CN1717489A - 真核细胞中的序列特异性dna重组 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及真核细胞中DNA的序列特异性重组方法，包括将含有包含至少一个重组序列核苷酸序列的第一个DNA引入细胞中，将含有包含至少另一个重组序列核苷酸序列的第二个DNA引入细胞中，通过λ噬菌体整合酶Int进行序列特异性重组。
Description
本发明涉及一种真核细胞中的DNA序列特异性重组方法，包括将含有包含至少一个重组序列的核苷酸序列的第一个DNA引入细胞中，将含有包含至少一个另外的重组序列的核苷酸序列的第二个DNA引入细胞中，并通过λ噬菌体整合酶Int进行序列特异性重组。
对真核基因组进行有控制的操作以及从附加型载体表达重组蛋白是分析有生命的生物中特定基因的功能的重要方法。而且，所述操作在医学的基因治疗方法中也发挥作用。在这种背景下，转基因动物的产生，基因或基因片段的改变(所谓的“基因寻靶(gene targeting)”)，以及外源DNA定向整合到高等真核生物的基因组中，这些都具有特别的重要性。目前，可以通过序列特异性重组系统的鉴定和应用来改进这些技术。
另外，将编码和表达所需多肽/产物的表达盒经序列特异性整合引入生物技术学相关的宿主细胞的基因组中，这对于制备生物药也更加重要。在稳定转化的细胞系中，所需多肽的表达水平依赖于整合的位点。通过序列特异性整合，可以优先使用具有高转录活性的位点。产生表达所需多肽/产物的生产细胞系的常规方法是基于重组表达载体在宿主细胞基因组中的随机整合。在稳定转化的细胞系中，整合的目标基因的表达水平的变化主要归因于染色体位置和拷贝数的差异。临近异染色质的随机整合导致可变化的转基因表达水平。促进整合的目标基因表达的染色体位置被认为是常染色质的转录活性区域。这种整合的随机性使重组细胞耐用性，生产能力以及品质有很大的多样性，迫使需要一种精细的筛选方法以鉴别和分离高水平表达所需多肽的适合的细胞克隆。此外，异质性还意味着不得不对每一个克隆研制一种最优化的生产方法，这使得研制适合的生产细胞系成为一个耗时，劳动密集型和昂贵的过程。
保守性序列特异性DNA重组酶分为两个家族。第一个家族，所谓的“整合酶”家族的成员，催化两个确定的核苷酸序列(在下文中被称作重组序列)之间的DNA链的断裂和再接合。所述重组序列或者在两个不同的DNA分子上，或者在一个DNA分子上，从而分别导致分子间或分子内重组。对于分子内重组，反应结果依赖于重组序列相互的各自方向。在倒置的情况下，即重组序列的方向相反时，重组序列之间的DNA片段发生倒位。在同方向(direct)的情况下，即DNA底物上重组序列串连重复时，会发生删除。在分子间重组的情况下，即如果两个重组序列位于两个不同的DNA分子上的情况，这两个DNA分子可以融合。整合酶家族的成员通常既催化分子内重组也催化分子间重组，而第二个家族的重组酶，所谓的“转化酶/解离酶”仅能催化分子内重组。
目前，用于操作真核基因组的重组酶属于整合酶家族。所述的重组酶是P1噬菌体的Cre重组酶和来自酵母的Flp重组酶(Müller，U.(1999)Mech.Develop.，82，pp.3)。Cre重组酶结合的重组序列命名为loxP。LoxP是一个34bp长的核苷酸序列，由两个1 3bp长的倒置核苷酸序列和一个8bp长的位于所述倒置序列之间的间隔区组成(Hoess，R.et al.(1985)J.Mol.Biol.，181，pp.351)。命名为FRT的Flp结合序列具有类似的结构。然而，它们与loxP不同(Kilby，J.et al.(1993)Trends Genet.，9，pp.413)。因此，重组序列不能互相替换，即Cre不能重组FRT序列，FLP不能重组loxP序列。两个重组系统都是对长距离有活性的，即被倒置或删除以及被两个loxP或FRT序列侧翼连接的DNA片段可以是数个10000碱基对长。
例如，可以用所述两个系统实现小鼠体系中的组织特异性重组，植物和动物中的染色体易位，以及基因表达的受控诱导；Müller，U.(1999)Mech.Develop.，82，pp.3的综述性文章。在小鼠的特定组织中，DNA聚合酶β以这种方法被删除；Gu，H.et al.(1994)Science，265，pp.103。另一个例子是，DNA肿瘤病毒SV40癌基因在小鼠晶状体中特异性激活，导致在这些组织中排他性的肿瘤形成。Cre-loxP策略还可与诱导型启动子联合使用。例如，重组酶的表达由干扰素-诱导型启动子调节，导致特定基因在肝脏而不在其它组织中(或者在其它组织中仅仅是低程度的)删除；Kühn，R.et al.(1995)Science，269，pp.1427。
迄今为止，转化酶/解离酶家族的3个成员已用于操作真核基因组。Mu噬菌体转化酶Gin的突变体，无需辅因子(cofactor)也能催化植物原生质体中的DNA片段倒位。然而，已发现这种突变体具有超级的导致重组的能力，即它还催化DNA链在其天然重组序列之外的其它位置断裂。这导致了植物原生质体基因组中不期望的部分致死重组事件。化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)的β-重组酶催化小鼠细胞培养物中两个作为同向重复(direct repeat)的重组序列之间的重组，导致片段删除。然而，删除的同时还检测到了倒位，这使得该系统不适于受控用于操作真核基因组。大肠杆菌γδ解离酶的突变体已显示出对附加型基因组重组序列和人为引入的基因组重组序列有活性，但后一种反应的效率仍然相当低。
分别用Cre和Flp重组酶操作真核基因组显示出显著的缺点。在删除的情况下，即基因组中两个串连重复的loxP或FRT重组序列重组的情况下，会有所述串连重复之间的DNA片段的不可逆丢失。这样，位于该DNA片段的基因将从细胞和生物体中永久性的丢失。因此，重建初始状态以便对基因在例如生物较后期发育阶段的功能进行新的分析是不可能的。删除导致的DNA片段不可逆的丢失可以通过相应DNA片段的倒位来避免。基因通过倒位在不被丢失的情况下即可被灭活，然后在较后期的发育阶段或成年动物中，通过回复重组(back recombination)适时调节重组酶的表达，可以再被激活。然而，在这种改进方法中使用Cre和Flp重组酶有如下缺点：不能对倒位进行调节，因为重组事件并不使重组序列改变。因此，反复发生重组事件，引起各自基因失活，这是由于相应DNA片段的倒位仅在一些靶细胞，最多50％的靶细胞中达到反应平衡。有人尝试通过构建在一次重组之后不能用于进一步的反应的突变的loxP序列，来解决，至少部分解决这个问题。然而，该缺点是该反应特有的，即通过倒位灭活基因之后，不能随后通过回复重组激活基因。
Flp重组酶的另一个缺点是其在37℃热稳定性降低，这样明显限制了在高等真核生物，例如体温约39℃的小鼠，中的重组反应效率。因此，制备了比野生型重组酶热稳定性高的Flp突变体。然而，甚至这些突变的Flp酶仍然显示低于Cre重组酶的重组效率。
序列特异性重组酶的另一个用途是在医学领域，例如基因治疗，其中重组酶将所需DNA片段以稳定的和可控的方式整合到相应人靶细胞的基因组中。Cre和Flp都能催化分子间重组。这两种重组酶使带有一拷贝的其各自重组序列的质粒DNA与经由同源重组已预先插入真核基因组的相应的重组序列进行重组。然而，希望这个反应包括真核基因组中“天然”存在的重组序列。因为，loxP和FRT分别是34和54个核苷酸长，作为基因组的一部分的这些重组序列发生准确匹配在统计学上不太可以。即使存在重组序列，上面提到的回复反应的缺点仍然存在，即Cre和Flp重组酶都可以在通过分子内重组成功的整合之后，切除插入的DNA片段。
因此，本发明的一个问题是提供简单的和可控的重组系统以及所需的操作方法(working means)。本发明的另一个问题是提供重组系统以及所需的操作方法，它可以对所需DNA序列进行稳定的定向整合。本发明的另一个问题是提供一种方法，它允许基于这些重组系统中的一种来产生改良的蛋白表达系统。
所述问题由权利要求描述的主题来解决。
用下述例证更详细的解释本发明。
图1是重组反应，即野生型整合酶Int催化的整合和切除的示意图。显示了带有一拷贝重组序列attP的超螺旋质粒DNA(顶部)。AttP含有5个所谓的Int臂结合位点(P1，P2，P1′，P2′，P3′)，2个核心Int结合位点(C和C′；用黑色箭头标示)，3个IHF结合位点(H1，H2，H′)，2个Xis结合位点(X1，X2)以及所谓的重叠区(空心矩形)，此处发生实际的DNA链交换。在下面的线状DNA上显示出attP，attB的天然配对(partner)序列，它含有2个Int核心结合位点(B和B′；用空箭头标示)以及重叠区。对于attB和attP之间的重组，Int和IHF是将质粒整合到带有attB的DNA片段中所必需的。从而形成两个新的作为切除的靶序列的杂合重组序列attL和attR。后一种反应需要野生型Int和IHF，以及另一个由λ噬菌体编码的辅因子XIS。
图2显示的是分子内和分子间的重组反应。(A)是分子内整合(attB×attP)重组。(B)是分子间整合(attB×attP)重组。(C)是分子内切除(attL×attR)重组。(D)是分子间切除(attL×attR)重组。在每组的上部示意性地画出了底物载体和预期的重组产物。在用底物和表达载体共转染之后的3个时间点通过FACS测量GFP-表达细胞的比例。我们显示了三次分析的平均值以及用垂直线代表的标准差。
图3显示的是att位点上Int臂-结合DNA序列的存在刺激分子间重组。(A)是含有不同组合形式的attB或attP的几对分子间重组底物载体，以及产生的由CMV启动子驱动表达GFP的产物。(B)各种组合的底物载体与野生型Int，突变型Int-h或Int-h/218的表达载体共转染。48h，用FACS分析细胞，并测量两对底物的GFP-表达细胞的比例。如图所示，以attP和attP之间的重组作为参照。我们显示了三次分析的平均值和用垂直线代表的标准差。Int的GFP-表达细胞的实际平均值(％)是0.08(B×B)，1.24(P×P)，和0.81(P×B)。Int-h的是1.15(B×B)，8.07(P×P)，和9.90(P×B)。Int-h/218的是4.01(B×B)，17.62(P×P)，和16.45(P×B)。
图4显示的是纯化的IHF蛋白刺激由野生型Int进行的分子内和分子间整合式重组。(A)在转染到瞬时表达野生型Int或Int-h的HeLa细胞之前与或不与IHF温育的底物载体的示意图。(B)是转染后48h，用FACS分析GFP-表达细胞的比例。这些比例之比相对于由IHF引起的重组激活进行作图。此图显示了三次分析的平均值和用垂直线指示的标准差。存在和不存在IHF时，GFP-表达细胞的实际平均值(％)分别是，分子内重组Int(7.93/1.26)，Int-h(17.57/13.14)；分子间重组Int(13.94/3.47)，Int-h(20.33/16.83)。
图5显示了设计用于在CHO-DG44细胞中进行序列特异性DNA重组的表达载体的示例。“P/E”指包含增强子和启动子元件的组合单元，“P”是启动子元件，“T”是转录的mRNA聚腺苷酸化所必需的转录终止位点。“GOI”指目标基因，“dhfr”指可扩增的选择性标记二氢叶酸还原酶，“FP”指荧光蛋白，如ZsGreen，“npt”指选择性标记新霉素磷酸转移酶。箭头表示转录单元中转录起始点。位于第一个DNA上的重组位点attP或attB与位于第二个DNA上的重组位点attP或attB之间的序列特异性重组用交叉线表示，并由λ噬菌体整合酶介导。“att”指示例性显示出的分别由位于第一个和第二个DNA的attP和attP，attP和attB，attB和attP，或attB和attB之间的重组形成的附着位点。
