MXPA05005080A - Recombinacion secuencia especifica de adn en celulas eucarioticas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con un metodo de recombinacion de secuencia especifica de ADN en celulas eucarioticas, que comprende la introduccion dentro de una celula de un primer ADN que comprende una secuencia nucleotidica que contiene por lo menos una secuencia de recombinacion, introduccion dentro de una celula de un segundo ADN que comprende una secuencia nucleotidica que contiene por lo menos una secuencia de recombinacion adicional y realizacion de la recombinacion de secuencia especifica por una integrasa Int de bacteriofago ?.

Description

RECOMBINACION SECUENCIA ESPECIFICA DE ADN EN CELULAS EUCARIOTICAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método de , recombinación de secuencia especifica de ADN en células eucarióticas, que comprende la introducción en una célula de un primer ADN que comprende una secuencia nucleotídica que contiene por lo menos una secuencia de recombinación, introducción al interior de una célula de un segundo ADN que comprende una secuencia nucleotídica que contiene por lo menos una 'secuencia de recombinación adicional al interior de una célula y realización de la recombinación de secuencia especifica por la integrasa Int del bacteriófago ?. La manipulación controlada de genomas eucarióticos y la expresión de proteínas recombinantes a partir de vectores episómicos son métodos importantes para analizar las funciones de genes específicos en organismos vivos. Además, tales manipulaciones juegan un papel en los métodos de terapia de genes en medicina. En este contexto, la generación de animales transgénicos , el cambio de genes o los segmentos de gen (denominado "direccionamiento de gen") y la integración dirigida para ADN extraño del genoma de eucariotas superiores son de importancia particular. Recientemente, estas tecnologías pueden mejorarse por medio Ref. 163535 de caracterización y aplicación de sistemas de recombinación específicos de secuencia. Además, la integración específica de secuencia de los casetes de expresión, que codifican y expresan un polipéptido/producto deseado en el genoma de células anfitrionas pertinentes biotecnológicas también adquiere más significancia para la producción de sustancias biofarmacéuticas . El nivel de expresión para un polipéptido deseado en una línea de células transformada estable depende del sitio de integración. Mediante integración específica de secuencia, los sitios los cuales pueden ser utilizados preferiblemente tienen una actividad elevada de transcripción. El método convencional para generar líneas de células de producción que expresan un polipéptido/producto deseado se basa en la integración ^aleatoria del vector de expresión recombinante en el genoma de la célula anfitriona. Las variaciones en el nivel de expresión de uno o varios de los genes integrados de interés en líneas de células transformadas estables se atribuye principalmente a diferencias en ubicaciones cromosómicas y número de copias. La integración aleatoria en la proximidad de la heterocromatina resulta en niveles variables de expresión de transgen. Las ubicaciones del cromosoma que promueve la expresión de uno o varios de los genes integrados de interés se consideran como regiones transcripcionalmente activas de eucromatina . Esta condición aleatoria de la integración provoca una gran diversidad en la robustez, productividad y calidad de las células recombinantes que necesita procesos elaborados de detección y separación sistemáticos (cribado) para identificar y aislar el clon de célula adecuado que exprese el polipeptido deseado en gran cantidad. Además, la heterogeneidad también significa que para cada clon debe desarrollarse un procedimiento de producción optimizado, lo que vuelve el desarrollo de una línea de células de producción adecuada un proceso que consume tiempo, que requiere trabajo y que es costoso. Las ADN recombinasas de secuencia especifica conservadoras se han dividido en dos familias . Los miembros de la primera familia, la denominada familia de "integrasa" , cataliza la separación y la ¦ unión nuevamente de cadenas de ADN entre dos secuencias nucleotídicas definidas las cuales se nombrarán como secuencias de recombinación en lo siguiente . Las secuencias de recombinación pueden estar ya sea en dos moléculas de ADN diferentes o sobre una molécula de ADN, lo que resulta en recombinación intermolecular e intramolecular, respectivamente. Para recombinación intramolecular, el resultado de la reacción depende de la orientación respectiva de las secuencias de recombinación entre sí. En el caso de una orientación invertida, es decir opuesta, de las secuencias de recombinación, se produce inversión de los segmentos de ADN que se encuentran entre las secuencias . de recombinación. En el caso de secuencias repetidas directas, es decir en tándem de las secuencias de recombinación sobre un ADN sustrato, se produce supresión. En el caso de recombinación intermolecular, es decir, ambas secuencias de xecombinación se localizan en dos molécula de ADN diferentes, puede presentarse fusión de las dos moléculas de ADN. Aunque los miembros de la familia de integrasa habitualmente catalizan recombinación intramolecular así como intermolecular, las recombinasas de la segunda familia de las denominadas "invertasas/resolvasas" son únicamente capaces de catalizar la recombinación intramolecular. Actualmente, las recombinasas las cuales se utilizan para la manipulación de genomas eucarióticos pertenecen a la familia de integrasa. Tales recombinasas son las recombinasas Cre del bacteriófago Pl y la recombinasa Plp de levadura (Müller, U. (1999) Meen. Develop., 82, pp . 3). Las secuencias de recombinación a las cuales se une la recombinasa Cre se denominan loxP. LoxP es una secuencia nucleotídica de 34 pares de base de largo que consiste de dos 13 secuencias de pares de bases largas de secuencias nucleotídicas invertidas y un separador de 8 pares de bases de largo que se encuentra entre las secuencias invertidas (Hoess, R. Et al. (1985) J. Mol. Biol . , 181, pp . 351). El FRT de las secuencias de unión mencionadas para Flp se acumulan de manera similar. No obstante, difieren de loxP ( ilby, J. Et al. (1993) Trends Genet . , 9, pp. 413). Por lo tanto, las secuencias de recombinación no se pueden sustituir entre sí, es decir, Cre no es capaz de recombinar secuencias FRT y FLP no es capaz de recombinar secuencias loxP. Ambos sistemas de recombinación son activos sobre distancias grandes, es decir, el segmento de ADN que se va a invertir o suprimir y flanqueado por dos secuencias loxP o FRT puede ser de varias 10 000 pares de base de largo. Por ejemplo, una recombinación específica de tejido en un sistema de ratón, un desplazamiento cromosómico en plantas y animales y una inducción controlada de la expresión del gen se obtiene con los dos sistemas; artículos de revisión de Müller, U. (1999) Meen. Develop., 82, pp. 3. La ADN polimerasa ß fue suprimida en tejidos particulares en ratones de esta manera; Gu, H, et al. (1994) Science, 265, p . 103. Un ejemplo adicional es la activación específica del oncogen del ADN del virus de tumor SV40 en los cristalinos de ratón lo que genera la formación de tumor exclusivamente en esos tejidos. Se ha utilizado la estrategia Crs-loxP en relación con promotores inducibles. Por ejemplo, la expresión de la recombinasa es regulada con un promotor inducible por interferón lo que genera la supresión de un gen específico en el hígado y no -o únicamente en un bajo grado- en otros tejidos; Kühn, R. et al. (1995) Science, 269, pp. 1427.

Hasta ahora se han utilizado tres miembros de la familia invertasa/resolvasa para la manipulación de genomas eucarióticos . Un mutante del bacteriófago Mu invertasa Gin puede catalizar la inversión de un fragmento de ADN en protoplastos vegetales sin cof ctores . No obstante, se ha descubierto que este mutante es hiperrecombinogénico, es decir, catalizan las separaciones de la cadena de ADN también en otras secuencias diferentes a las secuencias de recombinación natural . Esto genera sucesos de recombinación parcialmente mortales no deseados en los genomas de protoplasto de planta. La recombinasa ß de Streptococcus pyogenes cataliza la recombinación en cultivos de célula de ratón entre dos secuencias de recombinación como secuencias repetidas directas lo que genera la separación del segmento. No obstante, simultáneamente con la supresión también se ha detectado la inversión lo que vuelve poco adecuado el uso controlado del sistema para manipulación de genomas eucarióticos. Los imitantes de la resolvasa ?d de E. coli se ha demostrado que son activos en secuencias de recombinación genómicas episómicas e introducidas artificialmente, pero la eficiencia de esta última reacción aún es más bien pobre. La manipulación de genomas eucarióticos con la recombinasa Cre y Flp, respectivamente, muestran desventajas significativas. En caso de supresión, es decir la recombinación de dos secuencias de recombinación repetidas en tándem loxP o FRT en un genoma existe una pérdida irreversible del segmento de ADN que se encuentra entre las secuencias repetidas en tándem. De esta manera, un gen que se localice en este segmento de ADN se perderá permanentemente para la célula y el organismo. Por lo tanto es imposible la reconstrucción del estado original para un análisis nuevo de la función del gen, es decir, en una etapa de desarrollo posterior del organismo. La pérdida irreversible del segmento de ADN causada por la supresión se puede evitar por una inversión del segmento de ADN respectivo. Se puede inactivar un gen por una inversión sin que haya pérdida y se puede activar nuevamente en una etapa de desarrollo posterior o en el animal adulto por medio de una expresión regulada en tiempo de la recombinasa via recombinación de retorno. No obstante, el uso de recombinasas tanto Cre como FLP en este método modificado tiene la desventaja de que la inversión no puede ser regulada dado que las secuencias de recombinación no se alterarán como resultado del suceso de recombinación. Por lo tanto, los sucesos de recombinación repetida que se presentan provocan la inactivación del gen respectivo debido a la inversión del segmento de ADN respectivo únicamente en algunas, y en el mejor de los casos en 50% de las células objetivo en el equilibrio de la reacción. Se han realizado esfuerzos por resolver este problema, por lo menos en parte, al construir secuencias loxP mutadas las cuales no pueden ser utilizadas para reacción adicional después de una recombinación sencilla. No obstante, la desventaja es la condición única de la reacción, es decir, . no existe activación subsecuente por retrorrecombinación después de inactivación del gen, por inversión. Una desventaja adicional de la recombinasa Flp es su estabilidad térmica reducida a 37°C, y de esta manera se limita significativamente la eficiencia de la reacción de recombinación en eucariotas superiores, por ejemplo, en ratones con una temperatura corporal de aproximadamente 39°C. Por lo tanto, se han generado mutantes de Flp los cuales muestran una mayor estabilidad al calor en comparación con la recombinasa tipo silvestre. No obstante, incluso estas enzimas Flp mutantes aún muestran una eficiencia de recombinación menor en comparación con la recombinasa Cre . Un uso adicional de las recombinasas de secuencia especifica se encuentra en el campo médico, por ejemplo en genoterapia, en donde las recombinasas integran un segmento de ADN deseado en el genoma de una célula objetivo humana respectiva de una manera estable y controlada. Tanto Cre como Flp pueden catalizar la recombinación intermolecular. Ambas recombinasas recombinan un ADN plasmídico el cual presenta una copia de su secuencia de recombinación respectiva con una secuencia de recombinación correspondiente la cual ha sido insertada antes dentro del genoma eucariótico por medio de recombinación homologa. No obstante, es deseable que esta reacción incluya una secuencia de recombinación que se presenta de manera "natural" en el genoma eucariótico. Debido a que loxP y FRT tienen una longitud de 34 y 54 nucleótidos, respectivamente, es estadísticamente poco probable la presentación de coincidencias exactas de estas secuencias de recombinación como parte del genoma. Incluso si estuviera presente una secuencia de recombinación, aún existe la desventaja de la reacción contraria mencionada antes, es decir, las recombinasas tanto Cre como Flp pueden cortar el segmento de ADN insertado después de integración exitosa por recombinación intramolecular. Por lo tanto, un problema de la presente invención es proporcionar un sistema de recombinación sencillo y controlable y un medio de trabajado requerido. Un problema adicional de la presente invención es el suministro de un sistema de recombinación y el medio de trabajado requerido, lo cual se puede llevar a cabo en una integración estable y dirigida de la secuencia de ADN deseada. Un problema adicional de la presente invención es el suministrar métodos los cuales permitan la generación de un sistema de expresión de proteína mejorado en base en uno de los sistemas de recombinación. Tales problemas se resuelven por la materia objeto caracterizada en las reivindicaciones.

La invención se explica con mayor detalle con las siguientes ilustraciones. La figura 1 muestra un presentación esquemática de las reacciones de recombinación específicamente la integración y el corte catalizados por la integrasa Int de tipo silvestre. Se muestra un ADN plasmídico superhelicoidal (parte superior) que presenta una copia de la secuencia de recombinación attP. AttP consiste de los cinco denominados brazos de los sitios de unión para Int (Pl, P2 , Pl' , P2 ' , P3')/ dos sitios de unión de Int de núcleo (C y C ; marcados con flechas negras), tres sitios de unión para IHF (Hl, H2 , H' ) , dos sitios de unión para Xis (XI, X2) y la denominada región de superposición (rectángulo claro) , en donde se lleva a cabo el cambio de cadena de ADN actual . La secuencia de asociado natural para attP, attB se muestra sobre un segmento de ADN lineal en la parte inferior y consiste de dos sitios de unión de núcleo para Int (B y B' ; marcados con flechas claras) y una región de superposición. Para la recombinación entre attB y attP, son necesarios Int e IHF que lleven a la integración del plásmido en el segmento de ADN que presenta attB. De esta manera, se forman dos secuencias de recombinación híbridas nuevas, attL y attR las cuales sirven como secuencias objetivo para el corte. Esta última reacción requiere en la situación de tipo silvestre Int e IHF, y además un cofactor adicional XIS codificado por el fago ?.

