에 변형된 인테그라제를 사용하는 것이 바람직하다. 야생형 인테그라제가 본 발명의 방법에 사용된 경우에는, 재조합 반응의 자극을 성취하기 위해 IHF가 추가로 필요할 수 있다. 변형된 인테그라제는, 이러한 인테그라제가 IHF 또는 기타 숙주 인자, 예를 들면 XIS 및 FIS를 사용하지 않고서도 재조합 반응을 수행할 수 있도록 변형된 것이다. 예를 들면, attL과 attR 서열 사이의 재조합 반응은 숙주 인자를 추가함이 없이 변형된 Int에 의해 수행될 수 있다 (결과 5.1 및 도 2C 및 2D 참조).

변형된 폴리펩티드의 생성 및 목적하는 활성의 스크리닝은 당업계의 기술수준이며, 용이하게 수행될 수 있다[참조 문헌:Erlich, H. (1989) PCR Technology. Stockton Press]. 예를 들면, 변형된 인테그라제를 암호화하는 핵산 서열은, 시험관내에서 또는 암호 서열을 세균 또는 진핵 세포에 도입시 전사되어 인테그라제로 해독되는 임의의 핵산 서열을 포함하도록 한다. 변형된 인테그라제 단백질 암호화 서열은, 암호화된 폴리펩티드의 생물학적 기능 활성, 즉 레콤비나제 활성이 유지되는 한, 천연적 (자발적 돌연변이에 의함)으로 또는 재조합으로 조작된 돌연변이체 및 변이체, 천연의 또는 야생형의 절두된 형 및 단편, 기능상 등가물, 유도체, 동족체 및 융합물일 수 있다. 변형된 레콤비나제가, 본 발명의 결과 5.1 또는 WO01/16345의 실시예 3에 기술된 바와 같은 기질 벡터 및 발현 벡터를 이용한 공동-형질감염 분석에서 측정된 바에 의하면, 야생형 인테그라제의 활성의 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이상을 가지는 경우에, 레콤비나제 활성이 유지된다. 특정 아미노산 서열 치환이 인테그라제 또는 이의 내재하는 핵산 암호화 서열에 생길 수 있으며, 유사한 특성을 가진 단백질이 수득될 수 있다. 아미노산의 하이드로패틱 지수 (hydropathic index)[참조 문헌: Kyte, J. et al. (1982) J. Mol. Biol. , 157, pp. 105]에 사용에 의해 기능적으로 등가인 인테그라제를 제공하는 아미노산 치환은 이의 내재 핵산 서열 상에 부위-특이적 돌연변이유발 또는 폴리머라제 연쇄 반응-매개된 돌연변이유발을 수행함으로써 제조될 수 있다. 본 발명에서, 야생형 단백질에 비해 개선된 레콤비나제 활성/재조합 효율 또는 하나 이상의 숙주 인자에 독립적인 재조합 활성을 나타내는 돌연변이체 또는 변형된 인테그라제가 바람직하다. "야생형 단백질"은 암호화 폴리펩티드의 완전하고, 절두되지 않고, 변형되지 않은 천연의 유전자를 의미한다. 바람직한 두 개의 Int 돌연변이체는 Int-h 및 Int-h/218로 명명된 박테리오파아지 람다 인테그라제이다[참조 문헌: Miller et al. (1980) Cell, 20, pp. 721; Christ, N. and Droge, P. (1999) J. Mol. Biol. , 288, pp. 825]. Int-h는 야생형 Int에 비해 위치 174에 글루타메이트 잔기 대신에 리신 잔기를 포함한다. Int-h/218는 위치 218에 글루타메이트 잔기 대신에 또 다른 리신 잔기를 포함하며, Int-h 유전자의 PCR 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. 이러한 돌연변이체는 attB/attB, attP/attP, attL/attL 또는 attR/attR 및 기타 모든 가능한 조합, 예를 들어 attP/attR, attL/attP, attL/attB, 또는 attR/attB 또는 이의 유도체 사이의 재조합을 이.콜라이, 진핵 세포 및 시험관내에서, 즉 반응 튜브 내에서 정제된 기질을 사용하여, 조인자 IHF, XIS, 및/또는 FIS 및 음성 초나선형성 없이 촉매할 수 있다. 재조합 효율의 개선은 조인자, 예를 들어 FIS를 사용하여 달성할 수 있다. 돌연변이체 Int-h/218가 증가된 효율로 재조합 반응을 촉매하기 때문에, 이 돌연변이체가 바람직하다.

제1 반응이 절단을 유도하고 사용된 2개의 재조합 서열이 동일한 경우 (예를 들어 attP/P), 재조합 후 생성된 재조합 서열은 기질 상의 것과 동일 할 것이다 (예를 들어, 이 경우에는 두 개의 attP 서열). 그러나, 두 개의 파트너 서열이 상이한 경우 (예를 들어 attP/R), 재조합 반응은, 하나의 서열 (예: attP)로 부터의 기능적 절반 및 다른 서열 (예: attR)로 부터의 절반을 포함하는 하이브리드 재조합 서열을 생성시킬 것이다. 기능적 절반 재조합 부위는 5' 또는 3' 형 중첩 서열로서 정의될 수 있으며, 이에 따라 중첩은 각 경우에 기능적 절반-부위의 일부로서 고려된다. 사용된 재조합 서열의 각각의 중첩 영역이 동일한 경우에, 절단 반응은 본 발명에 따른 임의의 재조합 서열을 사용하여 수행할 수 있다. 추가로, 중첩 영역은 서로에 대해 재조합 서열의 배향, 즉 역위 배향 또는 정배향을 나타낸다. 당해 반응은 단지 저효율로 야생형 Int를 사용하여 수행할 수 있으나, 코어 결합 부위에 추가하여, IHF의 첨가 또는 IHF의 부재하에 암 (arm) 결합 부위(들)의 존재가 상기 효율을 자극하고 증가시킨다. 당해 반응은 임의의 조인자 없이 변형된 Int에 의해 수행될 수 있다.

또한, Xis 인자 유전자를 포함하는 추가의 DNA 서열이 세포 내로 도입되는 방법이 바람직하다. 추가의 DNA 서열이 Xis 인자 유전자의 공간적 및/또는 시간적 발현을 일으키는 조절 DNA 서열을 추가로 포함하는 방법이 가장 바람직하다.