所用的术语“转化”或“进行转化”，“转染”或“进行转染”指任何将核酸序列引入细胞的引入作用，它导致遗传修饰的，重组的，转化的或转基因的细胞。引入以本领域已知的任何方法以及如Sambrook，J.et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York or Ausubel，F.M.et al.(1994 updated)CurrentProtocols in Molecular Biology，New York：Greene Publishing Associates andWiley-Interscience所描述的方法进行。所述方法包括，但不限于脂质转染，电穿孔，多聚阳离子(如DEAE-葡聚糖)-介导的转染，原生质体融合，病毒感染以及显微注射，或以钙法，电休克法，静脉内/肌内注射，喷雾法(aerosolinhalation)或卵母细胞注射的方式进行。转化可导致宿主细胞瞬时的或稳定的转化。术语“转化”或“进行转化”还指以各个病毒各自的天然方式引入病毒核酸序列。病毒核酸序列无需以裸露的核酸序列形式存在，但可以包装在病毒蛋白包膜内。因此，该术语不仅仅涉及在“转化”或“进行转化”术语下通常已知的方法。优选能提供最适的转染频率和所引入核酸的表达的转染方法。用常规程序可以确定合适的方法。对稳定的转染子，构建体或者整合到宿主细胞基因组或人工染色体/微染色体中，或者以附加体的形式存在以便在宿主细胞中稳定维持。
本文所用的术语“重组序列”涉及attB，attP，attL和attR及其衍生物。attB序列的例子如SEQ ID NO：13具体所示，attP序列的例子如SEQ IDNO：14具体所示，attL序列的例子如SEQ ID NO：15具体所示，attR序列的例子如SEQ ID NO：16具体所示。
本文所用的术语“衍生物”涉及与天然存在的attB，attP，attL和attR序列比较，在重叠区和/或核心区有一个或多个，优选7个，更优选2，3，4，5或6个取代的attB，attP，attL和attR序列。术语“衍生物”还涉及attP，attL或attR的至少一个核心Int结合位点加一个或多个拷贝的Int臂结合位点。术语“衍生物”还涉及attP，attL或attR的至少一个核心Int结合位点加一个或多个拷贝的IHF，FIS或XIS因子结合位点。术语“衍生物”还涉及这些特征的组合。术语“衍生物”此外还涉及其任何功能片段以及真核细胞中支持序列特异性重组的内源核苷酸序列，例如在人基因组中鉴别出的attH(参见，例如WO01/16345)。术语“衍生物”通常包括适于实现本发明预期用途的attB，attP，attL或attR序列，这意味着这些序列介导由λ噬菌体整合酶(野生型或修饰型)驱动的序列特异性重组事件。
术语“功能性片段”涉及具有取代，缺失和/或插入的attB，attP，attL和attR序列(包括野生型或修饰的蛋白结合位点的存在或缺失)，所述取代，缺失和/或插入不会显著影响所述序列在由野生型或修饰型λ噬菌体整合酶驱动的重组事件中的应用。与相应的天然存在的重组序列，用相同的重组酶，在相同的条件下(例如，体外或体内使用，同样的宿主细胞类型，同样的转染条件，存在或缺乏相同的宿主因子，相同的缓冲条件，同样的温度，等)比较，当重组频率为至少约70％，优选至少约80％，更优选约90％，进一步优选至少约95％，最优选超过100％时，功能性没有受到显著的影响。或者attB，attP，attL和/或attR序列的取代，缺失和/或插入给予由野生型或修饰型λ噬菌体整合酶驱动的重组事件至少一个促进作用，所述促进可以包括，例如与相应天然重组序列用相同重组酶在相同条件下的表现(见上文)相比，(i)提高重组事件(整合和/或切除)的效率，(ii)提高重组的特异性，(iii)利于切除式重组事件，(iv)利于整合式重组事件，(v)消除对一些或全部宿主因子的需要。
修饰的重组位点或修饰的整合酶的功能可以用依赖于所需具体特征的方法来证明，并且是本领域已知的。例如，本发明所描述的共转染试验(参见结论5.1或WO 01/16345的实施例3)可用于描述在各种细胞系中整合酶-介导的染色体外DNA重组的特征。简单的说，用编码整合酶蛋白的表达载体和底物载体共转染细胞，所述底物载体是重组酶的底物，编码功能性/非功能性报告基因(例如，荧光蛋白如GFP)并且其中含有至少一个重组序列。一旦表达载体表达整合酶，报告基因的功能将成为非功能性/功能性的。因此，重组活性可以通过收获重组的底物载体并寻找DNA水平的重组证据(例如，通过PCR，重组区序列分析，限制酶分析，Southern印迹分析)进行分析，或者通过寻找蛋白水平的重组证据(例如，ELASA，Western印迹分析，放射免疫分析，免疫沉淀，免疫染色，荧光蛋白的FACS分析)进行分析。
本文所用的术语“重叠区”定义了重组序列中发生DNA链交换，包括链断裂和再连接的序列，其涉及野生型att位点的共有DNA序列5′-TTTATAC-3′，或者所述序列具有功能性核苷酸取代。唯一的前提是，重组配对序列之间的重叠区的序列是相同的。
术语“核心结合位点”涉及在每组野生型att位点中，2个采取倒转的方向，并被重叠区分隔的不完全重复的拷贝。核心结合位点对于以低亲和力结合重组酶来进行重组是必需的。每个核心结合位点包含9个紧邻的碱基对并涉及下列DNA序列，所述序列在B-序列的情况下在野生型att位点含有5′-CTGCTTTTT-3′的核苷酸序列，在B′-序列的情况下在野生型att位点含有5′-CAAGTTAGT-3′的核苷酸序列(反向互补链)，在C-序列的情况下在野生型att位点含有5′-CAGCTTTTT-3′的核苷酸序列，在C′-序列的情况下在野生型att位点含有5′-CAACTTAGT-3′的核苷酸序列(反向互补链)，或者所述序列具有功能性核苷酸取代。
本文所用的术语“Int臂结合位点”或“臂结合位点”涉及共有序列5’-C/AAGTCACTAT-3’，或者所述序列具有功能性核苷酸取代。Int臂结合位点可以位于核心Int结合位点的上游和/或下游的各种距离处。
本文所用的关于重组序列，臂-结合位点和宿主因子结合位点的术语“同系物”或“同源”或“类似”涉及与天然存在的重组序列，臂-结合位点和宿主因子结合位点比较，具有约70％，优选约80％，更优选约85％，再优选约90％，进一步优选约95％，最优选约99％同一性的核酸序列。例如在NCBI的相似性运算法则BLAST中使用标准参数(Basic Local AlignmentSearch Tool，Altschul et al.，Journal of Molecular Biology 215，403-410(1990))，被视为同源或相似的序列，当与重组序列比较时，显示出概率P＜10-5。
本文所用的术语“载体”涉及用于在细胞中吸收，增殖，表达或传递核酸的天然存在的或合成产生的构建体，例如质粒，噬菌粒，粘粒，人工染色体/微染色体，噬菌体，病毒或逆转录病毒。用来构建载体的方法是本领域技术人员熟知的，并且在各种出版物中都有描述。特别是，构建合适载体的技术，包括功能性和调节性成分（如启动子，增强子，终止子和聚腺苷酸化信号，选择标记，复制起始点和剪接信号)的说明，在Sambrook，J.etal.(1989)，出处同上以及本文引用的参考文献中以大量的细节进行了综述。真核表达载体典型地还包含促进载体在细菌中增殖的原核序列，如复制起始点和用于在细菌中进行筛选的抗生素抗性基因。包含能有效连接多核苷酸的克隆位点的多种真核表达载体是本领域已知的，并且其中一些可从如Stratagene，La Jolla，CA；Invitrogen，Carlsbad，CA；Promega，Madison，WI orBD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA.公司从商业途径获得。
本文所用的术语“目标基因”，“所需序列”或“所需基因”含义相同，指任何长度的编码目标产物的多核苷酸序列。所选的序列可以是全长的或截短的基因，融合的或标记的基因，可以是cDNA，基因组DNA，或DNA片段，优选cDNA。它可以是天然序列，即天然存在形式，或按照期望进行突变或修饰。这些修饰包括使在所选择的宿主细胞中使用的密码子最优化的密码子优化，人源化或标记化。所选择的序列可编码分泌的，细胞质的，核的，膜结合的或细胞表面的多肽。“目标产物”包括蛋白，多肽，其片段，肽，反义RNA，所有这些都能在所选择的宿主细胞中表达。
本文所用的术语“核酸序列”，“核苷酸序列”或“DNA序列”指寡核苷酸，核苷酸或多核苷酸及其片段和部分，以及基因组来源或合成来源的DNA或RNA，它们可以是单链或双链，并代表正义链或反义链。所述序列可以是非编码序列，编码序列或两者的混合。本发明的多核苷酸包括其中一个或多个密码子被其同义密码子替换的核酸区域。
本发明的核酸序列可以利用本领域技术人员熟知的标准技术制备。术语“编码”指核酸中特定核苷酸序列(如染色体中的基因或mRNA)的固有性质，所述固有性质是作为在生物学过程中合成其它具有指定核苷酸序列(即rRNA，tRNA，其它RNA分子)或氨基酸序列及由此带来的生物学特性的多聚物和大分子的模板。因此，当基因产生的mRNA经过转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白时，该基因编码蛋白。基因或cDNA的编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并通常由序列表提供)和非编码链(用作转录模板)都可以用于编码该基因或cDNA的蛋白或其它产物。编码蛋白的核酸包括具有不同核苷酸序列，但由于遗传密码简并性，编码该蛋白的相同氨基酸序列的任何核酸。编码蛋白的核酸和核苷酸序列可以包括内含子。
术语“多肽”可与氨基酸残基序列或蛋白质交换使用，指任何长度的氨基酸聚合体。这些术语还包括经过反应进行翻译后修饰的蛋白质，该反应包括，但不限于糖基化，乙酰化，磷酸化或蛋白质加工。多肽结构可进行修饰和改变，例如与其它蛋白融合，氨基酸序列取代，缺失或插入，同时该分子保持其生物功能活性。例如，对多肽的氨基酸序列或其核酸编码序列进行特定的取代，可以获得具有相似特性的蛋白。氨基酸的修饰可通过，例如对其核酸序列进行定点诱变或聚合酶链式反应介导的突变来制备。
本文所用的术语“表达”指在宿主细胞中转录和/或翻译异源核酸序列。宿主细胞中所需产物的表达水平或者根据细胞中存在的相应的mRNA的量来确定，或者根据所选择的序列编码的所需多肽的量来确定。例如，用Northern印迹杂交，核糖核酸酶RNA保护，细胞RNA原位杂交或通过PCR可以定量由所选择的序列转录的mRNA(参见Sambrook，J.et al.(1989)，出处同上；Ausubel，F.M.et al.(1994 updated)，出处同上)。所选择的序列编码的蛋白可用各种方法定量，例如用ELISA，用Western印迹，用放射免疫分析，用免疫沉淀，对蛋白进行生物活性分析，或对蛋白进行免疫染色并随后进行FACS分析PCR(参见Sambrook，J.et al.(1989)，出处同上；Ausubel，F.M.etal.(1994 updated)，出处同上)。
“表达盒”定义了构建体中含有一个或多个将被转录的基因的区域，其中该片段所包含的基因彼此有效连接并由单个启动子转录，结果不同的基因至少是转录连接的。一个转录单元可以转录和表达一个以上的蛋白和产物。每个转录单元包括对包含在该单元中的任何一个所选择序列的转录和翻译所必需的调节元件。
术语“有效连接(operatively linked)”指两个或两个以上的核酸序列或序列元件以允许它们按照预期方式发挥功能的方式定位。例如，如果启动子和/或增强子以顺式发挥作用控制或调节所连接序列的转录，则启动子和/或增强子与编码序列是有效连接的。通常，但不是必然的，有效连接的DNA序列是紧邻的，而且当需要连接两个蛋白编码区或者是在分泌引导序列的情况下，有效连接的DNA序列必需是紧邻的并且位于阅读框中。
