JP7260510B2 - 組み換え型タンパク質の効率的な選択性 - Google Patents
組み換え型タンパク質の効率的な選択性 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2015年8月3日に作成されたファイル「8700WO_ST25.txt」(75,769バイト)としてコンピュータ可読形式で提出される配列表を参照により組み込む。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
配列番号:3の前記アミノ酸配列に少なくとも93%の同一性を有するタンパク質をコードする哺乳類ツニカマイシン(Tn)耐性遺伝子を含み、目的遺伝子(GOI)および少なくとも1つの調節要素に操作可能にリンクした、単離細胞。
(項目2)
前記細胞に前記Tn耐性遺伝子が外因的に添加された、項目1に記載の単離細胞。
(項目3)
前記Tn耐性遺伝子が、配列番号:3の前記アミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有する前記タンパク質をコードする、項目1または2に記載の単離細胞。
(項目4)
前記Tn耐性遺伝子が配列番号:3の前記アミノ酸配列と少なくとも98%の同一性を有する前記タンパク質をコードする、項目1~3のいずれか一項に記載の単離細胞。
(項目5)
前記Tn耐性遺伝子が、配列番号:2、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、および配列番号:17から成る群から選択される核酸配列を含む、項目1または2に記載の単離細胞。
(項目6)
前記Tn耐性遺伝子が、配列番号:12を含む前記核酸配列を含む、項目1または2に記載の単離細胞。
(項目7)
前記少なくとも1つの調節要素が、プロモーター、リボソーム結合部位、およびエンハンサーから成る群から選択される、項目1~6のいずれか一項に記載の単離細胞。
(項目8)
第2の目的遺伝子(GOI)をさらに含む、項目1~7のいずれか一項に記載の単離細胞。
(項目9)
前記目的遺伝子(GOI)が外因的に添加されたGOIである、項目1~8のいずれか一項に記載の単離細胞。
(項目10)
前記外因的に添加されたGOIがヒトの遺伝子である、項目1~9のいずれか一項に記載の単離細胞。
(項目11)
前記調節要素が外因的に添加された調節要素である、項目1~10のいずれか一項に記載の単離細胞。
(項目12)
前記第1のおよび/または第2のGOIが、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗原結合断片、およびFc融合タンパク質から成る群から選択される、項目1~11のいずれか一項に記載の単離細胞。
(項目13)
前記第1のGOIおよび前記第2のGOIが、抗体軽鎖またはその抗原特異的な断片、抗体重鎖またはその抗原特異的な断片、Fc融合タンパク質またはその断片、および受容体またはそのリガンド特異的な断片をコードする遺伝子、から成る群から独立して選択される、項目1~12のいずれか一項に記載の単離細胞。
(項目14)
前記GOIがプロモーターに操作可能にリンクした、項目1~113のいずれか一項に記載の単離細胞。
(項目15)
前記GOIは、抗体軽鎖またはその抗原結合断片、抗体重鎖またはその抗原結合断片、Fc融合タンパク質またはその断片、リガンド、および受容体またはそのリガンド結合断片から選択される糖タンパク質をコードする、項目1~14のいずれか一項に記載の単離細胞。
(項目16)
リコンビナーゼ認識部位が前記第1のGOIと前記第2のGOIとの間に存在する、項目8~15のいずれか一項に記載の単離細胞。
(項目17)
前記第1のGOIに対するリコンビナーゼ認識部位5’と、前記第2のGOIに対するリコンビナーゼ認識部位3’と、をさらに含む、項目8に記載の単離細胞。
(項目18)
前記細胞が真核細胞である、項目1~17のいずれか一項に記載の単離細胞。
(項目19)
前記細胞が哺乳類細胞である、項目1~18のいずれか一項に記載の単離細胞。
(項目20)
前記細胞が、CHO-K1、COS-7、HEK293、腫瘍細胞、リンパ球、網膜細胞、および幹細胞から成る群から選択される、項目1~18のいずれか一項に記載の単離細胞。
(項目21)
前記細胞がCHO-K1細胞である、項目1~20のいずれか一項に記載の単離細胞。
(項目22)
組み換え型の目的タンパク質(POI)を生成する方法であって、
a. (i)哺乳類ツニカマイシン(Tn)耐性遺伝子および(ii)前記POIをコードする遺伝子を含む核酸分子をコードする哺乳類宿主細胞を提供することと、
b. 前記Tnの第1の濃度の存在下で前記細胞を培養することと、
c. 前記Tn耐性遺伝子の少なくとも1つのコピーを発現する細胞集団を単離することと、
d. 前記Tnの増加する濃度の存在下で前記細胞集団を培養することであって、前記Tnの増加する濃度が前記POIの生成を増加することと、
e. 前記POIを前記細胞培養から単離することとを含む、方法。
(項目23)
前記哺乳類Tn耐性遺伝子が配列番号:2の前記核酸配列と少なくとも95%の同一性を有する核酸配列を含む、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記哺乳類Tn耐性遺伝子が配列番号:2の前記核酸配列と少なくとも98%の同一性を有する核酸配列を含む、項目22に記載の方法。