Las figuras 2A-2D muestran reacciones de recombinación intramoleculares e intermoleculares. (2A) recombinación integrativa intermolecular (attB x attP) . (2B) recombinación integrativa intermolecular (attB x attP) . (2C) recombinación cortante intramolecular (attL x attR) . (2D) recombinación cortante intermolecular (attL x attR) . Los vectores del sustrato y los productos de recombinación esperados se esquematizan en la parte superior de cada panel. La fracción de células que expresan GFP se determina por FACS en tres puntos en el tiempo después de cotransfección del sustrato y los vectores de expresión. Se muestran valores medios de tres ensayos con desviaciones estándar indicadas por líneas verticales. Las figuras 3A-3B muestran que la presencia de secuencias de ADN que unen el brazo de Int en los sitios att estimulan la recombinación intermolecular. (3A) pares de vectores de sustrato para recombinación intermolecular contienen ya sea attB o attP en diferentes combinaciones y generan productos que expresan GFP activados por el promotor de CMV (3B) varias combinaciones de vectores de sustrato se cotransfectan con vectores de expresión para Int de tipo silvestre, Int-h mutante o Int-h/218. A las 48 h se analizan las células por FACS y se determina la proporción de células que expresan GFP para dos pares de sustratos . La recombinación entre attP y attP sirve como referencia, como se ha indicado. Se muestran valores medios de tres ensayos con desviaciones estándar indicadas por líneas verticales. Los valores medios reales de células de expresión de GFP (%) para Int son 0.08 (B x B) , 1.24 (P x P) y 0.81 (P x B) . Aquellos para Int-h son: 1.15 (B x B) , 8.07 (P x P) y 9.90 (P x B) . Aquellos para Int-h/218 son de 4.01 (B x B) , 17.62 (P x P) , y 16.45 (P x B) . Las figuras 4A-4B muestran que la proteína IHF purificada estimula la recombinación integrativa intramolecular e intermolecular por Int de tipo silvestre. (4?) representación esquemática de vectores de sustrato los cuales incuban con o sin IHF antes de su transfeccion en células HeLa que expresan de manera transitoria Int de tipo silvestre o Int-h. (4B) a las 48 horas después de la transfeccion, las fracciones de células que expresan GFC se analizan por FACS . Se gráfica la proporción de estas fracciones como activación de recombinación por IHF. La gráfica muestra los valores medios de tres ensayos con desviaciones estándar indicados por líneas verticales. Los valores medios reales de células que expresan GFP (%) en presencia y ausencia de IHF, respectivamente, son, para Int (7.93/1.26) y para Int-h (17.57/13.14) en el caso de recombinación intramolecular, y para Int (13.94/3.47) e Int-h (20.33/16.83) al analizar la recombinación intermolecular. La figura 5 muestra esquemáticamente diseños de vector de expresión ejemplares para la recombinación de ADN específico de secuencia en células CHO-DG44. El término' "P/E" significa una unidad compuesta que contiene un elemento mej orador y un promotor, "P" indica un elemento promotor y "T" indica un sitio de terminación de transcripción requerido para la poliadenilación del ARN mensajero transcrito. "GOI" se refiere a un gen de interés, "dhfr" a un marcador seleccionable amplificable de dihidrofolato reductasa, "FP" a una proteina fluorescente tal como ZsGreen y "npt" a un marcador seleccionable de neomicina fosfotransferasa. Una flecha indica el sitio de inicio de transcripción dentro de una unidad de transcripción. La recombinación de secuencia especifica entre el sitio de recombinación attP o attB que se localiza en el primer ADN y el sitio de recombinación attP o attB que se localiza en el segundo ADN se muestra con una cruz y está mediado por la integrasa de bacteriófago ?. El término "att" se refiere a los sitios de unión que resultan de la recombinación mostrada de manera ejemplar entre attP y attP, attP y attB, attB y attP o attB y attB que se localizan en el primero y segundo ADN, respectivamente. Los términos "transformación" o "transformar", "transfecclón" o "transíectar" , como se utilizan en la presente, significa cualquier introducción de una secuencia de ácido nucleico al interior de una célula, lo que resulta en células modificadas genéticamente, recombinantes , transformadas o transgénicas . La introducción se puede realizar por cualquier método bien conocido en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York o Ausubel, F.M. et al (actualizada en 1994) Current Protocols in Molecular Biology, New York: Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience . Los métodos incluyen pero no se limitan a lipofección, electroporación, tranfección por policatión (tal como la mediada por DEAE-dextrano) , fusión de protoplastos , infecciones virales y microinyección o se puede llevar a cabo por medio del método de calcio, el método de electrochoque , inyección intravenosa/intramuscular, inhalación de aerosol o inyección de un ovocito. La transformación puede resultar en una transformación transitoria o estable de las células anfitrionas . El término "transformación" o "para transformar" también significa la introducción de una secuencia de ácido nucleico viral de una manera la cual es natural para el virus respectivo. La secuencia de ácido nucleico viral no necesita estar presente como una secuencia de ácido nucleico desnudo sino que se puede empacar en una envoltura de proteina viral. Por lo tanto, el término se relaciona no sólo con el método el cual habitualmente se conoce bajo el término "transformación" o "transformar" . Se favorecen métodos de transfección que proporcionan frecuencia óptima de transfección y expresión del ácido nucleico introducido. Los métodos adecuados se pueden determinar por procedimientos sistemáticos. Para los transfectantes estables los constructos (plásmido recombinante) se integran en el genoma de la célula anfitriona o un cromosoma artificial minicromosoma o bien se localizan episómicamenté de manera que se mantienen establemente dentro de la célula anfitriona. El término "secuencias de recombinación" como se utiliza en la presente, se relaciona con las secuencias de at B, aütP, attL y attR y derivados de las mismas. Un ejemplo de una secuencia attB se especifica en SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 13, un ejemplo de una secuencia attP se especifica en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 14, un ejemplo de una secuencia attL se especifica en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 15 y un ejemplo de una secuencia attR se especifica en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 16. El término "derivado" como se utiliza en la presente, se relaciona con secuencias de attB, attP, attL y attR que tienen una o más sustituciones, preferiblemente siete, de manera más preferible dos, tres, cuatro, cinco o seis en la región de superposición o en la región de núcleo, en contraste con las secuencias attB, attP, attL y attR que se presentan de manera natural . El término "derivado" también se relaciona con por lo menos un sitio de unión de Int del núcleo de attB, attP, attL y attR. El término "derivado" también se relaciona con por lo menos un sitio de unión de Int de attP, attL y attR más una o más copias de sitio de unión de brazo para Int . El término "derivado" también se relaciona con por lo menos un sitio de unión de núcleo de Int de attP, attL o attR y adicionalmente una o más copias de los sitios de unión de factor IHF, FIS O XIS. El término "derivado" también se relaciona con una combinación de estas características. Además, el término "derivado" se relaciona con cualquier fragmento funcional del mismo y con secuencias nucleotxdicas endógenas en células eucarióticas que soportan la recombinación de secuencia especifica , por ejemplo, attH identificada en el genoma humano (véase, por ejemplo, WO 01/16345) . El término "derivado" en general incluye las secuencias attB, attB, attL o attR adecuadas para llevar a cabo el uso propuesto de la presente invención, lo que significa que la secuencia media sucesos de recombinación específicos de secuencia activados por una integrasa (del tipo silvestre o modificada) del bacteriófago ?. El término "fragmento funcional" se relaciona con secuencias attB, attP, attL y attR que tienen sustituciones, supresiones o inserciones (que incluye la presencia o ausencia de sitios de unión de proteína de tipo silvestre o modificadas) , las cuales no afectan significativamente el uso de dichas secuencias en los sucesos de recombinación activados por una integrasa de tipo silvestre o modificada del bacteriófago ?. La funcionalidad no es afectada de manera significativa cuando la frecuencia de recombinación es de por lo menos aproximadamente 70%, de manera preferible por lo menos aproximadamente 80%, de manera más preferible aproximadamente 90%, y de manera más preferible adicional por lo menos aproximadamente 95%, y de manera mucho más preferible más de aproximadamente 100% en comparación con las secuencias de recombinación correspondientes que existen en la naturaleza utilizando la misma recombinasa bajo las mismas condiciones (por ejemplo uso in vitro o in vivo, un tipo de célula anfitriona idéntica, condiciones de transíección idénticas, presencia o ausencia de los mismos factores del anfitrión, las mismas condiciones de amortiguador, temperatura idéntica, etcétera) . De manera alternativa, las sustituciones, supresiones o inserciones de las secuencias atfcB, attP, attL y attR confieren por lo menos una mejoría de los sucesos de recombinación activados por la integrasa de tipo silvestre o modificada del bacteriófago ?, por lo que el mejoramiento puede consistir, por ejemplo, de: (i) incrementar la eficiencia de sucesos de recombinación (integración o corte) , (ii) incrementar la especificidad de recombinación, (iii) favorecer sucesos de recombinación cortantes, (iv) favorecer sucesos de recombinación integrantes (integrativos) , (v) liberar de los requerimientos para algunos o todos los factores del anfitrión, en comparación con las secuencias de recombinación correspondientes que existen en la naturaleza utilizando la misma recoinbinasa bajo las mismas condiciones (véase antes) . La funcionalidad de los sitios de recombinación modificados o de la integrasa modificada se pueden demostrar de manera que dependen de la característica particular deseada y se conocen en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo de cotransfección como se describe en la presente invención (véanse resultados 5.1 o el ejemplo 3 de WO 01/16345) para caracterizar la recombinación mediada por integrasa de ADM extracromosomico en una diversidad de líneas celulares. Brevemente, las células son cotransfectadas con un vector de expresión que codifica para la proteína integrasa y un sustrato vector que es un sustrato para la recombinasa, codificar para un gen indicador funcional/no funcional (por ejemplo una proteína fluorescente como GFP) y que contiene por lo menos una secuencia de recombinación en la misma. Ante la expresión de la integrasa por el vector de expresión, la función del gen indicador se volverá no funcional/funcional. Por lo tanto, la actividad de recombinación se puede ensayar ya sea por recuperación del sustrato vector recombinado y al buscar evidencia de la recombinación a nivel de ADN (por ejemplo al realizar una PCR, un análisis de secuencia de la región recombinada, análisis de enzima de restricción, análisis de transferencia Southern) o al buscar por evidencia de la recombinación a nivel de proteina (por ejemplo ELISA, transferencia Western, radioinmunoensayo, inmunoprecipitación, inmunotinción, análisis FACS de proteínas fluorescentes) . El término "región de superposición" como se utiliza en la presente define la secuencia de las secuencias de recombinación en donde se lleva a cabo un cambio de cadena de ADN, incluyendo separación y unión nuevamente de la cadena, y se relaciona con una secuencia de ADN de consenso 5 ' -TTTATAC-3 ' en sitios att de tipo silvestre o una secuencia que tiene sustituciones nucleotídicas funcionales. El único prerrequisito es que la secuencia de la región que se superpone sea idéntica entre secuencias asociadas recombinantes . El término "sitio de unión de núcleo" se relaciona con dos copias repetidas de manera imperfecta en una orientación invertida, separadas por la región de superposición en cada conjunto de sitios att de tipo silvestre. Los sitios de unión de núcleo son esenciales para la recombinación por unión de la integrasa a baja afinidad. Cada sitio de unión de núcleo consiste de nueve pares de bases contiguos y se relaciona con secuencias de ADN que consiste de la secuencia B de la secuencia nucleotídica 5 ' -CTGCTTTTT-3 ' , para la secuencia B' de la secuencia nucleotídica 5 ' CAAGTTAGT-3 ' (cadena complementaria inversa), para la secuencia C de la secuencia nucleotídica 5'-CAGCTTTTT-3 ' y para la secuencia C de . la secuencia nucleotídica 5 ' -CAACTTAGT-3 ' (cadena complementaria inversa) en sitios att de tipo silvestre o las secuencias que tienen sustituciones nucleotídicas funcionales. El término "sitio de unión de brazo para Int" o "sitios de unión de brazo", como se utilizan en la presente, se relacionan con la secuencia de consenso 5 ' -C/AAGTCACTA -3 ' o la secuencia que tiene sustituciones nucleotídicas funcionales. El sitio de unión de brazo para Int se puede colocar a diversas distancias corriente arriba o corriente arriba del sitio (s) de unión Int de núcleo. El término "homólogo" u "homólogos" o "similar" como se utiliza en la presente con respecto a las secuencias de recombinación, sitios de unión de brazo y sitios de unión de factor de anfitrión se relacionan con una secuencia de ácido nucleico que es idéntica en aproximadamente 70%, preferiblemente en aproximadamente 80%, de manera más preferible en aproximadamente 85%, de manera mucho más preferible en aproximadamente 90%, de modo aún más preferible en aproximadamente 95% y de manera mucho más preferible en aproximadamente 99% de las secuencias de recombinación que se encuentran en la naturaleza, los sitios de unión de brazo y los sitios de unión de factor de anfitrión. Con el término homólogo o similar se consideran secuencias, las cuales, por ejemplo, utilizando parámetros estándar en el algoritmo de similitud BLAST o NCBI (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al., Journal of Molecular Biology 215, 403-410 (1990) ) muestran una probabilidad de P < 10"5 cuando se comparan con las secuencias de recombinación. El término "vector" , como se utiliza en la presente, se relaciona con constructos (plásmidos recombinantes) que se encuentran en la naturaleza o generados sintéticamente para captación, proliferación, expresión o transmisión de ácidos nucleicos en una célula,' por ejemplo plásmidos, fagémidos, cósmidos, cromosomas artificiales/minicromosomas, bacteriófagos, virus o retrovirus . Los métodos utilizados para construir vectores son bien conocidos por las personas expertas en la técnica y se describen en diversas publicaciones. En particular las técnicas para construir vectores adecuados incluyen una descripción de los componentes funcionales y reguladores tales como promotores, mejoradores, señales de terminación y poliadenilación, marcadores de selección, orígenes de replicación y señales de empalme, se revisan con detalle considerable en Sambrook, J. et al. (1989), supra y las referencias mencionadas allí . Los vectores de expresión eucarióticos típicamente contendrán también secuencias procarióticas que faciliten la propagación del vector en la bacteria tal como un origen de replicación o genes de resistencia a antibióticos para selección en bacterias. Una diversidad de vectores de expresión eucarióticos que contienen un sitio de clonación en el cual se puede enlazar operativamente un polinucleótido, son bien conocidos en la técnica y algunos están disponibles comercialmente de compañías tales como Stratagene, La Jolla, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA; Promega, Madison, WI o BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA. Los términos "gen de interés", "secuencia deseada" o "gen deseado", como se utiliza en la presente, tienen el mismo significado y se refieren a una secuencia polinucleotidica de cualquier longitud que codifica para un producto de interés. La secuencia seleccionada puede ser de longitud completa o un gen truncado, un gen de fusión o marcado y puede ser ADNc, ADN genomico o un fragmento de ADN, preferiblemente ADNc. Puede ser una secuencia nativa, es decir, formas que se presentan en la naturaleza o puede estar mutado o modificado de alguna otra manera; según se desee. Estas modificaciones incluyen optimizaciones de codones para optimizar el uso de codones en la célula anfitriona seleccionada, humanización o marcado. La secuencia seleccionada puede codificar para un polipéptido secretado, citoplásmico, nuclear, unido a membrana o de superficie celular. El término "producto de interés" incluye proteínas, polipéptidos, fragmentos de los mismos, péptidos, ARN antisentido todos los cuales se pueden expresar en la célula anfitriona seleccionada. El término "secuencia de ácido nucleico" , "secuencia nucleotídica" o "secuencia de ADN" , como se utiliza en la presente, se refiere a un oligonucleótido, nucleótido o polinucleótido y fragmentos y porciones del mismo y a ADN o ARN de origen genó ico o sintético, el cual puede ser de cadena sencilla o doble y representar una cadena transcrita (directa, sense) o complementaria (antisentido) . La secuencia puede ser una secuencia no codificante, una secuencia codificante o una mezcla de ambas. Los polinucleótidos de la invención incluyen regiones de ácido nucleico en donde uno o más codones han sido sustituidos por sus sinónimos . Las secuencias de ácido nucleico de la presente invención se pueden preparar utilizando técnicas estándar bien conocidas por los expertos en la técnica. El término "que codifica" o "codificantes" se refiere a la propiedad inherente de secuencias especificas de nucleótidos en un ácido nucleico, tales como un gen en cromosoma o un ARNm, que sirven como plantillas para las síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (es decir, ARNr, ARNt u otras moléculas de ARN) o aminoácidos y las propiedades biológicas que resultan de los mismos. Por lo tanto, un gen codifica para una proteina si la transcripción y traducción del ARNm producido por dicho gen produce la proteina en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, la secuencia nucleotídica de la cual es idéntica a la secuencia de ARNm y habitualmente se proporciona en listas de secuencias así como la cadena no codificante, utilizada como la plantilla para la transcripción de un gen o ADNc, se pueden denominar como codificante de la proteína u otro producto de dicho gen o ADNc. Un ácido nucleico que codifica para una proteína incluye ácidos nucleicos que tienen secuencias nucleotídicas diferentes pero que codifican para la misma secuencia de aminoácidos de la proteína debido a la degeneración del código genético. Los ácidos nucleicos y las secuencias nucleotídicas que codifican para proteínas pueden incluir intrones . El término "polipéptido" se utiliza de manera intercambiable con las secuencias de residuos de aminoácidos o proteínas y se refieren a polímeros o aminoácidos de cualquier longitud. Estos términos también incluyen proteínas que son modificadas post traduccionalmente mediante reacciones que incluyen, pero que no se limitan a glucosilación, acetilación, fosforilación o procesamiento de proteínas. Las modificaciones y cambios, por ejemplo fusiones a otras proteínas, sustituciones, supresiones o inserciones en la secuencia de aminoácidos se pueden realizar en la estructura de un polipeptido mientras la molécula mantenga su actividad funcional biológica. Por' ejemplo, ciertas sustituciones en la secuencia de aminoácidos se pueden realizar en un polipeptido o en su secuencia codificante de ácido nucleico subyacente y se puede obtener una proteina con propiedades similares. Se pueden preparar modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, al realizar mutagénesis específica de sitio o mutagénesis mediada por reacción en cadena de polimerasa sobre sus secuencia de ácido nucleico subyacente. El término "expresión" como se utiliza en la presente, se refiere a la transcripción o traducción de una secuencia heteróloga de ácido nucleico dentro de una célula anfitriona. El nivel de expresión de un producto deseado en una célula anfitriona se puede determinar en base ya sea a la cantidad de ARNm correspondiente que está presente en la célula o a la cantidad del polipéptido deseado codificado por la secuencia seleccionada. Por ejemplo, el ARNm transcrito de una secuencia seleccionada se puede cuantificar por hibridación de transferencia Northern, protección de ARN de ribonucleasa, hibridación in situ a ARN celular o por PCR (véase Sambrook, et al. (1989), supra; Ausubel, F.M. et al (actualizada en 1994) , supra) . Las proteínas codificadas por una secuencia seleccionada se pueden cuantificar por diversos métodos, por ejemplo, por ELISA, por transferencia Western, por radioinmunoensayos , por inmunoprecipitación, al realizar ensayos para determinar la actividad biológica de la proteína o por inmunoteñido de la proteína seguido por PCR y análisis FACS (véase Sambrook, J. et al. (1989), supra; Ausubel, F. . et al. (actualizada en 1994), supra) . Un "cásete de expresión" define una región dentro de un constructo que contiene uno o más genes que se van a transcribir, en donde los genes contenidos dentro del segmento están unidos operativamente entre sí y se transcriben desde un promotor simple, y como resultado, los diferentes genes están enlazados por lo menos transcripcionalmente . Se puede transcribir y expresar desde cada unidad de transcripción más de una proteína o producto. Cada unidad de transcripción comprenderá los elementos reguladores necesarios para la transcripción y traducción de cualquier secuencia seleccionada que esté contenida dentro de la unidad. El término "enlazado operativamente" significa que dos o más secuencias de ácido nucleico o elementos de secuencia se colocan de manera tal que permiten que funcionen de la manera que se desea, por ejemplo, un promotor o mej orador está unido operativamente a una secuencia codificante si actúa en cis respecto al control o modula la transcripción de la secuencia enlazada. De manera general, aunque no necesariamente, las secuencias de ADM que están unidas operativamente están contiguas y, cuando es necesario, se unen a dos regiones codificantes proteínicas o en el caso de un líder secretor, contiguas en un marco de lectura. El término "gen marcador de selección" se refiere a un gen que sólo permite que las células transporten el gen que va a ser seleccionado específicamente para o contra la presencia de un agente de selección correspondiente. A modo dé ilustración, se puede utilizar un gen de resistencia a antibióticos como un gen marcador seleccionable positivo que permite que la célula anfitriona transformada con el gen sea seleccionada positivamente por la presencia del antibiótico correspondiente; una célula anfitriona no transformada no será capaz de crecer o sobrevivir bajo las condiciones de cultivo de selección. Los marcadores seleccionables pueden ser positivos, negativos o bifuncionales . Los marcadores seleccionables positivos permiten la selección para células transportadas por el marcador al conferir resistencia a un medicamento o compensar un defecto metabólico o catabólico en la célula anfitriona. En contraste, los marcadores de selección negativos permiten que las células transporten el marcador que va a ser eliminado selectivamente. Por ejemplo, utilizando el gen HSV-tk como un marcador se volverá a la células sensibles a agentes tales como aciclovir y ganciclovir. Los genes marcadores seleccionables utilizados en la presente, incluyendo los genes seleccionables amplificables incluirán mutantes y variantes sometidos a ingeniería de manera recombinante, fragmentos, equivalentes funcionales, derivados, homólogos y fusiones del gen marcador seleccionable nativo en la medida en que el producto codificado retenga la propiedad seleccionable. Los derivados útiles generalmente tienen similitud de secuencia sustancial (a nivel de aminoácidos) en regiones o dominios del marcador seleccionable asociado con la propiedad seleccionable. Se ha descrito una diversidad de genes marcadores que incluyen marcadores bifuncionales (por ejemplo positivo/negativo) (véase, por ejemplo, WO 92/08796 y WO 94/28143) , incorporados como referencia en la presente. Por ejemplo, los genes seleccionables utilizados comúnmente con células eucarióticas incluyen los genes para aminoglucósido fosfotransferasa (APH) , higromicina fosfotransferasa (HYG) , dihidrofolato reductasa (DHFR) , timidina cinasa (TK) , glutamina sintetasa, asparagina sintetasa y genes que codifican para resistencia a neomicina (G418) , puromicina, histidinol D, bleomicina y fleomicina . La selección también se puede realizar por clasificación de células activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) utilizando, por ejemplo, un marcador de superficie celular, una ß-galactosidada bacteriana o proteínas fluorescentes (por ejemplo proteínas fluorescentes verdes (GFP, por sus siglas en inglés) y sus variantes de Aequorea victoria y Renilla reniformis u otras especies; proteínas fluorescentes rojas, proteínas fluorescentes y sus variantes a partir de especies no bioluminiscentes (por ejemplo los géneros Discosoma, Anemonia, Clavularia y Zoanthus) para selección para células recombinantes . El término "agente de selección" se refiere a un sustrato que interfiere con el crecimiento o supervivencia de una célula anfitriona que es deficiente en un gen seleccionable particular. Por ejemplo, para seleccionar para la presencia de un gen de resistencia a antibióticos como APH (aminoglucosido fosfotransferasa) en una célula transfectada se utiliza el antibiótico Geneticina (G418) . La integrasa (habitualmente y designada en la presente como "Int") del bacteriófago ? pertenece, al igual que Cre y Flp, a la familia integrasa de la secuencia específica conservadora de las ADN recombinasas . En su función natural, Int cataliza la recombinación integrante entre dos secuencias de recombinación diferentes, específicamente ttB y attP. La secuencia AttB comprende 21 nucleótidos y originalmente fue aislada del genoma de E. coli; Mizuuc i, M. Y Mizuuchi, K. (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77, pp. 3220. Por otra parte, attP tiene 243 nucleótidos y es mucho más larga y se encuentra en la naturaleza en el genoma del bacteriófago ?; Landy, A. y Ross, W. (1977) Science, 197, pp. 1147. La recombinasa Int tiene siete sitios de unión en attP y dos en attB. La función biológica de Int es la integración específica de secuencia del genoma circular del fago en el locus attB en el cromosoma de E, coli. La integrasa Int necesita un cofactor proteínico, el denominado factor de anfitrión de integración (habitualmente y denominado en la presente como "IHF" ) para la recombinación integrante; ikuchi, Y. Und Nash, H. (1978) J. Biol . Chem. , 253, 7149. El factor IHF es necesario para el ensamblado de un complejo de recombinación funcional con attP. Un segundo cofactor para la reacción de integración es el ADN negativo superenrollado de attP. Finalmente, la recombinación entre attB y attP lleva a la formación de dos secuencias de recombinación nuevas, específicamente, attL y attR, las cuales sirven como sustrato y secuencia de reconocimiento para una reacción de recombinación adicional, la reacción de corte. Un resumen amplio de la integración del bacteriófago X se proporciona, por ejemplo, en Landy, A. (1989) Annu. Rev. Biochem. , 58, pp. 913. El corte del genoma del fago extrayéndolo del genoma bacteriano también está catalizado por la Int recombinasa . Para esto, es necesario un cofactor adicional además de Int e IHF, el cual es codificado por el bacteriófago ?. Esta es la exocinasa (cortasa (habitualmente y denominada en la presente como "XIS") que tiene dos sitios de unión en attR; Gottesman, M. y Weisberg, R. (1971) The Bacteriophage Lambda, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 113. En contraste con la recombinación integrante, el ADN negativo superenrollado de las secuencia de recombinación no es necesario para recombinación cortante. No obstante, el ADN negativo superenrollado incrementa la eficiencia de la reacción de recombinación. Se puede obtener una mejora adicional de la eficiencia de la reacción de corte con un segundo cof ctor, específicamente FIS (factor para la estimulación de inversión) , el cual actúa junto con XIS; Landy, A. (1989) Annu. Rev. Biochem. , 58, pp. 913. El corte es genéticamente la reacción inversa exacta de la integración, es decir, attB y attP se generan nuevamente. Un resumen amplio del corte de bacteriófago ? se proporciona, por ejemplo, en Landy, A. (1989) Annu. Rev. Biochem., 58, pp. 913. Un aspecto de la presente invención se relaciona con un método de recombinación de secuencia especifica del ADN en una célula eucariótica, que comprende: a) introducir una primera secuencia de attB, ttP, attL o attR o un derivado de la misma en una célula, b) introducir una segunda secuencia de attB, attP, attL o attR o un derivado de la misma en una célula, en donde la primera secuencia de ADN comprende una secuencia de attB o un derivado de la misma, la segunda secuencia comprende una secuencia de attB, attL o attR, o un derivado de la misma, o en donde, la primera secuencia de ADN comprende una secuencia attP o n derivado de la misma, la segunda secuencia comprende una secuencia de attP, attL o attR o un derivado de la misma, o en donde, la primera secuencia de ADN comprende una secuencia attL o un derivado de la misma, la segunda secuencia comprende una secuencia de attB, attP o attL o un derivado de la misma, o en donde, si la primera secuencia de ADN comprende una secuencia de attR o un derivado de la misma, la segunda secuencia comprende una secuencia de attB, attP o attR o un derivado de la misma, c) realizar la recombinación de secuencia especifica por una integrasa Int de bacteriófago ?. Se prefiere en este método cuando, en la etapa c) la recombinación de secuencia especifica es realizada por Int o por Int y XIS, FIS o IHF . Se prefiere adicionalmente el método en el que, en la etapa c) la recombinación de secuencia especifica es realizada por Int o por Int y un factor XIS, o por Int e IHF, o por Int y XIS e IHF. Se prefiere de manera adicional un método en donde, en la etapa c) la recombinación de secuencia especifica se realice por una Int modificada, preferiblemente Int-h o Int-h/218. En este contexto, el uso de Int modificada junto con XIS, FIS o IHF también está dentro del ámbito de la presente invención. En una modalidad más preferida de este método, la recombinación de secuencia especifica de ADN en células eucarióticas se realizará en sitios de recombinación idénticamente o casi idénticamente. Por lo tanto, la presente invención se relaciona con un método de recombinación de secuencia especifica como se describe en lo anterior, en donde la primera secuencia de ADN comprende una secuencia de attB o un derivado de la misma, la segunda secuencia comprende también una secuencia de attB o un derivado de la misma, o en donde la primera secuencia de ADN comprende una secuencia de attP o un derivado de la misma, la segunda secuencia comprende una secuencia de attP o un derivado de la misma, o en donde la primera secuencia de ADN comprende una secuencia de attL o un derivado de la misma, la segunda secuencia comprende una secuencia attL o un derivado de la misma o en donde la primera secuencia de ADN comprende una secuencia de attR o un derivado de la misma, la segunda secuencia comprende una secuencia de attR o un derivado de la misma . El método de la presente invención se puede llevar a cabo no sólo con las secuencias que se presentan de manera natural de attB, attP, attL o attR, sino también con secuencias modificadas, por ejemplo sustituidas, de attB, attP, attL o attR. Por ejemplo se ha observado una recombinación integrante del bacteriófago ? y E. coli entre secuencias homologas de attP y attB (mutantes de las secuencias de tipo silvestre) las cuales tienen una o más sustituciones en attB (Nash, H. (1981) Annu. Rev. Genet . , 15, pp. 143; Nussinov, R. y Weisberg, R. (1986) J. Biomol . Struct. Dynamics, 3, pp 1134) o en attP (Nash, H. (1981) Annu. Rev. Genet . , 15, pp. 143). De este modo, la presente invención se relaciona con un método en donde las secuencias utilizadas de attB, attP, attL o attR tienen una o más sustituciones en comparación con las secuencias que se encuentran en la naturaleza de attB, attP, attL o attR. Se prefiere un método en donde las secuencias de attB, attP, attL o attR tengan uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más sustituciones. Las sustituciones se pueden presentar tanto en la región de superposición como en la región de núcleo. La región completa de superposición comprende siete nucleótidos y también puede estar sustituida. Se prefiere de manera adicional un método en el que las sustituciones se introducen dentro de las secuencias de attB, attP, attL o attR, ya sea en la región del núcleo o en la región de superposición. Se prefiere la introducción de una sustitución en la región de superposición y la introducción simultánea de una o dos sustituciones en la región de núcleo. La presente invención también se relaciona con un método en donde las secuencias utilizadas de attB, attP, attL o attR son derivados, que incluyen fragmentos funcionales de los mismos de los sitios de recombinación en comparación con las secuencias que se presentan en la naturaleza de attB, attP, attL o attR.