术语“选择标记基因”指当存在相应的选择试剂时，使得只有带有该基因的细胞被特异性的筛出或筛除的基因。例如，抗生素抗性基因可用作阳性选择标记基因，它使得存在相应的抗生素时，用该基因转化的宿主细胞能以阳性形式被筛选出来；在选择性培养条件下，非转化宿主细胞不能生长或存活。选择性标记可以是阳性的，阴性的或双功能性的。阳性选择性标记通过赋予宿主细胞抗药性或补偿代谢或分解代谢的缺陷，使得可以筛选带有该标记的细胞。相反，阴性选择性标记使得带有该标记的细胞被选择性的消除。例如，用HSV-tk基因作为标记将使细胞对如阿昔洛维(acyclovir)和更昔洛维(gancyclovir)这样的试剂敏感。本文所用的选择性标记基因(包括可扩增的选择性标记基因)包括重组改造的突变体和变异体，片段，功能等价物，衍生物，同系物和天然选择性标记基因的融合体，只要所编码的产物保持该可被选择的特性。有用的衍生物通常在与选择性特性有关的选择性标记的区域或功能域中，具有相当的序列相似性(氨基酸水平)。已描述了多种标记基因，包括双功能(即阳性/阴性)标记(参见例如WO92/08796和WO 94/28143)，通过参考文献掺入此处。例如，通常用于真核细胞的选择性基因包括氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因，潮霉素磷酸转移酶(HYG)基因，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，胸苷激酶(TK)基因，谷氨酰胺合成酶基因，天冬酰胺合成酶基因，以及编码抗新霉素(G418)，嘌呤霉素，组氨醇D，博来霉素和腐草霉素的基因。
筛选还可以通过荧光激活细胞分选术(FACS)进行，其中使用了，例如细胞表面标记，细菌β-半乳糖苷酶或荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白(GFP)及其来自水母(Aequorea victoria)和海参(Renilla reniformis)或其它物种的变异体；红色荧光蛋白，荧光蛋白及其来自非生物发光物种(例如圆盘拟珊瑚海葵(Discosoma sp.)，海葵(Anemonia sp.)，羽珊瑚(Clavularia sp.)，钮扣珊瑚(Zoanthus sp.)的变异体)，来筛选重组细胞。
术语“选择试剂”指干扰缺乏具体选择性基因的宿主细胞的生长或存活的物质。例如，使用抗生素遗传霉素(G418)筛选转染细胞中是否存在抗生素抗性基因，如APH(氨基糖苷磷酸转移酶)。
λ噬菌体整合酶(通常地并且本文命名为“Int”)，像Cre和Flp一样，属于序列特异性保守性DNA重组酶的整合酶家族。Int的天然功能是催化两个不同的重组序列，称为attB和attP之间的整合式重组。AttB含有21个核苷酸，最初从大肠杆菌基因组分离；Mizuuchi，M.and Mizuuchi，K.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，pp.3220。另一方面，有243个核苷酸的attP长的多，并且天然存在于λ噬菌体基因组中；Landy，A.and Ross，W.(1977)Science，197，pp.1147。Int重组酶在attP共有7个结合位点，在attB有2个结合位点。Int的生物学功能是将环状噬菌体基因组序列特异性的整合到大肠杆菌染色体上的attB位点。Int需要蛋白辅因子，即所谓的整合宿主因子(通常地并且本文命名为“IHF”)进行整合式重组；Kikuchi，Y.und Nash，H.(1978)J.Biol.Chem.，253，7149。IHF是将功能性重组复合物与attP装配所需的。该整合反应的第二个辅因子是attP的DNA负超螺旋。最后，attB和attP之间的重组导致形成两个新的重组序列，称作attL和attR，它们作为进一步重组反应，即切除反应的底物和识别序列。例如Landy，A.(1989)Annu.Rev.Biochem.，58，pp.913提供了λ噬菌体整合的综合概述。
将噬菌体基因组从细菌基因组中切除也由Int重组酶催化。为此，除了Int和IHF，还需要λ噬菌体编码的另一个辅因子。它是切除酶(通常地并且本文命名为“XIS”)，在attR有两个结合位点；Gottesman，M.and Weisberg，R.(1971)The Bacteriophage Lambda，Cold Spring Harbor Laboratory，pp.113。与整合式重组相反，重组序列的DNA负超螺旋对于切除式重组并不是必需的。但是，DNA负超螺旋提高了这种重组反应的效率。切除反应效率的进一步改进可由第二个辅因子实现，该辅因子称作FIS(倒位刺激因子)，并与XIS联合发挥作用；Landy，A.(1989)Annu.Rev.Biochem.，58，pp.913。切除反应在遗传学上是整合反应的精确逆反应，即重新生成attB和attP。例如Landy，A.(1989)Annu.Rev.Biochem.，58，pp.913提供了λ噬菌体切除的综合概述。
本发明的一个方面涉及真核细胞中DNA序列特异性重组的方法，包括
a)将第一个attB，attP，attL或attR序列或其衍生物引入到细胞中，
b)将第二个attB，attP，attL或attR序列或其衍生物引入到细胞中，其中当所述的第一个DNA序列含有attB序列或其衍生物，则所述第二个序列含有attB，attL或attR序列或其衍生物，或者当所述的第一个DNA序列含有attP序列或其衍生物，则所述第二个序列含有attP，attL或attR序列或其衍生物，或者当所述的第一个DNA序列含有attL序列或其衍生物，则所述第二个序列含有attB，attP或attL序列或其衍生物，或者当所述的第一个DNA序列含有attR序列或其衍生物，则所述第二个序列含有attB，attP或attR序列或其衍生物，
c)通过λ噬菌体整合酶Int进行序列特异性重组。
优选该方法中步骤c)是通过Int或通过Int和XIS，FIS，和/或IHF进行序列特异性重组。更优选该方法中步骤c)是通过Int或通过Int和XIS因子，或通过Int和IHF，或通过Int和XIS以及IHF进行序列特异性重组。再优选该方法中步骤c)是通过修饰的Int，优选Int-h或Int-h/218进行序列特异性重组。根据上下文，修饰的Int与XIS，FIS和/或IHF一起使用也包含在本发明的含义中。
该方法的一个更优选的实施例中，真核细胞中的DNA序列特异性重组在相同的或几乎相同的重组位点之间进行。因此，本发明涉及上述的序列特异性重组方法，其中当所述的第一个DNA序列含有attB序列或其衍生物，则所述第二个序列也含有attB序列或其衍生物，或者当所述的第一个DNA序列含有attP序列或其衍生物，则所述第二个序列含有attP序列或其衍生物，或者当所述的第一个DNA序列含有attL序列或其衍生物，则所述第二个序列含有attL序列或其衍生物，或者当所述的第一个DNA序列含有attR序列或其衍生物，则所述第二个序列含有attR序列或其衍生物。
本发明的方法不仅能用天然存在的attB，attP，attL，和/或attR序列进行，也能用修饰的，如取代的attB，attP，attL，和/或attR序列进行。例如，已观察到λ噬菌体和大肠杆菌的attB和attP同源序列(野生型序列的突变体)之间的整合式重组，其中attB有一个或多个取代(Nash，H.(1981)Annu.Rev.Genet.，15，pp.143；Nussinov，R.and Weisberg，R.(1986)J.Biomol.Struct.Dynamics，3，pp 1134)and/or in attP(Nash，H.(1981)Annu.Rev.Genet.，15，pp.143)。
因此，本发明涉及一种方法，其中所使用的attB，attP，attL，和/或attR序列与天然存在的attB，attP，attL，和/或attR序列比较，有一个或多个取代。优选方法中attB，attP，attL，和/或attR序列有1，2，3，4，5，6，7或更多个取代。取代不仅可以发生在重叠区还可以发生在核心区。含有7个核苷酸的完整重叠区也可以被取代。更优选方法中或者在attB，attP，attL，和/或attR序列的核心区或者在其重叠区引入取代。优选在重叠区引入一个取代并且同时在核心区引入一个或两个取代。本发明还涉及一种方法，其中与天然存在的attB，attP，attL，和/或attR序列比较，所使用的attB，attP，attL，和/或attR序列是所述重组位点的衍生物，包括其功能性片段。
选择重组序列中有一个或多个取代这种形式的修饰，这样尽管发生了修饰，仍然可以进行重组。这种取代的例子列在，如Nash，H.(1981)，出处同上和Nussinov，R.and Weisberg，R.(1986)，出处同上的出版物中，并且不限于此。通过例如诱变方法(Ausubel，F.M.et al.(1994 updated)，出处同上描述了一些这种方法)可以很容易的引入进一步的修饰，并且可以通过例如本发明实施例(实施例1和2，结论5.1)所描述的测试重组(test recombinations)检测它们的用途。
另外，本发明涉及一种方法，其中所使用的attB，attP，attL，和/或attR序列仅含有一个各自的核心Int结合位点，然而，含有超过2个核心Int结合位点也同样是优选的。一个优选实施例中，本发明涉及一种方法，其中所使用的attB，attP，attL，和/或attR序列仅由一个各自的核心Int结合位点组成。另一个优选实施例中，所使用的attB，attP，attL，和/或attR序列由两个或多个核心Int结合位点组成。
本发明进一步涉及一种方法，其中所使用的attB，attP，attL，和/或attR序列除了含有核心Int结合位点之外，还含有一个或多个，优选2，3，4，5，或多于5个Int臂结合位点的拷贝。所述结合位点包含具有5’-C/AAGTCACTAT-3’(SEQ ID NO：1)序列的共有基序，或其修饰序列，所述修饰序列具有核苷酸取代以及Int结合功能。Int的臂结合位点可以位于核心Int结合位点上游和/或下游的各种距离处。
为了实施本发明的方法，第一个重组序列可以含有另外的DNA序列，它使得在所需靶基因座，如真核细胞基因组或人工/微染色体中的基因座进行整合。这种重组经由，例如细胞内重组机制介导的同源重组而发生。对于所述重组，另外的DNA序列必须与靶基因座的DNA同源，并且分别位于attB，attP，attL，或attR序列或其衍生物的3′和5′端。本领域技术人员知道同源性程度必须多大，各自的3′和5′序列必须多长，才有足够的概率发生同源重组，参见Capecchi，M.(1989)Science，244，pp.1288的综述。
然而，还可以通过其它的机制将第一个重组序列整合到真核细胞基因组或任何人工/微染色体中，例如，经由同样由细胞内重组事件介导的随机重组。使用与，例如用loxP/FRT序列进行整合的位点不同的位点，经由序列特异性重组进行的所述第一个重组位点的整合也是可以想到的。
第二个重组序列也可包含对经由同源重组整合到所需靶基因座所必需的DNA序列。对于本发明的方法，第一个和/或第二个重组序列可包含另外的DNA序列。优选其中两个DNA序列都包含另外DNA序列的方法。
含有或不合有另外的DNA序列的第一个和第二个序列可以以连续的方式引入，也可以以共转化的方式引入，其中所述重组序列位于两个不同的DNA分子上。优选这种方法，其中含有或不含有另外的DNA序列的第一个和第二个DNA位于并且引入到真核细胞中的单个DNA分子上。此外，可能将第一个重组序列引入到细胞中，将第二个重组序列引入到另一个细胞中，随后细胞融合。术语融合指生物杂交以及最广泛意义的细胞融合。
