TW201615833A - 重組蛋白之有效選擇性 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供一新穎的表現系統，其包括一提升所欲的糖蛋白後轉譯修飾之哺乳動物可選擇標記。特言之，本發明係包括藉由使用一以哺乳動物來源之GPT基因為基底的選擇標記系統，於哺乳動物細胞中供最佳重組蛋白表現之方法和組成物。本發明包括於哺乳動物細胞中促進重組蛋白之選擇性及增強表現複製和蛋白產率之方法，以及使用GPT表現系統之方法。

Description

重組蛋白之有效選擇性
本發明係提供以一致和有效的方式在哺乳動物細胞中表現重組蛋白。特言之，本發明係包括藉由使用哺乳動物選擇標記於哺乳動物細胞中供提升蛋白表現之方法及組成物。本發明包括於哺乳動物細胞中促進重組蛋白之選擇性和增強表現複製及蛋白產率之方法，以及使用此等表現系統之方法。
細胞表現系統的開發為一提供用於研究和治療用途之可靠和有效關注蛋白來源的重要目標。由於，例如，哺乳動物表現系統對適當地後轉譯修飾重組蛋白之能力，哺乳動物細胞之重組蛋白表現就製造治療性蛋白通常為較佳的。
有各種載體可在哺乳動物宿主中供表現，其各自含有在細胞培養期間能容易分離重組蛋白表現細胞之選擇標記。在此等系統中乃利用可選擇的標記基因(SMG)，因為其係賦予表現關注蛋白之細胞一選擇性利益，然而SMG必須就其表現型中立性、有效性及多變性之理由作最適化。
儘管有許多宿寄SMG之可用的載體和表現系統，但在哺乳動物系統中所獲得的重組蛋白之表現，無論在數量或品質或二者上，常常無法令人滿意。分子的生物「指紋」，例如後轉譯修飾如糖蛋白，在開發 一重組蛋白治療劑中於定義分子的利用和效用上特別重要(Cumming,D.A.,1990,Glycobiology,1(2)：115-130)。對表現的關注蛋白之生物性質不會有負面影響的SMG為特別有利的。
大部分的SMG為細菌性來源，且由於憂心細菌抗生素抗藥性基因對環境細菌之橫向轉移風險，就用於哺乳動物系統中有其他的缺點(Breyer,D.et al.,2014,CriticalReviews in Plant Sciences 33：286-330)。去除使用細菌性抗生素抗藥性基因可能對於消費者接受性及減輕此等可察覺風險，具有正面效應。
基因工程化的自體細胞快速在臨床上獲得成功(參見，例如Kershaw,M.H.et al.,2013,Nature Reviews：Cancer 13：525-541)。選擇和設計用於人類自體細胞產物中的基因修飾之載體為重要的，特別是因為不欲的導入非人類組份至人類自體細胞中可能對病患的安全具有嚴重的後果(Eaker,et al.2013,Stem cells Trans.Med.2：871-883；首先在2013年10月7日發表於線上SCTMEXPRESS)。僅具有哺乳動物來源而非細菌性之組份的載體系統，就用於過繼性免疫治療之病患-特異性T細胞應為有利的。
因此，所欲的係導入哺乳動物選擇性基因，特別是該等在表現系統中給予轉變的細胞一表現性或代謝性利益之基因供製造所指之哺乳動物蛋白。再者，可靠地表現足夠高量的治療蛋白，及適當和一致地修飾此治療蛋白後轉譯之細胞株，為高度所希望的。因此，在本項技術中需要改良的哺乳動物表現系統。
使用哺乳動物衣黴素(tunicamycin)(Tn)抗藥性基因作為哺乳動物表現系統中的可選擇標記可增加轉染子的效率和複製數。已觀察到可操作連接一關注基因之Tn抗藥性基因在哺乳動物細胞的族群上創造選擇性 壓力，因此增加轉染子(亦即關注基因)之隨機整合。請了解，可選擇標記系統可培養所欲轉染子之選擇性，然而本發明之方法給予意料外增加關注基因之效率和隨機整合，以及所欲蛋白之可靠的生物質性。因此本發明之組成物和方法得以對表現蛋白產生品質上良好的後轉譯修飾之有利的選擇性。
