RS61371B1 - Efikasna selektivnost rekombinantnih proteina - Google Patents

Description

STANJE TEHNIKE

Oblast pronalaska

[0001] Pronalazak obezbeđuje ekspresiju rekombinantnih proteina u ćelijama sisara na konzistentan i efikasan način. Posebno, pronalazak uključuje postupke i kompozicije za poboljšanu ekspresiju proteina u ćelijama sisara korišćenjem selekcionih markera sisara. Pronalazak uključuje postupke koji olakšavaju selektivnost i pojačane ekspresione kopije, kao i prinos proteina rekombinantnih proteina u ćelijama sisara, i metode korišćenja takvih ekspresionih sistema.

Opis srodnog stanja tehnike

[0002] Razvoj ćelijskih ekspresionih sistema je važan cilj za obezbeđivanje pouzdanog i efikasnog izvora datog proteina za istraživanje i terapijsku upotrebu. Ekspresija rekombinantnih proteina u ćelijama sisara je često poželjna za proizvodnju terapijskih proteina zbog, na primer, sposobnosti ekspresionih sistema sisara da na odgovarajući način post-translaciono modifikuju rekombinantne proteine.

[0003] Različiti vektori su dostupni za ekspresiju kod domaćina sisara, svaki sadrži selekcione markere koji omogućavaju jednostavnu izolaciju ćelija koje eksprimuju rekombinantne proteine tokom ćelijske kulture. Selekcioni marker geni (SMG) koriste se u takvim sistemima jer pružaju selektivnu prednost ćelijama koje eksprimuju protein od interesa, međutim SMG moraju, između ostalih razloga, biti optimizovani zbog svoje fenotipske neutralnosti, efikasnosti i svestranosti. WO 2009/066919 opisuje upotrebu gena UDP-N-acetil-D-glukoazim:dolikol fosfat-N-acetilglukozamin-fosfotransferaze kao markera za odabir biljnih transformanata. Uniprot ulazni pristupni br. G31967 odnosi se na informacije o sekvenci za gen UDP-N-acetil-D-glukoazim:dolikol-fosfat- N-acetilglukozamin-fosfotransferaza jajnika kineskog hrčka (CHO)-K1 ćelijske linije. Socca i Krag J. Biol. Chem. (1990) 265(33): 20621-20626 opisuje sekvencu cDNK koja određuje uridin difosfat N-acetil-D-glukoazim:dolikol fosfat N-acetilglukozamin-1-fosfatnu transferazu iz ćelija jajnika kineskog hrčka.

[0004] Uprkos dostupnosti brojnih vektora i ekspresionih sistema koji su domaćini SMG, ekspresija rekombinantnog proteina postignuta u sisarskim sistemima je često nezadovoljavajuća, bilo u količini ili kvalitetu, bilo u oba. Biološki „otisak prsta“ molekula, na primer post-translacione modifikacije poput glikozilacije, od posebne je važnosti za definisanje korisnosti i efikasnosti molekula u razvoju terapijskog rekombinantnog proteina (Cumming, D.A., 1990, Glycobiology, 1(2):115-130). SMG-ovi koji nemaju negativan uticaj na biološka svojstva eksprimovanog proteina od interesa su posebno korisni.

[0005] Većina SMG su bakterijskog porekla i daju druge nedostatke za upotrebu u sistemima sisara zbog rastuće zabrinutosti zbog rizika od horizontalnog prenosa gena rezistencije na bakterijske antibiotike na bakterije iz okoline (Breyer, D. et al., 2014, Critical Reviews in Plant Sciences 33:286-330). Ukidanje upotrebe gena rezistencije na bakterijske antibiotike moglo bi imati pozitivne efekte na prihvatanje potrošača i ublažavanje tako uočenih rizika.

[0006] Autologne ćelije genetski proizvedene brzo postaju klinički uspeh (videti npr. Kershaw, M.H. et al., 2013, Nature Reviews: Cancer 13:525-541). Izbor i dizajn vektora za genetske modifikacije u proizvodima humanih autolognih ćelija je presudan, posebno jer bi neželjeno uvođenje nehumanih komponenti u humanu autolognu ćeliju moglo imati ozbiljne posledice po bezbednost pacijenta (Eaker, et al.2013, Stem cells Trans. Med.2:871-883; prvi put objavljeno onlajn u SCTMEXPRESS 7. oktobra 2013). Vektorski sistem koji sadrži samo komponente poreklom od sisara, a ne bakterijske, bio bi povoljan za upotrebu u specifičnim T ćelijama pacijenta za adoptivnu imunoterapiju.

[0007] Stoga je poželjno uvesti gene selektivnosti sisara, posebno one koji transformisanim ćelijama daju fenotipsku ili metaboličku prednost u ekspresionim sistemima za proizvodnju proteina sisara od interesa. Štaviše, veoma je poželjna ćelijska linija koja pouzdano eksprimuje dovoljno visok nivo terapijskog proteina i na odgovarajući način i dosledno modifikuje terapijski protein post-translaciono. Shodno tome, u tehnici postoji potreba za poboljšanim ekspresionim sistemima sisara.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0008] Upotreba gena za rezistenciju na tunikamicin (Tn) sisara kao selektivnog markera u ekspresionom sistemu sisara može povećati efikasnost i broj kopija transfektanata. Primećeno je da upotreba gena za rezistenciju na Tn koji je operativno povezan sa genom od interesa stvara selektivni pritisak na populaciju ćelija sisara, povećavajući tako nasumičnu integraciju transfektanta (tj. gena od interesa). Podrazumeva se da selektabilni markerski sistemi mogu pospešiti odabir željenih transfektanata, međutim postupci prema pronalasku daju neočekivano povećanje i efikasnosti i slučajne integracije gena od interesa, kao i pouzdane biološke kvalitete željenog proteina. Kompozicije i postupci pronalaska tako omogućavaju povoljan izbor kvalitativno povoljnih post-translacionih modifikacija za eksprimovane proteine.

[0009] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovanu ćeliju koja sadrži: (a) gen za rezistenciju na tunikamicin (Tn) sisara koji kodira protein koji je najmanje 93% identičan sa sekvencom amino-kiseline SEQ ID NO: 3, gde se gen za rezistenciju na Tn egzogeno dodaje ćeliji; (b) prvi gen od interesa (GOI), gde je prvi GOI egzogeno dodat GOI; i (c) najmanje jedan regulatorni element, pri čemu je gen za rezistenciju na Tn operativno povezan sa prvim GOI i najmanje jednim regulatornim elementom, pri čemu je ćelija ćelija sisara, i pri čemu prvi GOI kodira laki lanac antitela ili njegov fragment koji vezuje antigen, teški lanac antitela ili njegov fragment koji vezuje antigen, ili Fc-fuzioni protein ili njegov fragment.

[0010] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu, pri čemu nukleinska kiselina sadrži gen za rezistenciju na tunikamicin (Tn) sisara koji kodira protein koji je najmanje 93% identičan sekvenci amino-kiselina SEQ ID NO: 3, prvi gen od interesa (GOI) operativno povezan sa genom za rezistenciju na Tn i najmanje jednim regulatornim elementom, i pri čemu prvi GOI kodira laki lanac antitela ili njegov fragment koji vezuje antigen, teški lanac antitela ili njegov fragment koji vezuje antigen, ili Fc-fuzioni protein ili njegov fragment.

[0011] Predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje postupak, koji obuhvata (a) uvođenje vektora koji sadrži nukleinsku kiselinu u populaciju ćelija domaćina sisara transfekcijom, pri čemu nukleinska kiselina sadrži gen za rezistenciju na tunikamicin (Tn) sisara koji kodira protein koji je najmanje 93% identičan sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO: 3, prvi gen od interesa (GOI) koji je operativno povezan sa genom za rezistenciju na Tn i najmanje jednim regulatornim elementom; (b) kultivisanje ćelijske populacije iz koraka (a) u prisustvu Tn, čime se dobija ćelijski transfektant koji sadrži nukleinsku kiselinu vektora.

[0012] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje postupak za proizvodnju rekombinantnog proteina od interesa (POI), pri čemu postupak obuhvata: (a) obezbeđivanje ćelije domaćina sisara koja sadrži: (i) gen za rezistenciju na tunikamicin (Tn) sisara koji kodira protein koji je najmanje 93% identičan sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO: 3, gde je gen za rezistenciju na Tn ekzogeno dodat ćeliji; (ii) prvi gen od interesa (GOI), gde je prvi GOI egzogeno dodan GOI; i (iii) najmanje jedan regulatorni element, pri čemu je gen otporan na Tn operativno vezan za prvi GOI i najmanje jedan regulatorni element; i (b) kultivisanje ćelije u prisustvu Tn da eksprimuje POI iz GOI. Takođe je ovde opisana izolovana ćelija koja sadrži gen za rezistenciju na tunikamicin (Tn) sisara, koji je najmanje 93% identičan sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO:3, operativno povezan sa genom od interesa (GOI) i najmanje jednim regulatornim elementom.

[0013] Ovde je dalje opisan postupak za proizvodnju rekombinantnog proteina od interesa (POI), pri čemu postupak obuhvata: obezbeđivanje ćelije domaćina sisara koja kodira molekul nukleinske kiseline koji sadrži (i) gen za rezistenciju na tunikamicin (Tn) sisara i (ii) gen koji kodira POI; kultivisanje ćelije u prisustvu prve koncentracije Tn; izolovanje ćelijske populacije koja eksprimuje najmanje jednu kopiju gena za rezistenciju na Tn; kultivisanje ćelijske populacije u prisustvu rastućih koncentracija Tn, pri čemu povećanje koncentracije Tn povećava proizvodnju POI; i izolovanje POI iz ćelijske kulture.

[0014] Ovde je, takođe, opisan postupak glikozilovanja supstrata proteina N-glikana, pri čemu postupak obuhvata: obezbeđivanje ćelije domaćina sisara koja kodira molekul nukleinske kiseline koji sadrži gen za rezistenciju na Tn sisara koji je operativno povezan sa genom koji kodira proteinski supstrat kome je potrebna glikozilacija; kultivisanje ćelije u prisustvu prve koncentracije Tn; izolovanje ćelijske populacije koja eksprimuje najmanje jednu kopiju gena za rezistenciju na Tn; kultivisanje ćelijske populacije u prisustvu rastućih koncentracija Tn, pri čemu povećanje koncentracije Tn povećava proizvodnju POI; i izolovanje proteinskog supstrata iz ćelijske kulture.

[0015] U nekim ovde opisanim postupcima, gen za rezistenciju na Tn operativno je povezan sa genom koji kodira POI, a gen koji kodira POI operativno je povezan sa najmanje jednim regulatornim elementom.

[0016] Prema predmetnom pronalasku, gen za rezistenciju na Tn se egzogeno dodaje ćeliji. Prema predmetnom pronalasku, gen za rezistenciju na Tn kodira protein koji je najmanje 93% identitičan sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO:3. U drugim realizacijama, gen za rezistenciju na Tn kodira protein koji je najmanje 94% identitičan sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO:3. Ovde opisan gen za rezistenciju na Tn može kodirati protein koji je najmanje 93% identitičan sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO:4. Ovde opisan gen za rezistenciju na Tn može kodirati protein koji je najmanje 94% identitičan sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO:4.

[0017] U nekim realizacijama, gen za rezistenciju na Tn sisara sadrži gen za rezistenciju na Tn kineskog hrčka (Cricetulus griseus). U drugim realizacijama, gen za rezistenciju na Tn sisara sadrži humani gen za rezistenciju na Tn.

[0018] Gen za rezistenciju na Tn može, takođe, da sadrži sekvencu nukleinske kiseline odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 i SEQ ID NO:17.

[0019] U određenim realizacijama gore pomenutih pronalazaka, gen za rezistenciju na Tn sisara sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 92% identična sekvenci nukleinske kiseline SEQ ID NO:2. U nekim realizacijama, gen za rezistenciju na Tn sisara sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 92% identična sekvenci nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 12.

[0020] Najmanje jedan regulatorni element koji je operativno povezan sa genom za rezistenciju na Tn je obezbeđen u izolovanoj ćeliji pronalaska, pri čemu regulatorni element uključuje, ali nije ograničen na promotor, mesto vezivanja ribozoma i pojačivač. U još jednoj realizaciji, GOI je operativno povezan sa promotorom. U još jednoj realizaciji, GOI je operativno povezan sa mestom vezivanja ribozoma, kao što je IRES.

[0021] U nekim realizacijama, izolovana ćelija, vektor i postupci pronalaska dalje sadrže drugi egzogeno dodat gen od interesa (GOI). U nekim realizacijama, drugi GOI kodira glikoprotein koji je opciono izabran iz lakog lanca antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, teškog lanca antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, Fc-fuzionog proteina ili njegovog fragmenta, liganda i receptora ili njegovog fragmenta koji vezuje ligand. U još jednoj realizaciji, egzogeno dodat GOI je humani gen. U još jednoj realizaciji, regulatorni element je egzogeno dodat regulatorni element.

[0022] U izolovanoj ćeliji predmetnog pronalaska i vektoru predmetnog pronalaska, prvi GOI kodira laki lanac antitela ili njegov fragment koji vezuje antigen, teški lanac antitela ili njegov fragment koji vezuje antigen, ili Fc-fuzioni protein ili njegov fragment.

[0023] U nekim realizacijama postupka predmetnog pronalaska, prvi GOI kodira glikoprotein koji je opciono izabran iz lakog lanca antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, teškog lanca antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, Fc-fuzionog proteina ili njegovog fragmenta, liganda i receptora ili njegovog fragmenta koji vezuje ligand.