예를 들면, 특정 유형의 세포에서 유전자의 활성화/비활성화를 유도하는 Int에 의한 성공적인 통합성 분자내 재조합 (역위) 후, 상기 유전자는 Int의 발현과 동시에 유도된 XIS의 공간적 및/또는 시간적 발현에 의해 나중에 재차 불활성화되거나 활성화될 수 있다.

게다가, 본 발명은, 진핵 세포에서 DNA의 서열-특이적 재조합에서의 임의의 재조합 서열 또는 이의 유도체, 예를 들면 서열번호 2에 제시된 attP의 유도체의 용도에 관한 것이다. 진핵 세포는, 이의 세포 내에 인테그라제 또는 Xis 인자를 갖지 않는 생물체, 예를 들면 포유동물의 세포 응집물로 존재할 수 있다. 이러한 생물체를, 인테그라제 또는 Xis 인자를 세포내에 함유하는 다른 생물체와 교배하는데 사용하여, 자손을 생산할 수 있으며, 이때 당해 자손의 세포 내에서는 서열-특이적 재조합이 수행된다. 따라서, 본 발명은, 진핵 세포에서 서열-특이적 재조합에서의 인테그라제 또는 인테그라제 유전자 및 Xis 인자 또는 Xis 인자 유전자 및 IHF 인자 또는 IHF 인자 유전자의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 본 발명의 방법이 수행되고, 본 발명의 방법을 수행한 후 수득된 진핵 세포 또는 세포주에 관한 것이다.

본 발명의 실행은, 다른 언급이 없는 한, 당업자의 기술에 속하는 세포 생물학, 분자 생물학, 세포 배양, 면역학 등을 사용할 것이다. 이들 기법은 현재의 문헌에 완전히 기재되어있다[참조 문헌: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987, updated); Brown ed., Essential Molecular Biology, IRL Press (1991); Goeddel ed., Gene Expression Technology, Academic Press (1991); Bothwell et al. eds., Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Bartlett Publ. (1990); Wu et al., eds., Recombinant DNA Methodology, Academic Press (1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression, Stockton Press (1990); McPherson et al., PCR: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1991); Gait ed., Oligonucleotide Synthesis (1984); Miller & Calos eds., Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (1987); Butler ed., Mammalian Cell Biotechnology (1991); Pollard et al., eds., Animal Cell Culture, Humana Press (1990); Freshney et al., eds., Culture of Animal Cells, Alan R. Liss (1987); Studzinski, ed., Cell Growth and Apoptosis, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Presss (1995); Melamed et al., eds., Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss (1990); Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, Inc. (updated); Wirth & Hauser, Genetic Engineering of Animals Cells, in: Biotechnology Vol. 2, Phuhler ed. , VCH, Weinheim 663-744; the series Methods of Enzymology (Academic Press, Inc. ), and Harlow et al. , eds. , Antibodies: A Laboratory Manual (1987)].

상기 명세서에서 언급된 모든 문헌 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 당업계의 숙련가의 기술 수준을 나타내는 것이다. 본원에서 인용된 모든 문헌 및 특허 출원은 이들의 전문이 본원에 참조로서 인용되어, 본 발명이 속하는 당업계의 기술상황을 보다 충분히 설명한다. 전반적으로 상기된 본 발명은 아래의 실시예를 참조하여 보다 용이하게 이해할 것이며, 본원에 포함된 실시예는 본 발명의 특정 태양을 단지 설명하기 위한 것이지, 본 발명을 어떤식으로든 제한하고자 하는 것이 아니다.

실시예

방법

1. 발현 및 기질 벡터의 제조

모조 (mock) 및 Int 발현 벡터 pCMV, pCMVSSInt, pCMVSSInt-h, 및 pCMVSSInt-h/218의 작제가 문헌[참조: Lorbach, E. et al. (2000) J. Mol. Biol, 296, pp. 1175]에 기재되어 있다. Int 발현은 사람 사이토메갈로바이러스 프로모터에 의해 유도된다.

attB/attP(pλIR) 또는 attL/attR(pλER)을 정배향 반복체로 함유하는, 분자내 재조합 분석에 사용된 기질 벡터는 pGEM^®4Z (Promega)의 유도체이다. ClaI/EcoRI-절단된 pPGKneo 속에 attB를 이본쇄-올리고뉴클레오티드로서 삽입시켜, pλIR를 작제하였다. 이 벡터는, Int-h 유전자를 PstIlXbaI를 사용하여 네오마이신 유전자(neo)로 대체시킨 pPGKSSInt-h의 유도체이다. pCMVSSInt를 주형으로 사용하는 PCR에 의해 CMV 프로모터 및 하이브리드 인트론을 제조하여, KpnI/ClaI-절단된, attB-함유 pPGKneo 벡터 속에 클로닝하였다. 이어서, 이러한 CMV-attB-neo-발현 카세트를 PCR에 의해 BamHI-절단된 pGEM^®4Z 속에 클로닝시켰다. 전사 종결 시그날을 결실시키는 P'-암(arm)에 A-대-C 치환을 함유하는 attP 부위를, 아래의 프라미어를 사용하는 어셈블리 PCR에 의해 제조하였다:

(attP01) 5'-GTCACTATCAGTCAAAATA C AATCA-3' (서열번호 3),

(attP02) 5'-TGATT G TATTTTGACTGATAGTGAC-3' (서열번호 4),

(PFP-NsiI) 5'-CCAATGCATCCTCTGTTACAGGTCACTAATAC-3' (서열번호 5) 및

(P'RP-EcoRV-NotI) 5'ATAAGAATGCGGCCGCAGATATCAGGGAGTGGGACAAAATTGAA-3' (서열번호 6).

pGFPattB/attP를 주형으로서 사용하였다[참조 문헌: Lorbach, E. et al. (2000), supra]. 당해 PCR 단편을 NsiI 및 NotI으로 절단하고, pBS302 (Gibco/BRL)로 부터 수득된 전사 종결 카세트를 함유하는 BamHI/PstI-단편의 3'-말단에 연결시켰다. GFP 유전자 및 폴리A 시그날을, pCMVSSGFP (PstI/XbaI를 사용하여 Int-h 유전자를 eGFP로 대체시킨 pCMVSSInt-h의 유도체)를 사용하는 PCR에 의해 클로닝시켰다. PCR 단편을 함유하는 GFP를 NotI 및 XbaI로 절단한 다음, BamHI/NotI-절단된 전사 종결/attP 단편과 함께, 이미 CMV 프로모터, attB, 및 neo 발현 카세트를 함유하는 BamHI/XbaI-절단된 벡터에 연결시켰다. GFPattL/attR (Lorbach, E. et al. (2000), supra)을 주형으로서 사용하여 PCR에 의해 attL을 제조하는 점을 제외하고는, pλIR와 마찬가지로 pλER를 작제하고, ClaI/EcoRI-절단된 pPGKneo 속에 클로닝시켰다. pGFPattL/attR를 주형으로 사용하여 PCR에 의해 attR 부위를 제조하고, 생성물을 NsiI 및 NotI로 절단하였다.