在一方面，本發明係提供包括一哺乳動物衣黴素(Tn)-抗藥基因之單離細胞，而該基因係編碼一與SEQ ID NO：3胺基酸序列具有至少93%相同度之蛋白，其可操作連接一關注基因(gene of interest；GOI)及至少一調控元素。
在另外方面，本發明係提供一製造重組的關注蛋白(POI)之方法，其中該方法係包括：提供一編碼核酸分子之哺乳動物宿主細胞，其包括(i)一哺乳動物衣黴素(Tn)-抗藥性基因及(ii)編碼該POI之基因；在一第一Tn濃度的存在下培養此細胞；分離一表現至少一複製的Tn-抗藥基因之細胞族群；在增加的Tn濃度之存在下培養此細胞群族，其中增加Tn的濃度係增加POI產生；及從細胞培養中分離此POI。
又在另外的方面，本發明係提供糖基化一N-聚糖蛋白基質之方法，其中該方法包括：提供一編碼核酸分子之哺乳動物宿主細胞，其包括一可操作連接一編碼糖基化所需的蛋白基質之基因的哺乳動物衣黴素(Tn)-抗藥性基因；在一第一Tn濃度的存在下培養此細胞；分離一表現至少一複製的Tn-抗藥基因之細胞族群；在增加的Tn濃度之存在下培養此細胞群族，其中增加Tn的濃度係增加POI產生；以及從細胞培養中分離此蛋白基質。
在某些此等方法之實施例中，此Tn-抗藥基因可操作連接編碼POI之基因，且該編碼POI之基因可操作連接至少一調控元素。
在某些實施例中，此Tn-抗藥基因係外源上加至細胞。在其 他的實施例中，此Tn-抗藥基因係編碼與SEQ ID NO：3胺基酸序列具有至少93%相同度之蛋白。在其他的實施例中，此Tn-抗藥基因係編碼與SEQ ID NO：3胺基酸序列具有至少94%相同度之蛋白。在某些實施例中，此Tn-抗藥基因係編碼與SEQ ID NO：4胺基酸序列具有至少93%相同度之蛋白。又在其他的實施例中，此Tn-抗藥基因係編碼與SEQ ID NO：4胺基酸序列具有至少94%相同度之蛋白。
在某些實施例中，此哺乳動物的Tn-抗藥基因係包括一中國倉鼠(Cricetulus griseus)Tn-抗藥基因。在其他的實施例中，此哺乳動物Tn-抗藥基因係包括一人類Tn-抗藥基因。
Tn-抗藥基因亦可包括由下列組成之群中選出的核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：17。
在前述發明之特定的實施例中，此哺乳動物Tn-抗藥基因係包括一與SEQ ID NO：2核酸序列具有至少92%相同度之核酸序列。在某些實施例中，此哺乳動物Tn-抗藥基因係包括一與SEQ ID NO：12核酸序列具有至少92%相同度之核酸序列。
在本發明之單離的細胞中係提供至少一可操作連接Tn-抗藥基因之調控元素，其中該調控元素係包括(但不限於)啟動子、核醣體結合位點及增強子。又在另外的實施例中，此GOI可操作連接一啟動子。在另外的實施例中，此GOI可操作連接一核醣體結合位置，例如一IRES。
在某些實施例中，本發明之單離的細胞和方法進一步係包括一第二關注基因(GOI)，而該GOI係編碼此關注蛋白(POI)。在一實施例中，此關注基因(GOI)為一外源上加入的GOI。在另外的實施例中，此外源上加入的GOI為一人類基因。又在另外的實施例中，此調控元素為一外源上加入的調控元素。
在其他的實施例中，此第一及/或第二GOI係編碼一包括(但不限於)一抗體重鏈、抗體輕鏈、抗原結合片段及/或Fc-融合蛋白之POI。