[0024] Prvi i/ili drugi ovde opisani GOI mogu kodirati POI, uključujući, ali ne ograničavajući se na, teški lanac antitela, laki lanac antitela, fragment koji vezuje antigen i/ili Fc-fuzioni protein.

[0025] Prvi GOI i drugi GOI ovde opisani mogu se nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od gena koji kodira laki lanac antitela ili njegov fragment specifičan za antigen, teški lanac antitela ili njegov fragment specifičan za antigen, Fc-fuzioni protein ili njegov fragment i receptora ili njegovog fragmenta specifičnog za ligand. U jednoj realizaciji, mesto prepoznavanja rekombinaze je prisutno između prvog GOI i drugog GOI. U drugim realizacijama, mesto 5’ za prepoznavanje rekombinaze je obezbeđeno za prvi GOI i mesto 3’ za prepoznavanje rekombinaze u odnosu na drugi GOI.

[0026] U još jednoj realizaciji postupaka predmetnog pronalaska, GOI kodira glikoprotein izabran iz lakog lanca antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, teškog lanca antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, Fc-fuzionog proteina ili njegovog fragmenta, liganda i receptora ili njegovog fragmenta koji vezuje ligand.

[0027] Ovde opisane izolovane ćelije koje se ne pojavljuju u prirodi mogu biti izvedene iz eukariotske ćelije. Izolovana ćelija predmetnog pronalaska je ćelija sisara. U nekim realizacijama, izolovana ćelija je ex vivo humana ćelija. U drugim realizacijama, ćelija se bira iz grupe koju čine CHO (npr. CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (npr. COS-7), limfocit, matična ćelija, ćelija mrežnjače, Vero, CV1, bubrega (npr. HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60 Jurkat, Daudi, A431 (epidermalni), CV-1, U937, 3T3, L ćelija, C127 ćelija, SP2/0, NS-0, MMT ćelija, tumorska ćelija i ćelijska linija izvedena iz gore pomenute ćelije. U određenim realizacijama, izolovana ćelija pronalaska je CHO-K1 ćelija, limfocit, ćelija mrežnjače ili matična ćelija.

[0028] U jednoj realizaciji, prva koncentracija Tn je 1 µg/mL. U još jednoj realizaciji, rastuće koncentracije Tn obuhvataju drugu i treću koncentraciju Tn.

[0029] U nekim realizacijama, druga koncentracija je veća od prve koncentracije Tn, a treća koncentracija je veća od druge koncentracije Tn. U određenim realizacijama, druga koncentracija Tn je 2,5 µg/ml, a treća koncentracija 5 µg/ml.

[0030] U još nekim realizacijama, rastuće koncentracije Tn obuhvataju drugu koncentraciju Tn, pri čemu je druga koncentracija Tn 2,5 µg/ml ili 5 µg/ml.

[0031] Bilo koji od aspekata i realizacija pronalaska može se koristiti zajedno sa bilo kojim drugim aspektom ili realizacijom pronalaska, osim ako nije drugačije naznačeno ili očigledno iz konteksta.

[0032] Ostali ciljevi i prednosti postaće očigledni iz pregleda sledećeg detaljnog opisa.

KRATAK OPIS SLIKA

[0033]

Slika 1 prikazuje shematski dijagram operativne ekspresione kasete u konstruktu vektora kloniranja, koja se koristi za uvođenje sekvence nukleinske kiseline koja kodira gen od interesa, na primer eGFP, u ćelijski genom. SV40 Promotor: Simian virus 40 Promotor; GPT: GlcNAc-1-P transferaza (npr. CHO-GPT, SEQ ID NO:2; ili hGPT, SEQ ID NO: 12); IRES: unutrašnje ribosomsko mesto ulaska; eGFP: poboljšani zeleni fluorescentni protein; SV40polyA: Simian virus 40 polyA.

Slike 2A do 2C predstavljaju poravnanje GPT sekvenci amino-kiselina sisara, naime humanih GPT_HUMAN; UniProtKB Accn. No. Q9H3H5; SEQ ID NO:4), rezus makakija (GPT_MACMU; UniProtKB Accn. No. F6TXM3; SEQ ID NO:5), šimpanze (GPT_PANTR; UniProtKB Accn. No. H2R346; SEQ ID NO:6), psa (GPT_CANFA; UniProtKB Accn. No. E2RQ47; SEQ ID NO:7), zamorčeta (GPT_CAVPO; UniProtKB Accn. No. E2RQ47; SEQ ID NO:8), pacova (GPT_RAT; UniProtKB Accn. No. Q6P4Z8; SEQ ID NO:9), i miša (GPT_MOUSE; UniProtKB Accn. No. P42867; SEQ ID NO:10) u poređenju sa GPT sekvencama amino-kiselina kineskog hrčka (GPT_CRIGR; UniProtKB Accn. No. P24140; SEQ ID NO:3).

Slike 3A i 3B prikazuju primerom kako se optimizacija proteina može postići korišćenjem postupaka i kompozicija prema pronalasku. Slika 3A prikazuje postupak odabira pozitivnog ćelijskog transfektanta iz prvog ćelijskog bazena uzgajanog sa 1 µg/mL tunikamicina (Tn). Posle toga, druga ćelijska kultura sa povećanom koncentracijom tunikamicina, npr.2,5 µg/mL ili 5 µg/mL, za pojačavanje ekspresije proteina. Slika 3B: prikazuje postupak odabira pozitivnog ćelijskog transfektanta iz prvog ćelijskog bazena uzgajanog sa 1 µg/mL tunikamicina (Tn), a zatim serijsko povećavanje koncentracije Tn u naknadnim ćelijskim kulturama kako bi se optimizovala ekspresija proteina.

Slike 4A do 4B prikazuju dijagrame rasejanja koji predstavljaju različite parametre selektivnosti higromicina. Modifikovane CHO ćelije sadrže YFP gen okružen lox mestima. Selekcioni markeri (gen za rezistenciju na antibiotike i eGFP) okruženi lox mestima ugrađuju se na YFP mesto i zamenjuju YFP ciljanom integracijom sa Cre rekombinazom. Slučajni integrati eksprimuju i YFP i eGFP Slika 4A: Ćelije se transfektuju vektorom Cre rekombinaze i ekspresionim hpt vektorom koji sadrži eGFP; ali uzgajano bez higromicina u kulturi. Slika 4B: Ćelije se transfektuju vektorom Cre rekombinaze i ekspresionim hpt vektorom koji sadrži eGFP; u prisustvu 400 µg/mL higromicina.

Slike 5A do 5F prikazuju FACS dijagrame rasejanja koji predstavljaju različite parametre selektivnosti tunikamicina (Tn). Modifikovane CHO ćelije sadrže YFP gen okružen lox mestima. Selekcioni markeri (gen za rezistenciju na antibiotike i eGFP) okruženi lox mestima ugrađuju se na YFP mesto i zamenjuju YFP ciljanom integracijom sa Cre rekombinazom. Slučajni integrati eksprimuju i YFP i eGFP Slika 5A: Ćelije su transfektovane sa vektorom Cre rekombinaze i CHO-GPT ekspresionim vektorom koji sadrži eGFP; ali bez tunikamicina u kulturi. Slika 5B: Ćelije su transfektovane sa vektorom Cre rekombinaze i CHO-GPT ekspresionim vektorom koji sadrži eGFP; u prisustvu 1 µg/mL Tn. Slika 5C: Ćelije su transfektovane sa vektorom Cre rekombinaznim i CHO-GPT ekspresionim vektorom koji sadrži eGFP; u prisustvu 2,5 µg/mL Tn. Slika 5D: Ćelije su transfektovane sa vektorom Cre rekombinaze i humanim GPT ekspresionim vektorom koji sadrži eGFP; ali bez tunikamicina u kulturi. Slika 5E: Ćelije su transfektovane sa vektorom Cre rekombinaze i humanim GPT ekspresionim vektorom koji sadrži eGFP; u prisustvu 1 µg/mL Tn. Slika 5F: Ćelije su transfektovane sa vektorom Cre rekombinaze i humanim GPT ekspresionim vektorom koji sadrži eGFP; u prisustvu 2,5 µg/mL Tn.

Slike 6A i 6B pokazuju GPT ekspresione ćelijske pulove u poređenju sa ne-GPT ekspresionim pulovima u njihovoj relativnoj sposobnosti da pojačaju ekspresiju operativno vezanog GOI, kao što je eGFP. Slika 6A: prikazuje relativni broj genskih kopija CHO-GPT mereno PCR-om za ćelijske pulove kako sledi: Pul-49 ćelije (bez dodavanja egzogenog GPT-a) bez selekcije Tn; Pul-49 ćelije (bez egzogenog GPT-a) sa 5 µg Tn selekcije; Pul-1 ćelije prirodno eksprimuju veće količine GPT (podaci nisu prikazani) i testiraju se bez selekcije Tn; Pul-78 ćelije (bez egzogenih GPT) bez selekcije Tn; CHO ćelije koje eksprimuju egzogeno dodat hpt i 400 µg/mL selekcije higromicina; CHO ćelije koje eksprimuju egzogeni GPT pod uslovima selekcije Tn od 1 µg/mL; CHO ćelije koje eksprimuju egzogeni GPT izabrane iz 1 µg/mL Tn selekcionog bazena dalje uzgajanog u 1 µg/mL Tn; CHO ćelije koje eksprimuju egzogeni GPT izabrane iz 1 µg/mL Tn selekcionog bazena dalje uzgajanog u 2,5 µg/mL Tn; CHO ćelije koje eksprimuju egzogeni GPT izabrane iz 1 µg/mL Tn selekcionog bazena dalje uzgajanog u 5 µg/mL Tn. Slika 6B: prikazuje relativni broj genskih kopija gena od interesa, eGFP, mereno qPCR-om za iste ćelijske pulove (kao slika 6A).

Slike 7A do 7D prikazuju glikoformne karakteristike Fc-fuzionog proteina 1 (FcFP1) proizvedenog iz ćelijske kulture kako sledi, Slika 7A: CHO ćelije koje ne eksprimuju GPT koristeći standardni protokol (Lot B10002M410), u poređenju sa Slikom 7B: CHO ćelije koje eksprimuju CHO-GPT i nemaju selekciju Tn (Lot 110728). Slika 7C: CHO ćelije koje eksprimuju CHO-GPT i izabrane sa 1 µg/mL Tn (Lot 110728-01), u poređenju sa Sliku 7D: CHO ćelije koje eksprimuju CHO-GPT i odabrane sa 5 µg/mL Tn (Lot 110728-02). Svaki hromatogram ukazuje na frakcije koje sadrže sijalilirane ostatke kako sledi: OSA = nula ostataka sijalinske kiseline; 1SA = jedan ostatak sijalinske kiseline; 2SA = dva ostatka sijalinske kiseline; 3SA = tri ostatka sijalinske kiseline; 4SA = četiri ostatka sijalinske kiseline.

Slika 8 prikazuje preklapajući profil glikozilacije Fc-fuzionog proteina 1 (FcFP1) uzorkovan iz (A) Lota B10002M410, (B) Lota 110728, (C) Lota 110728-01 i (D) Lota 110728-02. Glikoprofili svakog proteina proizvedenog iz GPT lotova su kompatibilni sa referentnim standardnim proteinima i glavne vrste glikoforma se dosledno proizvode. Očigledno je da u GPT lotovima nisu proizvedene nove i jedinstvene vrste glikoforma u poređenju sa referentnim standardnim proteinom.

DETALJAN OPIS

[0034] Pre opisivanja predmetnih postupaka, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na ovde opisane posebne postupke i eksperimentalne uslove, jer takvi postupci i uslovi mogu varirati. Takođe, treba razumeti da je ovde upotrebljena terminologija samo u svrhu opisivanja određenih realizacija i da nije namenjena ograničavanju, pošto je obim predmetnog pronalaska definisan zavisnimpatentnim zahtevima.

[0035] Kako je upotrebljeno u ovoj specifikaciji i priloženim zahtevima, oblici jednine „a“, „an“ i „the“ (u engleskom jeziku) uključuju množinske reference, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.

Tako, na primer, upućivanje na „postupak“ uključuje jedan ili više postupaka i/ili korake ovde opisane vrste i/ili koji će postati očigledni stručnjacima u tehnici nakon čitanja ovog patenta.

[0036] Ukoliko nije drugačije definisano ili je drugačije naznačeno, svi ovde upotrebljeni tehnički i naučni izrazi imaju isto značenje kako uobičajeno tumače stručnjaci u tehnici kojoj ovaj pronalazak pripada.

[0037] Iako se bilo koji postupak i materijal sličan ili ekvivalentan ovde opisanima mogu koristiti u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska, sada će biti opisani određeni postupci i materijali.

[0038] Različiti geni dobro poznati u tehnici mogu da dodele selektivni fenotip ćelijama sisara u kulturi. Obično, selektivni marker geni eksprimuju proteine, obično enzime koji daju rezistenciju na različite antibiotike u ćelijskoj kulturi. U nekim selektivnim uslovima, ćelije koje eksprimuju flourescentni proteinski marker postaju vidljive i na taj način se mogu izabrati. Primeri u tehnici uključuju betalaktamazu (bla; gen za rezistenciju na beta-laktamski antibiotik ili ampR; gen za rezistenciju na ampicilin), bis (gen acetil-transferaze za rezistenciju na blasticidin), higromicin fosfotransferaza (hpt; gen za rezistenciju na higromicin) i drugi.