本发明的方法可用于，例如在分子内重组中使呈反方向(indirect)的重组序列之间的DNA片段倒置。此外，本发明的方法还可用于在分子内重组中删除呈同方向的重组序列之间的DNA片段。如果每个重组序列都以5′-3′或3′-5′的方向整合，则它们呈同方向。如果，例如attB序列以5′-3′的方向整合，而attP序列以3′-5′的方向整合，则重组序列呈反方向。如果每个重组序列经由例如同源重组整合到外显子5′和3′侧的内含子序列中，并且整合通过整合酶进行，那么在反向重组序列的情况下，外显子将被倒置，在同向重组序列的情况下，外显子将被删除。在这个过程中，各自基因编码的多肽可以丧失其活性或功能，或者这种倒置或删除可以使转录终止，因此没有(完整)转录体产生。以这种方式，可以研究例如所编码多肽的生物学功能。另外，倒置或删除反应还可用于，例如通过将编码多肽的开放阅读框与使得所编码多肽进行转录和/或翻译的调节元件功能性连接，来激活编码所需多肽的基因的表达。这些调节元件包括，但不限于启动子和/或启动子/增强子元件，它们都是本领域已知适用于不同真核表达系统的那些。
然而，第一个和/或第二个重组序列可以包含另外的编码一个或多个目标多肽/产物的核酸序列。例如，结构蛋白，酶蛋白或调节蛋白可以经由重组序列引入到在分子内重组后瞬时或稳定表达的基因组中。所引入的多肽/产物可以是内源性的或外源性的。此外，也可引入标记蛋白或生物药相关的治疗性多肽。本领域技术人员知道本申请中对本发明方法的应用的这种列举仅仅是举例而不是限制。用目前所使用的Cre和Flp重组酶进行的根据本发明的应用的例子可能可以从例如Kilby，N.et al.，(1993)，Trends Genet.，9，pp.413的综述中找到。
另外，本发明的方法可用于通过在附加型底物上的分子内重组删除或倒置载体上的DNA片段。删除反应可用于，例如从所谓的辅助病毒删除包装序列。这种方法广泛用于基因治疗所用病毒载体的工业生产中；Hardy，S.et al.，(1997)，J.Virol.，71，pp.1842。
分子间重组使各自含有一拷贝attB，attP，attL，或attR，或att序列各种组合，或其衍生物的两个DNA分子融合。例如，可以首先将attB或其衍生物经由同源重组引入到细胞中一个已知的，特征明确的基因座或人工/微染色体中。随后，带有attB，attP，attL，或attR的载体或DNA片段可以经由分子间重组整合到所述的基因组attB序列中。该方法中，优选突变的整合酶，如Int-h或Int-h/218在发生重组的真核细胞中共表达。更优选共表达突变的整合酶Int-h/218。编码所述任一种突变整合酶的基因可位于被转染的，优选共转染的第二个DNA载体上，或位于带有attP，attL，attR或也带有attB序列或其衍生物的载体或DNA片段上。另外的序列可位于带有attB，attP，attL，或attR的载体或DNA片段上，例如侧翼为loxP/FRT序列的具体标记蛋白的基因。用这种方法可以实现，例如在一种细胞类型中对不同基因进行比较表达分析时，所述基因不受各自整合基因座的阳性或阴性影响。另外，本发明的方法可用于通过附加型底物上的分子间重组使载体上的DNA片段融合。融合反应可用于，例如表达重组蛋白或相关结构域以筛选表型。这种方法可用在真核细胞中蛋白功能的高通量分析，并因此具有相当大的重要性。
如上所述，分子间重组可用于将编码一个或多个所需多肽/产物的一个或多个目标基因引入到例如附加型底物，人工/微染色体，或含有第一个重组序列的各种宿主细胞基因组中。根据上下文，第二个DNA除了含有至少一个重组序列，如attP，attB，attL，attR或其任何衍生物之外，还含有表达一个或多个所需蛋白/产物的一个或多个表达盒。该表达盒可经由重组序列引入到所需靶基因座，使得含有第二个重组序列和表达盒的DNA与预先引入到所述附加型底物，人工/微染色体或宿主细胞基因组中的第一个重组序列之间发生序列特异性重组。这个实施方案对于构建适于生产生物药产品的高表达细胞系可以有相当大的重要性。
根据上下文，含有至少一个重组序列的第一个DNA，通过例如随机整合被引入到宿主细胞的基因组或包含在宿主细胞中的人工/微染色体或附加型底物中。或者，宿主细胞可以用含有相应的至少一个重组位点的人工/微染色体或附加型底物转化。另一种将重组序列整合到由λ噬菌体整合酶Int识别的所需靶基因座的方法是使用如上所述的同源重组技术。
为了有利于筛选将重组序列引入到所需靶基因座的稳定转化体，在同一时间将选择性标记基因共同引入到相同的靶基因座中。这是可以实现的，例如如果重组序列和选择性标记基因共同位于相同载体或DNA片段上，可以例如通过上述任何方法(同源重组，随机整合等)，将它们引入到所述靶基因座中。由于选择性标记基因的表达水平与整合位点的转录活性相关，可以非常有效的鉴别，例如在生物反应器中，显示出整合位点的高表达水平，细胞耐用性(robustness)以及好的生长特性的细胞。可用本领域已知的方法，例如根据细胞中存在的相应mRNA的量，或者根据基因编码的多肽的量，确定选择性标记基因的表达水平。例如，可以用Northern印迹杂交，核糖核酸酶RNA保护，细胞RNA原位杂交或用PCR来定量从所引入的基因序列转录的mRNA(参见Sambrook et al.，1989；Ausubel et al.，1994，出处同上)。由所选的序列编码的蛋白也可用各种方法定量，例如用ELASA，用Western印迹，用放射免疫分析，用免疫沉淀，用蛋白的生物活性分析，对蛋白进行免疫染色并随后进行FACS分析，或通过测量荧光蛋白的荧光信号(参见Sambrook et al.，1989；Ausubel et al.，1994 updated，出处同上)。用这种方法可获得生产生物药的生产细胞系的优秀候选物。
整合的重组序列(第一个重组序列)使得可以将另一个DNA分子，例如带有至少一个另外的重组序列(第二个重组序列)的载体或DNA片段，经由以λ噬菌体整合酶Int进行的序列特异性重组，整合到转录活性基因座。优选，含有至少一个第二个重组序列的另一个DNA分子进一步含有表达至少一个生物药相关目标基因的表达盒。为此，含有第一个优选在转录活性基因座整合到宿主细胞基因组中的整合式重组序列的宿主细胞，被含有λ噬菌体整合酶Int的第二个重组序列的DNA分子转染，并在使得第一个和第二个重组序列之间能进行序列特异性重组的条件下培养，优选使含第二个重组序列的DNA分子整合到含第一个重组序列的宿主细胞基因组中。第一个和第二个重组序列可以是attP，attB，attL，attR或者是其任何允许由λ噬菌体整合酶Int或其任何功能突变体进行序列特异性重组的衍生物。例如，如果第一个重组序列含有attP或其衍生物，则第二个可以含有attP，attB，attL，attR或其任何衍生物。
优选其中由Int，或由Int和XIS，FIS和/或IHF进行序列特异性重组的方法。更优选其中由Int或由Int和XIS因子，或由Int和IHF，或由Int和XIS以及IHF进行序列特异性重组的方法。再优选其中由修饰的Int，优选Int-h或Int-h/218进行序列特异性重组的方法。根据上下文，修饰的Int与XIS和/或IHF一起使用也包含在本发明的含义中。
以这种方法，可以将任何含有λ噬菌体整合酶Int第二个重组序列的DNA序列整合到宿主细胞中已知的，特征明确的和确定的基因座中。为了筛选其中发生了序列特异性重组的细胞，可以引入，例如含有选择性标记基因的非功能性表达盒，例如没有启动子或启动子/增强子或只有该基因部分编码区的表达盒。只有当已发生序列特异性重组的情况下，才会产生有效表达选择性标记基因的完整且有功能的表达盒，因此才能筛选具有经由序列特异性整合而整合的目标基因的细胞。
通过本发明的方法，可以得到一种生产细胞系，它与宿主细胞的区别仅仅是整合在指定整合位点(如一个基因组基因座)的DNA序列的同一性(identity)不同。由于不同细胞克隆之间的遗传变异较少，可以使用更多的遗传过程来开发生产细胞系，这样可以减少克隆筛选和研究最优化生产过程的时间和精力。这种生产细胞系可用于制造所需多肽。
因此本发明的另一个方面涉及一种在真核细胞中表达编码一个或多个所需多肽/产物的至少一个目标基因的方法，包括：
a)将含有attB，attP，attL或attR序列或其衍生物的第一个DNA引入到细胞中；
b)将含有attB，attP，attL或attR序列或其衍生物以及至少一个目标基因的第二个DNA引入到细胞中，
c)将所述细胞与λ噬菌体整合酶Int接触；
d)通过λ噬菌体整合酶Int进行序列特异性重组，其中第二个DNA整合到第一个DNA中；和
e)在能表达目标基因的条件下培养所述细胞。
优选方法中，当所述的第一个DNA序列含有attB序列或其衍生物，则所述第二个序列含有attB，attL或attR序列或其衍生物，或者当所述的第一个DNA序列含有attP序列或其衍生物，则所述第二个序列含有attP，attL或attR序列或其衍生物，或者当所述的第一个DNA序列含有attL序列或其衍生物，则所述第二个序列含有attB，attP或attL序列或其衍生物，或者当所述的第一个DNA序列含有attR序列或其衍生物，则所述第二个序列含有attB，attP或attR序列或其衍生物。
这种方法的一个更优选实施例中，在所述第二个DNA被引入所述细胞之前，第一个DNA已被整合到宿主细胞的基因组，人工染色体/微染色体或附加型元件中，优选整合在显示高转录活性的位点。
本发明还涉及一种在宿主细胞中表达至少一个或多个目标基因的方法，其中所述宿主细胞包含一个整合到所述宿主细胞基因组中的attB，attP，attL或attR序列或其衍生物，所述方法包括：
a)将含有attB，attP，attL或attR序列或其衍生物以及至少一个目标基因的DNA引入到所述细胞中，
b)将所述细胞与λ噬菌体整合酶Int接触；
c)通过λ噬菌体整合酶Int进行序列特异性重组，其中第二个DNA整合到第一个DNA中；
d)在能表达目标基因的条件下培养所述细胞。
该方法不仅可以用通过对所述细胞进行基因改道而整合到宿主细胞基因组中的attB，attP，attL或attR序列或其衍生物来实现，还可以用基因组中天然存在的重组序列，例如WO 01/1 6345所描述的attH位点(5’-GAAATTCTTTTTGATACTAACTTGTGT-3’；SEQ ID NO：17)或任何其它允许由Int或其功能突变体介导序列特异性重组的重组序列来实现。
优选方法中，由Int或由Int和XIS因子，或由Int和IHF，或由Int和XIS以及IHF进行所述序列特异性重组。更优选的方法中由修饰的Int，优选Int-h或Int-h/218进行所述序列特异性重组。根据上下文，修饰的Int与XIS，和/或IHF一起使用也包含在本发明的含义中。Int，Int-h或Int-h/218，XIS和/或IHF可以以纯化形式添加到细胞中或由进行序列特异性重组的宿主细胞共表达。
上述方法的另一个实施例涉及一种方法，其中由在所述宿主细胞中表达的、由目标基因编码的蛋白/产物，从细胞中分离，或者如果它分泌到培养基中，则从细胞培养上清中分离。