상이한 부착 부위 앞에 CMV 프로모터를 함유하는 분자간 재조합 분석용 기질 벡터: pCMVattPmut는 P-암(arm) 내에 3개의 G-대-C 치환을 함유한다. 이들 변화는, 재조합 후 GFP 발현을 방해할 수 있는 ATG 출발 코돈을 제거하는데 필요하다. 상기 치환은 attP 내의 단백질 결합 부위 밖이고, 어셈블리 PCR에 의해 도입되어졌 다. 먼저, 두 개의 중첩 PCR 생성물, 프라미어 쌍 attP-ATC-1/attP-2를 가진 것과 attP-ATC-3/attP-4를 가진 것을 제조하였다. PCR 생성물을 겔-정제하고, 프라이머 attP-PstI 및 attP-XbaI를 사용하는 PCR의 주형으로서 사용하였다. 수득된 생성물을 PstI 및 XhaI로 분해하고, pCMVSSInt 속으로 클로닝하였다. 어셈블리 PCR을 위한 프라이머 서열은 다음과 같다:

(attP-ATC-1)5'-tttggataaaaaacagactagataatactgtaaaacacaagatatgcagtcacta-3' (서열번호 7),

(attP-2) 5'-taacgcttacaatttacgcgt-3' (서열번호 8),

(attP-ATC-3) 5'ctgcatatcttgtgttttacagtattatctagtctgttttttatccaaaatctaa-3' (서열번호 9),

(attP-4) 5'-ctggacgtagccttcgggcatggc-3' (서열번호 10),

(attP-PstI) 5'-gactgctgcagctctgttacaggtcac-3' (서열번호 11),

(attP-XbaI) 5'-gactgtctagagaaatcaaataatgat-3'(서열번호 12).

PstI/XbaI-절단된 pCMVattPmut 속에 attB를 이본쇄 올리고뉴클레오티드로서 삽입시켜, pCMVattB를 제조하였다. pλER을 attL에 대한 주형으로서 사용하는 PCR에 의해 pCMVattL를 제조하고, 이를 PstI/XbaI-절단된 pCMVattPmut 내에 도입하였다.

프로모터결여(promoterless) GFP 유전자의 앞 쪽에 위치한 att 부위 및 전사 종결 시그날을 함유하는 벡터를 다음과 같이 작제하였다: 먼저, Aval 및 NdeI를 사용하여 pTKHyg (Clontech)로 부터 히그로마이신 유전자의 일부를 제거하여, pWSattBGFP를 제조하였다. 점착 말단을 클레노우(Klenow) 폴리머라제에 의해 평활 말단으로 만든 후에, 당해 벡터 골격을 연결시켰다. PCR에 의해 생성된 attB-GFP 단편을 MfeI 및 HindIII 부위에 클로닝시키고, 이로써 attB의 5'에 새로운 NheI 부위가 생성되었다. 최종적으로, 전사 종결 서열을, EcoRI 및 NheI에 의한 제한 절단을 통해 삽입시켰다. pλER로 부터 BamHI/NotI 전사 종결-attR 단편을 분리하여 pWSattRGFP를 수득하고, 이를 동일한 효소로 절단한 pWSattBGFP에 삽입시켰다. pGFPattP/attB를 주형으로서 사용하는 attB 부위의 PCR에 의해 pWSattPGFP를 제조하고, 이를 EcoRI/NotI로 절단된 pWSattBGFP 속에 삽입하여, attB를 대체시켰다. 플라스미드는 친화성 크로마토그래피(Qiagen)를 사용하여 이.콜라이 균주 XL1-Blue로 부터 분리하였다. 관련 유전자 요소의 뉴클레오티드 조성을, 형광-이용 373A 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 DNA 서열분석에 의해 입증하였다.

2. 세포 배양, 재조합 분석, 및 유동 세포측정

HeLa 세포를, 10% 태아 송아지 혈청, 스트렙토마이신 [0.1 mg/ml] 및 페니실리 [100 U/ml]이 보충된 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM)에서 배양하였다. 세포를 형질감염 전에 2회 계대배양하였다.

전형적인 재조합 분석은 아래와 같이 수행하였다. 세포를 수거하고, PBS로 세척하고, L-글루타민 및 페놀 레드 (Life Technologies)를 함유하지 않는 RPMI 1640 중에 재현탁시켰다. 이어서, 총 60㎍의 발현 및 기질 벡터를 1:1의 몰비로, 유전자 펄서(Gene pulser) (Bio-Rad)를 사용하여 300V 및 960μF에서 약 1 x 10⁷개 세포 속에 도입하였다. 전기천공 후, 세포를 10 cm 디쉬 상에 적당히 희석하여 넣었다. 단일-세포 현탁액을, 형질감염 후 24, 48, 및 72 시간째에 수득하였다. 죽은 세포를 7-아미노-액티노마이신 D (Sigma)로 염색시켜, 분석으로 부터 배제시키고, 세포를 FACScalibur (Becton Dickinson)로 분석하였다. FACS 데이터를 CellQuest^TM 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 분자간 재조합 분석을 위한 형질감염 효율을 각각의 실험에 대해 40㎍ pCMV를 20㎍ pEGFP-C1 (Clontech)와 함께 공동-형질감염시켜 측정하였으며; 분자내 재조합에 대한 효율은 30㎍ pCMV 및 30㎍ pEGFP-C1를 사용하여 측정하였다.