[0039] Ovde opisani postupci oslanjaju se na upotrebu tunikamicina i enzima (markera) koji mogu omogućiti ćelijama rezistentnim na tunikamicin da rastu u ćelijskoj kulturi. Tunikamicin (Tn) je smeša antibiotika koji deluju kao inhibitori bakterijskih i eukariotskih N-acetilglukozamin transferaza koje sprečavaju stvaranje intermedijera N-acetilglukozamin lipida i glikozilaciju novosintetisanih glikoproteina. (King, I.A., i Tabiowo, A., 1981, Effect of tunicamycin on epidermal glycoprotein and glycosaminoglycan synthesis in vitro. Biochem. J., 198(2):331-338). Tn je citotoksičan jer specifično inhibira UDP-N-acetilglukozamin: dolikol fosfat N-acetilglukozamin- 1-P transferazu (GPT), enzim koji katalizuje početni korak biosinteze oligosaharida povezanih sa dolikolom. U prisustvu tunikamicina, glikoproteini povezani sa asparaginom napravljeni u endoplazmatičnom retikulumu (ER) nisu glikozilovani sa N-vezanim glikanima, pa se zbog toga možda neće pravilno previti u ER i stoga mogu biti ciljano razgrađeni (Koizumi, et al. 1999, Plant Physiol. 121 (2):353-362). Otuda je Tn značajan induktor rasprostranjenog proteinskog odgovora (UPR) koji dovodi do apoptoze u bakterijskim i eukariotskim ćelijama.

[0040] Gen za uridin difosfat GPT (poznat i kao GlcNAc-1-P transferaza) identifikovan je kao prekomerno eksprimovan u određenim ćelijskim uslovima kako bi se obezbedila rezistentnost na Tn (Criscuolo i Krag, 1982, J Biol Chem, 263(36):19796-19803; Koizumi, et al., 1999, Plant Physiology, Vol.121, pp.353-361). Gen koji kodira GPT, takođe, opisan kao GenBank Accn. Br. M36899 (SEQ ID NO: 2), izolovan je iz ćelijske linije jajnika kineskog hrčka rezistentne na Tn i kodira protein 408 aminokiseline (SEQ ID NO: 3) (Scocca i Krag, 1990, J Biol Chem 265(33):20621-20626; Lehrman, M. et al., 1988, J Biol Chem 263(36): 19796-803). GPT hrčka je prekomerno eksprimovan u ćelijama kvasca (S. pombe) i dodeljuje Tn rezistenciju u ovim ćelijama; takođe pružajući pogodan izvor za prečišćavanje GPT enzima (Scocca JR, et al.1995, Glycobiology, 5(1):129-36). Analizirani su nivoi transkripta GPT u ćelijama hibridoma (B ćelije koje eksprimuju IgG, nasuprot mirnim B ćelijama), dok je primećeno da ćelije koje proizvode IgG ne pokazuju povećane nivoe GPT transkripta ili aktivnosti, ali je primećen mali porast GPT u prelasku iz mirnih u aktivne B ćelije. Zaključeno je da nivoi GPT mogu odgovarati ranom razvoju proliferativnog odgovora na stimulaciju LPS (antigena) u B ćelijama (Crick, D.C. et al, 1994, J Biol Chem 269(14): 10559-65).

[0041] Dalje, ranije nije bilo poznato da li će promena ekspresije GPT, sa ili bez prisustva Tn, u ćelijskom ekspresionom sistemu uticati na glikozilaciju proteinskog proizvoda, pa samim tim i na kvalitet proizvoda. Podrazumeva se da je optimalna i dosledna glikozilacija kritični atribut proteina u proizvodnji terapijskih glikoproteina.

[0042] Ovde je opisan poboljšani postupak za proizvodnju rekombinantnih proteina u ćelijskim sistemima sisara koji koristi gen za rezistenciju na Tn sisara, GPT, kao regulisani selekcioni marker, dok povećani broj kopija gena od interesa operativno povezanih sa GPT korelira sa povećanom nasumičnom integracijom GPT ekspresione kasete u ćeliju.

[0043] Tehnika je prepoznala da se proizvodnja terapijskih proteina, posebno glikoproteina, oslanja na ekspresione sisteme tipa sisarskih koji oponašaju prirodnu glikozilaciju takvih proteina. (Za pregled videti Bork, K. et al, 2009, J Pharm Sci. 98(10):3499-3508.) Na primer, terminalni monosaharid određenih glikoproteina, poput N-vezanih složenih glikana, obično zauzima sijalna kiselina. Sijalilacija može uticati na farmakokinetička svojstva glikoproteina, kao što su apsorpcija, poluživot u serumu i klirens ili na druga fizičko-hemijska ili imunogena svojstva glikoproteina. Prekomerno eksprimovani rekombinantni glikoproteini često imaju nepotpunu ili nedoslednu glikozilaciju. Pouzdane metode su ključne za doslednost procesa i kvalitet terapijskih glikoproteina proizvedenih u ćelijskim linijama sisara.

[0044] Takođe ovde opisan je poboljšani postupak za glikozilaciju rekombinantnih proteina, i.e. postupak za dobijanje glikoproteina u ćelijskim sistemima sisara kako bi se obezbedio konzistentan prinos kvaliteta željenih proteina.

Definicije

[0045] DNK regioni su operativno povezani kada su međusobno funkcionalno povezani. Na primer, promotor je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako je promotor sposoban da učestvuje u transkripciji sekvence; mesto vezivanja ribozoma operativno je povezano sa sekvencom kodiranja ako je postavljeno tako da omogućava translaciju. Generalno, operativno povezani mogu da uključuju, ali ne zahtevaju bliskost. U slučaju sekvenci poput sekretornih lidera, bliskost i pravilno postavljanje u okvir za čitanje su uobičajene karakteristike. Sekvenca za pojačavanje proizvodnje, kao što je promotor, operativno je povezana sa genom od interesa (GOI), gde je funkcionalno povezana sa GOI, na primer gde njegovo prisustvo rezultira povećanom ekspresijom GOI.

[0046] Kao takva, fraza „operativno povezana“, kao što je u kontekstu konstrukata ekspresionog vektora DNK, kontrolna sekvenca, npr. promotor ili operator ili marker, je odgovarajuće postavljen na položaj u odnosu na kodirajuću sekvencu tako da kontrolna sekvenca usmerava ili dozvoljava proizvodnju polipeptida / proteina od interesa koji je kodiran kodirajućom sekvencom. Na primer, tamo

1

gde je selekcioni marker potreban da bi ćelije preživele u određenim uslovima kulture, gen od interesa je operativno povezan sa genom selekcionog markera, jer se ekspresija neće dogoditi bez prisustva operabilnog proteina markera selekcije.

[0047] „Promotor“ kako se ovde koristi označava DNK sekvencu dovoljnu za usmeravanje transkripcije DNK sekvence za koju je operativno povezana, tj. povezana na takav način kako bi se omogućila transkripcija gena od interesa i/ili gena selekcionog markera kada su prisutni odgovarajući signali. Ekspresija gena može se staviti pod kontrolu bilo kog promotora ili pojačivača koji su poznati u tehnici.

[0048] „Ekspresioni vektor“ u kontekstu predmetnog pronalaska može biti bilo koji pogodan vektor, uključujući hromozomske, nehromozomske i sintetičke vektore nukleinske kiseline (sekvenca nukleinske kiseline koja sadrži odgovarajući skup elemenata za kontrolu ekspresije). Primeri takvih vektora uključuju derivate SV40, bakterijske plazmide, DNK fage, bakulovirus, kvasne plazmide, vektore izvedene iz kombinacija plazmida i DNK fage i vektore virusne nukleinske kiseline (RNK ili DNK). U jednoj realizaciji, molekul nukleinske kiseline koji kodira Fc-fuzini protein ili polipeptid sadrži molekul vektora gole DNK ili RNK, uključujući, na primer, linearni ekspresioni element (kao što je opisano u, na primer, Sykes i Johnston, 1997, Nat Biotech 12, 355-59), kompaktni vektor nukleinske kiseline (kao što je opisano u, na primer, US6,077,835 i/ili WO00/70087), ili plazmidni vektor kao pBR322, pUC 19/18, ili pUC 118/119. Takvi vektori nukleinske kiseline i njihova upotreba dobro su poznati u stanju tehnike (videti, na primer, US5,589,466 i US5,973,972).

[0049] Kako se ovde koristi, „operator“ označava sekvencu DNK koja je uvedena u ili blizu gena na takav način da gen može da se reguliše vezivanjem proteina represora za operatora i, kao rezultat, sprečava ili dozvoljava transkripciju GOI, tj. nukleotida koji kodira polipeptid ili protein od interesa.

[0050] Vezna mesta za ribozome uključuju „unutrašnja mesta za ulazak u ribozome“ (IRES) ili mogu sadržati 5’ kapu. Mnoge IRES sekvence su dobro poznate u tehnici. IRES predstavlja sekvencu kontrole translacije, pri čemu se IRES lokacija obično nalazi na 5’ gena od interesa i omogućava translaciju RNK na način nezavisan od kape. Transkribovani IRES mogu direktno da vezuju ribosomske podjedinice tako da je lokacija kodona inicijatora mRNK pravilno orijentisana u ribozomu za translaciju. IRES sekvence se obično nalaze u 5’ UTR mRNK (direktno ushodno od inicijacijskog kodona). IRES funkcionalno zamenjuju potrebu za raznim proteinskim faktorima koji deluju na mehanizme eukariotske translacije.

[0051] Termini „poboljšani“ ili „unapređeni“ kada se koriste za opisivanje ekspresije proteina uključuju povećanje količine i/ili konzistentnosti kvaliteta proteina (tj. genskog proizvoda) proizvedenog ovde opisanim ekspresionim sistemom ili postupcima pronalaska. Kao takvo, ovo uključuje poboljšanje od najmanje oko 1,5 puta do najmanje oko 3 puta poboljšanje u ekspresiji u odnosu na ono što se obično primećuje slučajnom integracijom u genom, na primer, u poređenju sa skupom integranata koji koriste drugi konstrukti selekcionog markera. Kao takvo, višestruko poboljšanje ekspresije primećeno za proteine od interesa upoređuje se sa nivoom ekspresije istog gena, mereno pod suštinski istim uslovima, u odsustvu ekspresione kasete ili ćelije pronalaska koja sadrži GPT gen, ili u prisustvu ekspresione kasete ili ćelije koja sadrži drugačiji selekcioni marker. Poboljšanje eksprimovanja takođe se može meriti dobijenim brojem slučajnih integracionih događaja. Poboljšana efikasnost rekombinacije uključuje poboljšanje sposobnosti rekombinacije lokusa (na primer, korišćenje mesta za prepoznavanje rekombinaze). Poboljšanje se odnosi na merljivu efikasnost slučajne rekombinacije, koja je obično 0,1%. U određenim uslovima, poboljšana efikasnost rekombinacije je oko 10 puta veća od slučajne, ili oko 1%. Ukoliko nije navedeno, pronalazak čija se zaštita traži nije ograničen na određenu efikasnost rekombinacije. Pojačavanje ekspresije takođe se može meriti dobijenim brojem kopija gena mereno kvantitativnom lančanom reakcijom polimeraze (qPCR) ili nekom drugom dobro poznatom tehnikom.

[0052] Poboljšani ili unapređeni proizvod takođe se odnosi na konzistentniji kvalitet, na primer, posttranslacione modifikacije primećene kod ovde opisanog GPT ekspresionog sistema. Konzistentni kvalitet uključuje posedovanje npr. poželjnog profila glikozilacije nakon repliciranja proizvodnih linija. Doslednost u pogledu kvaliteta odnosi se na stepen ujednačenosti i standardizacije, dok se ponovljene proizvodne serije u osnovi ne menjaju. Izračunavanje Z-broja za merenje konzistentnosti podučava se ovde. Druge statističke mere su poznate u tehnici za merenje konzistentnosti.

[0053] Izraz „selektivni pritisak“ je sila ili podsticaj koji se primenjuje na živi organizam (npr. ćeliju) ili sistem (npr. kao što je ekspresioni sistem) koji menja ponašanje i preživljavanje (kao što je npr. sposobnost preživljavanja) živog organizma ili sistema u datoj sredini.

[0054] Izraz „pojačavanje gena“ znači povećanje broja identičnih kopija sekvence gena. Određene ćelijske procese karakteriše stvaranje višestrukih kopija određenog gena ili više gena koji pojačavaju fenotip koji gen daje ćeliji, na primer rezistenciju na antibiotike.

[0055] Tamo gde se koristi fraza „egzogeno dodat gen“ ili „egzogeno dodat GOI“ u odnosu na ekspresionu kasetu, fraza se odnosi na bilo koji gen koji nije prisutan u ćelijskom genomu, kako se nalazi u prirodi, ili dodatnu kopiju gena integrisanu u (različiti lokus unutar) genom. Na primer, „egzogeno dodat gen“ u genomu CHO (npr. selekcioni marker gen) može biti gen hrčka koji se u prirodi ne nalazi unutar određenog CHO lokusa (tj. gen hrčka iz drugog lokusa u genomu hrčka), gen bilo koje druge vrste (npr. humani gen), himerni gen (npr. čovek / miš) ili može biti gen hrčka koji se u prirodi ne nalazi u genomu CHO (tj. gen hrčka koji ima manje od 99,9 % identiteta gena iz drugog lokusa u genomu hrčka), ili bilo kog drugog gena za koji u prirodi nije pronađeno da postoji u prirodnom genomu CHO.

[0056] Slučajni integracioni događaji se razlikuju od ciljanih integracionih događaja, dok umetanje gena u genom ćelije nije specifično za lokaciju u slučajnim integracionim događajima. Primer ciljane integracije je homologna rekombinacija. Slučajna (nehomologna) integracija znači da lokacija (lokus) rezultirajućeg integrata nije poznata ili navedena. Smatra se da se nasumična integracija može dogoditi nehomolognim krajnjim spajanjem (NHEJ), međutim nije ograničena na ovaj postupak.

[0057] Efikasnost selekcije podrazumeva procenat populacije preživelih ćelija koje eksprimuju selekcioni marker i, ako je primenljivo, protein od interesa pod kontrolom selekcionog markera.