Se selecciona una modificación en forma de una o más sustituciones en las secuencias de recombinación de mañera tal que la recombinación se puede llevar a cabo a pesar de una o varias modificaciones. Los ejemplos de tales sustituciones se incluyen, por ejemplo en las publicaciones de Nash, H. (1981) supra y Nussinov, R y Weisberg, R. (198S) , supra y no se consideran como limitantes . Se pueden introducir fácilmente modificaciones adicionales, por ejemplo, por método de mutagénesis (muchas de estas se describen en Ausubel, P.M. et al. (actualizada en 1994) supra) y también se pueden probar para su uso por recombinaciones de prueba como se describe, por ejemplo, en los ejemplos de la presente invención (ejemplos 1 y 2, resultados 5.1) . Además, la presente invención se relaciona con un método en donde las secuencias utilizadas de attB, attP, attL o attR comprenden únicamente uno de los sitios de unión Int de núcleos respectivos, no obstante, también se prefieren más de dos sitios de unión de núcleo ' de Int. En una modalidad preferida, la presente invención se relaciona con un método en donde las secuencias utilizadas de attB, attP, attL o attR consisten únicamente de uno de los sitios de unión respectivos del núcleo de Int. En una modalidad adicional, las secuencias utilizadas de attB, attP, attL o attR consisten de dos o más sitios de unión de núcleo Int.