(項目25)
前記哺乳類Tn耐性遺伝子が、チャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)Tn耐性遺伝子を含む、項目22~24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記哺乳類Tn耐性遺伝子がヒトTn耐性遺伝子を含む、項目22に記載の方法。
(項目27)
前記哺乳類Tn耐性遺伝子が、配列番号:2、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、および配列番号:17から成る群から選択される核酸配列を含む、項目22に記載の方法。
(項目28)
前記Tn耐性遺伝子が、前記POIをコードする前記遺伝子に操作可能にリンクする、項目22~27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
前記POIをコードする前記遺伝子が、少なくとも1つの調節要素に操作可能にリンクする、項目22~27のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記少なくとも1つの調節要素が、プロモーター、リボソーム結合部位、およびエンハンサーから成る群から選択される、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記POIをコードする第2の遺伝子をさらに含む、項目22~30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記遺伝子が外因的に添加された目的遺伝子(GOI)である、項目22~31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記外因的に添加されたGOIがヒトの遺伝子である、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記調節要素が外因的に添加された調節要素である、項目29または30に記載の方法。
(項目35)
前記POIが、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗原結合断片、およびFc融合タンパク質から成る群から選択される、項目22~34のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
前記Tnの第1の濃度が、1μg/mLである、項目22~35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
Tnの前記増加する濃度が、Tnの第2の濃度およびTnの第3の濃度を含む、項目22~36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記Tnの第2の濃度が前記Tnの第1の濃度より大きく、かつ前記Tnの第3の濃度が前記Tnの第2の濃度より大きい、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記Tnの第2の濃度が2.5μg/mLであり、また前記Tnの第3の濃度が5μg/mLである、項目37または38に記載の方法。
(項目40)
前記Tnの増加する濃度がTnの第2の濃度を含み、前記Tnの第2の濃度が2.5μg/mLまたは5μg/mLである、項目22~36のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
N-グリカンタンパク性基質をグリコシル化する方法であって、
a. グリコシル化を必要として前記タンパク性基質をコードする遺伝子に操作可能にリンクした哺乳類ツニカマイシン(Tn)耐性遺伝子を含む核酸分子をコードする哺乳類宿主細胞を提供することと、
b. 前記Tnの第1の濃度の存在下で前記細胞を培養することと、
c. 前記Tn耐性遺伝子の少なくとも1つのコピーを発現する細胞集団を単離することと、
d. 前記Tnの増加する濃度の存在下で前記細胞集団を培養することであって、前記Tnの増加する濃度が前記POIの生成を増加することと、
e. 前記タンパク性基質を前記細胞培養から単離することとを含む、方法。
(項目42)
前記哺乳類Tn耐性遺伝子が配列番号:2の前記核酸配列と少なくとも93%の同一性を有する核酸配列を含む、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記哺乳類Tn耐性遺伝子が配列番号:2の前記核酸配列と少なくとも98%の同一性を有する核酸配列を含む、項目39に記載の方法。
(項目44)
前記哺乳類Tn耐性遺伝子が、チャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)Tn耐性遺伝子を含む、項目41~43のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
前記哺乳類Tn耐性遺伝子がヒトTn耐性遺伝子を含む、項目41に記載の方法。
(項目46)
前記哺乳類Tn耐性遺伝子が、配列番号:2、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、および配列番号:17から成る群から選択される核酸配列を含む、項目41に記載の方法。
(項目47)