정제된 IHF에 관한 실험을, 먼저 30㎍의 Int 발현 벡터를 상기한 바와 같이 전기천공을 통해 약 6 x 10⁶개 세포로 도입시켜 수행하였다. 3 내지 4 시간 후, 약 1 x 10⁵개 세포를, 분자내 재조합을 위하여 2㎍의 기질 벡터로 형질감염시키거나, 또는 분자간 재조합을 위하여 총 2㎍의 기질 벡터를 1:1의 몰비로 형질감염시켰다. 기질을, 2㎍의 정제된 IHF [참조 문헌: Lange-Gustafson BJ, Nash HA. , Purification and properties of Int-h, a variant protein involved in site-specific recombination of bacteriophage lambda., J Biol Chem. 1984 Oct 25; 259 (20): 12724-32]와 함께 저 염 완충액 (50 mM NaCl, 10 mMTris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) 중에서 30분 이상 동안 실온에서 예비-항온배양하였다. IHF-DNA 복합체 의 형질감염은 FuGene (Boehringer Mannheim)를 사용하여 수득하였고, 효율은 항상 80%의 범위 내였다. 세포를, 상기와 같이 추가로 48 시간 후, 유동 세포측정에 의해 분석하였다.

하이포크산틴 및 티미딘(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 보충한 무혈청 배지 CHO-S-SFMII (Invitrogen, Carlsbad, CA) 중에 현탁액으로 영구적으로 성장시킨 CHO-DG44/dhfr^-/- 세포 (IJrlaub, G. et al. , (1983), Cell, 33, pp. 405)를, 5% C0²를 함유하는 가습 대기하, 37℃의 세포 배양 플라스크에서 항온배양하였다. 세포를 2 내지 3일 마다 1 - 3x 10⁵ 세포/mL의 농도로 새로운 배지에 시딩하였다.

CHO-DG44 세포의 안정한 형질감염을 Lipofectamine 플러스 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 수행하였다. 형질감염당, 0.8 mL 하이포크산틴/티미딘(HT)-보충된 CHO-S-SFMII 배지에서 6 x 10⁵개의 지수적으로 성장하는 세포를 6-웰 챔버 속에 시딩하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라, 200μL의 용적 중의 총 1㎍ 플라스미드 DNA, 4μL Lipofectamine 및 6μL 플러스 시약을 각각의 형질감염에 사용하고, 세포에 첨가하였다. 3 시간 동안의 항온배양 후, 2 mL의 HT-보충된 CHO-S-SFMII 배지를 첨가한다. 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 의한 선별의 경우, 배지를 형질감염한지 2일 후에, HT 및 400㎍/mL G418 (Invitrogen)가 보충된 CHO-S-SFMII 배지로 대체하고, 배지를 3 내지 3일 마다 교체하며 혼합된 세포군을 2 내지 3 주 동안에 선별한다. 안정한 형질감염된 CHO-DG44 새포의 DHFR에 기초한 선별의 경우에, 하이포크산틴/티미딘을 함유하지 않는 CHO-S-SFMII 배지를 사용한다. DHFR-에 기초한 유전자 증폭은, 5 내지 2000nM 메토트렉세이트 (Sigma,Deisenhofen, Germany)을 증폭 선별제로서 배지에 첨가함으로써 성취된다.

3. sICAM 및 MCP-1 ELISA

안정한 형질감염된 CHO-DG44 세포의 상청액 중의 sICAM 역가를 표준 프로토콜[Ausubel, F. M. et al. , (1994, updated) Current protocols in molecular biology. New York : Greene Publishing Associated and Wiley-Interscience]에 따라 사내 개발된 2개의 sICAM 특이적 모노클로날 항체(참조: 예를 들어 미국 특허 제5,284,931호 및 제5,475,091호)(이때 항체 중의 하나는 HRPO-접합된 항체이다)를 사용하여, ELISA로 정량화한다. 정제된 sICAM 단백질을 표준물로서 사용한다. 샘플을 Spectra Fluor Plus 판독기 (TECAN, Crailsheim, Germany)를 사용하여 분석한다.

안정한 형질감염된 CHO-DG44 세포의 상청액 중의 MCP-1 역가를, 제조업자의 프로토콜(BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Germany)에 따라 OptEIA 사람 MCP-1 셋트를 사용하여, ELISA로 정량화한다.

실시예 1: 분자내- 및 분자간 재조합 반응의 속도론

본 발명자는 앞의 연구에서, 돌연변이체 Int가 이.콜라이 및 사람 세포에서 천연 보조 인자의 부재하에서 분자내 통합성 및 절단성 재조합 반응을 촉매시킨다는 것을 보여주었다[참조 문헌: Christ, N. et al. (1999), supra; Lorbach, E. et al. (2000), supra]. 그러나, 포유동물 세포 내부의 에피솜 DNA의 상호작용에 관한 흥미로운 의문은 돌연변이체 Int가 분자간 재조합을 수행할 수 있는 능력, 즉 두 개의 재조합 부위가 상이한 DNA 분자에 트랜스로 위치하는 경우에 관한 것이다. 따라서, 본 발명자는 먼저 분자내- 및 분자간 통합성 재조합 반응을 비교하였다.

분자내 재조합을, attB 및 attP를 전사 종결 시그날에 플랭킹된 정배향 반복체로서 함유하는 기질을 사용하여 시험하였다. 이러한 재조합 카세트는 다시 CMV 프로모터 및 GFP에 대한 암호 서열에 의해 플랭킹된다. attB와 attP 사이의 재조합에 의해 하이브리드 부위 attL 및 attR가 생성되며, 종결 시그날의 절단이 유도된다. 따라서, GFP 유전자의 후속적 발현은 재조합 레포터로서 작용한다(도 2A, 상단).