在有利于表达所需基因以及有利于从细胞和/或细胞培养上清分离目标蛋白的条件下，所述生产细胞优选培养在无血清的培养基中并悬浮培养。优选目标蛋白以分泌多肽的形式从培养基中回收，或者如果目标蛋白表达时没有分泌信号，则从宿主细胞裂解物中回收。有必要从其它重组蛋白，宿主细胞蛋白和污染物中纯化目标蛋白，以获得目标蛋白的基本均一制品。第一步通常是将细胞和/或颗粒性细胞碎片从培养基或裂解物中分离。此后通过例如免疫亲和柱或离子交换柱的分级分离，乙醇沉淀，反相HPLC，在硅石或阳离子交换树脂如DEAE上进行Sephadex色谱，将目标产物从污染的可溶蛋白，多肽和核酸中纯化。通常，教导技术人员如何纯化宿主细胞表达的异源蛋白的方法是本领域已知的。例如Harris et al.(1995)ProteinPurification：A Practical Approach，Pickwood and Hames，eds.，IRL Press andScopes，R.(1988)Protein Purification，Springer Verlag描述了这样的方法。因此，上述表达至少一种目标基因的方法可以增加额外的纯化步骤，其中所需多肽从宿主细胞纯化，或者如果分泌到培养基中，则从细胞培养物中纯化。
本发明的方法可在所有真核细胞中进行。细胞和细胞系可存在于，例如细胞培养物中，并且包括但不限于真核细胞，如酵母，植物，昆虫或哺乳动物细胞。例如细胞可以是卵母细胞，胚胎干细胞，造血干细胞或任何类型的分化细胞。优选其中真核细胞是哺乳动物细胞的方法。更优选其中哺乳动物细胞是人，猿猴，鼠，大鼠，兔，仓鼠，山羊，牛，绵羊或猪的细胞的方法。优选的生产生物药的细胞系或“宿主细胞”是人，鼠，大鼠，猴或啮齿类动物的细胞系。更优选仓鼠细胞，优选BHK21，BHK TK-，CHO，CHO-K1，CHO-DUKX，CHO-DUKX B1和CHO-DG44细胞或所述任一种细胞系的衍生物/后代。特别优选CHO-DG44，CHO-DUKX，CHO-K1和BHK21，甚至更优选CHO-DG44和CHO-DUKX细胞。此外，还已知鼠骨髓瘤细胞，优选NS0和Sp2/0细胞或所述任一种细胞系的衍生物/后代作为生产细胞系。
当宿主细胞在无血清条件下，以及任选在不含任何动物来源的蛋白/多肽的培养基中构建，适应并完全培养时，这种宿主细胞是最优选的。商品化的培养基，如Ham′s F12(Sigma，Deisenhofen，Germany)，RPMI-1640(Sigma)，Dulbecco′s改良Eagle′s培养基(DMEM；Sigma)，基本必需培养基(MEM；Sigma)，Iscove′s改良Dulbecco′s培养基(IMDM；Sigma)，CD-CHO(Invitrogen，Carlsbad，CA)，CHO-S-SFMII(Invtirogen)，无血清CHO培养基(Sigma)，以及无蛋白CHO培养基(Sigma)都是适合的营养液的例子。如有必要，任一种培养基中可补充各种化合物，化合物的例子有激素和/或其它生长因子(如胰岛素，运铁蛋白，表皮生长因子，胰岛素样生长因子)，盐(如氯化钠，钙，镁，磷酸盐)，缓冲液(如HEPES)，核苷(如腺苷，胸苷)，谷氨酰胺，葡萄糖或其它等效能源，抗生素，微量元素。还可包含以本领域技术人员熟知的适宜浓度的任何其它必需添加物。本发明中优选使用无血清培养基，但也可使用补充了适量的血清的培养基培养宿主细胞。为了培养并筛选表达选择性基因的遗传修饰细胞，培养基中添加了适宜的选择性试剂。
本发明中“所需蛋白/多肽”或“目标蛋白/多肽”例如，但不限于胰岛素，胰岛素样生长因子，hGH，，tPA，细胞因子，如白介素(IL)，例如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，干扰素(IFN)-α，IFNβ，IFNγ，IFNω，IFNσ，肿瘤坏死因子(TNF)，如TNFa，TNFβ，TNFγ，TRAIL；G-CSF，GM-CSF，M-CSF，MCP-1和VEGF。还包括促红细胞生成素或任何其它激素生长因子制品以及能作为激动剂或拮抗剂和/或具有治疗或诊断用途的任何其它多肽。本发明的方法还能有利的用于生产抗体，如单克隆，多克隆，多特异性以及单链性质的抗体或其片段，例如Fab，Fab′，F(ab′)2，Fc和Fc′-片段，免疫球蛋白重链和轻链及其恒定区，可变区或超变区以及Fv-和Fd-片段(Chamov，S.M.et al.(1999)Antibody Fusion Proteins，Wiley-Liss Inc.)。
Fab片段(抗原结合片段＝Fab)由两条链的可变区组成，它们通过临近的恒定区结合在一起。它们可以通过用例如木瓜蛋白酶消化常规抗体形成，但同时也可以通过基因工程制备类似的Fab片段。另外的抗体片段包括可以用胃蛋白酶进行蛋白质水解而制备的F(ab‘)2片段。
使用基因工程方法，有可以生产仅由重链(VH)和轻链(VL)可变区组成的缩短的抗体片段。它们被称作Fv片段(可变片段＝可变部分的片段)。因为这些Fv片段缺乏由恒定链的半胱氨酸对两条链的共价连接，所以经常要稳定Fv片段。用短肽片段，例如10至30个氨基酸，优选15个氨基酸的短肽片段连接重链和轻链的可变区是有利的。以这种方式可以获得由VH和VL通过肽接头连接而成的单一肽链。已知这种抗体蛋白称作单链Fv(scFv)。Huston C.et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，16，pp.5879描述了现有技术中已知的这种scFv-抗体蛋白的实例。
近年来，已发展了各种策略来制备多体衍生物形式的scFv。这尤其是为了制备具有改良的药代动力学和生物分布特性以及具有提高的结合亲和力的重组抗体。为了实现scFv多体化，将scFv制备成带有多体化功能域的融合蛋白。这种多体化功能域可以是，例如IgG的CH3区或卷曲螺旋结构(螺旋结构)，如亮氨酸拉链区域。然而，还有一些策略，其中利用scFv的VH/VL区域之间的相互作用实现多体化(例如二体，三体和五体抗体)。技术人员所称的二体抗体(diabody)是指二价、同二聚体形式的scFv衍生物。将scFv分子中的接头缩短至5-10个氨基酸导致形成其中发生链间VH/VL重叠(superimposition)的同二聚体。还可通过掺入二硫桥来构建二体抗体。Perisic，O.et al.(1994)Structure，2，pp.1217中能找到现有技术中二体抗体-抗体蛋白的实例。
微体(minibody)对技术人员而言是指二价、同二聚体形式的scFv衍生物。它由融合蛋白组成，该融合蛋白包含免疫球蛋白，优选IgG，更优选IgGl的CH3区域作为二聚化区域，该区域经由铰链区(例如，同样来自IgGl)和接头区域与scFv连接。Hu，S.et al.(1996)Cancer Res.，56，pp.3055中能找到现有技术中微体-抗体蛋白的实例。
三体(triabody)对技术人员而言是指三价、同三聚体形式的scFv衍生物(Kortt A.A.et al.(1997)Protein Engineering，10，pp.423)。其中VH-VL不需接头序列就直接融合的ScFv衍生物导致三体的形成。
本领域技术人员还熟悉所谓的微型抗体(miniantibody)，它具有二价，三价或四价结构并衍生自scFv。通过二聚，三聚或四聚体式卷曲螺旋进行多聚化(Pack，P.et al.(1993)Biotechnology，11，pp.1271；Lovejoy，B.et al.(1993)Science，259，pp.1288；Pack，P.et al.(1995)J.Mol.Biol.，246，pp.28)。本发明的一个优选实施例中，目标基因编码上述任一种所需多肽，优选编码单克隆抗体，衍生物或其片段。
为实施本发明的任何一个实施例，整合酶必须作用于重组序列。整合酶或整合酶基因和/或辅因子或辅因子基因，例如XIS因子或XIS因子基因和/或IHF或IHF基因可以是在引入第一个和第二个重组序列之前就已经存在于真核细胞中。它们也可以在引入第一个和第二个重组序列之间或引入第一个和第二个重组序列之后被引入进来。现有技术中(Nash，H.A.(1983)Methods of Enzymology，100，pp.210；Filutowicz，M.et al.(1994)Gene，147，pp.149)已经描述了重组酶和宿主因子蛋白的纯化。如果这些是未知的，可使用细胞提取物或以例如文献记载的纯化Int或Cre重组酶的程序进行部分纯化的酶。纯化的蛋白可通过标准技术，例如以注射或显微注射的方式或以本发明实施例2中针对IHF所描述的脂质转染的方式，引入到细胞中。用于序列特异性重组的整合酶优选在进行反应的细胞中表达。为了这个目的，将含有整合酶基因的第三个DNA序列引入细胞。如果序列特异性重组由例如attL/attR进行，则细胞中可另外引入XIS因子基因(第四个DNA序列)。更优选其中第三个和/或第四个DNA序列经由同源重组或随机方式整合到细胞真核基因组或人工/微染色体的方法。进一步优选这种方法，其中第三个和/或第四个DNA序列含有导致整合酶基因和/或XIS因子基因进行空间表达(spatial expression)和/或瞬时表达的调节序列。
在这种情况下，空间表达指，Int重组酶，XIS因子，和/或IHF因子分别仅在特定的细胞类型中使用细胞类型特异性启动子表达，并且仅在这些细胞中催化重组，所述细胞例如肝细胞，肾细胞，神经细胞或免疫系统的细胞。调节整合酶/XIS因子/IHF表达时，可以通过在特定发育阶段或在成年生物的特定时间点激活启动子实现瞬时表达。另外，通过使用诱导性启动子，例如通过干扰素或四环素依赖性启动子，也可实现瞬时表达；参见Müller，U.(1999)Mech.Develop.，82，pp.3的综述。
本发明方法所使用的整合酶可以是野生型和修饰的(突变的)λ噬菌体整合酶。由于野生型整合酶仅能够与称为IHF的辅因子进行高效率的重组反应，所以优选在本发明的方法中使用修饰的整合酶。如果本发明的方法使用了野生型整合酶，则需要另外添加IHF以实现对重组反应的刺激。修饰的整合酶被修饰成所述整合酶无需IHF或其它宿主因子，如XIS和FIS，就能进行重组反应。例如，attL和attR序列之间的重组反应可通过修饰的Int进行而无需另外的宿主因子(参见结论5.1和图2C和2D)。
修饰多肽的产生和所需活性的筛选是现有技术，并且可以很容易的进行；Erlich，H.(1989)PCR Technology.Stockton Press。例如，编码修饰的整合酶的核酸序列意图包括在体外或者在将编码序列引入细菌或真核细胞后能被转录和翻译成整合酶的任何核酸序列。修饰的整合酶蛋白编码序列可以是天然存在的(通过自发突变)或重组改造的突变体和变异体，截短的版本和片段，功能等价物，衍生物，同系物以及天然存在的或野生型的蛋白的融合体，只要所编码多肽维持生物功能活性，即重组活性。如本发明的结论5.1或WO 01/16345的实施例3所述，用底物载体和表达载体在共转染试验中测量，当修饰的重组酶具有至少50％，优选至少70％，更优选至少90％，最优选至少100％的野生型整合酶Int活性时，则维持了重组活性。对整合酶或其核酸编码序列进行一些氨基酸序列取代，可获得具有相似性质的蛋白。利用氨基酸水疗法索引(Kyte，J.et al.(1982)J.Mol.Biol.，157，pp.105)提供功能等价整合酶多肽的氨基酸取代，可通过在其核酸序列上进行由定点诱变或聚合酶链式反应介导的突变来制备。本发明优选，与野生型蛋白比较，显示出改良的重组活性/重组效率或不依赖一个或多个宿主因子的重组活性的突变体或修饰的整合酶。“野生型蛋白”指完整的，非截短形式的，非修饰形式的，天然存在的基因编码的多肽。优选两个命名为Int-h和Int-h/218的λ噬菌体整合酶Int突变体；Miller et al.(1980)Cell，20，pp.721；Christ，N.and Drge，P.(1999)J.Mol.Biol.，288，pp.825。与野生型Int比较，Int-h在174位由赖氨酸残基代替谷氨酸残基。Int-h/218在218位由另一个赖氨酸残基代替谷氨酸残基，此酶由Int-h基因的PCR突变产生。所述突变体可以在大肠杆菌，真核细胞以及在体外，即在反应试管中使用纯化的物质时，催化attB/attB，attP/attP，attL/attL或attR/attR以及所有其它可以的组合，例如attP/attR，attL/attP，attL/attB，或attR/attB或其衍生物之间的重组，无需辅因子IHF，XIS，和/或FIS以及负超螺旋。用辅因子，例如FIS，可以实现重组效率的改进。优选突变体Int-h/218，因为这个突变体以提高的效率催化重组反应。