[0058] Procenat identiteta, kada se opisuje protein rezistencije na Tn, treba da uključuje homologne sekvence koje prikazuju navedeni identitet duž regiona susedne homologije, ali prisustvo praznina, delecija ili insercija koje nemaju homologa u upoređenoj sekvenci ne uzimaju se u obzir pri izračunavanju procenta identiteta. Objašnjavajući upotrebu „procenta identiteta“ u ovom kontekstu, pozvaće se na sledeće poređenje sekvenci amino-kiselina:

1 MWAFPELPLPLPLLVNLIGSLLGFVATVTLIPAFRSHFIAARLCGQDLNKLSQQQIPESQ 60GPT_MOUSE 1 MWAFPELPL—PLLVNLFGSLLGFVATVTLIPAFRSHFIAARLCGQDLNKLSRQQIPESQ 58GPT_CRIG

[0059] Kako se ovde koristi, utvrđivanje „procenta identiteta“ između gornje sekvence „GPT_CRIG“ (za GPT kineskog hrčka) sa homologom miša („GPT_MOUSE“) ne bi uključivalo poređenje amino-kiseline 10 i 11 hrčaka, jer homolog hrčka nema homolognu sekvencu koju bi mogao upoređivati u poravnanju (tj. GPT miša ima inserciju u toj tački, ili homolog hrčka ima jaz ili deleciju, zavisno od slučaja). Prema tome, u prethodnom poređenju, procenat poređenja identiteta bi se proširio od „MWA“ na kraju 5’ do „ESQ“ na kraju 3’. U tom slučaju, homolog miša se razlikuje samo po tome što ima „R“ na GPT poziciji 51hrčka. Budući da je poređenje preko 58 susednih baza u kontinuiranih 60 baznih parova, sa samo jednom razlikom amino-kiselina (što nije praznina, brisanje ili umetanje), postoji preko 98% identiteta između dve sekvence (hrčka i miša) od GPT pozicija 1 hrčka do GPT pozicije 58 hrčka (jer „procenat identiteta“ ne uključuje penale za praznine, brisanja i umetanja). Iako se gornji primer zasniva na sekvenci amino-kiseline, podrazumeva se da bi se na isti način izračunao procenat identiteta sekvence nukleinske kiseline.

[0060] Izraz „ćelija“ uključuje bilo koju ćeliju koja je pogodna za ekspresiju sekvence rekombinantne nukleinske kiseline. Ćelije uključuju one prokariota i eukariota (jednoćelijske ili višećelijske), bakterijske ćelije (npr. sojeve E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp. itd.), ćelije mikobakterija, gljivične ćelije, ćelije kvasca (npr. S. cerevisiae, S. pombe, P. partoris, P. methanolica, itd.), biljne ćelije, ćelije insekata (npr. SF-9, SF-21, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, Trichoplusia ni, itd.), životinjske ćelije koje nisu humane, humane ćelije ili fuzije ćelija kao što su, na primer, hibridomi ili kvadromi. U nekim realizacijama, ćelija je ćelija čoveka, majmuna, čovekolikog majmuna, hrčka, pacova ili miša. U drugim realizacijama, ćelija je eukariotska i bira se iz sledećih ćelija: CHO (npr. CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (npr. COS-7), ćelije mrežnjače, Vero, CV1, bubrega (npr. HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60 Jurkat, Daudi, A431 (epidermalni), CV-1, U937, 3T3, L ćelija, C127 ćelija, SP2/0, NS-0, MMT ćelija, tumorska ćelija i ćelijska linija izvedena iz gore pomenute ćelije. U nekim realizacijama, ćelija sadrži jedan ili više virusnih gena, npr. ćeliju retine koja eksprimuje virusni gen (npr. ćeliju PER.C6®).

[0061] Fraza „integrisana gustina ćelija“, ili „ICD“ označava gustinu ćelija u medijumu za kulturu koja se uzima kao integral tokom određenog vremenskog perioda, izražena u ćelijskim danima po ml_. U nekim realizacijama, ICD se meri oko dvanaestog dana ćelija u kulturi.

1

[0062] „Glikozilacija“ ili fraza „glikozilovanje proteina“ uključuje stvaranje glikoproteina, dok su oligosaharidi vezani bilo za bočni lanac ostatka asparagina (Asn) (tj. N-vezani) ili ostatak serina (Ser)/treonina (Thr) (tj. O-vezani) proteina. Glikani mogu biti homo- ili heteropolimeri monosaharidnih ostataka, koji mogu biti linearni ili razgranati. Zna se da N-vezana glikozilacija započinje prvenstveno u endoplazmatičnom retikulumu, dok je pokazano da O-vezana glikozilacija započinje bilo u ER ili u Goldžijevom aparatu.

[0063] „N-glikanski protein“ ili „N-glikanski proteinski supstrat“ uključuje proteine koji sadrže ili mogu prihvatiti N-vezane oligosaharide. N-glikani mogu da se sastoje od N-acetil galaktozamina (GalNAc), manoze (Man), fukoze (Fuc), galaktoze (Gal), neuraminske kiseline (NANA) i drugih monosaharida, međutim N-glikani obično imaju zajedničku strukturu jezgra pentasaharida, uključujući: tri manoze i dva šećera N-acetilglukozamina (GIcNAc). Proteini sa uzastopnom sekvencom amino-kiseline (tj. sekvonom) Asn-X-Ser ili Asn-X-Thr, gde je X bilo koja amino-kiselina, osim prolina, mogu da obezbede mesto vezivanja za N-glikane.

Opšti opis

[0064] Pronalazak se barem delimično zasniva na otkriću da se pod određenim uslovima mogu stvoriti rekombinantni proteini u ćeliji u kojoj je gen koji kodira protein operativno povezan sa genom za rezistenciju na Tn, GPT i odabir ćelije koja proizvodi proteine je formatiran tako da povećava slučajne integracione događaje u ćelijskom genomu i tako povećava broj kopija gena od interesa i na kraju proizvodnju proteina.

[0065] Pronalazak se, takođe, zasniva barem delimično na otkriću da ćelija koja proizvodi proteine može biti optimizovana da eksprimuje proteine sa doslednim i pouzdanim post-translacionim modifikacijama. GPT ekspresione kasete, takođe, mogu da se integrišu u ćelijski genom, kao u ekspresione konstrukte, kao što su ekspresioni vektori, koristeći različite tehnike za uređivanje gena poznate u tehnici. Ekspresioni vektori koji sadrže GPT mogu se integrisati u genom slučajnom ili ciljanom rekombinacijom, poput homologne rekombinacije ili rekombinacije posredovane rekombinazama koje prepoznaju specifična mesta rekombinacije (npr. rekombinacija posredovana sa Cre-lox).

[0066] Homologna rekombinacija u eukariotskim ćelijama može se olakšati uvođenjem prekida u hromozomskoj DNK na mestu integracije. Modelski sistemi su pokazali da se učestalost homologne rekombinacije tokom ciljanja gena povećava ako se dvostruki lanac uvede unutar hromozomske ciljne sekvence. To se može postići ciljanjem određenih nukleaza na određeno mesto integracije. Proteini koji vezuju DNK i prepoznaju sekvence DNK na ciljnom lokusu poznati su u tehnici. Vektori za ciljanje gena se, takođe, koriste za olakšavanje homologne rekombinacije. U odsustvu vektora za ciljanje gena za popravak usmerenu na homologiju, ćelije često zatvaraju dvolančani prekid nehomolognim krajnjim spajanjem (NHEJ) što može dovesti do brisanja ili umetanja više nukleotida na mestu cepanja.

Konstrukcija vektora za ciljanje gena i selekcija nukleaze su u umeću stručnjaka na kojeg se ovaj pronalazak odnosi.

[0067] U nekim primerima, nukleaze cinkovih prstiju (ZFN), koje imaju modularnu strukturu i sadrže pojedinačne domene cinkovih prstiju, prepoznaju određenu 3-nukleotidnu sekvencu u ciljnoj sekvenci (npr. mesto ciljane integracije). Neke realizacije mogu da koriste ZFN sa kombinacijom pojedinačnih domena cinkovih prstiju koji ciljaju više ciljnih sekvenci.

[0068] Efektorske nukleaze (TALEN) slične aktivatoru transkripcije (TAL) mogu se, takođe, koristiti za uređivanje genoma specifičnog za lokaciju. Domen koji vezuje TAL efektorski protein DNK se obično koristi u kombinaciji sa nespecifičnim domenom cepanja restrikcione nukleaze, kao što je Fokl. U nekim realizacijama, fuzioni protein koji sadrži domen koji vezuje TAL efektorski protein DNK i domen cepanja restrikcione nukleaze se koristi za prepoznavanje i cepanje DNK na ciljnoj sekvenci unutar opisanog lokusa (Boch J et al., 2009 Science 326:1509-1512).

[0069] RNK vođene endonukleaze (RGEN) su programibilni alati za genomskog inžinjeringa koji su razvijeni od bakterijskih adaptivnih imunoloških mehanizama. U ovom sistemu - klaster redovno međusobno razdvojenih kratkih palindromskih ponavljanja (CRISPR)/CRISPR-povezanog (Cas) imunog odgovora - protein Cas9 formira endonukleazu specifičnu za sekvencu kada se kompleksuje sa dve RNK, od kojih jedna vodi izbor cilja. RGEN se sastoje od komponenata (Cas9 i tracrRNK) i specifične CRISPR RNK (crRNK) specifične za cilj. I efikasnost cepanja DNK cilja i lokacija mesta cepanja variraju u zavisnosti od položaja susednog motiva protospejsera (PAM), dodatnog zahteva za prepoznavanje cilja (Chen, H. et al, J. Biol. Chem. objavljeno na mreži 14. marta 2014, kao Rukopis M113.539726).

[0070] I dalje su stručnjaku dostupne druge metode homologne rekombinacije, kao što su nukleaze izvedene iz BuD (BuDN) sa preciznim specifičnostima vezivanja DNK (Stella, S. et al. Acta Cryst.2014, D70, 2042-2052). Precizne metode modifikacije genoma se biraju na osnovu dostupnih alata kompatibilnih sa jedinstvenim ciljnim sekvencama unutar genoma, tako da se izbegava narušavanje fenotipa ćelije.

[0071] Omogućene su ćelije i postupci za stabilno integrisanje sekvence nukleinske kiseline (gena od interesa) u ćeliju sisara, pri čemu je sekvenca nukleinske kiseline sposobna za pojačanu ekspresiju zahvaljujući integrisanju sa GPT sekvencom. Kompozicije i postupci su, takođe, obezbeđeni za upotrebu GPT u vezi sa ekspresionim konstruktima, na primer, ekspresionim vektorima, i za dodavanje egzogenog GPT u ćeliju sisara od interesa. Ćelije i postupci su obezbeđeni za upotrebu u doslednom, ali robusnom metodu pravljenja glikoproteina, posebno terapijskih glikoproteina.

Izrada GPT kasete selekcionih markera

[0072] Ovde su obezbeđeni ekspresioni vektori koji sadrže operativnu GPT ekspresionu kasetu. Ekspresiona kaseta sadrži neophodne regulatorne elemente koji omogućavaju i pokreću transkripciju i translaciju GPT sisara i željenog genskog proizvoda.

[0073] Takođe se mogu razviti razne kombinacije ovde opisanih gena i regulatornih sekvenci. Primeri

1

drugih kombinacija odgovarajućih sekvenci koje su ovde opisane i koje se, takođe, mogu razviti uključuju sekvence koje uključuju višestruke kopije ovde otkrivenih gena GPT, ili sekvence izvedene kombinovanjem opisanog GPT sa drugim nukleotidnim sekvencama da bi se postigle optimalne kombinacije regulatornih elemenata. Takve kombinacije mogu biti neprekidno povezane ili raspoređene kako bi se obezbedio optimalan razmak GPT-a orijentisan na gen od interesa i regulatorne elemente.

[0074] Poznato je da homologne sekvence gena koji kodiraju GPT postoje u ćelijama drugih vrsta sisara (kao što su, na primer, ljudi; vidi sliku 2), kao i u ćelijskim linijama koje potiču od drugih tipova tkiva sisara i mogu se izolovati tehnikama koje su dobro poznate u tehnici. Primerna lista sekvenci amino-kiselina GPT sisara data je na slici 2. Promene u nukleotidnoj sekvenci, kao što je optimizacija kodona, mogu se izvršiti na nukleotidnim sekvencama prikazanim u SEQ ID NO:2 i 11-17 kako bi se omogućila optimalna ekspresija odgovarajućih GPT proteina navedenih u SEQ ID NO:3-10. Pored toga, promene se mogu izvršiti u sekvenci amino-kiselina navedenoj u SEQ ID NO:3-10 izmenama nukleotidnih sekvenci koje kodiraju GPT. Takve tehnike koje uključuju, ali se ne ograničavaju na, tehnike usmerene na lokaciju ili slučajne mutageneze su dobro poznate u tehnici.

[0075] Dobijene GPT varijante se zatim mogu testirati na GPT aktivnost kao što je ovde opisano, npr. testirati na rezistenciju na tunikamicin. GPT proteini koji su najmanje oko 93% identični, ili najmanje oko 95% identični, ili najmanje oko 96% identični, ili najmanje oko 97% identični, ili najmanje oko 98% identični sekvenci amino-kiselina SEQ ID NO:3 koja ima GPT aktivnost mogu se izolovati rutinskim eksperimentisanjem i očekuje se da pokazuju istu rezistenciju na Tn, efikasnost selektivnosti i posttranslacione koristi kao SEQ ID NO:3. Shodno tome, homolozi GPT-a sisara i varijante GPT-a takođe su obuhvaćeni realizacijama pronalaska. Slike 2A do 2C pokazuju poravnanje različitih GPT sekvenci amino-kiselina sisara (naime, SEQ ID NO: 3-10). GPT sekvence sisara (nukleinske kiseline i aminokiseline) su očuvane među genomima hrčaka, ljudi, miša i pacova. Tabela 1 identifikuje primerne GPT proteine sisara i njihov stepen homologije.