在另外的實施例中，第一GOI和第二GOI獨立地係由下列編碼抗體輕鏈或其抗原-特異性片段、抗體重鏈或其抗原-特異性片段、Fc-融合蛋白及受體或其配體-特異性片段之基因組成之群中選出。在一實施例中，一重組酶辨識位置係存在第一GOI和第二GOI之間。在其他的實施例中，本發明進一步係提供一第一GOI之重組酶辨識位置5’至及一有關第二GOI之重組酶辨識位置3’。
又在另外的實施例中，此GOI係編碼一選自抗體輕鏈或其抗原結合片段、抗體重鏈或其抗原結合片段、Fc-融合蛋白或其片段、配體及受體或其配體結合片段之糖蛋白。
本發明之單離、非天然生成的細胞可衍生自真核細胞。在一實施例中，此細胞為一哺乳動物細胞。在某些實施例中，此單離的細胞為一體外人類細胞。在其他的實施例中，此細胞係由下列組成之群中選出：CHO(例如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、淋巴細胞、幹細胞、視網膜細胞、Vero、CV1、腎(例如HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB 8065、HL-60、Jurkat、Daudi、A431(上皮)、CV-1、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS-0、MMT細胞、腫瘤細胞及衍生自前述細胞之細胞株。在特定的實施例中，本發明之單離細胞為一CHO-K1細胞、淋巴細胞、視網膜細胞或幹細胞。
在一實施例中，第一Tn濃度為1μg/mL。在另外的實施例中，增加的Tn濃度係包括第二和第三Tn濃度。
在某些實施例中，第二濃度係大於第一Tn濃度，及第三濃度係大於第二Tn濃度。在特定的實施例中，此第二Tn濃度為2.5μg/ml， 而第三濃度為5μg/mL。
又在其他的實施例中，增加的Tn濃度係包括一第二Tn濃度，其中該第二Tn濃度為2.5μg/ml或5μg/mL。
除非另有說明或內文中明顯顯現，否則本發明之任何方面和實施例可與本發明之任何其他方面或實施例結合使用。
從審視接續的詳細說明，其他的目的和優點將變得顯而易見。
圖1係說明用於將編碼關注基因之核酸序列，例如eGFP導入一細胞基因體中之選殖載體結構中的操作表現匣流程圖。SV40啟動子：猴病毒40啟動子；GPT：GlcNAc-1-P轉移酶(例如CHO-GPT,SEQ ID NO：2；或hGPT,SEQ ID NO：12)；IRES：內部核醣體進入位；eGFP：增強的綠色螢光蛋白；SV40polyA：猴病毒40 polyA。
圖2A-2C係代表哺乳動物GPT胺基酸序列，亦即人類(GPT_HUMAN；UniProtKB登錄號Q9H3H5；SEQ ID NO：4)、獼猴(Rhesus macaque)(GPT_MACMU；UniProtKB登錄號F6TXM3；SEQ ID NO：5)、黑猩猩(chimpanzee)(GPT_PANTR；UniProtKB登錄號H2R346；SEQ ID NO：6)、狗(GPT_CANFA；UniProtKB登錄號E2RQ47；SEQ ID NO：7)、天竺鼠(GPT_CAVPO；UniProtKB登錄號E2RQ47；SEQ ID NO：8)、大鼠(GPT_RAT；UniProtKB登錄號Q6P4Z8；SEQ ID NO：9)及小鼠(GPT_MOUSE；UniProtKB登錄號P42867；SEQ ID NO：10)相較於中國倉鼠(GPT_CRIGR；UniProtKB登錄號P24140；SEQ ID NO：3)GPT胺基酸序列之比對。