如果第一个反应导致切除并且所使用的两个重组序列相同，例如attP/P，那么重组之后得到的重组序列将与底物上的序列相同，例如此处是两个attP序列。然而如果两个配对序列不同，例如attP/R，那么重组反应将产生杂合的重组序列，它含有来自一个序列(例如attP)的功能性一半以及来自另一个序列(attR)的一半。功能性半重组位点可定义为重叠区的5′序列或3′序列，每种情况中，重叠区都被认为是功能性半位点的一部分。如果所使用的重组序列各自的重叠区相同，则切除反应可由本发明的任何重组序列进行。此外，重叠区还指定了重组序列彼此的方向，即倒置或同向(direct)。用野生型Int仅能以低效率进行反应，然而，添加IHF或没有IHF时，除了核心结合位点之外臂结合位点的存在，能刺激和提高效率。由修饰的Int无需任何辅因子也可进行反应。
另外，优选其中将包含Xis因子基因的另一个DNA序列引入细胞的方法。更优选其中所述另一个DNA序列进一步包含提高Xis因子基因的空间表达和/或瞬时表达的调节DNA序列的方法。
例如，以导致基因在特定的细胞类型中激活/灭活的Int，进行成功的分子内整合式重组(倒位)之后，所述基因在稍后的时间点可通过诱导XIS进行空间和/或瞬时表达并同时表达Int而被再次灭活或激活。
另外，本发明涉及任何重组序列或其衍生物，例如SEQ ID NO：2具体所示的attP的衍生物，在真核细胞DNA序列特异性重组中的应用。真核细胞可存在于那些不在其细胞中包含整合酶或Xis因子的生物(例如哺乳动物)的细胞群中。所述生物可用于与在其细胞中带有整合酶或Xis因子的其它生物一起繁殖，以便产生后代，其中在所述后代的细胞中进行序列特异性重组。因此，本发明还涉及整合酶或整合酶基因以及Xis因子或Xis因子基因以及IHF因子或IHF因子基因在真核细胞序列特异性重组中的应用。另外，本发明涉及实施本发明方法的真核细胞和细胞系，其中所述细胞或细胞系在实施本发明方法之后获得。
本发明的实施将利用，除非另有指示，细胞生物学，分子生物学，细胞培养，免疫学的常规技术以及本领域技术人员所熟练掌握的类似技能。这些技术在现有文献中有充分描述，参见例如Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel et al.，Current Protocols in MolecularBiology(1987，updated)；Brown ed.，Essential Molecular Biology，IRL Press(1991)；Goeddel ed.，Gene Expression Technology，Academic Press(1991)；Bothwell et al.eds.，Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes，Bartlett Publ.(1990)；Wu et al.，eds.，Recombinant DNA Methodology，Academic Press(1989)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，Stockton Press(1990)；McPherson et al.，PCR：A Practical Approach，IRL Press at OxfordUniversity Press(1991)；Gait ed.，Oligonucleotide Synthesis(1984)；Miller &Calos eds.，Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(1987)；Butler ed.，Mammalian Cell Biotechnology(1991)；Pollard et al.，eds.，Animal Cell Culture，Humana Press(1990)；Freshney et al.，eds.，Culture of Anirnal Cells，Alan R.Liss(1987)；Studzinski，ed.，Cell Growth and Apoptosis，A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Presss(1995)；Melamed et al.，eds.，FlowCytometry and Sorting，Wiley-Liss(1990)；Current Protocols in Cytometry，JohnWiley & Sons，Inc.(updated)；Wirth & Hauser，Genetic Engineering of AnimalsCells，in：Biotechnology Vol.2，Pühler ed.，VCH，Weinheim 663-744；the seriesMethods of Enzymology(Academic Ptess，Inc.)，and Harlow et al.，eds.，Antibodies：A Laboratory Manual(1987)。
本说明书提到的全部出版物和专利申请是对本发明所属技术领域的技术人员的技术水平的指示。因此为了更加充分的描述本发明所属领域的状态，本文所引用的全部出版物和专利申请以其完整形式掺入作为参考。上述概括描述的发明通过参考下述实施例将会更容易理解，为此所包含的实施例仅仅是为了说明本发明的某些例子，并不是以任何方式意图限制本发明。
实施例
方法
1.
表达载体和底物载体的制备
模拟物(mock)和Int表达载体pCMV，pCMVSSInt，pCMVSSInt-h，和pCMVSSInt-h/218的构建已有文献记载；Lorbach，E.et al.(2000)J.Mol.Biol，296，pp.1175。Int的表达由人巨细胞病毒启动子驱动。
分子内重组试验所用的含有以attB/attP(pλIR)或attL/attR(pλER)作为同向重复的底物载体，是pGEM4Z(Promega)的衍生物。通过将attB作为双链寡核苷酸插入ClaI/EcoRI-切割的pPGKneo，构建pλIR。该载体是pPGKSSInt-h的衍生物，其中用PstI/XbaI以新霉素基因(neo)代替Int-h基因。以pCMVSSInt作为模板通过PCR产生CMV启动子+杂合内含子，将其克隆到以KpnI/ClaI切割、含attB的pPGKneo中。通过PCR将这个CMV-attB-neo-表达盒克隆到BamHI切割的pGEM4Z中。使用下列引物
(attP01)5’-GTCACTATCAGTCAAAATA
CAATCA-3’，(SEQ ID NO：3)
(attP02)5’-TGATT
GTATTTTGACTGATAGTGAC-3’，(SEQ ID NO：4)
(PFP-NsiI)5’-CCAATGCATCCTCTGTTACAGGTCACTAATAC-3’，(SEQ ID NO：5)
和(P’RP-EcoRV-NotI)5’-ATAAGAATGCGGCCGCAGATATCAGGGAGTGGGACAAAATTGAA-3’(SEQ ID NO：6)，以pGFPattB/attP作为模板，通过组装PCR(assembly PCR)，产生attP位点，在其P’-臂中含有A→C取代，这导致删除翻译终止信号(Lorbach，E.et al.(2000)，出处同上)。用NsiI和NotI切割PCR片段，并连接到从pBS302(Gibco/BRL)产生的、含有转录终止盒的BamHI/PstI片段的3’末端。利用pCMVSSGFP(pCMVSSInt-h的衍生物，其中利用PstI/XbaI以eGFP代替Int-h基因)，通过PCR克隆GFP基因以及polyA信号。用NotI和XbaI切割含GFP的PCR片段，然后与BamHI/NotI切割的转录终止子/attP片段一起，连接到已含有CMV启动子，attB以及新霉素表达盒的经BamHI/XbaI切割的载体中。构建pλER与构建pλIR一样，除了利用pGFPattL/attR(Lorbach，E.et al.(2000)，出处同上)作为模板，通过PCR产生attL并克隆到ClaI/EcoRI切割的pPGKneo中。利用pGFPattL/attR作为模板，通过PCR产生attR位点，并用NsiI和NotI切割产物。
分子间重组试验所用的底物载体含有位于不同附着位点之前的CMV启动子：pCMVattPmut，其P-臂包含3个G→C取代。这些变化对于删除ATG起始密码子阻止GFP在重组后表达是必须的。这些取代位于attP的蛋白结合位点之外，它们通过组装PCR来引入。首先，产生两个重叠的PCR产物，一个使用引物对attP-ATC-1/attP-2，一个使用引物对attP-ATC-3/attP-4。用pGFPattB/attP作模板。PCR产物经凝胶纯化，作为以attP-PstI和attP-XbaI为引物进行PCR的模板。获得的产物用PstI和XbaI消化并克隆到pCMVSSInt中。组装PCR的引物序列是
(attP-ATC-1)
5’-TTTGGATAAAAAACAGACTAGATAATACTGTAAAACACAAGATATGCAGTCACTA-3’，(SEQ ID NO：7)
(attP-2)5’-TAACGCTTACAATTTACGCGT-3’，(SEQ ID NO：8)
(attP-ATC-3)
5’-CTGCATATCTTGTGTTTTACAGTATTATCTAGTCTGTTTTTTATCCAAAATCTAA-3’，(SEQ ID NO：9)
(attP-4)5’CTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGC-3’，(SEQ ID NO：10)
(attP-PstI)5’-GACTGCTGCAGCTCTGTTACAGGTCAC-3’，(SEQ ID NO：11)
(attP-XbaI)5’-GACTGTCTAGAGAAATCAAATAATGAT-3’(SEQ ID NO：12)。
将attB作为双链寡核苷酸插入经PstI/XbaI切割的pCMVattPmut，产生pCMVattB。将attL引入经PstI/XbaI切割的pCMVattPmut中，用pλER作为模板，通过PCR产生pCMVattL。
含有位于无启动子GFP基因前面的转录终止信号和att位点的载体如下构建：首先用AvaI和NdeI从pTKHyg(Clontech)删除部分潮霉素基因产生pWSattBGFP。用Klenow聚合酶补齐粘性末端后连接载体骨架。PCR产生的attB-GFP片段克隆到MfeI和HindIII位点，从而产生新的attB 5′端NheI位点。最后，通过EcoRI和NheI的限制性酶切插入转录终止序列。从pλER中分离BamHI/NotI转录终止-attR片段，将其插入经相同酶切割的pWSattBGFP中，产生pWSattRGFP。用pGFPattP/attB作为模板，对attP位点进行PCR，将它插入经EcoRI/NotI切割的pWSattBGFP中来取代attB，产生pWSattPGFP。用亲和层析(Qiagen)从大肠杆菌XL1-Blue菌株分离质粒。DNA测序后，用荧光373A系统(Applied Biosystems)证实相关遗传元件的核苷酸组成。
2.