La presente invención se relaciona adicionalmente con un método en donde las secuencias utilizadas de attP, attL o attR comprenden, además del sitio de unión del núcleo Int, una o más, preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco o más de cinco copias del sitio de unión de brazo para Int . El sitio de unión comprende un motivo de consenso que tiene la secuencia 5 ' -C/AAGTCACTA -3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1) o una secuencia modificada del mismo que tiene sustituciones nucleotidicas y que es funcional con respecto a la unión de Int. Uno o varios de los sitios de unión de brazo para Int se puede colocar a diversas distancias hacia el extremo 5' o hacia el extremo 3' de uno o varios de los sitios de unión del núcleo de Int. Para realizar el método de la presente invención, la primera ¦ secuencia de recombinación puede comprender secuencias adicionales de ADN las cuales permiten la integración en el locus objetivo deseado, por ejemplo, en el genoma de la célula eucariótica o un minicromosoma artificial. Esta recombinación se produce, por ejemplo, vía la recombinación homologa la cual es mediada por mecanismos de recombinación celular interna. Para dicha recombinación, las secuencias adicionales de ADN deben ser homologas al ADN del locus objetivo y se deben localizar tanto 3' como 5' de las secuencias attB, attL, attP o attR o derivados de las mismas, respectivamente. Una persona experta en la técnica sabe que tan grande necesita ser el grado de homología y que tan largas deben ser las secuencias 3' y 5' respectivas de manera tal que se produzca la recombinación homologa con una probabilidad suficiente; véase la revisión de Capecchi, M. (1989) Science, 244, pp. 1288. No obstante, también es posible integrar la primera secuencia de recombinación por cualquier otro mecanismo dentro del genoma de la célula eucariótica o un minicromosoma artificial, por ejemplo, via integración aleatoria la cual también es mediada por sucesos de recombinación celular interna. La integración del primer sitio de recombinación vía recombinación de secuencia especifica utilizando sitios diferentes a aquellos integrados, por ejemplo utilizando las secuencias loxP/FRT, también resulta concebible. La segunda secuencia de recombinacion también puede comprender secuencias de ADN las cuales son necesarias para una integración dentro del locus objetivo deseado por medio de recombinación homologa. Para el método de la presente invención tanto en la primera como en la segunda secuencias de recombinación pueden comprender secuencias adicionales de ADN. Se prefiere un método en donde ambas secuencias de ADN comprendan secuencias adicionales de ADN. La introducción de la primera y segunda secuencias de recombinacion con o sin secuencias adicionales de ADN se puede llevar a cabo de manera consecutiva y en una transformación conjunta, en donde las secuencias de recombinación están presentes en dos moléculas diferentes de ADN. Se prefiere un método en donde la primera y segunda secuencias de recombinación, con o sin secuencias adicionales de ADN están presentes y se introducen dentro de células eucarióticas sobre una molécula sencilla de ADN. Además, la primera secuencia de recombinación se puede introducir en una célula y la segunda secuencia de recombinación se puede introducir en otra célula y posteriormente las células se fusionan. El término fusión significa cruza de organismos así como fusión celular en su sentido más amplio. El método de la presente invención se puede utilizar, por ejemplo para invertir un segmento de ADN que se encuentra entre secuencias de recombinación orientadas indirectamente en una recombinación intramolecular. Además, el método de la presente invención puede ser utilizado para suprimir el segmento de ADN que se encuentra entre las secuencias de recombinación orientada directamente en una recombinación intramolecular. Si las secuencias de recombinación , se incorporan cada una en la orientación 5' -3' o 3 '-5', están presentes en una orientación directa. Las secuencias de recombinación están en orientación indirecta, si, por ejemplo, la secuencia de attB se integra en 5' -3' y la secuencia de attP se integra en orientación 3 '-5'. Si las secuencias de recombinación se incorporan cada una, por ejemplo, via recombinación homologa dentro de secuencias de intron 5' y 3' de un exon y la recombinación se realiza por una integrasa, el exon se habrá invertido en caso de secuencias de recombinación orientadas indirectamente y habrá sido suprimido en caso de secuencias de recombinación orientadas directamente, de manera respectiva. Con este procedimiento, el polipéptido codificado para el gen respectivo puede perder su actividad o función, o la transcripción se puede detener por la inversión o supresión de manera que no se genere un transcrito (completo) . De esta manera se puede investigar, por ejemplo la función biológica del polipéptido codificado. Además, se pueden utilizar reacciones de inversión o supresión para activar la expresión de un gen que codifica para un polipéptido deseado, por ejemplo, mediante enlace funcional del marco de lectura abierto del polipéptido codificado con elementos reguladores los cuales permiten la transcripción o traducción del polipéptido codificado. Los elementos reguladores incluyen, pero no se limitan a elementos promotores o promotores/mej oradores, los cuales son bien conocidos en la técnica para diversos sistemas de expresión eucariótica. No obstante, la primera y/o segunda secuencia de recombinación pueden comprender secuencias adicionales de ácido nucleico que codifican para uno o más polipéptidos/productos de interés. Por ejemplo se puede introducir una proteína estructural , una proteína enzimática o reguladora vía las secuencias de recombinación en el genoma que se expresa en de manera transitoria o estable después de recombinación intramolecular. El polipéptido/producto introducido puede ser endógeno o exógeno. Además, se puede introducir una proteína marcadora o polipéptidos terapéuticos biofarmacéuticamente relevantes . Una persona experta en la técnica sabe que esta lista de aplicaciones del método de acuerdo con la presente invención es únicamente ejemplar y no limitante. Los ejemplos de aplicaciones de acuerdo con la presente invención realizados con las recombinasas Cre y Flp utilizadas hasta ahora se pueden encontrar, por ejemplo, en la revisión de Kilby, N. Et al., (1993), Trends Genet . , 9, pp. 413. Además, el método de la presente invención se puede utilizar para suprimir o invertir segmentos de ADN en vectores por una recombinación intramolecular sobre sustratos episómicos . Se puede utilizar una reacción de supresión para suprimir, por ejemplo, secuencias de empacado de los denominados virus cooperadores (helper) . Este método tiene una aplicación amplia en la producción industrial de vectores virales para aplicaciones de genoterapia Ardy, S. et al., (1997), J. Virol., 71, pp. 1842. La recombinación intermolecular lleva a la fusión de dos moléculas de ADN, cada una tiene una copia de attB, attP, attL o attR, o diversas combinaciones de secuencias de att o sus derivados. Por ejemplo, attB o un derivado del mismo se puede introducir primer via recombinación homologa en un locus genómico conocido y bien caracterizado de una célula o de un minicromosoma artificial. Posteriormente, un vector o un segmento de ADN que transporta attB, attP, attL o attR se puede integrar en la secuencia genómica de attB por medio de recombinación intermolecular. En este método se prefiere la expresión conjunta de la integrasa mutante, por ejemplo, Int-h o Int-h/218 dentro de las célula eucariótica, en donde se produce la recombinación . Se prefiere adicionalmente la expresión conjunta de la integrasa mutante Int-h/21'8. Los genes que codifican para cualquiera de estas integrasas mutantes se pueden localizar sobre un segundo vector de ADN que transíectado, preferiblemente cotransfectado, o sobre el vector o segmento de ADN que presenta la secuencia attP, attL, attR o también una secuencia attB o un derivado de la misma. Las secuencias adicionales se pueden localizar en el vector o el segmento de ADN que transporta attB, a tP, attL o attR, por ejemplo un gen para una proteína marcadora particular flanqueada por las secuencias loxP/FRT. Con esta solución se puede hacer que, por ejemplo, en el análisis de expresión comparativo de diferentes genes en un tipo de célula, los genes no sean alterados por influencias positivas o negativas del locus de integración genómico respectivo. Además, el método de la presente invención se puede utilizar para fusionar segmentos de ADN sobre vectores por una recombinación intermolecular sobre sustratos episómicos. Se puede utilizar una reacción de fusión, por ejemplo, para expresar proteínas recombinantes o dominios relevantes con el fin de cribar en búsqueda de genotipos. Este método se puede utilizar en el análisis de alto rendimiento de funciones de proteínas en células eucarióticas y por lo tanto es de interés considerable. Como se menciona en lo anterior, la recombinación intermolecular se puede utilizar para introducir uno o más genes de interés que codifican para uno o más de los polipéptidos/productos deseados en, por ejemplo, sustratos episómicos, cromosomas artificiales/minicromosomas o diversos genomas de células anfitrionas que contienen una primera secuencia de recombinación. En este contexto un segundo ADN comprende, además de por lo menos una secuencia de recombinación, por ejemplo attP, attB, attL, attR o cualquier derivado de la misma, uno o más casetes de expresión para la expresión de una o más proteínas/productos deseados. Dicho cásete de expresión puede ser introducido en un locus objetivo deseado vías las secuencias de recombinación las cuales permiten recombinación de secuencia especifica entre el ADN que comprende la segunda secuencia de recombinación y el cásete de expresión y la primera secuencia de recombinación se introduce antes dentro del sustrato episómico, el minicromosoma artificial, o el genoma de la célula anfitriona. Esta modalidad puede ser de gran interés para establecer lineas de células de alta expresión las cuales son adecuadas para la producción de productos biofarmacéuticos . En este contexto, debe introducirse un primer ADN que comprende por lo menos una secuencia de recombinación, por ejemplo mediante integración aleatoria, dentro del genoma de la célula anfitriona, cromosomas artificiales/minicromosomas o sustratos episómicos contenidos dentro de la célula anfitriona. Alternativamente, una célula anfitriona se puede transformar con un minicromosoma artificial o un sustrato episómico que comprende por lo menos uno o varios sitios de recombinación correspondientes. Otra manera de integrar una o varias secuencias de recombinación en un locus objetivo deseado, reconocido por la integrasa Int de bacteriófago ? es utilizar técnicas de recombinación homologa, como se ha mencionado antes. Para facilitar la selección por transfectantes estables los cuales hayan introducido una o varias secuencias de recombinación en el locus objetivo deseado, se introduce de manera conjunta un gen marcador de selección dentro del mismo locus objetivo, al mismo tiempo. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, si una o varias de las secuencias de recombinación y un gen marcador de selección se localizan de manera conjunta sobre el mismo vector o segmento de ADN, el cual es introducido dentro del locus objetivo, por ejemplo, por cualquier método mencionado antes (recombinación homologa, integración aleatoria, etcétera) . Dado que el nivel de expresión del gen marcador de selección se relaciona con la actividad de transcripción en el sitio de integración, se pueden identificar de manera muy eficaz las células que muestren un alto nivel de expresión en el sitio - de integración, robustez celular y buenas características de crecimiento, por ejemplo, en un biorreactor. Se puede determinar el nivel de expresión del gen marcador de selección por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, en base ya sea en la cantidad de ARNm correspondiente que está presente en la célula, o la cantidad de polipéptido codificado por el gen. Por ejemplo, el ARNm transcrito de la secuencia del gen introducido se puede cuantificar por hibridación de transferencia Northern, protección de ARN de ribonucleasa, hibridación in situ a ARN celular o por PCR (véase Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994, supra) . Las proteínas codificadas por una secuencia seleccionada se pueden cuantificar por diversos métodos, por ejemplo mediante ELISA, transferencia Western, por radioinmunoensayos , por inmunoprecipitación, por ensayos para determinar la actividad biológica de la proteína, por inmunotinción de la proteína seguido por análisis FACS o al medir las señales de fluorescencia de una proteína fluorescente (véase Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., actualizada en 1994, supra) . Mediante dicho método se pueden obtener excelentes candidatos de una línea de células de producción para elaborar sustancias biofarmacéuticas . Una o varias secuencias de recombinación integradas (primera secuencia de recombinación) permite la integración de una molécula adicional de ADN, por ejemplo un vector o un segmento de ADN que transporta por lo menos una secuencia de recombinación adicional (segunda secuencia de recombinación) vía recombinación de secuencia especifica por una integrasa Int de bacteriófago ? en un locus activo transcripcional . Preferiblemente, dicha molécula adicional de ADN comprende por lo menos una segunda secuencia, de recombinación y comprende además un cásete de expresión para la expresión de por lo menos un gen biofarmacéuticamente relevante de interés. Para esto, las células anfitrionas las cuales comprenden la primera secuencia de recombinación integrada, integrada preferiblemente en el genoma de la célula anfi riona en un locus transcripcional activo, se transfectan con una molécula de ADN que comprende la segunda secuencia de recombinación para la integrasa Int de bacteriófago ?, y se cultivan bajo condiciones que permiten recombinación de secuencia especifica entre la primera y segunda secuencias de recombinación, preferiblemente la integración de la molécula de ADM que comprende la segunda secuencia de recombinación dentro del genoma de la célula anfitriona que comprende la primera secuencia de recombinación. La primera y segunda secuencias de recombinación pueden ser ya sea attP, attB, attL o attR, o cualquier derivado de las mismas, las cuales permiten recombinación de secuencia especifica por una integrasa Int de bacteriófago ? o cualquier mutante funcional del mismo. Por ejemplo, si la primera secuencia de recombinación comprende attP o un derivado de la misma, la segunda puede comprender attP, attB, attL, attR o cualquier derivado de la misma. Se prefiere el método en donde la recombinación de secuencia especifica se realiza por Int o por Int y XIS, FIS o IHF. Se prefiere de manera adicional el método en donde la recombinación de secuencia especifica se realiza por Int o por Int y un factor XIS, o por Int e IHF o por Int y XIS e IHF. Se prefiere de manera adicional el método en donde la recombinación de secuencia especifica se realiza por Int modificada, preferiblemente Int-h o Int-h/218. En este contexto, también está dentro del significado de la presente invención el uso de Int modificada junto con XIS o IHF. Mediante este enfoque cualquier secuencia de ADN que comprenda una segunda secuencia de recombinación para la integrasa Int de bacteriófago ? se integra dentro de un locus conocido, bien caracterizado y definido de la célula anfitriona. Para seleccionar las células en donde se ha producido la recombinación de secuencia especifica uno puede introducir, por ejemplo, un c sete de expresión no funcional que comprende el gen marcador de selección, por ejemplo sin un promotor o promotor/mejorador o únicamente parte de la región codificante del gen. Únicamente si se ha producido la recombinación de secuencia especifica se generará un cásete de expresión completo y funcional con expresión eficiente del gen marcador de selección, y de esta manera se permite la selección de células que tengan integrado el gen de interés vía integración específica de secuencia. Mediante el método de la presente invención son obtenibles líneas de células para producción que difieren de la célula anfitriona únicamente en la identidad de secuencias de ADN integrado en el sitio definido de integración, por ejemplo, dentro de un locus genómico. Debido a la menor variación genética entre los diferentes clones de células se puede utilizar un procedimiento más genérico para el desarrollo de líneas de células para producción, y de esta manera se reduce el tiempo y la capacidad para selección de clon y el desarrollo de un procedimiento de producción optimizado. Las líneas de células para producción se pueden utilizar para la elaboración de los polipeptidos deseados. Un aspecto adicional de la presente invención por lo tanto se relaciona con un método para expresar por lo menos un gen de interés que codifica para uno o más polipéptidos/productos deseados, en una célula eucariótica, que comprende : a) introducir un primer ADN que comprende una secuencia de attB, attP, attL o attR o un derivado del mismo dentro de una célula; b) introducir un segundo ADN que comprende una secuencia de attB, attP, attL o attR o un derivado del mismo, y por lo menos un gen de interés dentro de una célula, c) poner en contacto a la célula con la integrasa Int de bacteriófago ?; d) realizar la recombinación de secuencia especifica por una integrasa Int de bacteriófago ?, en donde el segundo ADN se integra en el primer ADN; y e) cultivar a la célula bajo condiciones en las que se exprese uno o varios de los genes de interés . Se prefiere el método, en donde la primera secuencia de ADN comprende una secuencia de attB o un derivado de la misma, la segunda secuencia comprende una secuencia de attB, attL o attR o un derivado de la misma o en donde la primera secuencia de ADN comprende una secuencia de attP o un derivado de la misma, la segunda secuencia comprende una secuencia de attP, attL o attR o un derivado de la misma, o en donde -la primera secuencia de ADN comprende una secuencia de attL o un derivado de la misma, la segunda secuencia comprende una secuencia de attB, attP o attL o un derivado de la misma, o en donde la primera secuencia de ADN comprende una secuencia de attR o un derivado de la misma, la segunda secuencia comprende una secuencia de attB, a tP o a tR o un derivado de la misma. En una modalidad más preferida de dicho método, el primer ADN se ha integrado en el genoma, un minicromosoma artificial o un elemento episómico de una célula anfitriona, preferiblemente en sitios que muestran alta actividad de transcripción, antes de que se introduzca en la célula el segundo ADN. La presente invención también se relaciona con un método para expresar por lo menos uno o más genes de interés en una célula anfitriona, en donde la célula anfitriona comprende una secuencia de attB, attP, attL o attR, o un derivado del mismo integrado en el genoma de la célula anfitriona, que comprende: a) introducir un ADN que comprende una secuencia de attB, attP, attL o attR o un derivado del mismo, y por lo menos un gen de interés en la célula, b) poner en contacto a la célula con una integrasa Int de bacteriófago ?; c) realizar la recombinación de secuencia especifica por una integrasa Int de bacteriófago ?, en donde el segundo ADN se integra dentro del primer ADN; d) cultivar células bajo condiciones en donde uno o varios de los genes de interés se expresen. El método se puede llevar a cabo no solo con una secuencia de attB, attP, attL o attR o un derivado del mismo que se integra en un genoma de una célula anfitriona por ingeniería genética de la célula, pero también con una secuencia de recombinación que se produce de manera natural del genoma, por ejemplo el sitio attH descrito en WO 01/16345 (5 ' -GAAATTCTTTTTGATACTAACTTGTGT-3 ' ; SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 17) o cualquier otra secuencia de recombinación, lo cual permite la recombinación de secuencia especifica mediada por un Int o cualquier mutante funcional del mismo. Se prefieren aquellos métodos en donde la recombinación de secuencia especifica se realice por Int o por Int y un factor XIS o por Int e IHF, o por Int, XIS e IHF. Se prefiere adicionalmente un método en el que la recombinación de secuencia especifica se realiza por un Int modificado, preferiblemente Int-h o Int-h/218. En este contexto, el uso de un Int modificado junto con XIS o IHF también está dentro del significado de la presente invención. Se pueden agregar Int, Int-h o Int-h/218, XIS o IHF a la célula en forma purificada o que se coexpresa por la célula anfitriona, en donde se realiza la recombinación de secuencia especifica .