TABELA 1A: Identitet amino-kiselina GPT homologa

1

TABELA 1B: Identitet nukleinske kiseline reprezentativnih GPT homologa

[0076] Populacije ćelija koje eksprimuju povećane nivoe proteina od interesa mogu se razviti korišćenjem ovde datih GPT/tunikamicin metoda. Apsolutni nivo ekspresije variraće u zavisnosti od specifičnog proteina, u zavisnosti od toga koliko efikasno protein obrađuje ćelija.

[0077] Shodno tome, ovde je opisana nukleotidna sekvenca koja eksprimuje GPT odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:2 i 11-17. Takođe je ovde opisana nukleotidna sekvenca koja eksprimuje GPT koji je najmanje 92% identična, najmanje 93% identična, najmanje 94% identična, najmanje 95% identična, najmanje 96% identična, najmanje 98% identična, ili na najmanje 99% identična nukleotidnoj sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:2 i 11-17.

[0078] Takođe, ovde opisani su vektori koji sadrže SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO: 12. Vektori koji sadrže GPT gen sisara i opcione regulatorne elemente uključuju vektore za prolaznu ili stabilnu transfekciju.

[0079] U jednoj realizaciji, GPT gen se koristi za pojačavanje ekspresije GOI, kao što je prikazano na slici 1. Slika 1 prikazuje GOI koji je operativno povezan sa IRES sekvencom i GPT selekcionim markerom. GPT kaseta dalje uključuje promotorsku sekvencu, npr. SV40 promotor, i poliadenilacione (poli(A)) sekvence, npr. SV40 poli(A).

[0080] Kaseta za povećanje ekspresije (uključujući GPT i ushodni promotor) je optimalno integrisana u ćelijski genom. Koristeći metode iz pronalaska, GOI se eksprimuje u GPT ekspresionoj kaseti pod uslovima kulture na osnovu rastućih koncentracija Tn (slika 3A ili slika 3B). Očitavanje FACS-a, kao što je prikazano na slikama 5B, 5C, 5E i 5F, prikazuje distribuciju ekspresije u stabilno transfektovanoj populaciji ćelija, posebno dramatično povećanje efikasnosti selekcije upotrebom selekcionih markera rezistencije na Tn sisara, CHO-GPT i hGPT. Ekspresija GPT sisara dalje pojačava ekspresiju genskog proizvoda od interesa, na primer, proizvodnju fluorescentnog proteina, eGFP. Uzastopne kulture rastućih koncentracija Tn rezultiraju pojačanom ekspresijom od približno dva puta u poređenju sa GOI ekspresijom u ekspresionom sistemu koji koristi GPT pod uslovima kulture zasnovanim na jednoj koncentraciji Tn, kao što je prikazano na slici 6B.

[0081] Ovde opisana je ćelija sisara koja sadrži takav GPT gen, pri čemu je GPT gen egzogen i integrisan je u ćelijski genom postupcima prema pronalasku. Ćelije koje sadrže takav GPT gen koji ima najmanje jedan egzogeno dodat gen od interesa (GOI) koji je ushodno ili nishodno od GPT gena.

1

[0082] U različitim realizacijama, ekspresija GOI može se poboljšati stavljanjem GOI pod kontrolu GPT selekcionog markera. U drugim realizacijama, slučajni integracioni događaji GOI mogu se poboljšati stavljanjem GOI pod kontrolu GPT selekcionog markera sisara i obezbeđivanjem uslova ćelijske kulture koji sadrže više od 0,5 µg/mL koncentracije Tn. U nekim realizacijama, uslovi ćelijske kulture sadrže veću koncentraciju Tn od 1 µg/mL. Regulatorni element može biti operativno povezan sa GOI, gde eksprimovanje GOI - na odabranoj udaljenosti od GOI i GPT (u smeru 5’ ili 3’) - zadržava sposobnost da pojača eksprimovanje GOI preko, na primer, ekspresije obično uočene usled slučajnog integracionog događaja. U različitim realizacijama, poboljšanje je najmanje oko 1,5 puta do oko 2 puta ili više. Poboljšanje ekspresije u poređenju sa slučajnom integracijom ili slučajnom ekspresijom je oko 1,5 puta ili oko 2 puta ili više.

[0083] U još jednoj realizaciji, ravnomerno glikozilirani proteini mogu se postići korišćenjem postupaka prema pronalasku i ovde opisanih kompozicija. Kao što je prikazano u tabeli 4, GPT/GOI serije rekombinantnih proteina tretirane sa Tn omogućavaju ponovljene serije sa ekvivalentnim profilima glikozilacije. Kao takva, poboljšana ekspresija proteina, kao što su konzistentni profili glikozilacije, može se direktno uporediti izračunavanjem Z-broja kako je ovde opisano. Jednačina Z-broja uzima u obzir relativni broj pikova na hromatogramu koji predstavljaju ostatke sijalne kiseline (SA), kao i relativni oblik i intenzitet svakog vrha. Z-broj zasnovan je na površini koju zauzima svaki vrh i može se koristiti kao mera konzistencije za složene glikoproteine (videti npr. slike 7A-7D, sliku 8 i primer 3, ovde opisane.

[0084] Optimizacija ekspresije proteina se, takođe, može postići za svaki GOI, uključujući, na primer, orijentaciju kasete za ekspresiju ili optimizaciju kodona. Optimizacija proteina se, takođe, može postići promenom inkrementalne koncentracije Tn u metodama ćelijske kulture.

[0085] Rekombinantni vektori ekspresije mogu da sadrže sintetičke ili iz cDNK izvedene fragmente DNK koji kodiraju protein, operativno povezane sa pogodnim transkripcionim i/ili translacionim regulatornim elementom izvedenim iz gena sisara, virusa ili insekata. Takvi regulatorni elementi uključuju transkripcione promotore, pojačivače, sekvence koje kodiraju pogodna ribozomska mesta za vezivanje mRNK i sekvence koje kontrolišu završetak transkripcije i translacije, kako je ovde detaljno opisano. Ekspresioni vektori sisara mogu, takođe, da sadrže netranskribovane elemente kao što je poreklo replikacije, druge 5’ ili 3’ bočne netranskribovane sekvence i 5’ ili 3’ netranslatovane sekvence kao što su mesta doniranja splajsovanja i akceptora. Takođe se mogu ugraditi dodatni selekcioni marker geni (poput fluorescentnih markera) koji olakšavaju prepoznavanje transfektanata.

[0086] Ovde opisan vektor sadrži molekul nukleinske kiseline (ili gen od interesa) koji kodira protein od interesa, uključujući ekspresioni vektor koji sadrži molekule nukleinske kiseline (gene) opisane pri čemu molekul nukleinske kiseline (gen) je operativno povezan sa sekvencom kontrole ekspresije.

[0087] Obezbeđen je vektor koji sadrži gen od interesa (GOI), pri čemu je GOI operativno povezan sa sekvencom kontrole ekspresije pogodnom za ekspresiju u ćeliji domaćina sisara.

[0088] Korisni promotori koji se mogu koristiti u pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, SV40 rani

1

promotorski region, promotor sadržan u 3’ dugom krajnjem ponavljanju Rausovog virusa sarkoma, regulatorne sekvence gena metalotioneina, IE promotor mišjeg ili humanog citomegalovirusa (Gossen et al., (1995) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:5547-5551), 35S RNK promotora virusa mozaika karfiola i promotora fotosintetske enzimske ribuloza bifosfat karboksilaze, elemente promotora iz kvasca ili drugih gljivica kao što su promotor Gal 4, promotor ADC (alkohol dehidrogenaza), promotor PGK (fosfoglicerol kinaza), promotor alkalne fosfataze i sledeće životinjske kontrolne regione transkripcije, koji pokazuju specifičnost tkiva i korišćeni su kod transgenih životinja: elastaza 1; insulin; imunoglobulin; virus tumora mlečne žlezde miša; albumin; a-fetoprotein; a1-antitripsin; β-globin; i miozinski laki lanac-2.

[0089] Ovde opisani molekuli nukleinske kiseline, takođe, mogu biti operativno povezani sa efikasnom poli(A) terminacionom sekvencom, npr. SV40 poli(A), poreklom replikacije za plazmidni proizvod u E. coli i/ili pogodnim mestom za kloniranje (npr. polilinker). Nukleinske kiseline mogu, takođe, sadržati regulativni inducibilni promotor (inducibilan, potiskiv, razvojno regulisan) za razliku od konstitutivnog promotora kao što je CMV IE (stručnjak će prepoznati da su takvi izrazi zapravo deskriptori stepena ekspresije gena pod određenim uslovima).

[0090] Ovde su opisani postupci za proizvodnju proteina od interesa, dok je obezbeđen ekspresioni vektor koji sadrži gen od interesa (GOI). Takvi ekspresioni vektori mogu se koristiti za rekombinantnu proizvodnju bilo kog proteina od interesa. Transkripcione i translacione kontrolne sekvence u ekspresionim vektorima korisnim za transfekciju ćelija kičmenjaka mogu se obezbediti iz virusnih izvora. Na primer, najčešće korišćeni promotori i pojačivači potiču od virusa kao što su poliom, adenovirus 2, simian virus 40 (SV40) i humani citomegalovirus (CMV). Virusni genomski promotori, kontrolne i/ili signalne sekvence mogu se koristiti za podsticanje ekspresije, pod uslovom da su takve kontrolne sekvence kompatibilne sa izabranom ćelijom domaćinom. Takođe se mogu koristiti i nevirusni ćelijski promotori (npr. β-globin i EF-1a promotori), u zavisnosti od tipa ćelije u kojoj treba da se eksprimuje rekombinantni protein.

[0091] DNK sekvence izvedene iz virusnog genoma SV40, na primer, mesta porekla, rani i kasni promotor, pojačivač, spajanje i poliadenilacija SV40 mogu se koristiti za obezbeđivanje drugih genetskih elemenata korisnih za ekspresiju heterologne sekvence DNK. Rani i kasni promotori su posebno korisni, jer se oba lako mogu dobiti od virusa SV40 kao fragment koji, takođe, uključuje virusno poreklo SV40 za replikaciju (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Takođe se mogu koristiti manji ili veći fragmenti SV40. Obično je uključena sekvenca od približno 250 bp koja se proteže od mesta Hind III ka mestu Bgll koje se nalazi u SV40 poreklu replikacije.

[0092] Bicistronski vektori ekspresije koji se koriste za ekspresiju višestrukih transkripata su prethodno opisani (Kim S. K. and Wold B. J., Cell 42:129, 1985; Kaufman et al.1991, supra) i mogu se koristiti u kombinaciji sa GPT ekspresionim sistemom. Druge vrste ekspresionih vektora takođe će biti korisne, na primer, one opisane u SAD pat. br.4,634,665 (Axel et al.) i SAD pat. br.4,656,134 (Ringold et al.).

[0093] Mesto za integraciju, na primer, mesto za prepoznavanje rekombinaze, može da se postavi 5’

1

ili 3’ u sekvencu gena koja kodira POI. Jedan primer pogodne lokacije za integraciju je lokacija lox p. Još jedan primer pogodnog mesta za integraciju su dva mesta za prepoznavanje rekombinaze, na primer, izabrana iz grupe koja se sastoji od lox p lokacije, lox i lox 5511 lokacije.

Kasete za pojačavanje gena i njihovi ekspresioni vektori

[0094] Korisni regulatorni elementi, prethodno opisani ili poznati u tehnici, takođe mogu biti uključeni u konstrukte nukleinske kiseline koji se koriste za transfekciju ćelija sisara. Slika 1 prikazuje operativnu kasetu u GPT vektoru koja dalje sadrži promotorsku sekvencu, IRES sekvencu, gen od interesa i poli(A) sekvencu.

[0095] Ekspresioni vektor u kontekstu ovog pronalaska može biti bilo koji pogodan vektor, uključujući hromozomske, nehromozomske i sintetičke vektore nukleinske kiseline (sekvenca nukleinske kiseline koja sadrži odgovarajući skup ekspresionih upravljačkih elemenata). Primeri takvih vektora uključuju derivate SV40, bakterijske plazmide, DNK fage, bakulovirus, kvasne plazmide, vektore izvedene iz kombinacija plazmida i DNK fage i vektore virusne nukleinske kiseline (RNK ili DNK). U jednoj realizaciji, molekul nukleinske kiseline koji kodira antitela sadrži goli DNK ili RNK vektor, uključujući, na primer, linearni ekspresioni element (kao što je opisano u, na primer, Sykes i Johnston, Nat Biotech 12, 355-59 (1997)), kompaktni vektor nukleinske kiseline (kao što je opisano u, na primer, US 6,077,835 i/ili WO 00/70087), ili plazmidni vektor kao što je pBR322, pUC 19/18 ili pUC 118 /119. Takvi vektori nukleinske kiseline i njihova upotreba dobro su poznati u stanju tehnike (videti, na primer, US 5,589,466 i US 5,973,972).

[0096] Vektor ekspresije može alternativno biti vektor pogodan za eksprimovanje u sistemu kvasca. Može se koristiti bilo koji vektor pogodan za eksprimovanje u sistemu kvasca. Pogodni vektori uključuju, na primer, vektore koji sadrže konstitutivne ili inducibilne promotore poput alfa faktora kvasca, alkoholne oksidaze i PGH (pregledano u: F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing i Wiley InterScience New York (1987), i Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)).