细胞培养，重组试验，和流式细胞术
用添加了10％胎牛血清，0,1mg/ml链霉素和100U/ml青霉素的Dulbecco′s改良eagle培养基(DMEM)培养HeLa细胞。
典型的重组试验如下进行。收集细胞，用PBS洗涤并重悬于无L-谷氨酰胺和酚红(Life Technologies)的RPMI 1640中。然后用基因脉冲器(Genepulser，Bio-Rad)以300V和960μF 将摩尔比为1∶1的总计60μg的表达载体和底物载体引入到约1×107的细胞中。电穿孔之后，细胞以适宜的稀释度铺在10cm的皿中。转染24h，48h和72h后，制备单细胞悬液。通过用7-氨基-放线菌素D(Sigma)的染色分析除去死亡细胞，并用FACScalibur(Becton Dickinson)分析细胞。用CellQuestTM软件分析FACS数据。每次试验中，用40μg pCMV和20μg pEGFP-C1(Clontech)共转染测量分子间重组试验的转染效率；用30μg pCMV和30μg pEGFP-C1共转染测量分子内重组试验的转染效率。
进行涉及纯化的IHF的试验，如上述，首先将30μg Int表达载体经由电穿孔引入到约6×106细胞中。3至4小时后，用2μg底物载体转染约1×105的细胞进行分子内重组，或用摩尔比为1∶1的总计2μg的底物载体转染约1×105的细胞进行分子间重组。底物和2μg纯化的IHF(Lange-GustafsonBJ，Nash HA.，Purification and properties of Int-h，a variant protein involved insite-specific recombination of bacteriophage lambda.，J Biol Chem.1984 Oct25；259(20)：12724-32)在室温和低盐缓冲液(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)中预培养至少30min。用FuGene(Boehringer Mannheim)实现IHF-DNA复合物的转染，且效率总在80％的范围内。如上所述再经48h后，用流式细胞术分析细胞。
将在添加了次黄嘌呤和胸苷(Invitrogen，Carlsbad，CA)的无血清CHO-S-SFMII培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中永久悬浮生长的CHO-DG44/dhfr-/-细胞(Urlaub，G. et al.，(1983)，Cell，33，pp.405)，在37℃、含5％ CO2的潮湿空气中用细胞培养瓶培养。每2至3天，细胞以1-3×105细胞/mL的浓度接种到新鲜培养基中。
用Lipofectamine Plus试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)对CHO-DG44细胞进行稳定转染。每次转染时，将0,8mL添加了次黄嘌呤/胸苷(HT)的CHO-S-SFMII培养基中的6×105个呈指数生长的细胞接种到6孔板的孔中。200μL体积中的总计1μg质粒DNA，4μL Lipofectamine和6μL Plus试剂用于每次转染并添加到细胞中，然后进行制造商的试验程序。培养3h后，添加2mL补充了HT的CHO-S-SFMII培养基。在基于新霉素磷酸转移酶进行筛选的情况下，转染2天后，培养基用添加了HT和400μg/mL G418(Invitrogen)的CHO-S-SFMII培养基替换，每3至4天更换培养基，持续2至3周以筛选混合的细胞群体。对于基于DHFR筛选稳定转染的CHO-DG44细胞的情况，使用无次黄嘌呤/胸苷的CHO-S-SFMII培养基。通过向培养基添加5-2000nM甲氨蝶呤(Sigma，Deisenhofen，Germany)作为扩增选择试剂，实现基于DHFR的基因扩增。
3.
sICAM和MCP-1 ELISA
本实验室(in house)研制了两种sICAM特异性单克隆抗体，其中之一是HRPO-偶联抗体(例如参见US5,284,931和5,475,091)，用这两种抗体以ELISA标准程序(Ausubel，F.M.et al.，(1994，updated)Current protocols inmolecular biology.New York：Greene Publishing Associated andWiley-Interscience)定量测定稳定转染的CHO-DG44细胞上清液的sICAM滴度。以纯化的sICAM蛋白作为标准。用Spectra Fluor Plus reader(TECAN，Crailsheim，Germany)分析样品。
用OptEIA人MCP-1根据制造商的实验程序通过ELISA定量测定稳定转染的CHO-DG44细胞上清液的MCP-1滴度。
实施例1：分子内和分子间重组反应的动力学
我们在以前的研究中指出，突变型Int在缺乏天然附属因子时催化大肠杆菌和人细胞中的分子内整合式和切除式重组反应(Christ，N.et al.(1999)，出处同上；Lorbach，E.et al.(2000)，出处同上)。然而，关于哺乳动物细胞内部附加型DNA片段相互作用的一个有趣问题与突变型Int进行分子间重组的能力有关，即两个重组位点呈反式位于不同DNA分子上的情况。因此，我们首先比较分子内和分子间整合式重组反应。
用含有attB和attP(作为侧接转录终止信号的同向重复)的底物来测试分子内重组。该重组盒的侧翼为CMV启动子和GFP编码区。attB和attP之间的重组产生杂交位点attL和attR，并导致切除终止信号。因此，GFP基因随后的表达就作为重组的指示物(图2A，顶部)。
用Int，Int-h，或Int-h/218的表达载体与底物载体共转染HeLa细胞。用表达载体的骨架(模拟物)作为阴性对照。每次试验独立测定的转染效率在95％至98％范围内(数据未显示)。3次试验的FACS分析显示，两种突变型Int都有效催化重组，在一些实验中导致约30％的GFP表达细胞(图2A，底部)。通过对PCR片段进行DNA测序，间接测定重组产物的核苷酸序列，结果证明，突变型Int催化的链转移反应产生了预期的杂合att位点(数据未显示)。
显然双突变体Int-h/218比Int-h更有活性，而野生型Int几乎是失活的。转染后48h内GFP表达细胞的比例增加，并在随后的24h内保持稳定。反应时程还显示，大部分重组事件肯定发生在最初的24h内。这与Int-h/218在HeLa细胞中的表达时程十分吻合(数据未显示)。虽然我们不能排除GFP表达细胞的比例是由分子间，而不是分子内整合式重组引起，但是所得的数据仍可作为我们分析分子间重组的参考。
将attB和attP放置在不同质粒上，分析分子间整合式重组。重组将CMV启动子易位至GFP基因上游的位置(图2B，顶部)。因此，只有attB和attP之间的分子间重组将产生GFP表达细胞。用两种底物载体与Int表达载体共转染，之后进行FACS分析，所得结果与底物的分子内重组产生的结果相当(图2B，底部)。同样的，大部分重组事件肯定发生在转染后的最初24h内，并且Int-h/218比Int-h更有活性。野生型Int仅产生非常小比例的GFP表达细胞。这些结果证明，由突变型Int进行的分子间整合式重组在24至72h的时程内至少与相应的分子内重组反应一样有效。
接着，利用同样的试验策略比较分子内和分子间切除(attL×attR)重组途径。结果再次显示，由突变型Int进行的分子间重组与分子内重组一样有效(图2C和D)。然而，与整合式重组比较，切除式重组反应的效率稍稍降低。同样，野生型Int的重组几乎观察不到。
实施例2：att的DNA臂结合位点不是必需的，但刺激重组
目前的结果显示，突变型Int在显著量的转染细胞中催化附加型底物的整合式和切除式重组。相反，野生型Int的重组活性在上述背景中几乎检测不到。因为由野生型Int进行的切除式重组依赖于蛋白辅因子IHF和XIS的存在，但不需负DNA超螺旋，所以这个结果证明，人细胞中缺乏这些辅因子的真核对应物。此外，已知附加型底物在转染后立刻成为拓扑学松弛状(Schwikardi et al.(2000)FEBS Letters，471，pp.147)。因此，似乎突变型Int无需形成确定的核蛋白复合物，如装配在attP的整合体，就能进行重组。这提出了DNA臂结合位点在重组中的功能作用的疑问。他们位于至少一个迄今所使用的att位点搭档(partner)中。
为了研究这个问题，我们用含有各种组合形式的attB或attP的成对底物载体进行分子间重组(图3A)。以Int表达载体共转染48h后，用FACS测量重组产生的GFP表达细胞的比例。转染效率总是高于90％(数据未显示)。3次试验的结果显示，成对attP之间的分子间重组与attB和attP之间的重组一样有效(图3B)。然而，在很大程度上，只有Int-h/218利用成对的attB位点作为底物。这个反应的效率与attP和attP或attB和attP之间的反应相比，平均降低了约4倍(图3B)。因此，由两个attB位点之间的重组产生的GFP表达细胞的比例降至4-5％的水平。这些结果证明，att位点中臂型序列的存在对于由Int-h/218进行的重组反应不是必需的，但能显著刺激该反应。当使用Int-h时，这种刺激效果甚至更显著(约8倍)。另外，用野生型Int观察到的残留重组活性显得高度依赖于臂结合位点的存在。
实施例3：通过转染的IHF蛋白刺激由野生型Int进行的重组
由野生型Int在体外和大肠杆菌中催化的有效整合式重组需要蛋白辅因子IHF和attP超螺旋。哺乳动物细胞中明显缺乏任一辅因子，因此这导致我们研究，如果将与超螺旋底物预培养的纯化的IHF共同引入HeLa细胞，野生型Int的残留重组活性是否增加。为验证这种可以性，首先引入野生型Int或Int-h的表达载体。电穿孔3至4h后，在有或没有纯化的IHF的情况下，温育分子内或分子间重组的底物。然后用Fugene转染蛋白-DNA复合物以及无蛋白质的对照样品(图4A)。再过48h后比较GFP表达蛋白的比例。
3次试验的结果显示，由于IHF的存在，由野生型Int进行的分子内重组平均增至5倍。GFP阳性细胞的比例增加，例如在一次实验中，从缺乏IHF时的约1％提高到存在IHF时的6％。对分子间重组的刺激效果同样显著，但较小(约3倍)。转染48h后，刺激作用只针对野生型Int，因为Int-h的活性没有受到影响。重要的是，对照组显示，IHF蛋白的存在也不影响转染效率(数据未显示)。
实施例4：基于目标基因的序列特异性重组的改良的蛋白表达系统
用表达来自Zoanthu sp.的荧光蛋白ZsGreen1(Clontech Laboratories Inc.，Palo Alto，CA，U.S.A.)和抗生素抗性基因新霉素磷酸转移酶的线状第一质粒DNA稳定转染CHO-DG44细胞(图5)。另外，将attB或attP重组序列(天然的或修饰序列或其衍生物)放置在荧光蛋白基因及其启动子之间。用在两个选择性标记的转录单元之外具有单一限制性位点的限制性酶使第一质粒DNA线性化，将该质粒DNA通过随机整合引入到CHO-DG44的基因组中。成功稳定随机整合了第一质粒DNA的细胞通过在存在抗生素G418的情况下培养进行阳性筛选。在稳定转染子的异质库中，仅仅通过基于所引入的荧光蛋白ZsGreen1的表达水平进行荧光激活细胞分选术(FACS)，就能分离在第一质粒DNA整合位点有高转录活性的细胞。挑选具有最高ZsGreen1荧光的细胞，并以单个细胞的形式放置到96孔板的孔中。将所得细胞亚克隆扩增，并通过Southern印迹分析中的限制性内切酶图谱检测单个质粒序列在单个染色体位点的整合。为了后者，分别用在所引入的第一质粒DNA中没有，有一个和多个限制性位点的限制性酶消化细胞亚克隆的基因组DNA，用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳并转移到带正电荷的尼龙膜上(Amersham Biosciences，Freiburg，Germany)。根据Gene Images random primelabelling module(Amersham Biosciences)，用由ZsGreen1基因组成的随机引发型FITC-dUTP标记探针，在65℃的杂交炉中过夜进行杂交。随后在小规模生物反应器中，检测带有单拷贝插入片段的候选亚克隆在模拟生产分批培养中的性能。在全部生产阶段，除了通过测量ZsGreen1荧光进行监控的高表达水平之外，其它重要参数，如高细胞密度时的高存活能力，代谢和繁殖性能(reproducible performance)也要考虑。如此鉴别出带有整合的第一att重组序列的适合的宿主细胞。为了产生通过序列特异性重组生产生物药的生产细胞系，用第二个质粒DNA(见图5)转染这个宿主细胞，所述第二个质粒DNA含有位于attB或attP重组序列(天然的或修饰的或其衍生物)后面的无启动子二氢叶酸还原酶基因和能表达目标基因的完整转录单元，所述目标基因如治疗普通感冒的sICAM(可溶分子间粘附分子1)或人单核化学诱导蛋白-1(MCP-1)。另外，将表达突变型(修饰型)λ噬菌体整合酶的载体pCMVSSInt-h/218共转染。转染后，Int-h/218的瞬时表达足以进行下述序列特异性分子间重组，即位于宿主细胞基因组中优选的转录活性基因座的第一个att重组位点(attP或是attB)和所引入的第二个DNA质粒上的第二个att重组位点(attP或是attB)之间的重组。为了筛选已在attP和attP，attP和attB或attB和attB之间(这取决于第一个和第二个DNA质粒上的重组序列)发生了序列特异性重组的细胞，将转染的细胞转移到未补充次黄嘌呤和胸苷的CHO-S-SFMII培养基中，并进行培养。通过重组将无启动子的dhfr-标记基因和第二个DNA质粒上游att重组位点放置在ZsGreen1基因启动子序列和下游att重组位点的控制之下，使dhfr选择标记基因能充分表达，如此一来，只有正确的定向才能导致细胞从筛选中存活。同时ZsGreen1基因的功能表达盒被打断，留下了无启动子的ZsGreen1基因。所以细胞不再表达荧光蛋白。用FACS鉴别和分离非荧光细胞，所述FACS提供了检测生产目标蛋白的细胞的方法。另外，在位点特异性重组之前和之后，进行Southern印迹和PCR分析，随后进行DNA测序，以此验证序列特异性整合，所述PCR分析的引物位于侧接att位点的序列中。用ELISA分析目标蛋白，sICAM或MCP-1的表达。