前記Tn耐性遺伝子が、前記POIをコードする前記遺伝子に操作可能にリンクする、項目41~46のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
前記POIをコードする前記遺伝子が、少なくとも1つの調節要素に操作可能にリンクする、項目41~47のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
前記少なくとも1つの調節要素が、プロモーター、リボソーム結合部位、およびエンハンサーから成る群から選択される、項目48に記載の方法。
(項目50)
第2の目的遺伝子(GOI)をさらに含む、項目41~47のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
前記目的遺伝子(GOI)が外因的に添加されたGOIである、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記外因的に添加されたGOIがヒトの遺伝子である、項目51に記載の方法。
(項目53)
前記調節要素が外因的に添加された調節要素である、項目48または49に記載の方法。
(項目54)
前記POIが、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗原結合断片、およびFc融合タンパク質から成る群から選択される、項目41~53のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
前記Tnの第1の濃度が、1μg/mLである、項目41~54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
Tnの前記増加する濃度が、Tnの第2の濃度およびTnの第3の濃度を含む、項目41~55のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記Tnの第2の濃度が前記Tnの第1の濃度より大きく、かつ前記Tnの第3の濃度が前記Tnの第2の濃度より大きい、項目56に記載の方法。
(項目58)
前記Tnの第2の濃度が2.5μg/mLであり、また前記Tnの第3の濃度が5μg/mLである、項目56または57に記載の方法。
(項目59)
前記Tnの増加する濃度がTnの第2の濃度を含み、前記Tnの第2の濃度が2.5μg/mLまたは5μg/mLである、項目41~55のいずれか一項に記載の方法。
相互に機能的に関係しているとき、DNA領域は操作可能にリンクされる。例えば、プロモーターが配列の転写に参画する能力を有す場合、プロモーターはコード配列に操作可能にリンクし;リボソーム結合部位は、翻訳を許容するように位置する場合、コード配列に操作可能にリンクする。一般的に、操作可能にリンクしているとは、連続性を含むことができるが、連続性を必要としない。分泌リーダーなどの配列の場合には、連続性およびリーディングフレーム内での適正な配置は典型的な特徴である。プロモーターなどの生成強化配列は、目的遺伝子(GOI)と機能的に関係している場合、例えば、その存在が結果としてGOIの発現の増加をもたらす場合、GOIに操作可能にリンクしている。
本発明は、ある一定の条件下で組み換え型タンパク質が細胞内に生成されうるという発見に少なくとも部分的に基づき、タンパク質をコードする遺伝子は、Tn耐性遺伝子、GPTに操作可能にリンクし、また細胞ゲノム内でランダム組み込みイベントを増加し、したがって目的遺伝子のコピー数、および最終的にタンパク質生成を増加するためにタンパク質を生成する細胞の選択物の形式を整える。
操作的なGPT発現カセットを含む発現ベクターが本明細書に提供される。発現カセットは、哺乳類GPTおよび所望の遺伝子産物の転写および翻訳を許容および駆動するために必要な調節要素を含む。
以前記述されたまたは当該技術分野で既知の有用な調節要素を、哺乳類細胞をトランスフェクトするために使用される核酸構築体内に含むこともできる。図1は、プロモーター配列、IRES配列、目的遺伝子、およびpoly(A)配列をさらに含むGPTベクター内の操作的なカセットを例示する。
目的タンパク質をコードする核酸配列を、Tn耐性マーカー遺伝子およびIRESを含む細胞内に都合よく組み込み、また随意によりリコンビナーゼ認識部位と隣接することができる。哺乳類細胞内での発現のために好適な任意の目的タンパク質を使用することができるが、特に糖タンパク質は本発明の方法からの恩恵を受ける。例えば、目的タンパク質は、抗体もしくはその抗原結合断片、二重特異性抗体もしくはその断片、キメラ型抗体もしくはその断片、ScFvもしくはその断片、Fcタグ付きタンパク質(例えば、Trapタンパク質)もしくはその断片、成長因子もしくはその断片、サイトカインもしくはその断片、または細胞表面受容体の細胞外ドメインもしくはその断片とすることができる。
本発明の方法で使用される哺乳類宿主細胞は、真核性宿主細胞、通常哺乳類細胞であり、例えば、CHO細胞およびマウス細胞が含まれる。一実施形態では、本発明は、Cricetulus griseus(チャイニーズハムスター)(配列番号:3で示される)に由来するTn耐性マーカータンパク質またはそのホモログまたはその変異型をコードする核酸配列を含む細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞はTn耐性マーカー遺伝子の多重遺伝子コピーを含む。他の実施形態では、本発明は、ヒト(配列番号:4)、アカゲザル(配列番号:5)、チンパンジー(配列番号:6)、イヌ(配列番号:7)、モルモット(配列番号:8)、ラット(配列番号:9)、またはマウス(配列番号:10)に由来するTn耐性マーカータンパク質をコードする核酸配列を提供する。