圖3係舉例說明可如何使用本發明之方法和組成物完成蛋白最佳化。圖3A係描繪從以1μg/mL衣黴素(Tn)培養的細胞集池中選擇陽 性細胞轉染子之方法。隨後，以增加的衣黴素濃度，例如2.5μg/mL或5μg/mL培養第二細胞，以增強蛋白表現。圖3B：係描繪從以1μg/mL衣黴素(Tn)培養的第一細胞集池中選擇陽性細胞轉染子之方法，及然後連續地增加後續細胞培養中Tn的濃度以便於最佳化蛋白表現。
圖4A至4B係顯示代表各種效高黴素(Hygromycin)選擇性參數之FACS散佈圖。修飾的CHO細胞係包括二側為lox位點之YFP基因。二側為lox位點之選擇標記(抗生素抗藥基因及eGFP)合併在YFP位置並經由定點整合以Cre重組酶置換YFP。隨機整合體表現YFP和eGFP二者。
圖4A：以Cre重組酶載體和包括eGFP之hpt表現載體轉染細胞；但培養中並無效高黴素。圖4B：以Cre重組酶載體和包括eGFP之hpt表現載體轉染細胞；在400μg/mL效高黴素的存在下。
圖5A至5F係顯示代表各種衣黴素選擇性參數之FACS散佈圖。修飾的CHO細胞係包括二側為lox位點之YFP基因。二側為lox位點之選擇標記(抗生素抗藥基因及eGFP)合併在YFP位置並經由定點整合以Cre重組酶置換YFP。隨機整合體表現YFP和eGFP二者。圖5A：以Cre重組酶載體和包括eGFP之CHO-GPT表現載體轉染細胞；但培養中並無衣黴素。圖5B：以Cre重組酶載體和包括eGFP之CHO-GPT表現載體轉染細胞；在2.5μg/mL衣黴素的存在下。圖5D：以Cre重組酶載體和包括eGFP之人類GPT表現載體轉染細胞；但培養中並無衣黴素。圖5E：以Cre重組酶載體和包括eGFP之人類GPT表現載體轉染細胞；在1μg/mL Tn的存在下。圖5F：以Cre重組酶載體和包括eGFP之人類GPT表現載體轉染細胞；在2.5μg/mL Tn的存在下。
圖6A和6B係顯示GPT表現細胞集池相較於非-GPT表現集池，其對可操作連接GOI，例如eGFP之增強表現的相對能力。圖6A： 說明以PCR就細胞集池所測之CHO-GPT的基因複製相對數目如下：Pool-49細胞(無外源性GPT添加)無Tn選擇性；Pool-49細胞(無外源性GPT)帶有5ug Tn選擇性；Pool-1細胞自然表現較高量的GPT(數據未顯示)，並測試無Tn選擇性；Pool-78細胞(無外源性GPT)無Tn選擇性；表現外源上加入的hpt之CHO細胞及400μg/mL效高黴素選擇性；在1μg/mL Tn選擇性條件下表現外源性GPT之CHO細胞；從1μg/mL Tn選擇性集池選擇表現外源性GPT之CHO細胞，進一步於1μg/mL Tn中培養；從1μg/mL Tn選擇性集池選擇表現外源性GPT之CHO細胞，進一步於2.5μg/mL Tn中培養；從1μg/mL Tn選擇性集池選擇表現外源性GPT之CHO細胞，進一步於5μg/mL Tn中培養。圖6B：說明以qPCR就相同的細胞集池所測之關注基因eGPT的基因複製相對數目(如圖6A)。
圖7係說明由如下之細胞培養所產生的Fc-融合蛋白1(FcFP1)之糖型特性，圖7A：使用標準方案非表現GPT之CHO細胞(Lot B10002M410)，相較於圖7B：表現CHO-GPT及無Tn選擇性之CHO細胞(Lot 110728)。圖7C：表現CHO-GPT之CHO細胞並以1μg/mL Tn選擇(Lot 110728-01)，相較於圖7D：表現CHO-GPT之CHO細胞並以5μg/mL Tn選擇(Lot 110728-02)。各層析圖指出含有唾液酸化殘基之分溶液如下：0SA=零唾液酸殘基；1SA=1個唾液酸殘基；2SA=2個唾液酸殘基；3SA=3個唾液酸殘基；4SA=4個唾液酸殘基。