[0097] Ovde opisan vektor sadrži molekul nukleinske kiseline (ili gen od interesa) koji kodira protein od interesa, uključujući ekspresioni vektor koji sadrži molekule nukleinske kiseline (gene) opisane pri čemu molekul nukleinske kiseline (gen) je operativno povezan sa sekvencom za kontrolu ekspresije pogodnom za ekspresiju u ćeliji domaćina.

[0098] Sekvence za kontrolu ekspresije su napravljene da kontrolišu i pokreću transkripciju gena od interesa i naknadnu ekspresiju proteina u različitim ćelijskim sistemima. Plazmidi kombinuju ekspresibilni gen od interesa sa sekvencama za kontrolu ekspresije (tj. ekspresionim kasetama) koje sadrže poželjne regulatorne elemente kao što su, na primer, promotori, pojačivači, selekcioni markeri, operatori, itd. U ovde opisanom ekspresionom vektoru, GPT i proteini od interesa, poput molekula nukleinske kiseline koji kodiraju antitela, mogu sadržati ili biti povezani sa bilo kojim pogodnim

2

promotorom, pojačivačem, operatorom, proteinskim represorom, poli(A) završnim sekvencama i drugim ekspresionim olakšavajućim elementima.

[0099] Ekspresija gena od interesa, kao što je nukleotidna sekvenca koja kodira antitela, može se staviti pod kontrolu bilo kog elementa promotora ili pojačivača koji su poznati u tehnici. Primeri takvih elemenata uključuju promotore jake ekspresije (npr. humani CMV IE promotor / pojačivač ili CMV glavni IE (CMV-MIE) promotor, kao i RSV, SV40 kasni promotor, SL3-3, MMTV, ubikvitin (Ubi), ubikvitin C (UbC) i HIV LTR promotori).

[0100] U nekim realizacijama, vektor sadrži promotor izabran iz grupe koju čine SV40, CMV, CMV-IE, CMV-MIE, RSV, SL3-3, MMTV, Ubi, UbC i HIV LTR.

[0101] Ovde opisani molekuli nukleinske kiseline, takođe, mogu biti operativno povezani sa efikasnom poli(A) terminacionom sekvencom, poreklom replikacije plazmidnog proizvoda u E. coli, genom rezistencije na antibiotike kao selektivnim markerom, i/ili pogodnim mestom za kloniranje (npr. polilinkerom). Nukleinske kiseline mogu, takođe, sadržati regulativni inducibilni promotor (inducibilan, potiskiv, razvojno regulisan) za razliku od konstitutivnog promotora kao što je CMV IE (stručnjak će prepoznati da su takvi izrazi zapravo deskriptori stepena ekspresije gena pod određenim uslovima).

[0102] Markeri koji se mogu izabrati su elementi dobro poznati u tehnici. U nekim okolnostima, dodatni markeri se mogu izabrati, pored GPT, pri čemu takvi markeri čine ćelije vidljivim. Može se koristiti pozitivna ili negativna selekcija.

[0103] U nekim realizacijama, vektor sadrži jedan ili više selekcionih marker gena koji kodiraju zeleni fluorescentni protein (GFP), pojačani zeleni fluorescentni protein (eGFP), cijano fluorescentni protein (CFP), poboljšani cijano fluorescentni protein (eCFP), žuti fluorescentni protein (YFP) ili pojačani žuti fluorescentni protein (eYFP).

[0104] Za potrebe ovog pronalaska, ekspresija gena u eukariotskim ćelijama može se strogo regulisati upotrebom jakog promotora kojim upravlja operator koji je zauzvrat regulisan regulatornim fuzionim proteinom (RFP). RFP se u osnovi sastoji od domena koji blokira transkripciju i domena koji veže ligand koji reguliše njegovu aktivnost. Primeri takvih ekspresionih sistema opisani su u US20090162901A1.

[0105] Brojni operatori u prokariotskim ćelijama i bakteriofagama su dobro okarakterisani (Neidhardt, ed. Escherichia coli and Salmonella; Cellular and Molecular Biology 2d. Vol 2 ASM Press, Washington D.C.1996). Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, operativni region LexA gena E. coli, koji vezuje peptid LexA i operatore laktoze i triptofana, koji vezuju proteine represora kodirane genima Lacl i trpRE. coli. Tu, takođe, spadaju operatori bakteriofaga iz gena lambda PRi faga P22 ant/mnt koji vezuju proteine represora kodirane sa lambda cl i P22 arc. U nekim realizacijama, kada je domen koji blokira transkripciju proteina represora restrikcioni enzim, kao što je Notl, operator je sekvenca prepoznavanja za taj enzim. Stručnjak u tehnici prepoznaće da se operator mora nalaziti u blizini ili 3' promotora, tako da promotor može da kontroliše transkripciju. Na primer, SAD pat. br. 5,972,650, precizira da se sekvence tetO nalaze na određenoj udaljenosti od TATA okvira. U specifičnim realizacijama, operator je poželjno smešten odmah nishodno od promotora. U drugim realizacijama, operator je smešten u 10 osnovnih parova promotora.

[0106] U određenim realizacijama, operator se bira iz grupe koju čine tet operator (tetO), Notl sekvenca prepoznavanja, LexA operator, operator laktoze, operator triptofana i operator Arc (AO). U nekim realizacijama, protein represora je izabran iz grupe koju čine TetR, LexA, Lacl, TrpR, Arc, LambdaCI i GAL4. U drugim realizacijama, domen za blokiranje transkripcije je izveden iz eukariotskog represora proteina, npr. represora domena izvedenog iz GAL4.

[0107] U primernom ekspresionom ćelijskom sistemu, ćelije su projektovane da eksprimuju protein proteina represora tetraciklina (TetR) i protein od interesa stavlja se pod transkripcionu kontrolu promotora čija aktivnost je regulisana TetR-om. Dva tandemska TetR operatora (tetO) postavljaju se neposredno nishodno od CMV-MIE promotora / pojačivača u vektoru. Transkripcija gena koji kodira protein od interesa u režiji promotora CMV-MIE u takvom vektoru može biti blokirana TetR-om u odsustvu tetraciklina ili nekog drugog pogodnog induktora (npr. doksiciklina). U prisustvu induktora, TetR protein nije sposoban da veže tetO, otuda dolazi do transkripcije i translacije (ekspresije) proteina od interesa. (Videti, npr. SAD Patent br.7,435,553.)

[0108] Još jedan primerni ekspresioni ćelijski sistem uključuje regulatorne fuzione proteine kao što je TetR-ERLBDT2 fuzioni protein, u kome je domen za blokiranje transkripcije fuzionog proteina TetR i domen za vezivanje liganda je domen za vezivanje liganda za estrogenski receptor (ERLBD) sa T2 mutacijama (ERLBDT2; Feil et al. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun.237:752-757). Kada su tetO sekvence postavljene nishodno i proksimalno od jakog CMV-MIE promotora, transkripcija nukleotidne sekvence od interesa iz CMV-MIE / tetO promotora blokirana je u prisustvu tamoksifena i deblokirana uklanjanjem tamoksifena. U drugom primeru, upotreba fuzionog proteina Arc2-ERLBDT2, fuzionog proteina koji se sastoji od jednolančanog dimera koji se sastoji od dva Arc proteina povezana linkerom amino kiseline 15 i ERLBDT2 (supra), uključuje operatora Arc (AO), tačnije dva tandemska operatora arc neposredno nishodno od CMV-MIE promotora / pojačivača. Ćelijske linije mogu se regulisati pomoću Arc2-ERLBDT2, pri čemu ćelije koje eksprimuju protein od interesa pokreću se CMV-MIE / ArcO2 promotorom i mogu se indukovati uklanjanjem tamoksifena. (Videti, npr., US 20090162901A1.)

[0109] U nekim realizacijama, vektor pronalaska sadrži CMV-MIE / TetO ili CMV-MIE / AO2 hibridni promotor.

[0110] Vektori pronalaska mogu takođe da koriste Cre-lox alate za tehnologiju rekombinacije kako bi se olakšala replikacija gena od interesa. Strategija Cre-lox zahteva najmanje dve komponente: 1) Cre rekombinazu, enzim koji katalizuje rekombinaciju između dva loxP mesta; i 2) loxP mesta (npr. specifična bp sekvencu 34 bazna para koja se sastoji od 8-bp sekvence jezgra, gde se odvija rekombinacija, i dva bočna 13-bp obrnuta ponavljanja) ili mutantna lox mesta. (Videti, npr. Araki et al. PNAS 92:160-4 (1995); Nagy, A. et al. Genesis 26:99-109 (2000); Araki et al. Nuc Acids Res 30(19):e103 (2002); i US20100291626A1). U drugoj strategiji rekombinacije, FLP rekombinaza izvedena iz kvasca može se koristiti sa konsenzus sekvencom FRT (videti takođe, npr. Dymecki, S. PNAS 93(12): 6191-6196 (1996)).

[0111] U drugom aspektu, gen (tj. nukleotidna sekvenca koja ovde kodira rekombinantni polipeptid) je umetnut ushodno ili nishodno od GPT gena ekspresione kasete i opciono je operativno povezan sa promotorom, pri čemu je gen povezan sa promotorom okružen 5’ prvim mestom za prepoznavanje rekombinaze i 3’ drugim mestom za prepoznavanje rekombinaze. Takva mesta za prepoznavanje rekombinaze omogućavaju Cre-posredovanu rekombinaciju u ćeliji domaćina ekspresionog sistema. U nekim slučajevima, drugi gen povezan sa promotorom je nishodno (3’) od prvog gena i okružen 3’ drugim mestom za prepoznavanje rekombinaze. U još nekim drugim slučajevima, drugi gen povezan sa promotorom je okružen 5’ drugim mestom rekombinaze, i okružen 3’ trećim mestom prepoznavanja rekombinaze. U nekim realizacijama, mesta za prepoznavanje rekombinaze se biraju između loxP mesta, lox511 mesta, Iox2272 mesta i FRT mesta. U drugim realizacijama, mesta za prepoznavanje rekombinaze su različita. U daljoj realizaciji, ćelija domaćin sadrži gen sposoban da eksprimuje Cre rekombinazu.

[0112] U jednoj realizaciji, vektor sadrži prvi gen koji kodira laki lanac antitela ili teški lanac ovde opisanog antitela, i drugi gen koji kodira laki lanac antitela ili teški lanac ovde opisanog antitela.

[0113] U nekim realizacijama, vektor dalje sadrži gen za protein 1 koji se veže za X-kutiju (mXBP1), sposoban da dodatno pojača proizvodnju proteina / sekreciju proteina kroz kontrolu ekspresije gena uključenih u presavijanje proteina u endoplazmatičnom retikulumu (ER). (Videti, npr. Ron D, and Walter P. Nat Rev Mol Cell Biol.8:519-529 (2007)).

[0114] Bilo koja ćelija je pogodna za ekspresiju ovde opisane sekvence rekombinantne nukleinske kiseline. Ćelije korišćene u pronalasku su ćelije sisara kao što su ne-humane životinjske ćelije, humane ćelije ili ćelijske fuzije kao što su, na primer, hibridomi ili kvadromi. U određenim rešenjima, ćelija je ćelija čoveka, majmuna, hrčka, pacova ili miša. U drugim realizacijama, ćelija je eukariotska i bira se iz sledećih ćelija: CHO (npr. CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (npr. COS-7), ćelije mrežnjače, Vero, CV1, bubrega (npr. HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60 Jurkat, Daudi, A431 (epidermalni), CV-1, U937, 3T3, L ćelija, C127 ćelija, SP2/0, NS-0, MMT ćelija, tumorska ćelija i ćelijska linija izvedena iz gore pomenute ćelije. U nekim realizacijama, ćelija sadrži jedan ili više virusnih gena, npr. ćeliju retine koja eksprimuje virusni gen (npr. ćeliju PER.C6®).

[0115] U još daljoj realizaciji, pronalazak se odnosi na rekombinantnu ćeliju domaćina sisara, kao što je transfektom, koji proizvodi imunoglobulin, poput antitela ili bispecifičnog molekula. Primeri takvih ćelija domaćina uključuju projektovane ćelije sisara kao što su CHO ili HEK ćelije. Na primer, ovde opisana je ćelija koja sadrži nukleinsku kiselinu stabilno integrisanu u ćelijski genom koja sadrži sekvencu koja kodira za ekspresiju antitela koje sadrži ovde rekombinantni polipeptid. U sledećoj realizaciji, ovde opisana je ćelija koja sadrži neintegrisanu (tj. epizomalnu) nukleinsku kiselinu, kao što je plazmid, kozmid, fagemid ili linearni ekspresioni element, koji sadrži sekvencu koja kodira za ekspresiju antitela koje sadrži rekombinantni polipeptid ovde opisano. Dalje opisana ovde je ćelijska linija koja se proizvodi stabilnom transfekcijom ćelije domaćina plazmidom koji sadrži ovde opisani

2

ekspresioni vektor.

[0116] Tako je ovde opisana ćelija koja sadrži (a) rekombinantni polinukleotid koji kodira egzogeno dodat GPT gen sisara i (b) polinukleotid koji kodira protein sa više podjedinica. Egzogeno dodat GPT gen može biti 90% identičan sekvenci nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 2, čiji neograničavajući primeri su dati u SEQ ID NO: 11-17, a protein sa više podjedinica je antitelo. Ovde opisana ćelija, takođe, može da sadrži egzogeno dodati GPT gen i regulatorne elemente. Ovde opisana ćelija može biti ćelija sisara, poput CHO ćelije koja se koristi u proizvodnji biofarmaceutika.