Int, Int-h, 또는 Int-h/218에 대한 발현 벡터를 기질 벡터와 함께 HeLa 세포에 공동-형질감염시켰다. 발현 벡터 골격 (모조(mock))을 음성 대조군으로서 사용하였다. 각 실험에서 독립적으로 측정된 형질감염 효율은 95 내지 98% 범위 내였다(데이터는 제시되지 않음). 3회 실험으로 부터의 FACS 분석은, 두 개의 돌연변이체 Int가 모두 효율적으로 재조합을 촉매하여, 일부 실험에서는 약 30% GFP-발현 세포를 생성시켰다(도 2A, 하단). PCR 단편의 DNA 서열분석에 의해 간접적으로 측정된 재조합 생성물의 뉴클레오티드 서열은, 돌연변이체 Int에 의해 촉매된 쇄-전달-반응이 기대치 않은 하이브리드 att 부위를 생성시킨다는 것을 확인시켜 주었다 (데이터는 제시되지 않음).

이중 돌연변이체 Int-h/218가 Int-h 보다 활성인 반면, 야생형 Int가 거의 불활성이였다는 것이 명백하다. GFP-발현 세포의 분획이 형질감염 후 48 시간 동안 증가하였으며, 다음 24 시간 동안 안정하게 유지되었다. 반응의 시간 경과는 또한 재조합 현상의 대부분이 처음 24 시간 동안에 일어났다는 것을 나타낸다. 이는 HeLa 세포에서의 Int-h/218 발현의 시간 경과와 적절히 일치한다(데이터는 제시되지 않음). 비록 본 발명자가 GFP-발현 세포의 분획이 분자내 통합성 재조합 대신 분자간 재조합으로 부터 생성될 가능성을 배제할 수는 없지만, 데이터 셋트가 분자간 재조합의 분석을 위한 참조로서 사용될 수 있다.

본 발명자는, attB와 attP를 별도의 플라스미드에 배치하여, 분자간 통합성 재조합을 분석하였다. 재조합은 CMV 프로모터를 GFP 유전자의 상류 위치로 전좌시켰다(도 2B, 상단). 따라서, attB와 attP 사이의 분자간 재조합만이 GFP-발현 세포를 생성시킬 것이다. 두 개의 기질 벡터와 Int 발현 벡터의 공동-형질감염 후, FACS 분석은, 분자내 재조합에 대한 기질을 사용하여 생성된 것과 필적할 만한 결과를 나타내었다 (도 2B, 하단). 재차, 재조합 현상의 대부분은 형질감염 후 처음 24 시간 내에 일어남이 틀림없으며, Int-h/218가 Int-h 보다 활성이다. 야생형 Int는 매우 소량의 GFP-발현 세포만을 생성시켰다. 이들 결과는, 24 내지 72 시간 경과 동안에, 돌연변이 Int에 의한 분자간 통합성 재조합이 적어도 상응하는 분자내 반응 만큼 효율적이라는 것을 입증한다.

이어서, 동일한 실험 전략을 사용하여 분자내- 및 분자간 절단성 (attL x attR) 재조합 경로를 비교하였다. 당해 결과는 역시, 돌연변이체 Int에 의한 분자간 재조합이 분자내 재조합 만큼 효율적이라는 것을 보여주었다(도 2C 및 D). 그러나, 절단성 재조합 반응의 효율은 통합성 재조합에 비해 약간 감소하였다. 야생형 Int에 의한 재조합은 역시 거의 검출될 수 없었다.

실시예 2: att 내에 DNA 암(arm)-결합 부위가 요구되지 않으나, 재조합을 자극한다

지금까지의 결과는, 돌연변이 Int가 상당 수의 형질감염된 세포에서 에피솜 기질에 대해 통합성 및 절단성 재조합을 촉매한다는 것을 보여준다. 대조적으로, 야생형 Int의 재조합 활성은 배경 수준 이상으로 거의 검출되지 않았다. 야생형 Int에 의한 절단성 재조합이 단잭질 조인자 IHF 및 XIS에 의존하지만, 음성 DNA 초나선형성은 요구하지 않기 때문에, 이 결과는 이들 조인자의 진핵세포 상대가 사람 세포에는 결여되어 있다는 것을 입증한다. 또한, 에피솜 기질이 형질감염 후 위상학적으로 완화된다는 것이 공지되었다[참조 문헌:(Schwikardi et al. (2000) FEBS Letters, 471, pp. 147]. 따라서, 돌연변이 Int가 규명된 핵단백질 복합체, 예를 들면 attP에 어셈블링된 인타솜(intasome)의 부재하에서 재조합을 수행한다고 여겨진다. 이는 재조합에서 DNA 암-결합 부위의 기능적 역할에 대한 의문을 일으킨다. 이들은 지금까지 사용된 하나 이상의 파트너 att 부위에 존재하였다.

이러한 의문을 조사하기 위하여, 본 발명자는 다양한 조합으로 attB 또는 attP를 함유하는 기질 벡터의 쌍을 이용한 분자간 재조합을 사용하였다(도 3A). 재조합으로 부터 생성된 GFP-발현 세포의 분획을 Int 발현 벡터와의 공동-형질감염 후 48 시간째에 FACS에 의해 측정하였다. 형질감염 효율은 항상 90% 이상 이였다(데이터는 제시되지 않음). 3회의 실험의 결과는, attP 쌍 사이의 분자간 재조합이 attB와 attP 사이의 재조합 만큼 효율적이였다는 것을 보여준다(도 3B). 그러나, Int-h/218만이 attB 부위의 쌍을 기질로서 상당한 정도로 이용하였다. 이러한 반응의 효율은 평균적으로 attP와 attP 사이 또는 attB와 attP 사이의 반응에 비해 약 4배 감소되었다(도 3B). 따라서, 두 개의 attB 부위 사이의 재조합으로 부터 생성된 GFP-발현 세포의 분획은 4 내지 5%의 수준으로 저하되었다. 이들 결과는, att 부위 내에 암(arm) 유형의 서열의 존재가 Int-h/218에 의한 재조합에 요구되지 않으나, 당해 반응을 현저하게 자극한다는 것을 입증한다. 이러한 자극 효과는, Int-h가 사용되었을 때, 보다 더욱 현저하였다(약 8배). 추가로, 야생형 Int를 사용하여 관찰된 잔존 재조합 활성은 암(arm)-결합 부위의 존재에 매우 의존적이다.