用dhfr作为产生生产细胞系的标记基因，这种应用不仅提供了阳性筛选的优点，而且更进一步提供了通过甲氨喋呤诱导DHFR基因扩增从而提高细胞生产能力的可以性。这是通过在无次黄嘌呤/胸苷的CHO-S-SFMII培养基中补充增加量的甲氨喋呤而实现的。
序列表
<110>贝林格尔英格海姆法玛两合公司(BOEHRINGER INGELHEIM PHARMA GmbH & Co.KG)Drge，Peter
<120>真核细胞中的序列特异性DNA重组
<130>DRO-003 PCT
<140>未知
<141>2003-11-28
<150>CA 2,413,175
<151>2002-11-28
<150>US 10/310,695
<151>2002-12-05
<160>17
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Int结合位点的共有序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>c或a
<400>1
magtcactat 10
<210>2
<211>243
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>attP衍生物
<400>2
tctgttacag gtcactaata ccatctaagt agttgattca tagtgactgc atatcttgtg 60
ttttacagta ttatctagtc tgttttttat ccaaaatcta atttaatata ttgatattta 120
tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tatactaagt tggcattata aaaaagcatt 180
gcttatcaat ttgttgcaac gaacaggtca ctatcagtca aaataaaatc attatttgat 240
ttc 243
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
gtcactatca gtcaaaatac aatca 25
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
tgattgtatt ttgactgata gtgac 25
<210>5
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
ccaatgcatc ctctgttaca ggtcactaat ac 32
<210>6
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
ataagaatgc ggccgcagat atcagggagt gggacaaaat tgaa 44
<210>7
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
tttggataaa aaacagacta gataatactg taaaacacaa gatatgcagt cacta 55
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>8
taacgcttac aatttacgcgt 21
<210>9
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>9
ctgcatatct tgtgttttac agtattatct agtctgtttt ttatccaaaa tctaa 55
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>10
ctggacgtag ccttcgggca tggc 24
<210>11
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>11
gactgctgca gctctgttac aggtcac 27
<210>12
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>12
gactgtctag agaaatcaaa taatgat 27
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>13
ctgctttttt atactaactt g 21
<210>14
<211>243
<212>DNA
<213>λ噬菌体(Bacteriophage lambda)
<400>14
tctgttacag gtcactaata ccatctaagt agttgattca tagtgactgc atatgttgtg 60
ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta 120
tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tatactaagt tggcattata aaaaagcatt 180
gcttatcaat ttgttgcaac gaacaggtca ctatcagtca aaataaaatc attatttgat 240
ttc 243
<210>15
<211>102
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>15
ctgctttttt atactaagtt ggcattataa aaaagcattg cttatcaatt tgttgcaacg 60
aacaggtcac tatcagtcaa aataaaatca ttatttgatt tc 102
<210>16
<211>162
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>16
tctgttacag gtcactaata ccatctaagt agttgattca tagtgactgc atatgttgtg 60
ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta 120
tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tatactaact tg 162
<210>17
<211>27
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>17
gaaattcttt ttgatactaa cttgtgt 27
Claims (23)
1.在真核细胞中进行DNA的序列特异性重组的方法，包括
a)将含有第一个attB，attP，attL或attR序列或其衍生物的DNA引入到细胞中；
b)将含有第二个attB，attP，attL或attR序列或其衍生物的DNA引入到细胞中，其中当所述的第一个DNA序列含有attB序列或其衍生物，则所述第二个序列含有attB，attL或attR序列或其衍生物，或者当所述的第一个DNA序列含有attP序列或其衍生物，则所述第二个序列含有attP，attL或attR序列或其衍生物，或者当所述的第一个DNA序列含有attL序列或其衍生物，则所述第二个序列含有attB，attP或attL序列或其衍生物，或者当所述的第一个DNA序列含有attR序列或其衍生物，则所述第二个序列含有attB，attP或attR序列或其衍生物；和
c)通过λ噬菌体整合酶Int进行序列特异性重组。
2.在真核细胞中进行DNA的序列特异性重组的方法，所述真核细胞是已将权利要求1所述的第一个att序列或其衍生物整合到该细胞的人工染色体/微染色体或基因组中的细胞，所述方法包括权利要求1的步骤b)和c)。
3.权利要求1或2所述的方法，其中第一个att序列或其衍生物天然存在于所述真核细胞的基因组中，或是预先引入的。
4.一种在真核细胞中表达编码一个或多个所需多肽/产物的至少一个目标基因的方法，包括
a)将含有attB，attP，attL或attR序列或其衍生物的第一个DNA引入到细胞中；
b)将含有attB，attP，attL或attR序列或其衍生物以及至少一个目标基因的第二个DNA引入到细胞中；
c)将所述细胞与λ噬菌体整合酶Int接触；
d)通过λ噬菌体整合酶Int进行序列特异性重组，其中第二个DNA整合到第一个DNA中；和
e)在能表达目标基因的条件下培养所述细胞。
5.权利要求4所述的方法，其中当所述的第一个DNA序列含有attB序列或其衍生物，则所述第二个序列含有attB，attL或attR序列或其衍生物，或者当所述的第一个DNA序列含有attP序列或其衍生物，则所述第二个序列含有attP，attL或attR序列或其衍生物，或者当所述的第一个DNA序列含有attL序列或其衍生物，则所述第二个序列含有attB，attP或attL序列或其衍生物，或者当所述的第一个DNA序列含有attR序列或其衍生物，则所述第二个序列含有attB，attP或attR序列或其衍生物。
6.权利要求4或5所述的方法，其中在第二个DNA被引入到宿主细胞之前，第一个DNA已被整合到所述细胞的基因组，人工染色体/微染色体或附加型元件上。
7.权利要求6所述的方法，其中第一个DNA整合到宿主细胞的基因组中。
8.一种在真核细胞中表达编码一个或多个所需多肽/产物的至少一个目标基因的方法，所述真核细胞含有至少一个天然存在的，允许λ噬菌体整合酶Int或其任何功能突变体介导序列特异性重组的重组序列，所述方法包括
a)将含有attB，attP，attL或attR序列或其衍生物以及至少一个目标基因的DNA引入到所述细胞中；
b)将所述细胞与λ噬菌体整合酶Int接触；
c)通过λ噬菌体整合酶Int使天然存在于所述细胞中的重组序列和引入到所述细胞的DNA之间进行序列特异性重组；和
d)在能表达目标基因的条件下培养所述细胞。
9.权利要求8所述的方法，其中天然存在的序列是attH。
10.权利要求4至9之一所述的方法，其中所述所需多肽/产物从宿主细胞或细胞培养基中分离。
11.前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述attP，attB，attL或attR序列的衍生物包含一拷贝或多拷贝Int臂结合位点，或其中所述的衍生物包含一拷贝或多拷贝核心Int结合位点，或其中所述的衍生物包含一拷贝或多拷贝Int臂结合位点和一拷贝或多拷贝核心Int结合位点的组合。
12.权利要求11所述的方法，其中所述attP，attB，attL或attR序列的衍生物由一拷贝或多拷贝核心Int结合位点组成，或其中所述的衍生物由一拷贝或多拷贝Int臂结合位点和一拷贝或多拷贝核心Int结合位点的组合组成。
13.权利要求11或12所述的方法，其中核心结合位点由9个紧邻的碱基对组成并涉及DNA序列，所述DNA在B-序列的情况下在野生型att位点含有5′-CTGCTTTTT-3′的核苷酸序列，在B′-序列的情况下在野生型att位点含有5′-CAAGTTAGT-3′的核苷酸序列(反向互补链)，在C-序列的情况下在野生型att位点含有5′-CAGCTTTTT-3′的核苷酸序列，在C′-序列的情况下在野生型att位点含有5′-CAACTTAGT-3′的核苷酸序列(反向互补链)，或者所述序列具有功能性核苷酸取代。
14.前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述序列特异性重组通过Int和选自XIS，FIS和/或IHF的一个或多个辅因子进行。
15.前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述序列特异性重组通过修饰的Int，优选Int-h或Int-h/218进行。
16.权利要求14所述的方法，其中Int，Int-h或Int-h/218，XIS，FIS和/或IHF以纯化形式添加到细胞中或由进行序列特异性重组的所述宿主细胞共表达。
17.前述任意一项权利要求所述的方法，其中另外将第三个或第三个和第四个分别含有Int基因，或Int基因和一个和多个选自XIS基因，FIS基因和/或IHF基因的辅因子基因的DNA序列引入到细胞中。
18.前述任意一项权利要求所述的方法，其中当以修饰的Int，优选Int-h或Int-h/218进行序列特异性重组时，既不需要XIS，FIS，也不需要IHF。
19.前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述的第一个和/或第二个重组序列进一步包含编码目标多肽的核酸。
20.前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述目标多肽是抗体，激素或生长因子。
21.前述任意一项权利要求所述的方法，其中宿主细胞是哺乳动物细胞。
22.权利要求21所述的方法，其中哺乳动物细胞是啮齿类动物的细胞，优选小鼠或仓鼠细胞。
23.权利要求22所述的方法，其中仓鼠细胞是BHK或CHO细胞，小鼠细胞是鼠骨髓瘤细胞，优选NS0和Sp2/0细胞。
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