Una modalidad adicional de los métodos mencionados en lo anterior se relaciona con un método, en el que uno o varios polipéptidos/productos los cuales son codificados por uno o varios de los genes de interés y que se expresan en la célula anfitriona se aislan de las células o del sobrenadante de cultivo celular, si se secreta en el medio de cultivo. Dichas células para producción se cultivan preferencialmente en medios sin suero y en un cultivo en suspensión bajo condiciones las cuales son favorables para la expresión de uno o varios de los genes deseados y aislamiento de la proteína de interés de las células o del sobrenadante de cultivo celular. Preferiblemente, la proteína de interés se recupera del medio de cultivo como un polipéptido secretado, o se puede recuperar de lisados de células anfitrionas si se expresa sin una señal secretora. Es necesario purificar la proteína de interés de otras proteínas recombinantes , proteínas de la célula anfitriona y contaminantes de una manera que se obtengan preparaciones sustancialmente homogéneas de la proteína de interés . Como una primera etapa con frecuencia las células o los residuos de células particulados se separan del medio de cultivo o del lisado. Posteriormente el producto de interés se purifica a partir de proteínas solubles contaminantes, polipéptidos y ácidos nucleicos, por ejemplo mediante fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico, precipitación en etanol, CIAR en fase inversa, cromatografía en Sephadex sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE . En general se conocen bien en la técnica los métodos descritos por una persona experta respecto a la manera de purificar una proteína eteróloga expresada en células anfitrionas . Tales métodos se describen, por ejemplo, en Harris et al. (1995) Protein Purification: ? Practical Approach, Pickwood and Hames, eds . , IRL Press and Scópes, R. (1988) Protein Purification, Springer Verlag. Por lo tanto, el método mencionado antes de expresión de por lo menos un gen de interés se puede agregar mediante una etapa de purificación adicional, en donde el polipéptido deseado se purifica a partir de las células anfitrionas o de un cultivo de células si se secreta al medio de cultivo. El método de la presente invención se puede llevar a cabo en todas las células eucarióticas . Las células y líneas de células pueden estar presentes, por ejemplo, en un cultivo celular e incluyen, pero no se limitan a células eucarióticas tales como células de levadura, plantas, insectos o mamíferos. Por ejemplo, las células pueden ser ovocitos, embrioncitos indiferenciados, células indiferenciadas hematopoyéticas o cualquier tipo de células diferenciadas . Se prefiere un método en el que la célula eucariótica es una célula de mamífero. Se prefieren de manera adicional un método en el que la célula de mamífero es una célula de humano, simio, de ratón, rata, conejo, hámster, chivo, vaca, borrego o cerdo. Las lineas de células preferidas o las "células anfitrionas" para la producción de sustancias biofarmacéuticas son líneas de células de humano, ratón, rata, mono, o roedor. Las más preferidas son las células de hámster, preferiblemente las células BH 21, BHK TK~, CHO, CHO-KI, CHO-DU X, CHO-DUKX Bl y CH0-DG44 o los derivados/progenie de cualquiera de tales células. Se prefieren particularmente CH0-DG44, CHO-DUKX, CHO-KI y BHK21, e incluso de manera más preferida las células CHO-DG44 y CHO-DUKX. Además, también se conocen como líneas de células de producción células de mieloma murino, preferiblemente células NSO y Sp2/0 o derivados/progenie de dichas líneas de células. Las células anfitrionas más preferidas, cuando se han establecido, adaptado y cultivado completamente bajo condiciones sin suero y opcionalmente en medio en el cual están libres de cualquier proteína/péptido de origen animal. Los medios disponibles comercialmente tales como Ham F12 (Sigma, Deisenhofen, Alemania) , RPMI-1640 (Sigma) , medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Sigma) , medio esencial mínimo (MEM; Sigma) , medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM; Sigma) , CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) , CHO-S-SFMII (Invitrogen) , medio CHo sin suero (Sigma) y medio CHO sin proteínas (Sigma) son soluciones nutrientes apropiadas ejemplares. Cualquiera de los medios se puede suplementar según se necesite con una diversidad de compuestos cuyos ejemplos son hormonas u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento similar a insulina) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, fosfato) , amortiguadores (tales como HEPES) , nucleósidos (tales como adenosina, timidina) , glutamina, glucosa u otras fuentes de energía equivalentes, antibióticos y elementos en trazas. Cualquier otro suplemento necesario también se puede incluir en concentraciones apropiadas que sean conocidas por aquellos expertos en la técnica. En la presente invención se prefiere el uso de medios sin suero, pero también se pueden utilizar para el cultivo de células anfitrionas medios suplementados con una cantidad adecuada de suero. Para el crecimiento y selección de células modificadas genéticamente que expresan un gen seleccionable se agrega un agente de selección adecuado al medio de cultivo. Las "proteinas/polipéptidos deseados" o las "proteinas/polipéptidos de interés" de la invención son, por ejemplo, pero no se limitan á. insulina, factor de crecimiento similar a insulina, hGH, tPA, citosinas tales como interlucinas (IL) por ejemplo IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, inferieron (IFN) , IFN ß, IFN ?, IFN O o IFN ?, factor de necrosis tumoral (TNF) tal como TNF a y TNF ß, TNF ?, TRAIL G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCO-1 y VEGF . También se incluye la producción de erotropoyetina o de cualquier otro factor de crecimiento de hormonas o cualquier otro polipéptido que pueda servir como agonista o antagonista o que tenga uso terapéutico o de diagnóstico. El método de acuerdo con la invención también puede ser utilizado ventajosamente para la producción de anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales, policlonales , multiespecificos y de cadena única, o fragmentos de los mismos, por ejemplo los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fe y Fe', cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera y su región constante, variable o hipervariable así como fragmentos Fv- y Fd (Chamov, S. M. et al. (1999) Antibody Fusión Proteins, Wiley-Liss Inc.) Los fragmentos Fab (fragmento que une antlgeno = Fab) consiste de regiones variables de ambas cadenas las cuales se mantienen juntas por la región constante adyacente. Estas se pueden formar por digestión con proteasa, por ejemplo con papaina, a partir de anticuerpos convencionales, pero también se pueden producir fragmentos Fab similares en un tiempo medio, por ingeniería genética. Los fragmentos adicionales de anticuerpo incluyen fragmentos F(ab1 ) 2 los cuales se pueden preparar por separación proteolítica con pepsina. Mediante la utilización de métodos de ingeniería genética es posible producir fragmentos de anticuerpo acortados los cuales consisten únicamente de las regiones variables de la cadena pesada (VH) o de la cadena ligera (VL) . Estos se denominan como fragmentos Fv (fragmento variable - fragmento de la parte variable) . Dado que estos fragmentos Fv carecen de la unión covalente de las dos cadenas por la cisternas de las cadenas constantes , los fragmentos Fv con frecuencia son estabilizados. Es ventajoso enlazar las regiones variables de las cadenas pesada y ligera por un fragmento peptidico corto, por ejemplo de 10 a 30 aminoácidos, preferiblemente de 15 aminoácidos. De esta manera se obtiene una cadena peptídica única que consiste de Vh y VL, enlazada por un péptido enlazador. Una proteína de anticuerpo de esta clase se conoce como un Fv de cadena sencilla (scFv) . LOs ejemplos de proteínas de anticuerpo scFv de esta clase conocidos de la técnica anterior se describen en Huston C. et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 16, pp. 5879. En años recientes se han desarrollado diversas estrategias para preparar scFv como un derivado multimérico. Esto tiene el objetivo, en particular, de dirigirse a anticuerpos recombinantes con propiedades mejoradas farmacocinéticas y de biodistribución asi como una avidez aumentada de unión. Para obtener la multimerización de scFv, se preparan scFv como proteínas de fusión con dominios de multimerización. Los dominios de multimerización pueden ser, por ejemplo la región CH3 de una IgG o la estructura de rollo enrollado (coiled coil) (estructuras de hélice) tales como los dominios de cremallera de leucina. No obstante, también existen estrategias en las cuales se utiliza la interacción entre las regiones VH/VL de los scFv para la multimerización (por ejemplo dia-, tri- y pentacuerpos) . Mediante diacuerpo una persona experta en la técnica entiende un derivado scFv homodimérico bivalente. El acortamiento del enlazante en una molécula de scFv a 5-10 aminoácidos lleva a la formación de homodímeros en los cuales se lleva a cabo la superimposición VH/VL de entre la cadena. De manera adicional, los diacuerpos se pueden establecer por la incorporación de puentes disulfuro. Los ejemplos de proteínas diacuerpo-anticuerpo de la técnica anterior se pueden encontrar en Perisic, 0. et al. (1994) Structure, 2, pp.1217. Por un minicuerpo, una persona experta en la técnica entiende un derivado de scFv homodimérico bivalente. Consiste de una proteína de fusión la cual contiene de la región CH3 de una inmunoglobulina, preferiblemente IgG, y de manera más preferible IgGl como la región de dimerizacion la cual se conecta a scFv por medio de región de bisagra (por ejemplo también de IgGl) y una región enlazadora. Los ejemplos de proteínas de minicuerpo-anticuerpo de la técnica anterior se pueden encontrar en Hu, S. et al. (1996) C ncer Res., 56, pp. 3055. Por el término "triacuerpo" una persona experta en la técnica entiende: un derivado de scFv homotrimérico trivalente (Kortt A. A. et al. (1997) Protein Engineering, 10, p . 423) . Los derivados de scFv en donde VH-VL se fusionan directamente sin una secuencia enlazante genera la formación de los trímeros . Una persona experta también estará familiarizado con los denominados minianticuerpos los cuales tienen una estructura bi-, tri- o tetravalente y se derivan de scFv. La multimerización se lleva a cabo por estructuras di-, tri- o tetraméricas de rollo enrollado (Pack, P. et al. (1993) Biotechnology, 11, pp. 1271; Lovejoy, B. et al. (1993) Science, 259, p . 1288; Pack, P et al. (1995) J. Mol. Biol . , 246, pp. 28) . En una modalidad preferida de la presente invención, el gen de interés es codificado por cualquiera de estos polipéptidos deseados mencionados en lo anterior, preferiblemente para una anticuerpo monoclonal , un derivado o un fragmento del mismo. Con el fin de realizar cualquier modalidad de la presente invención, una integrasa debe actuar sobre las secuencias de recombinación. Las integrasa o el gen para integrasa o un cofactor o un gen para un cofactor, por ejemplo el factor XIS o el gen para el factor XIS o IHF o el gen para IHF pueden estar presentes en la célula eucariótica de antemano, antes de introducir la primera y segunda secuencia de recombinación. También se pueden introducir entre la introducción de la primera y segunda secuencia de recombinación o después de la introducción de la primera y segunda secuencia de recombinación. La purificación de la recombinasa y las proteínas de factor del anfitrión se han descrito en la técnica (Nash, H. A. (1983) Methods of Enzymology, 100, pp. 210; Filutowicz, M. et al. (1994) Gene, 147, pp. 149) . En los casos en donde no se conocen, se pueden utilizar extractos de células o las enzimas pueden ser purificadas parcialmente utilizando procedimientos descritos, por ejemplo, para recombinasa Int o Cre . Las proteínas purificadas se pueden introducir en una célula por técnicas estándar, por ejemplo, por medio de inyección o microinyección o por medio de una lipofección como se describe en el ejemplo 2 de la presente invención para IHF. Preferiblemente, la integrasa utilizada para la recombinación de secuencia especifica s se expresa en la célula en la cual se lleva a cabo la reacción. Para este propósito se introduce en las células una tercera secuencia de ADN que comprende un gen para integrasa. Sí la recombinación de secuencia especifica se lleva a cabo, por ejemplo con attL/attR, se puede introducir en las células un gen para factor XIS (cuarta secuencia de ADN) de manera adicional. La manera más preferida es un método en donde la tercera y cuarta secuencia de ADN se integran en el genoma eucariotico de la célula o un minicromosoma artificial por medio de recombinación homologa o bien aleatoriamente . Se prefiere además un método en el que la tercera o cuarta secuencia de ADN comprendan secuencias reguladoras que resultan en una expresión espacial o temporal del gen para integrasa o del gen para el factor XIS. En este caso, una expresión espacial significa que en la recombinasa Int el factor XIS o el factor IHF, respectivamente, se expresa únicamente en un tipo de célula particular mediante el uso de promotores específicos de tipo de célula y catalizan la recombinación únicamente en estas células, por ejemplo, en células de hígado, células de riñon, células nerviosas o células del sistema inmunológico . En la regulación de la expresión de integrasa/factor XIS/IHF se puede obtener expresión temporal por medio de promotores que sean activos desde, o en particular en una etapa de desarrollo particular o en un punto en el tiempo particular en un organismo adulto. Además, la expresión temporal se puede obtener mediante el uso de promotores inducibles, por ejemplo, por promotores que dependen de interferón o tetraciclina; véase la revisión de Müller, U. (1999) Meen. Develop . , 82 , pp . 3. La integrasa utilizada en el método de la presente invención puede ser tanto de tipo silvestre como una integrasa modificada (mutada) del bacteriógrafo ?. Dado que la integrasa de tipo silvestre únicamente es capaz de realizar la reacción de recombinación con una eficiencia elevada con un cofactor, específicamente IHF, se prefiere utilizar una integrasa modificada en el método de la presente invención. Sí se utiliza integrasa de tipo silvestre en el método de la presente invención, se puede necesitar IHF además de obtener una estimulación de la reacción de recombinación. La integrasa modificada se modifica de manera tal que la integrasa pueda llevar a cabo la reacción de recombinación sin IHF u otros factores del anfitrión tales como XIS y FIS. Por ejemplo, se puede realizar una reacción de recombinación entre las secuencias attL y attR por un Int modificado sin la adición de un factor del anfitrión (véase los resultados 5.1 y la figura 2C y 2D) . La generación de polipéptidos modificados y el cribado (detección sistemática) para determinar la actividad deseada son elementos conocidos en la técnica y se pueden llevar a cabo fácilmente; Erlich, H. (1989) PCR Technology. Stockton Press. Por ejemplo, se diseña una secuencia de ácido nucleico que codifica para un integrasa modificada para incluir cualquier secuencia de ácido nucleico que se transcribirá y traducirá en una integrasa ya sea in vivo o ante la introducción de la secuencia codificante en bacterias o células eucarióticas . Las secuencias codificantes para la proteina integrasa modificada pueden presentarse de manera natural (por mutación espontánea) o pueden ser mutantes y variantes generadas por ingeniería recombinante, versiones truncadas y fragmentos, equivalentes funcionales, derivados, homólogos y fusiones de las proteínas que se encuentran en la naturaleza o de tipo silvestre en la medida en que se mantenga la actividad funcional biológica, lo que significa la actividad de recombinasa, del polipéptido codificado. Se mantiene la actividad de recombinasa cuando la recombinasa modificada tiene por lo menos 50%, preferiblemente por lo menos 70%, de manera más preferida por lo menos 90%, de manera mucho más preferida por lo menos 100% de la actividad de la integrasa Int de tipo silvestre, medida en un ensayo de cotransfección con sustratos vectores y vectores de expresión como se describe en los resultados 5.1 de la presente invención o en el ejemplo 3 de WO 01/16345. Pueden realizarse ciertas sustituciones en las secuencias de aminoácidos en una integrasa o en su secuencia codificante de ácido nucleico subyacente y se puede obtener una proteína con propiedades similares. Las sustituciones de aminoácidos que proporcionan polipéptido de integrasa funcionalmente equivalentes mediante el uso del Indice hidropático de aminoácidos (Kyte, J. et al. (1982) J. Mol. Biol .. , 157, pp . 105) se puede preparar al realizar mutagénesis específica de sitio o mutagénesis mediada por reacción en cadena de polimerasa sobre la secuencia subyacente de ácido núcleico. En la presente invención se prefieren- integrasas mutantes o modificadas las cuales muestran, en comparación con la proteína tipo silvestre que se encuentra en la naturaleza, actividad de recombinasa/eficiencia de recombinación mejoradas o una actividad de recombinación independiente de uno o más factores del anfitrión. La "proteina de tipo silvestre" significa un gen del polipeptido codificante que se encuentra en la naturaleza no modificado, no truncado y completo. Dos mutantes Int preferidos son las integrasas de bacteriografo ? designadas como Int-h e Int-h/218; Miller et al. (1980) Cell, 20, pp. 721; Christ, N. y Dróge, P. (1999) J. Mol. Biol . , 288, pp. 825. Int-h incluye un residuo lisina en vez de un residuo glutamato en la posición 17 , en comparación con Int de tipo silvestre. Int-h/218 incluye un residuo lisina adicional en vez de un residuo glutamato en la posición 218 y se genera por mutagénesis PCR en el gen para Int-h. Tales mutantes pueden catalizar la recombinación entre attB/attB, attP/attP, attL/attL o attR/attR y todas las demás configuraciones posibles, por ejemplo attP/attR, attL/attP, attL/attB, o attR/attB o los derivados de la-s mismas sin los cofactores IHF, XIS o FIS y el superenrollado negativo en E. coli, en células eucarióticas e in vitro, es decir, con sustratos purificados en un tubo de reacción. Se puede obtener una mejoría de la eficiencia de la recombinación con un cofactor, por ejemplo FIS. Se prefiere el imitante Int-h/218, debido a que este mutante cataliza la reacción de combinación con eficiencia aumentada. Si la primera reacción lleva a una corte y las dos secuencias de recombinación utilizadas son idénticas, por ejemplo attP/P, las secuencias de recombinación resultantes después de la recombinación serán idénticas a aquellas en el sustrato, por ejemplo aquí, dos secuencias attP. No obstante, si las dos secuencias asociadas son diferentes, por ejemplo attP/R, la reacción de recombinación generará secuencias de recombinación híbridas las cuales comprenden una mitad funcional de una secuencia (por ejemplo attP) y una mitad de la otra (attR) . Se puede definir un sitio de semirecombinación funcional como la secuencia ya sea 5 ' ó 31 desde la superposición, por lo que la superposición se considera, en cada caso, como parte de un sitio medio funcional. Si la región de superposición respectiva de las secuencias de reconibinación utilizadas son idénticas, la reacción de corte se puede llevar a cabo con cualquier secuencia de recombinación de acuerdo con la invención. Adicionalmente, la región de superposición designa la orientación de las secuencias de recombinación entre sí también, es decir, invertida o directa, La reacción se puede llevar a cabo con Int de tipo silvestre con baja eficiencia únicamente, no obstante, la adición de IHF o en ausencia de IHF la presencia de uno o varios sitios de unión de brazo además del sitio de unión de núcleo estimula e incrementa la eficiencia. La reacción se puede llevar a cabo sin cofactor alguno por una Int modificada. Además, se prefiere un método en el que se introduce en las células una secuencia de ADN adicional que comprende un gen de factor XIS. El más preferido es un método en el que la secuencia de ADN adicional comprende, además, una secuencia de ADN reguladora lo que genera una expresión espacial o temporal del gen para el factor Xis. Por ejemplo, después de recombinación intramolecular integrativa exitosa (inversión) por medio de Int que se dirige a la activación/inactivación de un gen en un tipo de célula particular, dicho gen se puede inactivar o activar en un punto posterior del tiempo nuevamente por medio de una expresión espacial o temporal inducida de XIS con la expresión simultánea de Int. Además, la invención se relaciona con el uso de cualquier secuencia de recombinación o un derivado de la misma, por ejemplo para el derivado de attP como se especifica en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 en una recombinación de secuencia especifica de ADN en células eucarióticas . La célula eucariótica puede estar presente en un agregado celular de un organismo, por ejemplo un mamífero, que no tiene integrasa o factor Xis en sus células. El organismo se puede utilizar para cruza o crianza con otros organismos que tengan en sus células la integrasa o el factor Xis de manera que se genere descendencia en donde la recombinación de secuencia especifica s se realiza en células de la descendencia. De esta manera, la invención se relaciona con el uso de una integrasa o un gen para integrasa y un factor Xis o un gen para el factor Xis y un factor IHP o un gen para el factor IHF en una recombinación de secuencia especifica en células eucarióticas . Además, la presente invención se relaciona con células eucarióticas libres de células en las cuales se realiza el método de la presente invención, en donde las células o lineas de células se obtienen después de realizar el método de la presente invención . A menos que se indique de otra manera, la práctica de la presente invención utilizará técnicas convencionales de biología celular, biología molecular, cultivo celular, inmunología y similares los cuales son conocidos por los expertos en la técnica. Estas técnicas se describen completamente en la literatura actual. Véase, por ejemplo Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987, updated) ,- Brown ed. , Essential Molecular Biology, IRL Press (1991) ; Goeddel ed. , Gene Expression Technology, Academic Press (1991); Bothwell et al. eds . , Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Bartlett Publ . (1990); Wu et al., eds., Recombinant DNA Methodology, Academic Press (1989) ; Kriegler, Gene Transfer and Expression, Stockton Press (1990); McPherson et al., PCR: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1991); Gait ed., Oligonucleotide Synthesis (1984); Miller & Calos eds . , Gene Transfer vectors for Mammalian Cells (1987); Butler ed. , Mammalian Cell Biotechnology (1991) ; Pollard et al., eds., Animal Cell Culture, Humana Press (1990); Freshney et al., eds., Culture of Animal Cell, Alan R. Liss (1987); Studzinski, ed. , Cell Growth and Apoptosis, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1995) ; Melaed et al., eds., Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss (1990); Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, Inc. (updated) ; irth & Hauser, Genetic Engineering of Animáis Cells, in: Biotechnology Vol . 2, Pühler ed. , VCH, Weinheim 663-744; the series Methodos of Enzymology (Academic Press, Inc.), and Harlow et al., eds., Antibodies: A Laboratory Manual (1987) . Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en esta especificación son indicativas del nivel de habilidad de aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece la invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en la presente se incorporan en la presente como referencia en su totalidad con el fin de describir más completamente el estado de la técnica a la cual pertenece esta invención. La invención descrita de manera general en lo anterior se comprenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos los cuales se incluyen en la presente únicamente con el propósito de ilustración de ciertas modalidades de la presente invención y no se pretende que limiten la invención de manera alguna.