圖8係說明從(A)Lot B10002M410、(B)Lot 110728、(C)Lot 110728-01及(D)Lot 110728-02取樣的Fc-融合蛋白1(FcFP1)之重疊的糖基化樣貌。GPT批件中所產生的各蛋白之糖基化分布(glycoprofile)與參照的標準蛋白為相容的且主要的糖型種類產生一致。顯然，相較於參照的標準蛋白，在GPT批件中並無產生新穎和獨特的糖型種類。
詳細說明
在描述本方法之前，應了解，本發明不限於所述的特定方法和實驗條件，因為此等方法和條件可改變。亦應了解，文中所用的術語僅作為描述特定實施例之目的，且不希望受限，因為本發明之範圍將僅受限於所附的申請專利範圍。
除非文中明確地指出，否則如說明書和所附的申請專利範圍中所用，單數型「一」和「此」包括複數的參照物。因此，例如有關「一方法」係包括一或多種方法，及/或文中所述的類型之步驟及/或在閱讀本揭示文後，其對於熟習本項技術者將變得顯而易見。
除非另有定義或另有說明，否則所有文中所用的技術和科學術語係具有如本發明所屬技術之一般技術者所正常理解之相同意義。
雖然在施行或試驗本發明時可使用任何與該等文中所述的方法和物質類似或相當者，但特定的方法和物質為目前所述。文中所提及的所有出版品係以全文引用的方式併入本文中。
本項技術中熟知的各種基因可賦予培養中哺乳動物細胞一可選擇的表現型。一般，可選擇標記基因係表現蛋白，通常酵素在細胞培養中係賦予對各種抗生素之抗藥性。在某些選擇條件下，表現螢光蛋白標記之細胞可顯現出，且因此為可選擇的。本項技術之實例包括β-內醯胺酶(bla；β-內醯胺抗生素抗藥基因或ampR；合成青黴素(ampicillin)抗藥基因)、bls(保米黴素(blasticidin)阻抗乙醯轉移酶基因)、效高黴素磷酸轉移酶(hpt；效高黴素抗藥基因)及其他。
文中所述的方法係仰賴衣黴素及能讓細胞對衣黴素具阻抗性而得以在細胞培養中生長之酵素(標記)。衣黴素(Tn)為抗生素之混合物，其係作為細菌和真核生物N-乙醯葡萄糖胺轉移酶之抑制劑，防止N-乙醯葡 萄糖胺脂質中間物形成及新合成的糖蛋白之糖基化(King,I.A.,and Tabiowo,A.,1981,Effect of tunicamycin on epidermal glycoprotein and glycosaminoglycan synthesis in vitro.Biochem.J.,198(2)：331-338)。Tn具細胞毒性因為其係特異上抑制UDP-N-乙醯葡萄糖胺：磷酸多萜醇N-乙醯葡萄糖胺-1-P轉移酶(GPT)，一種催化多萜醇-連接的寡糖類之生物合成起始步驟的酵素。在衣黴素的存在下，在內質網(ER)中所製造的天門冬醯胺-連接的糖蛋白並未以N-連接醣型糖基化，且因此在ER內可能無法正確摺疊且因而可進行分解(Koizumi,et al.1999,Plant Physiol.121(2)：353-362)。因此，Tn為一在細菌和真核細胞中導致細胞凋亡之值得注意的未摺疊蛋白反應(UPR)之誘導劑。
用於二磷酸尿苷GPT(亦稱為GlcNAc-1-P轉移酶)之基因經鑑定在特定的細胞條件下為過度表現，以便於賦予對Tn之阻抗性(Criscuolo and Krag,1982,J Biol Chem,263(36)：19796-19803；Koizumi,et al.,1999,Plant Physiology,Vol.121,pp.353-361)。