실시예 3: 야생형 Int에 의한 재조합은 형질감염된 IHF 단백질에 의해 자극된다

시험관내 및 이.콜라이 내에서 야생형 Int에 의해 촉매된 효율적인 통합성 재조합은 단백질 조인자 IHF 및 attP의 초나선형성을 요구한다. 포유동물 세포에 조인자가 명백히 결여되어 있기 때문에, 본 발명자는, 초나선형성 기질과 함께 예비-항온배양된, 정제된 IHF가 HeLa 세포 내에 공동-도입되는 경우에, 야생형 Int의 잔존 재조합 활성이 증대되는지를 조사하였다. 이러한 가능성을 시험하기 위하여, 본 발명자는 먼저 야생형 Int 또는 Int-h에 대한 발현 벡터를 도입하였다. 전기천공 후, 3 내지 4 시간 째에, 분자내- 또는 분자간 재조합을 위한 기질을 정제된 IHF의 존재 또는 부재하에 항온배양하였다. 이어서, 단백질-DNA 혼합물 뿐만 아니라, 단백질-부재 대조군 샘플을 Fugene을 사용하여 형질감염시켰다(도 4A). GFP-발현 세포의 분획을 추가의 48 시간 후에 비교하였다.

3회의 실험으로 부터의 결과는 야생형 Int에 의한 분자내 재조합이, IHF의 존재로 인해, 평균적으로 최대 5배 까지 자극된다는 것을 보여준다. GFP-양성 세포의 분획이, 예를 들면 한 실험에서 IHF의 부재시 약 1%에서 이의 존재시 6%까지 증가되었다. 분자간 재조합에 대한 이러한 자극 효과가 또한 상당하지만, 덜 현저하였다(약 3배). 형질감염 후 48 시간 째에, 자극은 야생형 Int에 대해 특이적이였는데. 이는 Int-h의 활성이 영향받지 않기 때문이였다. 중요하게도, 대조군은 형질감겸 효율이 또한 IHF의 존재에 의해 영향받지 않는다는 것을 보여주었다 (데이터는 제시되지 않음).

실시예 4: 목적하는 유전자의 서열-특이적 재조합을 토대로 하는 개선된 단백질 발현 시스템

CHO-DG44 세포를, 조안터스 종(Zoanthus sp) 기원의 형광 단백질 ZsGreenl (Clontech Laboratories Inc. , Palo Alto, CA, U. S. A.) 및 항생물질 내성 유전자 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 발현하는 선형화된 제1 플라스미드로 안정하게 형질감염시켰다(도 5). 추가로, attB 또는 attP 재조합 서열(천연 또는 변형된 서열 또는 이의 유도체)를 형광 단백질 및 이의 프로모터 사이에 위치시킨다. 두 개의 선별 마커에 대한 전사 단위 밖에 단일 제한 부위를 갖는 제한 효소를 사용하여 선형화한 제1 플라스미드 DNA를 무작위 통합에 의해 CHO-DG44의 게놈 속에 도입한다. 제1 플라스미드 DNA의 성공적인 안정한 무작위 통합을 가진 세포를 항생물질 G418의 존재하에서 배양하여, 양성적으로 선별한다. 제1 플라스미드 DNA의 통합 부위에서 고도의 전사 활성을 가진 안정한 형질감염체 세포의 이질적 푸울(pool)을 단순히 도입된 형광 단백질 ZsGreenl의 발현 수준을 기준으로 하여 형광-활성화 세포 분류(FACS)에 의해 분리할 수 있다. 최고의 ZsGreenl 형광성을 가진 세포를 분류하여, 단일 세포로서 96 웰 플레이트의 웰 속에 넣는다. 생성된 세포 서브클론을 증대시키고, 단일 염색체 부위 내의 단일 플라스미드 서열의 통합에 대한 서던 블롯 분석에서의 제한 엔도뉴클리아제 맵핑에 의해 시험한다. 후자의 경우, 세포 서브클론의 게놈 DNA를, 도입된 제1 플라스미드 DNA 내에 제한 부위가 없거나, 하나이거나 여러개 있는 제한 효소로 각각 분해하고, 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하고, 양전하의 나일론 막(Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)으로 옮긴다. 하이브리드화를 밤새 65℃의 하이브리드화 오븐에서, 유전자 영상 램덤 프라임 표지화 모듈(Gene Images random prime labelling module) (Amersham Biosciences)의 프로토콜에 따른 ZsGreenl 유전자로 이루어진 랜덤-프라임된(radom-primed) FITC-dUTP 표지화된 프로브를 사용하여 수행한다. 후속적으로, 단일 복사체 삽입물을 가진 후보 서브클론을 소규모의 생물반응기내에서, 생산-모사 유가식(fedbatch) 공정에서의 이의 성능에 대해 시험하였다. ZsGreenl 형광성을 측정하여 모니터된, 완전한 생산 국면 동안의 고 발현 수준외에, 다른 중요한 파라미터, 예를 들면 고 세포 밀도에서의 높은 생존능, 대사 및 재생 기능을 고려한다. 이러한 방법에 의해, 통합된 제1 att 재조합 서열을 적당한 숙주 세포가 동정된다. 서열-특이적 재조합에 의해 생물약제를 생성하는 생산 세포주를 제조하기 위하여, 상기 숙주 세포를, attB 또는 attP 재조합 서열(천연 또는 변형된 서열 또는 이의 유도체) 및 목적하는 유전자의 발현을 위한 완전한 전사 단위, 예를 들면 감기 치료제 ICAM (가용성 세포간 접착 분자 1) 또는 사람 단구 화학주성 단백질-1(MCP-1)에 선행하는 프로모터결여 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자를 함유하는 제2 플라스미드 DNA(도 5 참조)로 형질감염시킨다. 추가로, 돌연변이된(변형된) 박테리오파아지 람다 인테그라제를 발현하는 벡터 pCMVSSInt-h/218를 공동-형질감염시킨다. 형질감염 후, Int-h/218의 일시적 발현은, 숙주 게놈 내의 바람직한 전사 활성화 유전자좌에 위치한 제1 att 재조합 부위(attP 또는 attB)와, 도입된 제2 DNA 플라스미드 상의 제2 att 재조합 부위 (attP 또는 attB) 사이의 서열-특이적 분자간 재조합을 수행하는데 충분하다. attP와 attP, attP와 attB 또는 attB와 attB 사이에서 서열-특이적 재조합이 일어나는 세포를 선별하기 위하여, 제1 및 제2 DNA 플라스미드 상의 재조합 서열의 선택에 따라, 형질감염된 세포를 옮겨서, 하이포크산틴 및 티미딘이 보충되지 않은 CHO-S-SFMII 배지에서 배양한다. 정확한 표적화만이, 제2 DNA 플라스미드 상에 상류의 att 재조합 부위를 가진 프로모터결여 dhfr-마커 유전자를 ZsGreenl 유전자의 프로모터 서열의 조절하에, 하류의 att 재조합 부위로 대체하여, 세포 생존 선별을 유도하여, dhfr 선별 마커 유전자의 효율적인 발현을 가능케한다. 동시에, ZsGreenl 유전자의 기능적 발현 카세트를 중단시켜, 프로모터결여 ZsGreenl 유전자를 뒤에 남긴다. 따라서, 세포는 형광성 단백질을 더 이상 발현하지 않는다. 비-형광성 세포는 FACS에 동정되고 분리하여, 목적하는 단백질을 생성하는 세포를 검출하는 수단을 제공한다. 추가로, 서열-특이적 통합은, 서던 블롯, 부위-특이적 재조합 전 및 후에 att 부위를 플랭킹하는 서열에 위치한 프라이머를 이용한 PCR 분석, 및 후속적인 DNA 서열분석에 의해 입증된다. 목적하는 단백질, sICAM 또는 MCP-1의 발현은 ELISA로 분석된다.