EJEMPLOS Métodos 1. Producción de vectores de expresión y sustrato Se ha descrito la construcción de vectores de expresión en falso y para Int pCMV, pCMVSSInt, pCMVSSInt-h, y pCMVSSInt-h/218; Lorbach, E. et al. (2000) J. Mol. Biol . , 296 pp. 1175. La expresión de Int es activada por el promotor de citomegalovirus humano . Los vectores de sustrato utilizados en ensayos de recombinación intramoleculares contienen como secuencias repetidas directas attB/attP (pXIR) o attL/attR (pAER) , y son derivados de pGEMMR4Z (Promega) . Las secuencias repetidas pAlR se construyen al insertar attB como un oligonucleótido de cadena doble en pPGKneo separado por CLAI/EcoRI. Este vector es un derivado de pPGKSSInt-h, en el cual el gen para Int-h se ha sustituido por un gen de neomicina (neo) utilizando Pstl/Xbal. El promotor de CMV más el intron híbrido se generan por PCR utilizando pCMVSSInt como plantilla y se clona dentro de un vector pPGKneo que contiene attB separado por Kpnl/CLAI. Esta secuencia de CMV-attB-neo-cassette de expresión después se clona por PCR en pGEM^ separada por BamHI. El sitio attP, que contiene una sustitución A a C en el brazo P', lo cual suprime una señal de detección translucional , se genera por PCR de ensamblado utilizando los cebadores: (attPOl) 5 ' -GTCACTATCAGTCAAAATACAATCA-3 ' , (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO (attP02) 5 * -TGATTGTATTTTGACTGATAGTGAC-3 ' , (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO (PFP-Nsil) 5 ' -CCAATGCATCCTCTGTTACAGGTCACTAATAC-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO y ( 'RP-EcoRV-Notl) 5 ' -ATAAGAATGCGGCCGCAGATATC AGGGAGTGGGACAAAATTGAA-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6) . se utiliza pGFPattB/attP como plantilla (Lorbach, E. et al. (2000), supra) . El fragmento de PCR se separa con Nsil y Notl y se liga al extremo 31 del fragmento BamHI/PstI que contiene un cassette de detención transcripcional , el cual se genera a partir de pBS302 (Gibco/BRL) . El gen para GFP y la señal polyA se clonan por PCR utilizando pCMVSSGFP (un derivado de pCMVSSInt-h en el cual el gen Int-h es •sustituido por eGFP utilizando Pstl/Xbal) . El fragmento de PCR que contiene GFP se separa con Notl y Xbal y después se une por ligación con el fragmento de detención transcripcional /attP separado por BamHI/Notl en el vector separado por BamHI/Xbal que ya contiene el promotor de CMV, attB, y el cassette de expresión neo. Se construye p AER como pAIR, excepto que se genera attL por PCR utilizando pGF attL/attR (Lorbach, E. et al. (2000), supra) como plantilla y se clona en pPGKneo separado por Clal/EcoRI. El sitio attR se genera por PC utilizando como plantilla pGFPattL/attP y el producto se separa con Nsil y Notl. Los vectores de sustrato para los ensayos de recombinación intramoleculares los cuales contienen el promotor de CMV frente a sitios de unión diferentes: pCMVattP contienen tres sustituciones G a C en el brazo P. Estos cambios son necesarios para eliminar los codones de inicio ATG que podrían evitar la expresión de GFP después de la recombinación. La sustituciones están fuera de los sitios de unión de proteina en attP se introducen por PCR de ensamblado. En primer lugar se generan dos productos de PCR de superposición uno con el par cebador attP-ATC-l/attP-2 y uno con attP-ATC-3/attP-4. Se utiliza como plantilla pGFPattB/attP. Los productos de PCR se purifican en gel y se utilizan como plantillas para PCR con cebadores attP-Pstl y attP-Xbal . El producto resultante se digiere con PstI y Xbal y se clona en pCMVSSInt. Las secuencias de cebador para ensamblado por PCR son. (attP-ATC-1) 5'- TTGGATAAAAAACAGACTAGATAATACTGTAAAACACAAGATA TGCAGTCACTA-31 , (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 7) (attP-2) 5 ' -TAACGCTTACAATTTACGCGT-31 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 8) (attP-ATC-3) 5 ' -CTGCATATCTTGTGTTTTACAGTATTATCTAGTCTGTTTTTTATC CAAAATCTAA-31 , (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 9) (attP-4) 5 ' CTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGC-3 ' , (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 10) (attP-Pstl) 51 -GACTGCTGCAGCTCTGTTACAGGTCAC-3 ' , (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 11) (attP-Xbal) 5 ' -GACTGTCTAGAGAAATCAAATAATGAT-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 12) . Se genera pCMVattB al insertar attB como un oligonucleótido de cadena doble dentro de pCMVattPmut separado por Pstl/Xbal. Se genera pCMVattL por PCR utilizando pAEr como plantilla para attL, el cual se introduce en pCMVattPmut separado por Pstl/Xbal. Vectores los cuales contienen una señal de detención transcripcional y un sitio att colocado frente al gen GFP sin promotor se construyen como sigue: se genera PWSattBGFP al suprimir primero una parte del gen para higromicina de pTKHyg (Clontech) utilizando Aval y Ndel. La estructura principal del vector se liga después de que los extremos pegajosos se vuelven romos por medio de polimerasa Klenow. Se clona un fragmento de attB-GFP, generado por PCR, en los sitios Mfel y HindIII y de esta manera se genera un sitio nuevo Nhel 5' de attB. Finalmente, se inserta la secuencia de detención transcripcional a través de restricción con EcoRI y Nhel. se genera pWSattRGFP al aislar el fragmento de detención transcripcional -attJ? por BamHl/Notl a partir de pAER, el cual se inserta dentro de pWSattBGFP separado con las mismas enzimas. Se genera por PCR pWSattPGFP del sitio attP utilizándolo como plantilla pGFP attP/attB, el cual se inserta dentro de pWS attBGFP separada con EcoRI/Notl y de esta manera sustituye a attB. Se aislan los plásmidos de E. coli cepa XLI-Blue utilizando cromatografía de afinidad (Qiagen) . Se verifica la composición nucleótidica de los elementos genéticos relevantes por secuenciado de ADN utilizando el sistema 373A basado en fluorescencia (Applied Biosystems) . 2. Cultivo celular, ensayos de recombinación y citometria de fluj o se cultivan células HeLa en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal 10%, estreptomicina [0,1 mg/ml] y penicilina [100 U/ml] . Las células se someten a pasaje dos veces antes de la transfección . Se realizan ' como siguen los ensayos de recombinación típicos. Se cosechan las células, se lavan con PBS y se resuspenden en RPMI 1640 sin L-glutamina y rojo de fenol (Life Technologies) . Después se introducen un total de 60 µg de vectores de expresión y de sustrato en una proporción molar de 1:1 en aproximadamente 1 x 107 células a 300 V y 960 ]iF utilizando un pulsador Gene (Bio-Rad) . Después de electroporación las células se siembran en placa en una dilución apropiada, sobre recipientes de 10 cm. Se prepara una suspensión de células solas a las 24, 48 y 72 h después de la transfección . Se excluyen del análisis las células muestras por tinción con 7-amino-actinomicina D (Sigma) y las células se analizan con un equipo FACScalibur (Becton Dickinson) . Los datos de FACS se analizan con el software (programa) CellQuestMR. Las eficiencias de transfección para los ensayos de recombinación intermolecular se determinan para cada experimento por cotransfección de 40 ig de pCMV con 20 ]ig de pEGFP-Cl (Clontech) ; los de recombinación intramolecular se determinan con 30 yg de pCMV y 30 ]iq de pEGFP-Cl . Los experimentos que involucran IHF purificadas se realizan al introducir primero 30 yg de los vectores de expresión Int a aproximadamente 6 x 10e células vía electroporación, como se describe en lo anterior. Después de 3 a 4 horas, se transfectan aproximadamente 1 x 105 células con 2 yg de vectores de sustrato para recombinación intramolecular, o con un total de 2 µg de vectores de sustrato en una proporción molar de 1:1 para recombinación intermolecular. Los sustratos se preincuban a temperatura ambiente con 2 g de IHF purificada (Lange-Gustafson BJ, Nash HA. , la purificación y propiedades de Int-h, una proteína variante involucrada en recombinación específica de sitio del bacteriófago ?., J Biol Chem. 1984 Oct 25; 259 (20) : 12724-32) en amortiguador salino bajo NaCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 ntiM) durante por lo menos 30 minutos. La transfección de los complejos de IHF-ADN se obtiene con FuGene (Boehringer Mannheim) y las eficiencias siempre están en el intervalo de 80%. Las células se analizan por citometría de flujo después de 48 h adicionales como se describe en lo anterior. Las células CHO-DG44/dhfr"/_ (Urlaub, G. et al., (1983) , Cell, 33, pp . 405), que crecen permanentemente en suspensión en medio sin suero CHO-S-SFMII (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con hipoxantina y timidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) , se incuban en matraces de cultivo celular a 37°C en una atmósfera humidificada que contiene C02 5%. Las células se siembran a una concentración de 1-3 x 105 células/ml en medio fresco cada dos a tres dias . Las transíecciones estables de células CHO-DG44 se llevan a cabo utilizando el reactivo Lipofectamine Plus (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Por transfección, se siembran 6 x 105 células en crecimiento exponencial en 0.8 mi de medio CHO-S-SFMII suplementado con hipoxantina-timidina (HT) en un pozo de una cámara de 6 pozos. Se utiliza para cada transfección un total de 1 µg de ADN plasmídico, 4 µ? de Lipofectamine y 6 µ? de reactivo Plus en un volumen de 200 µ?, y se agrega a las células, siguiendo el protocolo del fabricante . Después de incubación durante 3 horas se agregan 2 mi de medio CHO-S-SFMII suplementado con HT. En el caso de la selección basada en neomicina fosfotransferasa el medio se sustituye dos días después de la transfección con medio CHO-S-SFMII suplementado con HT y 400 ug/ml de G418 (Invitrogen) y las poblaciones de células mezcladas se seleccionan durante dos a tres semanas con cambios de medio cada 3 a 4 días . Para la selección basada en DHFR de las células CHO-DG44 transfectadas de manera estable, se utiliza medio CHO-S-SFMII sin hipoxantina/timidina. La amplificación del gen basada en DHF.R se obtiene al agregar metotrexato 5 - 2000 nM (Sigma, Deisenhofen, Alemania) como agente de selección de amplificación para el medio. 3. sICAM y ELISA de MCP-1 Los títulos de sICAM en sobrenadantes de células CHO-DG44 transfectadas de manera estable se cuantifican por ELISA con protocolos estándar (Ausubel, F.M. et al., (1994, actualizado) Current protocols in molecular biology. New York: Greene Publishing Associated and Wiley-Interscience) utilizando dos anticuerpos monoclonales específicos para sICAM desarrollados en el laboratorio (como se describe, por ejemplo en las patentes de E.U.A. números 5,284,931 y 5,475,091), por lo que uno de los anticuerpos es un anticuerpo conjugado a HRPO. Se utiliza como un estándar proteína sICAM purificada. Las muestras se analizan utilizando un lector Spectra Fluor Plus (TECAN, Crailsheim, Alemania) .