編碼GPT之基因，亦描述為GenBank登錄號M36899(SEQ ID NO：2)，係由Tn-抗藥性中國倉鼠卵巢細胞株中分離出且係編碼一408個胺基酸之蛋白(SEQ ID NO：3)(Scocca and Krag,1990,J Biol Chem 265(33)：20621-20626；Lehrman,M.et al.,1988,J Biol Chem 263(36)：19796-803)。倉鼠GPT在酵母細胞(裂殖酵母(S.pombe))中為過度表現的且在這些細胞中賦予Tn抗藥性；亦提供一方便的純化GPT酵素之來源(Scocca JR,et al.1995,Glycobiology,5(1)：129-36)。在雜交瘤細胞(表現IgG之B細胞，與靜態的B細胞)中分析GPT的轉錄量，儘管觀察到IgG-生產細胞並未展現增量之GPT轉錄或活性，然而在從靜態過渡到活化的B細胞中看到GPT小量增加。其結論出，GPT量可能係對應B細胞中對LPS(抗原)刺激之增生反應的早期發展(Crick,D.C.et al.,1994,J Biol Chem 269(14)：10559-65)。
此外，先前並不知道，在有或無Tn的存在下改變GPT之表現，在一細胞表現系統中是否對蛋白產物之糖基化有影響並因而影響產物品質。請了解，最佳和一致的糖基化為在製造治療性糖蛋白中一重要的蛋白屬性。
本發明係提供一於哺乳動物細胞系統中，利用哺乳動物Tn-抗藥基因GPT作為一可調節的選擇標記，而增加操作上連接GPT之關注基因的複製數以對應地增加隨機整合GPT表現匣至細胞，來製造重組蛋白之改良方法。
本項技術已辨識出，製造治療性蛋白，特別是糖蛋白，係仰賴模擬此等蛋白之天然糖基化的哺乳動物類型表現系統(請參見Bork,K.et al.,2009,J Pharm Sci.98(10)：3499-3508.)。例如，特定糖蛋白的末端單糖，例如N-連接的複合聚醣典型地係由唾液酸佔用。唾液酸化可能影響糖蛋白的藥物動力學性質，例如吸收度、血清半衰期及清除率或糖蛋白的其他物理化學或致免疫性質。過度表現的糖蛋白常常具有不完整或不一致的糖基化。可靠的方法對於在哺乳動物細胞株中生產治療性糖蛋白之處理一致性和品質為重要的。
本發明亦提供一用於糖基化重組蛋白之改良方法，亦即於哺乳動物細胞系統中製造糖蛋白之方法，以提供一致性品質產率之所欲的蛋白。
定義
DNA區當其為功能上彼此相關時，可操作上相連接。例如，若一啟動子能參與一序列的轉錄，則該啟動子可操作連接此編碼序列；若一核醣體-結合位置係經定位以便得以轉譯，則其可操作連接一編碼序列。一般，可操作連接係包括(但非必需)鄰近。在序列例如分泌性前導序列的情 況下，鄰近和適當放置在閱讀框架中為典型的特徵。一生產增強的序列，例如一啟動子，當其與GOI功能上相關，例如其存在造成GOI表現增加，則可操作連接一關注基因(GOI)。
就本身而論，「可操作連接」一詞，例如在DNA表現載體結構的內容中，一控制序列，例如起動子或操縱子或標記，適當地係位於相對於一編碼序列的位置，使得控制序列針對或得以產生由此編碼序列所編碼的特定之多肽/蛋白。例如，當選擇性標記為係在特定培養條件下存活所需時，該關注基因係可操作連接此選擇性標記基因，因為在沒有可操作選擇標記蛋白的存在下，表現將不會發生。
「啟動子」如文中所用係指足以引導一可操作與其相連接之DNA轉錄的DNA序列，亦即當適當的訊號存在時，以得以轉錄關注基因及/或選擇標記基因之方式相連接。基因的表現可在本項技術中已知的任何啟動子或增強子元素的控制下進行。