[0117] Ovde dalje opisana je ćelijska linija izvedena iz ćelije opisane u prethodnom aspektu. Pod izrazom „izvedeno iz“ podrazumeva se populacija ćelija koje su klonalno poreklom iz pojedinačne ćelije i imaju neke odabrane kvalitete, poput sposobnosti da proizvode aktivni protein u datom titru ili sposobnosti da se razmnožavaju do određene gustine. Ćelijska linija, koja je izvedena iz ćelije koja sadrži rekombinantni polinukleotid koji kodira GPT gen sisara i polinukleotid koji kodira protein sa više podjedinica, može biti sposobna da proizvede protein sa više podjedinica u titru od najmanje 3 grama po litru medijuma (g/L), najmanje 5 g/L ili najmanje 8 g/L. Ćelijska linija može postići integrisanu ćelijsku gustinu (ICD) koja je najmanje 30% veća, najmanje 50% veća, najmanje 60% veća ili najmanje 90% veća od integrisane gustine ćelija koja se može postići ćelijskom linijom izvedenom iz što je u suštini ista ćelija ali bez rekombinantnog polinukleotida koji kodira GPT.

[0118] Obezbeđen je metod za pojačavanje GOI. Primeri primena primenjuju rastuće koncentracije tunikamicina na eukariotski GPT ekspresioni sistem, čime se pojačava genska kopija GOI operativno povezanog sa egzogeno dodatim GPT genom sisara.

Proteini od interesa

[0119] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira protein od interesa može se pogodno integrisati u ćeliju koja sadrži marker gen za rezistenciju na Tn i IRES, i opciono biti obavijena mestom za prepoznavanje rekombinaze. Može se koristiti bilo koji protein od interesa koji je pogodan za ekspresiju u ćelijama sisara, međutim glikoproteini će posebno imati koristi od metoda prema pronalasku. Na primer, protein od interesa može biti antitelo ili njegov fragment koji veže antigen, bispecifično antitelo ili njegov fragment, himerno antitelo ili njegov fragment, ScFv ili njegov fragment, protein obeležen Fc (npr. Trap protein) ili njegov fragment, faktor rasta ili njegov fragment, citokin ili njegov fragment ili ekstracelularni domen receptora ćelijske površine ili njegov fragment.

[0120] Glikoproteini sa asparaginom vezanim (N-vezanim) glikanima su sveprisutni u eukariotskim ćelijama. Biosinteza ovih glikana i njihov prenos u polipeptide odvija se u endoplazmatičnom retikulumu (ER). N-glikanske strukture su dalje modifikovane određenim brojem glikozidaza i glikozil-transferaza u ER i Goldžijevom kompleksu. Proizvodnja proteina korišćenjem pronalaska usmerena je na konzistentnost nativne strukture N-glikana kako bi se eliminisali imunogeni epitopi („glikotopi“).

[0121] Koristeći metode prema pronalasku, lotovi rekombinantnih proteina pokazuju povoljne karakteristike. HPLC (sa fluorescentnom detekcijom) ponovljenih serija za proizvodnju proteina pokazala je da glikoproteini imaju ujednačenu ekspresiju i obrasce glikozilacije, kao što je prikazano na slikama 7-8 ovde. Obezbeđen je postupak glikozilovanja supstrata N-glikanskog proteina, dok je obezbeđena ćelija domaćina sisara koja kodira molekul nukleinske kiseline koji sadrži gen za rezistenciju na tunikamicin (Tn) sisara koji je operativno povezan sa genom koji kodira proteinski supstrat kome je potrebna glikozilacija; ćelija je kultivisana u prisustvu prve koncentracije Tn; izolovana je ćelijska populacija koja eksprimuje najmanje jednu kopiju gena za rezistenciju na Tn; populacija ćelija se uzgaja u prisustvu rastućih koncentracija Tn; a N-glikanski proteinski supstrat je izolovan iz ćelijske kulture. Sadržaj N-glikana u proteinskom supstratu može se proceniti na prisustvo monosaharida i oligosaharida bilo kojim postupkom poznatim u tehnici.

[0122] Detaljna strukturna analiza proteina povezanih sa glikanom može biti u korelaciji sa funkcionalnim karakteristikama proteina. Takva analiza koja karakteriše glikozilaciju proteina obično uključuje nekoliko koraka: i) enzimatsko ili hemijsko oslobađanje vezanih glikana; ii) derivatizaciju oslobođenih glikana reduktivnom aminacijom aromatičnim ili alifatskim aminima ili permetilacijom; iii) analizu glikana. Mnoge varijacije analize uzoraka glikozilacije poznate su stručnjaku. Glikoproteini mogu da nose nekoliko vrsta glikoforma koji zauzimaju različita mesta u određenim količinama, pa zbog toga njihova složenost može otežati reprodukciju u određenim proizvodnim metodama. Konzistentnost vrste i količine glikoforma je merljiva i predstavlja poželjan ishod za terapijsku proizvodnju proteina.

Ćelije domaćina i transfekcija

[0123] Ćelije domaćina sisara koje se koriste u postupcima prema pronalasku su ćelije sisara, uključujući, npr. CHO ćelije i ćelije miša. Ovde je opisana ćelija koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein markera rezistentnosti na Tn izveden iz Cricetulus griseus (kineskog hrčka) (kako je izloženo u SEQ ID NO:3), ili njegov homolog ili varijantu. U nekim realizacijama, ćelija sadrži više genskih kopija gena markera rezistencije na Tn. Ovde je opisana sekvenca nukleinske kiseline koja kodira protein markera rezistencije na Tn izveden iz čoveka (SEQ ID NO:4), rezus majmuna (SEQ ID NO:5), šimpanze (SEQ ID NO:6), psa (SEQ ID NO:7), zamorčeta (SEQ ID NO:8), pacova (SEQ ID NO:9) ili miša (SEQ ID NO:10).

[0124] Pronalazak uključuje ćeliju domaćina sisara transfektovanu ekspresionim vektorom pronalaska. Transfektovane ćelije domaćina uključuju ćelije koje su transfektovane ekspresionim vektorima koji sadrže sekvencu koja kodira protein ili polipeptid od interesa. Eksprimovani proteini će se obično izlučivati u medijum za kulturu, u zavisnosti od odabrane sekvence nukleinske kiseline, ali mogu se zadržati u ćeliji ili taložiti u ćelijskoj membrani. Za ekspresiju rekombinantnih proteina mogu se koristiti različiti sistemi ćelijskih kultura sisara. Primeri pogodnih ćelijskih linija domaćina sisara uključuju COS-7 linije ćelija bubrega majmuna, koje je opisao Gluzman (1981) Cell 23:175, i druge ćelijske linije

2

sposobne da eksprimuju odgovarajući vektor, uključujući, na primer, CV- 1/EBNA (ATCC CRL 10478), L ćelije, C127, 3T3, CHO, HeLa i BHK ćelijske linije. Druge ćelijske linije razvijene za specifične sheme selekcije ili pojačanja takođe će biti korisne sa ovde datim metodama i kompozicijama. U jednoj realizaciji pronalaska, ćelija je CHO ćelijska linija označena sa K1 (tj. CHO K1 ćelija). Da bi se postigao cilj velike količine proizvodnje rekombinantnih proteina, ćelijska linija domaćina treba da bude unapred prilagođena bioreaktorskom medijumu u odgovarajućem slučaju.

[0125] Nekoliko protokola transfekcije je poznato u tehnici i pregled je dat u Kaufman (1988) Meth. Enzymology 185:537. Odabrani protokol transfekcije zavisiće od tipa ćelije domaćina i prirode GOI i može se odabrati na osnovu rutinskih eksperimenata. Osnovni zahtevi bilo kog takvog protokola su prvo da se DNK koja kodira protein od interesa uvede u odgovarajuću ćeliju domaćina, a zatim da se identifikuju i izoluju ćelije domaćini koji su ugradili heterolognu DNK na relativno stabilan, ekspresibilan način.

[0126] Određeni reagensi korisni za uvođenje heterologne DNK u ćeliju sisara uključuju Lipofectin™ reagens i Lipofectamine™ reagens (Gibco BRL, Gaithersburg, Md.). Oba ova reagensa su komercijalno dostupni reagensi koji se koriste za formiranje kompleksa lipid-nukleinske kiseline (ili lipozoma) koji, kada se primene na kultivisane ćelije, olakšavaju unos nukleinske kiseline u ćelije.

[0127] Odabrani protokol transfekcije i elementi izabrani za upotrebu u njemu će zavisiti od vrste ćelije domaćina koja se koristi. Stručnjaci u tehnici svesni su brojnih različitih protokola i ćelija domaćina i mogu da odaberu odgovarajući sistem za ekspresiju željenog proteina, na osnovu zahteva korišćenog sistema ćelijskih kultura. Ovde je opisan ekspresioni vektor koji kodira polipeptid, uključujući, ali bez ograničenja na, antitelo, bispecifično antitelo, himerno antitelo, ScFv, protein koji vezuje antigen ili Fc fuzioni protein. Takvi ekspresioni vektori mogu se koristiti za rekombinantnu proizvodnju polipeptida primenom postupaka i kompozicija prema pronalasku.

[0128] Ostale karakteristike pronalaska postaće očigledne tokom sledećih opisa primera realizacija koji su dati za ilustraciju pronalaska i čija namera nije da ga ograniče.

PRIMERI

[0129] Sledeći primeri su dati kako bi se opisalo onima koji su prosečni stručnjaci u tehnici kako da naprave i koriste ovde opisane postupke i kompozicije, i nisu namenjeni da ograniče obim onoga što su pronalazači smatrali za svoj pronalazak. Uloženi su napori da se osigura tačnost u odnosu na korišćene brojeve (npr. količina, temperatura, itd.) ali treba uzeti u obzir neke eksperimentalne greške i odstupanja. Ako nije drugačije naznačeno, delovi su težinski delovi, molekulska težina je prosečna molekulska težina, temperatura je u stepenima Celzijusa, a pritisak je na ili blizu atmosferskog.

Primer 1. Efikasnost selekcije transfektovanih ćelija koje eksprimuju GPT.

[0130] Modifikovane CHO K1 ćelije su transfektovane plazmidnim vektorom koji sadrži CHO-GPT

2

(SEQ ID NO: 2), humanim GPT (SEQ ID NO:12) ili plazmidnim vektorom koji sadrži higromicin fosfotransferazu (Hpt, gen rezistentan na higromicin); npr. selekcioni marker gen (CHO-GPT ili hpt) je transkripciono povezan sa nishodnim eGFP genom preko IRES sekvence, u njihovim odgovarajućim vektorima. Na primer, svaki plazmid je konstruisan da sadrži sledeće sekvence gena, u smeru 5’ do 3’: Lox mesto, SV40 kasni promotor, bilo CHO-GPT (ili Hpt), IRES, poboljšani zeleni fluorescentni protein (eGFP), i drugo Lox mesto. Prečišćeni rekombinantni plazmidi su transfektovani zajedno sa plazmidom koji eksprimuje Cre rekombinazu, u modifikovanu CHO ćelijsku liniju domaćina koja sadrži: od 5’ do 3’, mesto lox, YFP i drugo lox mesto, na transkripciono aktivnom lokusu. Shodno tome, ćelija domaćin CHO može se izolovati protočnom citometrijom kao zeleno pozitivna ili žuto negativna ćelija. Kada je rekombinantni plazmid koji eksprimuje eGFP (transkripciono regulisan GPT ili hpt genima) transfektovan zajedno sa plazmidom koji eksprimuje Cre rekombinazu, rekombinacija posredovana Cre rekombinazom rezultira specifičnom lokacijom integracije kasete GPT/eGFP u hromozomskom lokusu koji sadrži lox mesta i dolazi do zamene YFP gena (tj. zelene pozitivne ćelije). Ako se eGFP slučajno integriše, nastaće i zeleno-pozitivne i žuto-pozitivne ćelije.

[0131] Populacije ćelija su ili inkubirane sa 0,1 µg/ml, 2,5 µg/ml ili 5 µg/ml tunikamicina (Tn) ili 400 µg higromicina (Hig), kako je prikazano u tabeli 2. Uočene rekombinantne populacije (ORP) merene su analizom sortiranja ćelija aktiviranim fluorescentom (FACS). Ćelije su sortirane da kvantifikuju svaku populaciju ćelija, a efikasnost selekcije je izračunata za ćelije koje eksprimuju samo GFP, a ne YFP (slike 4 ili 5).

[0132] Efikasnost selekcije (procenat populacije preživelih ćelija koje eksprimuju GFP) upoređena je između ćelijskih pulova rezistentnih na Tn ili Hig (tabela 2).

TABELA 2:Efikasnost selekcije

[0133] Primećeno je da je selekcija tunikamicina efikasna kao i selekcija higromicina. I CHO-GPT i humani GPT bili su efikasni u odabiru integrata u prisustvu 1 ug/ml ili 2,5 ug/ml tunikamicina.

2

Primer 2. Pojačanje genskog proizvoda.

[0134] Inkrementalna selekcija je izvršena primenom sve većih koncentracija tunikamicina na GPT ekspresioni sistem. CHO K1 ćelije su transfektovane plazmidnim vektorom koji sadrži gen CHO-GPT (SEQ ID NO: 2) kao gore. Plazmid sadrži u pravcu 5’ do 3’, prvo Lx mesto, kasni promotor SV40, gen CHO-GPT, IRES, eGFP i drugo Lox mesto. CRE-lox mesta direktno integrišu gen od interesa u genom što rezultira stabilnim pulom transfektanata ćelija sa najmanje jednom insercijom GPT-a po ćeliji. (Može se dogoditi više integranata usled slučajne integracije, kao što je prikazano gore). CHO ćelije su u početku kultivisane u prisustvu 1 µg/ml tunikamicina (Tn). Transfektanti su zatim izabrani iz stabilnog pula (nazvan Cell Pool 2) i potom prošireni u prisustvu 1 µg/ml, 2,5 µg/ml ili 5 µg/ml Tn. Sprovedeni su selekcioni krugovi da bi se identifikovale ćelijske populacije sposobne za pojačanu ekspresiju (više kopija) eGFP. Slučajni slučajevi integracije su se znatno povećali, u prisustvu 2,5 µg/ml ili 5 µg/ml Tn.