Los títulos de MCP-1 en los sobrenadantes de células CH0-DG44 transfectadas de manera estable se cuantifican por ELISA utilizando el equipo MCP-1 humano de OptEIA, de acuerdo con el protocolo del fabricante (BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Alemania) . Ejemplo 1: Cinética de las reacciones de recombinación intramoleculares e intermoleculares Hemos demostrado en estudios anteriores que las reacciones de recombinación integrativas y excisivas (cortantes) intramoleculares catalizadas por Int mutante en ausencia de factores accesorios naturales en E. coli y en células humanas (Christ, N. et al. (1999), supra} Lorbach, E. et al. (2000), supra) . No obstante, una cuestión interesante con respecto a las interacciones de ADN episómico dentro de células de mamífero se relaciona con la capacidad de Int mutante para realizar recombinación intermolecular, es decir, cuando se localizan dos sitios de recombinación en moléculas de ADN diferentes en relación trans . Por lo tanto comparamos las reacciones de combinación integrativa intramoleculares e intermoleculares en primer lugar. La recombinación intramolecular se prueba con un sustrato que contiene attB y attP como secuencias repetidas directas que flanquean una señal de detención transcripcional . A su vez, este cásete (secuencia corta) de recombinación está flanqueada por un promotor de CMV y la región codificante para GFP. La recombinación . entre attB y attP genera sitios híbridos attL y attR y genera el corte de la señal de detención. La expresión subsecuente del gen GFP de esta manera sirve como un indicador de recombinación (figura 2A, parte superior) . Los vectores de expresión ya sea para Int, Int-h o Int-h/218 se cotransfectan con el vector de sustrato en células HeLa. Se utiliza la estructura principal del vector de expresión (en falso) como un control negativo. Las eficiencias de transfección determinadas independientemente para cada experimento se encuentran en el intervalo de 95 a 98% (datos no mostrados) . El análisis FACS de 3 experimentos muestran que ambos mutantes Int catalizan eficazmente la recombinación, lo que lleva en ciertos experimentos a células que expresan aproximadamente 30% de GFP (figura 2?, parte inferior) . La secuencia nucleotídica de los productos de recombinación, determinado indirectamente por secuenciado de ADN o de fragmentos de PCR, confirma que las reacciones de transferencia estándar catalizadas por Int mutante generaron los sitios att híbridos esperados (datos no mostrados) . Es evidente que el mutante doble Int-h/218 es más activo que Int-h, mientras que Int de tipo silvestre es casi inactiva. La fracción de células que expresa GFP se incrementa durante 48 h después de la transfección y permanece estable por las siguientes 24 h. El curso en el tiempo de las reacciones también indica que la mayor parte de los sucesos de recombinación deben haber sucedido en las primeras 24 h. Esto concuerda con el curso en el tiempo de la expresión de Int-h/218 en células HeLa (datos no mostrados) . Aunque no se puede excluir la posibilidad de que una fracción de células que expresan GFP resulta de recombinación integrativa intermolecular en vez de intramolecular, los datos generados se pueden utilizar como una referencia para nuestro análisis de recombinación intermolecular. Analizamos la recombinación integrativa intermolecular al colocar afctB y attP en plásmidos separados. La recombinación desplaza al promotor de CMV a una posición hacia el extremo 5' del gen para GFP (figura 2B, parte superior) . Por lo tanto, únicamente la recombinación intermolecular entre attB y attP generará células que expresan GFP. El análisis por FACS después de cotransfección de los dos vectores de sustrato con los vectores de expresión Int genera resultados que son comparables con aquellos generados con sustratos para recombinación intramolecular (figura 2B, parte inferior) . Nuevamente, la mayor parte de los sucesos de recombinación deben haberse producido dentro de las primeras 24 horas después de la transfección Int-h/218 es más activo que Int-h. Int de tipo silvestre genera únicamente una fracción muy pequeña de células que expresan GFP. Estos resultados demuestran que el curso con respecto al tiempo de 24 a 72 h, la recombinación integrante intermolecular por el mutante Int es por lo menos tan eficiente como la reacción intramolecular correspondiente. Se utiliza la misma estrategia experimental para comparar las vias de recombinación cortantes intramoleculares e intermoleculares (attL x attR) . Los resultados muestran nuevamente que la recombinación intermolecular por Int mutante es tan eficiente como la recombinación intramolecular (figura 2C y D) . No obstante, la eficiencia de las reacciones de recombinación excesivas se reduce ligeramente en comparación con la recombinación integrante. La recombinación por Int de tipo silvestre nuevamente es escasamente detectable. Ejemplo 2: Los sitios de unión de brazo de ADN en att no se requieren pero estimulan la recombinación. Los resultados hasta ahora muestran que la recombinación integrante y cortante catalizada por Int mutante sobre sustratos episómicos en un número significativo de células transfectadas . En contraste, las actividades de recombinación de Int de tipo silvestre es escasamente detectable por encima del fondo. Dado que la recombinación cortante por Int de tipo silvestre depende de la presencia de cofactores proteínicos IHF y XIS pero no requiere de superenrollado de ADN negativo, este resultado demuestra que las partes eucarióticas de estos cofactores no se encuentran en células humanas. Además, se sabe que los sustratos episómicos se relacionan topológicamente poco después de la transfección (Schwikardi et al. (2000) FEBS Letters, 471, pp. 147) . Por lo tanto, parece que Int mutante realiza la recombinación sin la formación de complejos nucleoproteínicos definidos, tales como el intasoma ensamblado en attP. Esto hace surgir la cuestión del papel funcional de los sitios de unión de brazo de ADN en la recombinación. Se encuentran presentes en por lo menos uno de los sitios att asociados utilizados hasta ahora. Para investigar esta cuestión se utilizó recombinación intermolecular con pares de sustratos vectores que contienen attB y attP en diversas combinaciones (figura 3A) . La fracción de células que expresan GFP que resulta de la recombinación se determina por FACS a las 48 h. después de la cotransfección con los vectores de expresión Int . Las eficiencias de transfección fueron siempre superiores a 90% (datos no mostrados) . Los resultados de tres experimentos muestran que la recombinación intermolecular entre pares de attP es tan eficiente como la recombinación entre attB y attP (figura 3B) . No obstante, únicamente Int-h2/218 utiliza pares de sitios attB como sustrato en un grado significativo. La eficiencia de esta reacción es, en promedio, reducida aproximadamente cuatro veces en comparación con reacciones entre attP y attP o attB y attP (figura 3B) . Por lo tanto, la fracción de células que expresan GFP que resulta de la recombinación entre dos sitios attB descienden a un nivel de 4 a 5%. Estos resultados demuestran que la presencia de secuencias del tipo de brazo en sitios att no se requiere para recombinación por Int-h/218, pero que estimula de manera significativa la reacción. Este efecto estimulador incluso es más pronunciado (aproximadamente ocho veces) cuando se utiliza Int-h. Además, la actividad de recombinación residual observada con Int de tipo silvestre parece altamente dependiente de la presencia de los sitios de unión de brazo. Ejemplo 3: La recombinación por Int de tipo silvestre es estimulada por proteína IHF transfectada La recombinación integrante eficiente catalizada por Int de tipo silvestre ín vi tro y en E. coli requiere el cofactor proteinico IHF y superenrollado de attP. La carencia aparente ya sea de cofactor en células de mamífero de esta manera nos llevó a investigar si la actividad de recombinación residual de Int de tipo silvestre está aumentada si se purifica IHF, se preincuba con un sustrato superenrollado, se cointroduce en células HeLa. Para probar esta posibilidad introdujimos primero vectores de expresión ya sea para Int de tipo silvestre o Int-h. A las 3 a 4 h después de la electroporacion los sustratos para recombinación intramolecular o intermolecular se incuban ya sea con o sin IHF purificado. Las mezclas de proteína-ADN así como las muestras de control sin proteína después se transfectan utilizando Fugene (figura 4?) . Las fracciones de células que expresan GFP se comparan después de 48 h adicionales.