생산 세포주의 생성을 위한 마커 유전자로서의 dhfr의 사용은 양성 선별을 제공할 뿐만 아니라, 메토트렉세이트-유도된 DHFR-에 의한 유전자 증폭에 의해 세포의 생산성을 증가시킬 가능성을 제공한다. 이는 하이포크산틴/티미딘-부재 배양 배지 CHO-S-SFMII에 증가하는 양의 메토트렉세이트를 보충함으로써 달성된다.

<110> BOEHRINGER INGELHEIM PHARMA GmbH & Co. KG; Droge, Peter <120> Sequence specific DNA recombination in eukaryotic cells <130> DRO-003 PCT <150> CA 2,413,175 <151> 2002-11-28 <150> US 10/310,695 <151> 2002-12-05 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for Int binding-site <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> c or a <400> 1 magtcactat 10 <210> 2 <211> 243 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attP derivative <400> 2 tctgttacag gtcactaata ccatctaagt agttgattca tagtgactgc atatcttgtg 60 ttttacagta ttatctagtc tgttttttat ccaaaatcta atttaatata ttgatattta 120 tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tatactaagt tggcattata aaaaagcatt 180 gcttatcaat ttgttgcaac gaacaggtca ctatcagtca aaataaaatc attatttgat 240 ttc 243 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gtcactatca gtcaaaatac aatca 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 tgattgtatt ttgactgata gtgac 25 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ccaatgcatc ctctgttaca ggtcactaat ac 32 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ataagaatgc ggccgcagat atcagggagt gggacaaaat tgaa 44 <210> 7 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 tttggataaa aaacagacta gataatactg taaaacacaa gatatgcagt cacta 55 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 taacgcttac aatttacgcg t 21 <210> 9 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 ctgcatatct tgtgttttac agtattatct agtctgtttt ttatccaaaa tctaa 55 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 ctggacgtag ccttcgggca tggc 24 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 gactgctgca gctctgttac aggtcac 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 gactgtctag agaaatcaaa taatgat 27 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 13 ctgctttttt atactaactt g 21 <210> 14 <211> 243 <212> DNA <213> Bacteriophage lambda <400> 14 tctgttacag gtcactaata ccatctaagt agttgattca tagtgactgc atatgttgtg 60 ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta 120 tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tatactaagt tggcattata aaaaagcatt 180 gcttatcaat ttgttgcaac gaacaggtca ctatcagtca aaataaaatc attatttgat 240 ttc 243 <210> 15 <211> 102 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 15 ctgctttttt atactaagtt ggcattataa aaaagcattg cttatcaatt tgttgcaacg 60 aacaggtcac tatcagtcaa aataaaatca ttatttgatt tc 102 <210> 16 <211> 162 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 16 tctgttacag gtcactaata ccatctaagt agttgattca tagtgactgc atatgttgtg 60 ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta 120 tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tatactaact tg 162 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 gaaattcttt ttgatactaa cttgtgt 27

Claims (39)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. a) attB (서열번호 13), attP (서열번호 14), attL (서열번호 15) 또는 attR (서열번호 16) 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 제1 재조합 서열을 포함하는 제1 DNA를 진핵 숙주 세포 내로 도입하는 단계;

   b) 높은 세포 밀도에서의 높은 생존능, 대사 및 생성 동안 높은 발현 및 재생 성능을 가능하게 하는 능력 중 하나 이상의 파라미터에 기초하여, 생산 유가식 (fedbatch) 공정을 모방하는 소규모 생물반응기에서 후보 서브클론을 선별하는 단계;

   c) attB (서열번호 13), attP (서열번호 14), attL (서열번호 15) 또는 attR (서열번호 16) 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 제2 재조합 서열, 및 목적하는 치료 폴리펩티드(들) 또는 생성물(들)을 암호화하는 하나 이상의 목적하는 유전자를 포함하는 제2 DNA를 단계 b)에서 선별된 세포 내로 도입하는 단계;

   d) 상기 세포를 박테리오파아지 람다 인테그라제 Int와 접촉시키는 단계;

   e) 박테리오파아지 람다 인테그라제 Int에 의해 서열 특이적 재조합을 수행하여, 제2 DNA를 제1 DNA에 통합시키는 단계;

   f) 상기 세포를 목적하는 유전자(들)가 발현되는 조건하에서 무혈청 배지에서의 현탁 배양으로 배양하는 단계; 및

   g) 숙주 세포 또는 세포 배양 배지로부터 목적하는 치료 폴리펩티드(들) 또는 생성물(들)을 분리하는 단계를 포함하여, 진핵 세포에서 하나 이상의 치료 폴리펩티드(들) 또는 생성물(들)을 암호화하는 하나 이상의 목적하는 유전자를 발현시키는 시험관내 또는 생체외 방법.
5. 제4항에 있어서,