トランスフェクタント細胞発現GPTの選択効率
修飾したCHO K1細胞を、CHO-GPT(配列番号:2)、ヒトGPT(配列番号:12)を含有するプラスミドベクター、またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(Hpt、ハイグロマイシン耐性遺伝子)を含有するプラスミドベクターを用いて形質移入し、例えば、選択マーカー遺伝子(CHO-GPTまたはhpt)をIRES配列を介してそれらのそれぞれのベクター内で下流eGFP遺伝子に転写的にリンクした。例えば、5’~3’方向に以下の遺伝子配列を含有するように各プラスミドを構築した。Lox部位、SV40後期プロモーター、CHO-GPT(またはHpt)のいずれか、IRES、強化した緑色蛍光タンパク質(eGFP)、および第2のLox部位。精製した組み換え型プラスミドをCreリコンビナーゼを発現するプラスミドと一緒に修飾したCHO宿主細胞株へと形質移入し、この細胞株は、転写的に活性の遺伝子座において、5’~3’に、lox部位、YFP、および第2のlox部位を含有した。その結果として、フローサイトメトリーによって宿主CHO細胞を緑色陽性細胞または黄色陰性細胞として単離することができる。eGFP(GPTまたはhpt遺伝子によって転写的に調整された)を発現する組み換え型プラスミドが、Creリコンビナーゼを発現するプラスミドと一緒に形質移入されたとき、Creリコンビナーゼによって媒介された組み換えは結果として、lox部位の置き換えを含有する染色体の遺伝子座において、GPT/eGFPカセットの部位特異的な組み込みをもたらし、YFP遺伝子を生じる(すなわち緑色陽性細胞)。eGFPがランダムに組み込む場合、緑色陽性および黄色陽性細胞の両方がもたらされることになる。
遺伝子産物の増幅
ツニカマイシンのGPT発現系に対する濃度の増加を適用することによって漸増選択が行われた。CHO K1細胞は、上記のようにCHO-GPT遺伝子(配列番号:2)を含有するプラスミドベクターを用いて形質移入された。プラスミドは、5’~3’方向に、第1のLox部位、SV40後期プロモーター、CHO-GPT遺伝子、IRES、eGFP、および第2のLox部位を含有する。CRE-lox部位は、目的遺伝子のゲノムへの組み込みを指示し、結果として細胞当たり少なくとも1つのGPT挿入を有する細胞の安定したトランスフェクタントプールが得られる。(上に示したように、ランダム組み込みに起因してより多くの組み込み体が生じうる)。CHO細胞は当初1μg/mLのツニカマイシン(Tn)の存在下で培養された。次いで、トランスフェクタントは安定したプール(細胞プール2と名付けられる)から選択され、これに続いて1μg/mL、2.5μg/mL、または5μg/mLのTnの存在下で拡張された。eGFPの強化した発現の能力(多重コピー)を有する細胞集団を識別するために選択ラウンドが実施された。ランダム組み込みイベントは2.5μg/mLまたは5μg/mLのTnの存在下で大幅に増加した。
例示的な二量体タンパク質の発現およびグリコシル化プロファイル
「トラップ」タンパク質(Fc融合タンパク質-1、以下FcFP1と記載する)を発現するCHO細胞はGPTを含有する発現ベクターで形質移入される。プラスミドは、5’~3’方向に、Lox部位、SV40後期プロモーター、Tn耐性遺伝子(CHO-GPT)、IRES eGFP、SV40 polyA、および第2のLox部位を有する。GPT選択マーカーの選択のために1μg/mL Tnまたは5μg/mL Tnが使用された。選択されたプール細胞は、血清を含まない生成媒体中の懸濁液培養内で拡張される。GPTトランスフェクションはFACS解析によるeGFPの発現によって確認される。選択されたプールから回収されたペレットはGPT発現に対するコピー数解析のために送られ、また異なる濃度のツニカマイシンを用いて選択されたプール内でのFcFP1の発現レベルを判定するために12日間生産性アッセイが設定された。
Claims (22)
- 哺乳類細胞培養における選択マーカーとしてツニカマイシン(Tn)を採用する方法であって、
(a)哺乳類宿主細胞集団を提供するステップと、
(b)ステップ(a)の細胞集団にトランスフェクションにより核酸を導入するステップであって、ここで、前記核酸は、(i)配列番号:3のアミノ酸配列に少なくとも93%の同一性を有するタンパク質をコードする哺乳類ツニカマイシン(Tn)耐性遺伝子、および(ii)第1の目的タンパク質(POI)をコードする第1の目的遺伝子(GOI)を含むステップ、
(c)Tnの連続的に増加する濃度の存在下でステップ(b)の細胞集団を培養し、それにより、前記核酸を含む細胞トランスフェクタントを選択するステップ、ならびに
(d)前記選択された細胞トランスフェクタントを培養し、前記選択された細胞トランスフェクタントにおいて前記第1のGOIから前記第1のPOIを発現し、前記細胞培養から前記第1のPOIを単離するステップ