Los resultados de tres experimentos muestran que la recombinación intramolecular por Int de tipo silvestre fue estimulada, en promedio, hasta cinco veces debido a la presencia de IHF. La fracción de células GFP positivas se incrementó, por ejemplo, en un experimento de aproximadamente 1% en presencia de IHF a 6% en su presencia. El efecto estimulador sobre la recombinación intermolecular también es significativo pero menos pronunciado (aproximadamente tres veces) . Después de 48 h después de transfección la estimulación es especifica para Int de tipo silvestre dado que la actividad de Int-h no se ve alterada. De manera importante, los controles muestran que las eficiencias de transfección tampoco son afectadas por la presencia de proteina IHF (datos no mostrados) . Ejemplo 4: El sistema de expresión de proteína mejorado basado en recombinación de secuencia especifica del gen de interés Se transfectan de manera estable células CHO-DG44 con un primer ADN plasmídico linealizado que expresa la proteina fluorescente ZsGreen 1 del género Zoanthus sp. (Clontch Laboratories Inc., Palo Alto, CA, E.U.A.) y el gen para resistencia a antibiótico, neomicina fosfotransferasa (figura '5) . Además, ya sea la secuencia de recombinación de attB o attP (secuencia natural o modificada o derivado de la misma) se coloca entre el gen para la proteina fluorescente y su promotor. El primer ADN plasmídic , linealizado mediante la utilización de una enzima de restricción con un sitio de restricción único fuera de las unidades de transcripción para ambos marcadores de selección, se introduce por integración aleatoria dentro del genoma de CH0-DG44. Las células con una integración aleatoria estable exitosa del primer ADN plasmídico se seleccionan positivamente por cultivo en presencia del antibiótico G418. Dentro del acumulado heterogéneo de células transfectantes estables con una alta actividad de transcripción en el sitio de integración del primer ADN plasmídico se pueden aislar simplemente por clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) basada en el nivel de expresión de la proteína fluorescente introducida ZsGreen 1. Las células con la más alta fluorescencia de ZsGreen 1 se clasifican y colocan como células solas dentro de los pozos de una placa de 96 pozos. Los subclones de células resultantes se expanden y prueban por endonucleasa de restricción mapeada por análisis de transferencia Southern para integración de una secuencia plasmídica única en un sitio cromosómico único. Para el ADN genómico posterior de los subclones de células se digieren con enzimas de restricción con sitios de restricción nulos, uno o múltiples dentro del primer ADN plasmídico introducido, respectivamente, que se somete a electroforesis en gel de agarosa 0.8% y se transfiere a membrana de nylon cargada positivamente (Amersham Biosciences, Priburgo, Alemania) . La hibridación se realiza durante la noche a 65°C en un horno de hibridación con una sonda marcada con FITC-dUTP cebada aleatoria que consiste del gen para ZsGreen 1 de acuerdo con el protocolo de un módulo de marcado de cebado aleatorio de Gene Images (Amersham Biosciences) . Los subclones candidatos con un inserto de una sola copia posteriormente se prueban en biorreactores a pequeña escala para determinar su funcionamiento en un proceso de alimentación por lotes que imita la producción. Además de altos niveles de expresión durante la fase de producción completa, monitoreada al medir la fluorescencia de ZsGreen 1, se toman en consideración otros parámetros importantes tales como alta viabilidad a alta densidad celular, metabolismo y un desempeño reproducible . De esta manera se identifica una célula anfitriona adecuada con una primera secuencia de integración att integrada. Para generar una linea de célula de producción que produce una sustancia biofarmacéutica por recombinación de secuencia especifica , esta célula anfitriona es transfectada con un segundo ADN plasmídico (véase la figura 5) que contiene un gen para dihidrofolato reductasa sin promotor precedido ya sea por la secuencia de recombinación attB o attP (una secuencia natural o modificada o un derivado de la misma) y una unidad de transcripción completa para la expresión del gen de interés, por' ejemplo, sICAM terapéutico frío común (molécula 1 de adhesión intercelular soluble) o la proteína-1 quimioatrayente de monocito humano (MCP-1) . Además se cotransfecta el vector pCMVSSInt-h/218 que expresa la integrasa del bacteriófago ? mutada (modificada) . Después de la transfección, la expresión transitoria de Int-h/218 es suficiente para realizar la recombinación intermolecular específica de secuencia entre el primer sitio de recombinación att (ya sea attP o attB) localizada en un locus activo transcripcional preferido dentro del genoma de la célula anfitriona y el segundo sitio de recombinación de att (ya sea attí? o attB) en el segundo plásmido de ADN introducido. Para seleccionar células en donde se ha producido recombinación de secuencia especifica entre attP y attP, attP y attB o aatB y attB, dependiendo de la selección de la secuencia de recombinación en el primero y el segundo plásmido de ADN, las células transfectadas se transfieren y cultivan en medio CHO-S-SFMII sin los suplementos de hipoxantina y timidina. Únicamente los resultados dirigidos correctamente en las células que sobreviven a la selección al colocar vía recombinación el gen marcador DHP sin promotor con un sitio de recombinación att hacia el extremo 5' en el segundo ADN plasmídico bajo el control de la secuencia promotora del gen ZsGreen 1 con un sitio de recombinación att hacia el extremo 31 y de esta manera se permite la expresión eficaz del gen marcador de selección DHFR. Al mismo tiempo se interrumpe el cásete de expresión funcional del gen ZsGreen 1 dejando atrás al gen ZsGreen 1 sin promotor. De esta manera las células no expresan ninguna proteína fluorescente más . Las células no fluorescentes se identifican y aislan por FACS proporcionando un medio para detectar a las células productoras de la proteína de interés. Además, la integración específica de la secuencia se verifica por transferencia Southern y análisis PCR con cebadores que se localizan en las secuencias que flanquean a los sitios att antes y después de recombinación específica de sitio seguida por secuenciado subsecuente del ADN. La expresión de la proteína de interés, sICA o MCP-1, se ensaya por ELISA. El uso de dhfr como gen marcador para la generación de producción de líneas celulares ofrece no solo la ventaja de selección positiva sino también la posibilidad de incrementar aún más la productividad de la célula por amplificación de gen basada en dhfr, inducida por metotrexato . Esto se obtiene al suplementar el medio de cultivo sin hipoxantina/timidina CHO-S-SFMII al incrementar las cantidades de metotrexato. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para ¦ llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (23)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método de recombinación de secuencia especifica de ADN en una célula eucariótica, caracterizado porque comprende : a) introducir un ADN que comprende una primera secuencia de attB, attP, attL o attR o un derivado de la misma al interior de una célula, b) introducir un ADN que comprende una segunda secuencia de attB, attP, attL o attR o un derivado de la misma en una célula, en donde la primera secuencia de ADN comprende una secuencia de attB o un derivado de la misma, la segunda secuencia comprende una secuencia de attB, attL o attR, o un derivado de la misma, o en donde, la primera secuencia de ADN comprende una secuencia attP o un derivado de la misma, la segunda secuencia comprende una secuencia de attP, attL o attR o un derivado de la misma, o en donde, si la primera secuencia de ADN comprende una secuencia attL o un derivado de la misma, la segunda secuencia comprende una secuencia de attB, attP o attL o un derivado de la misma, o en donde, si la primera secuencia de ADN comprende una secuencia de attR o un derivado de la misma, la segunda secuencia comprende una secuencia de attB, attP o attR o un derivado de la misma, y c) realizar la recombinación de secuencia especifica por una integrasa Int de bacteriófago ?.

2. El método de recombinación de secuencia especifica de ADN en una célula eucariótica que tiene integrada la primera secuencia de att o un derivado de la misma, de conformidad con la reivindicación 1 en un minicromosoma artificial o el genoma de la célula eucariótica, caracterizado porque comprende las etapas b) y e) de conformidad con la reivindicación 1.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la primera secuencia att o un derivado de la misma se encuentra de manera natural en el genoma de la célula eucariótica o se introduce previamente.

4. Un método para expresar por lo menos un gen de interés que codifica para uno o más polipéptidos/productos deseados en una célula eucariótica, caracterizado porque comprende: a) introducir dentro de una célula un primer ADN que comprende una secuencia attB, attP, attL o attR o un derivado de la misma; b) introducir en una célula un segundo ADN que comprende una secuencia attB, attP, attL o attR o un derivado de la misma, y por lo menos un gen de interés; c) poner en contacto la célula con una integrasa Int de bacteriófago ?; d) realizar la recombinación de secuencia especifica por la integrasa Int de bacteriófago ?, en donde el segundo ADN se integra al primer ADN; y e) cultivar a la célula bajo condiciones en donde se expresa uno o varios de los genes de interés .

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque si la primera secuencia de ADN comprende una secuencia attB o un derivado de la misma, la segunda secuencia comprende una secuencia de attB, attL o attR o un derivado de la misma, o en donde si la primera secuencia de ADN comprende una secuencia de attP o un derivado de la misma, la segunda secuencia comprende una secuencia de attP, attL o attR, o un derivado de la misma, o en donde la primera secuencia de ADN comprende una secuencia attL o un derivado de la misma, la segunda secuencia comprende una secuencia de attB, attP o attL o un derivado de la misma, o en donde, la primera secuencia de ADN comprende una secuencia attR o un derivado de la misma, la segunda secuencia comprende una secuencia de attB, attP o attR o un derivado de la misma.

6. El método de acuerdo con las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado porque el primer ADN se ha integrado en el genoma, un minicromosoma artificial o un elemento episómico de la célula anfitriona antes de que se introduzca en la célula el segundo ADN.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el primer ADN se ha integrado en el genoma de la célula anfitriona.

8. Un método para expresar por lo menos un gen de interés que codifica para uno o más polipéptidos/productos deseados en una célula eucariótica que tiene por lo menos una secuencia de recombinación que se presenta de manera natural la cual permite recombinación de secuencia especifica mediada por un Int de bacterióf go ? o cualquier mutante funcional del mismo, caracterizado porque comprende: a) introducir en la célula un ADN que comprende una secuencia de attB, attP, attL o attR o un derivado de la misma y por lo menos un gen de interés; b) poner en contacto a la célula con una integrasa Int de bacteriófago ?; c) realizar la recombinación ¦ de secuencia especifica por la integrasa Int de bacteriófago ?, entre la secuencia de recombinación que se encuentra en la naturaleza, en la célula y el ADN introducido en la célula; y d) cultivar a la célula bajo condiciones en donde se expresa uno o varios de los genes de interés .

9. Un método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia que se encuentra en la naturaleza es afctff.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, caracterizado porque uno o varios de los polipéptidos/productos deseados se aislan de la célula anfitriona o del medio de cultivo de la célula.

11. El método de conformidad con cualquiera de las 5 reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el derivado de la secuencia de attP, attB, attL o attR comprende una copia o más copias de uno o varios de los sitios de unión de brazo para Int o en donde el derivado comprende una copia o más copias de uno o varios sitios de unión Int del núcleo, 10 o en donde el derivado comprende una combinación de una copia o más copias de uno o varios de los sitios de unión de brazo para Int y una copia o más copias de uno o varios de los sitios de unión Int del núcleo.

12. El método de conformidad con la reivindicación 15 11, caracterizado porque el derivado de la secuencia de attP, attB, attL o attR consiste de una copia o más copias de uno o varios de los sitios de unión Int del núcleo o en donde el derivado consiste de una combinación de una copia o más copias de uno o varios de los sitios de unión del brazo para •20 Int y una copia o más copias de uno o varios de los sitios de unión Int del núcleo .

13. El método de conformidad con la reivindicación 11 ó 12, caracterizado porque el sitio de unión del núcleo consiste de nueve pares de bases contiguas y se relacionan 25 con secuencias de ADN que consisten para la secuencia B de la secuencia nucleotídica 5 ' -CTGCTTTTT-3 ' , para la secuencia B ' de la secuencia nucleotídica 51 -CAAGTTAGT-3 ' (cadena complementaria inversa) , para la secuencia C de la secuencia nucleotídida 5 ' -CAGCTTTTT-3 ' y para la secuencia C' de la secuencia nucleotídica 5 ' -CAACTTAGT-3 ' (cadena complementaria inversa) en sitios att de tipo silvestre o en secuencias que tienen sustituciones nucleotídicas funcionales.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la recombinación de secuencia especifica se realiza por Int y uno o más cofactores que se seleccionan de XIS, FIS o IHF.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la recombinación de secuencia especifica se realiza por una Int modificada, preferiblemente Int-h o Int-h/218.

16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque Int, Int-h o Int-h/218, XIS, FIS y/o IHF se agregan a la célula en forma purificada o se coexpresan por la célula anfitriona, en donde se. realiza la recombinación de secuencia especifica .

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque adicionalmente se introducen en la célula una tercera o una tercera y cuarta secuencias de ADN que comprenden un gen para Int, o un gen para Int y uno o más genes cofactores que se seleccionan del gen para XIS, el gen para FIS y/o el gen para IHF, respectivamente.

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque no se requiere XIS, FIS o IHF cuando se realiza la recombinación de secuencia especifica por una Int modificada, preferiblemente Int-h o Int-h/218.

19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la primera y/o segunda secuencia de recombinación comprende además un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de interés.

20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el polipéptido de interés es un anticuerpo, hormona o factor de crecimiento.

21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la célula anfitriona es una célula de mamífero.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula de roedor, preferiblemente una célula de ratón o hámster.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la célula de hámster es una célula BHK o CHO y la célula de ratón es una célula de mieloma murino preferiblemente una célula NSO o Sp2/0.