   제1 DNA 서열이 attB 서열을 포함하는 경우에 제2 서열은 attB, attL 또는 attR 서열을 포함하거나, 또는 제1 DNA 서열이 attP 서열을 포함하는 경우에 제2 서열은 attP, attL 또는 attR 서열을 포함하거나, 또는 제1 DNA 서열이 attL 서열을 포함하는 경우에 제2 서열은 attB, attP 또는 attL 서열을 포함하거나, 또는 제1 DNA 서열이 attR 서열을 포함하는 경우에 제2 서열은 attB, attP 또는 attR 서열을 포함하는 시험관내 또는 생체외 방법.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 제2 DNA가 숙주 세포로 도입되기 전에, 제1 DNA가 숙주 세포의 게놈, 인공 염색체 또는 미니염색체 또는 에피솜 요소에 통합되는 시험관내 또는 생체외 방법.
7. 제6항에 있어서, 제1 DNA가 숙주 세포 게놈에 통합되는 시험관내 또는 생체외 방법.
8. 삭제
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10. 삭제
11. 제4항에 있어서, 서열-특이적 재조합이 Int, 및 엑시지오나제 (excisionase: XIS), 역위 자극을 위한 인자 (factor for inversion stimulation: FIS) 및 통합 숙주 인자 (integration host factor: IHF)로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 조인자에 의해 수행되는 시험관내 또는 생체외 방법.
12. 제11항에 있어서, Int, XIS, FIS 또는 IHF가 정제된 형태로 세포에 첨가되거나, 서열-특이적 재조합이 수행되는 숙주 세포에 의해 공동-발현되는 시험관내 또는 생체외 방법.
13. 제4항에 있어서, 서열-특이적 재조합이 변형된 Int에 의해 수행되는 시험관내 또는 생체외 방법.
14. 제11항에 있어서, 서열-특이적 재조합이 변형된 Int에 의해 수행되는 시험관내 또는 생체외 방법.
15. 제14항에 있어서, 변형된 Int가 Int-h 또는 Int-h/218인 시험관내 또는 생체외 방법.
16. 제15항에 있어서, Int-h, Int-h/218, XIS, FIS 또는 IHF가 정제된 형태로 세포에 첨가되거나, 서열-특이적 재조합이 수행되는 숙주 세포에 의해 공동-발현되는 시험관내 또는 생체외 방법.
17. 제4항에 있어서, Int 유전자, 또는 Int 유전자와, XIS 유전자, FIS 유전자 및 IHF 유전자로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 조인자 유전자를 각각 포함하는 제3 DNA 서열, 또는 제3 및 제4 DNA 서열이 세포에 추가로 도입되는 시험관내 또는 생체외 방법.
18. 제4항에 있어서, 서열-특이적 재조합이 변형된 Int에 의해 수행되는 경우에 XIS, FIS 및 IHF가 요구되지 않는 시험관내 또는 생체외 방법.
19. 제4항에 있어서, 제1, 제2, 또는 제1 및 제2 재조합 서열이 목적하는 치료 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함하는 시험관내 또는 생체외 방법.
20. 제4항에 있어서, 목적하는 치료 폴리펩티드가 항체, 호르몬 또는 성장 인자인 시험관내 또는 생체외 방법.
21. 제4항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 시험관내 또는 생체외 방법.
22. 제21항에 있어서, 포유동물 세포가 설치류 세포인 시험관내 또는 생체외 방법.
23. 제22항에 있어서, 설치류 세포가 마우스 세포 또는 햄스터 세포인 시험관내 또는 생체외 방법.
24. 제23항에 있어서, 햄스터 세포가 BHK 또는 CHO 세포이고, 마우스 세포가 쥐 골수종 세포인 시험관내 또는 생체외 방법.
25. 제18항에 있어서, 서열-특이적 재조합이 Int-h 또는 Int-h/218에 의해 수행되는 경우에 XIS, FIS 및 IHF가 요구되지 않는 시험관내 또는 생체외 방법.
26. 제11항에 있어서, Int 유전자, 또는 Int 유전자와, XIS 유전자, FIS 유전자 및 IHF 유전자로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 조인자 유전자를 각각 포함하는 제3 DNA 서열, 또는 제3 및 제4 DNA 서열이 세포 속에 추가로 도입되는 시험관내 또는 생체외 방법.
27. 제13항에 있어서, Int 유전자, 또는 Int 유전자와, XIS 유전자, FIS 유전자 및 IHF 유전자로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 조인자 유전자를 각각 포함하는 제3 DNA 서열, 또는 제3 및 제4 DNA 서열이 세포 속에 추가로 도입되는 시험관내 또는 생체외 방법.
28. 제15항에 있어서, Int 유전자, 또는 Int 유전자와, XIS 유전자, FIS 유전자 및 IHF 유전자로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 조인자 유전자를 각각 포함하는 제3 DNA 서열, 또는 제3 및 제4 DNA 서열이 세포 속에 추가로 도입되는 시험관내 또는 생체외 방법.
29. 제7항에 있어서, 제1, 제2, 또는 제1 및 제2 재조합 서열이 목적하는 치료 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함하는 시험관내 또는 생체외 방법.
30. 삭제
31. 삭제
32. 제11항에 있어서, 제1, 제2, 또는 제1 및 제2 재조합 서열이 목적하는 치료 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함하는 시험관내 또는 생체외 방법.
33. 제13항에 있어서, 제1, 제2, 또는 제1 및 제2 재조합 서열이 목적하는 치료 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함하는 시험관내 또는 생체외 방법.
34. 제15항에 있어서, 제1, 제2, 또는 제1 및 제2 재조합 서열이 목적하는 치료 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함하는 시험관내 또는 생체외 방법.
35. 삭제
36. 제11항에 있어서, 목적하는 치료 폴리펩티드가 항체, 호르몬 또는 성장 인자인 시험관내 또는 생체외 방법.
37. 제13항에 있어서, 목적하는 치료 폴리펩티드가 항체, 호르몬 또는 성장 인자인 시험관내 또는 생체외 방법.
38. 제15항에 있어서, 목적하는 치료 폴리펩티드가 항체, 호르몬 또는 성장 인자인 시험관내 또는 생체외 방법.
39. 제19항에 있어서, 목적하는 치료 폴리펩티드가 항체, 호르몬 또는 성장 인자인 시험관내 또는 생체외 방법.

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