[0135] Broj kopija genskog proizvoda, bilo CHO GPT, eGFP ili mGapdh (normalizovana kontrola), izmeren je korišćenjem standardnih qPCR metoda. Broj kopija eGFP-a u ćelijama iz pula rezistentnih na Tn od 1 µg/ml, inkubiranih dalje sa 2,5 µg/ml Tn, bio je najmanje 2 puta veći od broja kopija eGFP-a iz pula rezistentnih na Tn od 1 µg/ml, inkubiranih dalje sa 1 µg/ml Tn. Broj genskih kopija se dodatno povećao kada je pul tretiran sa Tn od 1 µg/ml dalje inkubiran sa 5 µg/ml Tn. Povećanje broja genskih kopija za eGFP korelira sa povećanjem genskih kopija CHO-GPT. (Videti slike 6A i 6B.)

[0136] Da bi se utvrdilo da li se povećanje broja kopija gena prevodi u povećanu ekspresiju proteina, srednji fluorescentni intenzitet (MFI) meren je pomoću FACS za iste ćelijske pulove koji eksprimuju GPT i eGFP koji su tretirani sa višestrukim krugovima selekcije Tn, naime 1, 2,5 ili 5 µg Tn (videti npr. uzorke 7, 8 i 9 na slici 6B). Poređenje ekspresije eGFP za ove ćelijske pulove predstavljeno je u tabeli 3.

[0137] Pul ćelija koji eksprimuje GPT koji je bio podvrgnut drugom krugu selekcije sa 5 5µg Tn rezultirao je nešto većim od 2,5 puta produktivnijim rezultatom u poređenju sa tretmanom od 1µg Tn i 1,5 puta produktivnijeg rezultata u poređenju sa 2,5 µg Tn tretmanom, u odnosu na proizvodnju eGFP (Tabela 3).

TABELA 3: Proizvodnja eGFP proteina

[0138] Bez ograničavanja bilo kojom teorijom, postupno povećanje koncentracije Tn pojačalo je selektivni pritisak na ćelije na kontrolisan način, povećavajući na taj način produktivni rezultat.

[0139] Ekspresioni vektori rezistencije na Tn su, takođe, korišćeni u daljim eksperimentima, opisanim u nastavku, da bi se ispitali efekti Tn selekcije na obrasce glikozilacije.

2

Primer 3. Profil ekspresije i glikozilacije primernog dimernog proteina.

[0140] CHO ćelije koje eksprimuju protein „Trap“ (Fc fuzioni protein-1, u daljem tekstu FcFP1) transfektovane su ekspresionim vektorom koji sadrži GPT. Plazmid ima, u pravcu 5’ do 3’, Lox mesto, SV40 kasni promotor, gen za rezistenciju na Tn (CHO-GPT), IRES eGFP, SV40 poliA i drugo Lox mesto.1 µg/mL Tn ili 5 µg/mL Tn je korišćeno za odabir GPT selekcionog markera. Odabrani pulovi ćelija prošireni su u suspenzijskim kulturama u medijumu za proizvodnju bez seruma. GPT transfekcija potvrđena je ekspresijom eGFP FACS analizom. Peleti prikupljeni iz odabranih pulova poslati su na analizu broja kopija za GPT ekspresiju i postavljen je 12-dnevni test produktivnosti da bi se odredio nivo ekspresije FcFP1 u pulovima odabranim sa različitim koncentracijama tunikamicina.

[0141] FcFP1 je izabran zbog svog složenog obrasca glikozilacije, koji ima obilje mesta glikozilacije. Da bi se utvrdili profili glikozilacije, ćelije koje eksprimuju protein FcF1 proširene su u ćelijskoj kulturi pod standardnim protokolom (bez Tn) ili uslovima tretmana Tn kao što je prikazano u Tabeli 4, zatim je protein izolovan i prečišćen.

TABELA 4: Proizvodnja FcFP1 proteina

[0142] Izvršena je detaljna analiza glikana primenom hromatografije zasnovane na dobro poznatim metodama za HPLC i oznake fluorescentne antranilne kiseline (AA) (Anumula, and Dhume, Glycobiology, 8(7):685-694, 1998), za svaku partiju glikoproteina da bi se utvrdilo da li je Tn imao negativan uticaj na profile glikozilacije. Proizvodne serije (lotovi) su, takođe, upoređene sa referentnim standardom koji predstavlja terapeutski prihvatljivu seriju proteina. Reprezentativna analiza glikana prikazana je na slikama 7A-7D. Svaka serija, u poređenju sa referentnim lotom, dosledno daje isti broj vrhova, relativni oblik i relativni intenzitet. Preklapanje svakog hromatograma (slika 8) ukazuje na to da nisu otkriveni jedinstveni ili neobični vrhovi.

[00143] Profilisanje oligosaharida je izvedeno poznatim HPLC metodama u odnosu na referentni standardni lot za protein FcFP1. Izmereni su nivoi sijalilacije za lotove proteina FcFP1 trap i izračunat je Z-broj za svaki lot (3 replike). Z-broj predstavlja meru varijacije između lotova. Z-broj uzima u obzir relativni broj vrhova, kao i relativni oblik i intenzitet svakog vrha. Na primer, površina svakog vrha 0SA, 1SA, 2SA, 3SA i 4SA na slikama 7A-7D je kvantifikovana kao u tabeli 5.

2

TABELA 5: Kvantitativna analiza oligosaharida

OS = oligosaharid; 0SA = nula ostataka sijalinske kiseline; 1SA = jedan ostatak sijalinske kiseline; 2SA = dva ostatka sijalinske kiseline; 3SA = tri ostatka sijalinske kiseline; 4SA = četiri ostatka sijalinske kiseline

Z Broj = (Area1SA+2*Area2SA+3*Area3SA+4*Area4SA)

(Area0SA+Area1SA+Area2SA+Area3SA+Area4SA)

[00144] Z-broj izračunat za svaki lot je unutar prihvatljivog opsega u poređenju sa referentnim lotom, stoga se podrazumeva da svaki proteinski lot postiže isti materijal kao i terapeutski molekul. S obzirom da je poznato da prisustvo Tn negativno utiče na glikozilaciju N-vezanih glikoproteina, bilo je neočekivano da će proizvodnja proteina biti pouzdana i konzistentna, kao i produktivna, s obzirom na uslove povećanog selekcionog pritiska od Tn.

1

�

�

4

4

4

�

4

�

4

1

2

4

�

�

�

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Izolovana ćelija koja sadrži:

(a) gen za rezistenciju na tunikamicin (Tn) sisara koji kodira protein koji ima najmanje 93% identiteta sa sekvencom amino-kiseline SEQ ID NO: 3, pri čemu je gen za rezistenciju na Tn egzogeno dodat u ćeliju;

(b) prvi gen od interesa (GOI), pri čemu je prvi GOI egzogeno dodat GOI; i

(c) bar jedan regulatorni element,

naznačena time što je gen za rezistenciju na Tn operativno povezan sa prvim GOI i najmanje jednim regulatornim elementom, i što ćelija je ćelija sisara, i što prvi GOI kodira laki lanac antitela ili njegov fragment koji vezuje antigen, teški lanac antitela ili njegov fragment koji vezuje antigen, ili Fc-fuzioni protein ili njegov fragment.

2. Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu, naznačen time što nukleinska kiselina sadrži gen za rezistenciju na tunikamicin (Tn) sisara, koji kodira protein koji ima najmanje 93% identiteta sa sekvencom amino-kiseline SEQ ID NO: 3, prvi gen od interesa (GOI) operativno povezan sa genom za rezistenciju na Tn i najmanje jednim regulatornim elementom, i pri čemu prvi GOI kodira laki lanac antitela ili njegov fragment koji vezuje antigen, teški lanac antitela ili njegov fragment koji vezuje antigen, ili Fc-fuzioni protein ili njegov fragment.

3. Izolovana ćelija prema zahtevu 1 ili vektor prema zahtevu 2, naznačena time što gen za rezistenciju na Tn sadrži sekvencu nukleinske kiseline odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, i SEQ ID NO: 17.

4. Izolovana ćelija prema zahtevu 1 ili vektor prema zahtevu 2, naznačena time što je najmanje jedan regulatorni element izabran iz grupe koja se sastoji od promotora, mesta za vezivanje ribozoma i pojačivača.

5. Izolovana ćelija prema zahtevu 1, ili vektor prema zahtevu 2, naznačena time što je prvi GOI operativno vezan za promotor.

6. Izolovana ćelija prema patentnom zahtevu 1 ili vektor prema patentnom zahtevu 2, koja dalje sadrži drugi egzogeno dodat gen od interesa (GOI), pri čemu opciono drugi GOI kodira glikoprotein i pri čemu je opciono glikoprotein izabran iz lakog lanca antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, teškog lanca antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, ili Fc-fuzionog proteina ili njegovog fragmenta, liganda, i receptora ili njegovog fragmenta koji vezuje ligand.

7. Postupak koji obuhvata

(a) uvođenje vektora koji sadrži nukleinsku kiselinu u populaciju ćelija domaćina sisara transfekcijom, pri čemu nukleinska kiselina sadrži gen za rezistenciju na tunikamicin (Tn) sisara koji kodira protein koji ima najmanje 93% identiteta sa sekvencom amino-kiseline SEQ ID NO: 3, prvi gen od interesa (GOI) koji je operativno povezan sa genom za rezistenciju na Tn, i najmanje jedan regulatorni element;

(b) kultivisanje ćelijske populacije iz koraka (a) u prisustvu Tn, čime se dobija ćelijski transfektant koji sadrži nukleinsku kiselinu vektora.

8. Postupak za proizvodnju rekombinantnog proteina od interesa (POI), pri čemu postupak obuhvata:

(a) obezbeđivanje ćelije domaćina sisara koja sadrži:

(i) gen za rezistenciju na tunikamicin (Tn) sisara koji kodira protein koji ima najmanje 93% sa sekvencom amino-kiseline SEQ ID NO: 3, pri čemu je gen za rezistenciju na Tn egzogeno dodat u ćeliju;

(ii) prvi gen od interesa (GOI), pri čemu je prvi GOI egzogeno dodat GOI; i (iii) najmanje jedan regulatorni element, pri čemu je gen za rezistenciju na tunikamicin (Tn) operativno povezan sa prvim GOI i najmanje jednim regulatornim elementom; i

(b) kultivisanje ćelije u prisustvu Tn radi eksprimovanja POI iz GOI.

9. Postupak prema zahtevu 7 ili 8, naznačen time, što:

(i) gen za rezistenciju na Tn sadrži sekvencu nukleinske kiseline odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, i SEQ ID NO: 17;

(ii) najmanje jedan regulatorni element je izabran iz grupe koju čine promotor, mesto vezivanja ribozoma i pojačivač;

(iii) prvi GOI je operativno povezan sa promotorom; i/ili

(iv) prvi GOI kodira glikoprotein i pri čemu je opciono glikoprotein izabran iz lakog lanca antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, teškog lanca antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, Fc-fuzionog proteina ili njegovog fragmenta, liganda, i receptor ili njegovog fragmenta koji vezuje ligand.

10. Postupak prema zahtevu 7, naznačen time, što vektor dalje sadrži drugi egzogeno dodati gen od interesa (GOI), pri čemu opciono drugi GOI kodira glikoprotein i pri čemu je opciono glikoprotein izabran iz lakog lanca antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, teškog lanca antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, Fc-fuzionog proteina ili njegovog fragmenta, liganda, i receptor ili njegovog fragmenta koji vezuje ligand.

11. Postupak prema zahtevu 8, naznačen time, što ćelija sisara dalje sadrži drugi egzogeno dodati gen od interesa (GOI), pri čemu opciono drugi GOI kodira glikoprotein i pri čemu je opciono glikoprotein izabran iz lakog lanca antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, teškog lanca antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, Fc-fuzionog proteina ili njegovog fragmenta, liganda, i receptor ili njegovog fragmenta koji vezuje ligand.

12. Postupak prema bilo kom od zahteva 7-11, naznačen time, što je Tn u koncentraciji od najmanje 1 µg/ml, poželjno time što je Tn u koncentraciji od 1 µg/ml, 2,5 µg/ml ili 5 µg/ml.

13. Postupak prema zahtevu 7, naznačen time, što se ćelijski transfektant dobija

kultivisanjem ćelijske populacije iz koraka (b) u prisustvu sekvencijalno rastućih koncentracija Tn, ili postupak prema patentnom zahtevu 8, naznačen time, što kultivisanje obuhvata kultivisanje u prisustvu sekvencijalno rastućih koncentracija Tn, pri čemu opciono kultivisanje obuhvata kultivisanje pri prvoj koncentraciji Tn od 1 µg/ml, nakon čega sledi kultivisanje pri drugoj koncentraciji Tn od 2,5 µg/ml ili 5 µg/ml.

14. Postupak prema bilo kom od zahteva 7-11 i 13, koji dalje obuhvata izolovanje POI eksprimovanog iz GOI.

15. Izolovana ćelija prema bilo kom od zahteva 1 i 3-6, ili postupak prema bilo kom od zahteva 7-14, pri čemu je ćelija: (a) izabrana iz grupe koja se sastoji od CHO-K1, COS-7, HEK293, ćelija tumora, limfocita, ćelija mrežnjače i matičnih ćelija; ili (b) CHO-K1 ćelija.