を含み、前記第1のPOIがN-グリコシル化タンパク質である、方法。 - ステップ(c)における培養が、1μg/mLの第1のTn濃度で培養すること、続いて、2.5μg/mLまたは5μg/mLの第2のTn濃度で培養することを含む、請求項1に記載の方法。
- 組み換え型の目的タンパク質(POI)を生成する方法であって、前記方法が:
(a)外因性核酸を含む哺乳類宿主細胞を提供するステップであって、ここで前記外因性核酸は、(i)配列番号:3のアミノ酸配列に少なくとも93%の同一性を有するタンパク質をコードする哺乳類ツニカマイシン(Tn)耐性遺伝子、および(ii)第1のPOIをコードする第1の目的遺伝子(GOI)を含むステップ;
(b)Tnの存在下で前記細胞を培養して、前記第1のPOIを発現するステップ;ならびに
(c)前記細胞培養から前記第1のPOIを単離するステップ
を含み、前記第1のPOIがN-グリコシル化タンパク質である、方法。 - 前記Tnが、1μg/mL、2.5μg/mL、または5μg/mLの濃度である、請求項3に記載の方法。
- 前記培養が、Tnの連続的に増加する濃度の存在下での培養を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記培養が、1μg/mLの第1のTn濃度で培養すること、続いて、2.5μg/mLまたは5μg/mLの第2の濃度で培養することを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記Tn耐性遺伝子が、配列番号:2、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、および配列番号:17からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記哺乳類宿主細胞が、CHO、COS-7、HEK293、腫瘍細胞、リンパ球、網膜細胞、および幹細胞からなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記哺乳類宿主細胞がCHO細胞である、請求項3に記載の方法。
- 哺乳類細胞培養における選択マーカーとしてツニカマイシン(Tn)を採用する方法であって、
(a)哺乳類宿主細胞集団を提供するステップと、
(b)ステップ(a)の細胞集団にトランスフェクションにより核酸を導入し、標的の遺伝子座に前記核酸の組み込みを許容するステップであって、ここで、前記核酸は、(i)配列番号:3のアミノ酸配列に少なくとも93%の同一性を有するタンパク質をコードする哺乳類ツニカマイシン(Tn)耐性遺伝子、および(ii)第1の目的遺伝子(GOI)を含むステップ、
(c)Tnの存在下でステップ(b)の細胞集団を培養するステップ、ならびに
(d)前記標的の遺伝子座に組み込まれた前記核酸を含む、細胞トランスフェクタントを得るステップ、
を含み、前記第1のGOIによってコードされるタンパク質がN-グリコシル化タンパク質である、方法。 - 前記標的の遺伝子座への前記組み込みが、前記標的の遺伝子座における特定の部位を認識するリコンビナーゼによって媒介される、請求項10に記載の方法。
- 前記標的の遺伝子座への前記組み込みが、相同的組み換えによって媒介される、請求項10に記載の方法。
- 前記相同的組み換えが、前記標的の遺伝子座内の配列を切断するヌクレアーゼによって促進される、請求項12に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化物質様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、またはRNA誘導型エンドヌクレアーゼから選択される、請求項13に記載の方法。
- ステップ(c)における前記培養が、Tnの連続的に増加する濃度で培養することを含む、請求項10に記載の方法。
- ステップ(c)における前記培養が、第1の濃度でのTnの存在下で培養することを含み、ここでステップ(d)から得た前記細胞トランスフェクタントが、前記第1の濃度よりも高い第2の濃度でのTnの存在下でさらに培養される、請求項10に記載の方法。
- 前記Tn耐性遺伝子が、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、および配列番号:10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項10に記載の方法。
- 前記Tn耐性遺伝子が、配列番号:2、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、および配列番号:17からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記第1のGOIが、第1の目的タンパク質(POI)をコードする、請求項10に記載の方法。
- 前記第1のPOIを前記第1のGOIから発現し、前記第1のPOIを前記培養した細胞トランスフェクタントから単離することをさらに含む、請求項19に記載の方法。
- 前記哺乳類宿主細胞が、CHO、COS-7、HEK293、腫瘍細胞、リンパ球、網膜細胞、および幹細胞からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記哺乳類宿主細胞がCHO細胞である、請求項10に記載の方法。
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