一「表現載體」在本發明內文中可為任何適合的載體，包括染色體、非染色體和合成的核酸載體(包括一組適合的表現控制元素之核酸序列)。此等載體之實例包括SV40的衍生物、細菌質體、嗜菌體DNA、桿狀病毒、酵母質體、衍生自質體和嗜菌體DNA組合物之載體、病毒核酸(RNA或DNA)載體。在一實施例中，一Fc-融合蛋白或多肽-編碼核酸分子係包括在裸DNA或RNA載體中，其包括，例如線性表現元素(如描述於，例如Sykes and Johnston,1997,Nat Biotech 12,355-59中)，一緊密化的核酸載體(如描述於，例如US6,077,835及/或WO00/70087中)或質體載體例如pBR322、pUC 19/18或pUC 118/119。此等核酸載體和其用法已為本項技術所熟知(參見，例如US5,589,466和US5,973,972)。
如文中所用「操縱子」係指以藉由將一阻遏蛋白與該操縱子結合來調節一基因之方式導入至或接近該基因之DNA序列，因而防止或得以轉錄GOI，亦即編碼一關注多肽或蛋白之核苷酸。
核醣體結合位包括「內部核醣體進入位」(IRES)或可包括5’端帽。許多IRES序列已為本項技術所熟知。IRES代表一轉譯控制序列，其中該IRES位置典型地係位於關注基因的5’端，並得以用端帽-獨立方式轉譯RNA。轉錄的IRES可直接結合核醣體亞單元使得mRNA起始密碼子的位置在核醣體中適當的朝向轉譯。IRES序列典型地係位於mRNA的5’UTR(起始密碼子的正上游)。IRES功能上取代對各種與真核生物轉譯機制相互作用的蛋白因子之需求。
術語「增強」或「改善」當用於描述蛋白表現時係包括增加由表現系統或本發明方法所生產的蛋白(液及基因產物)之量及/或品質的一致性。因此，其係包括在典型地藉由隨機整合至基因體中所觀察到的，例如相較於使用另外的可選擇標記結構之整合體集池，至少增強約1.5-倍至至少約3-倍增強表現。因此，將關注蛋白所觀察的倍數-表現增強與在缺乏包括GPT基因之本發明表現匣或細胞，或在包括不同可選擇標記之表現匣或細胞下，於實質上相同條件所測量的相同基因之表現量相比較。表現增強亦可藉由所產生的隨機整合事件之數目來測量。增強的重組效率包括基因座之重組能力的增強(例如，使用重組酶-辨識位置)。增強係指在重組期間可測量的有效性，其典型地為0.1%。在特定的條件下，增強的重組效率隨著隨機為約10-倍，或約1%。除非有說明，否則所聲請的本發明並不限於一特定的重組效率。表現增強亦可藉由所產生的基因複製之數目來測量，如藉由定量聚合酶連鎖反應(qPCR)或其他熟知的技術來測量。
增強或改良的產物亦指更一致的品質，例如以本發明之GPT表現系統所觀察到的後轉譯修飾。一致的品質包括，例如在複製生產株後， 具有所欲的糖基化樣貌。一致性，就品質而言，係指相同度和標準化的程度，而複製生產批件基本上係無變異。在文中教導了計算用以測量一致性的Z-數。用於測量一致性的其他統計方法已為本項技術所知。
「選擇壓力」一詞為施用於活的生物體(例如一細胞)或系統(例如一表現系統)之力或刺激，其改變了該活的生物體在一特定環境中之行為和存活(例如存活能力)。
「基因增幅」一詞係指相同的基因序列複製數目增加。特定的細胞進程其特徵為多重複製的特別基因之產生其加大基因賦予細胞的表現型，例如抗生素抗藥性。
當「外源上加入的基因」或「外源上加入的GOI」係用於有關表現匣時，該詞語係指任何非存在自然發現的細胞基因體內之基因，或整合至(不同的基因座內)基因體之添加的基因複製體。例如，CHO基因體內之「外源上加入的基因」(例如一可選擇的標記基因)，可為一並非在自然界特定CHO基因座內所發現的倉鼠基因(亦即，來自倉鼠基因體另外的基因座之倉鼠基因)、來自其他物種的基因(例如人類基因)、嵌和基因(例如人/小鼠)，或可為並非在自然界CHO基因體內所發現的倉鼠基因(亦即與來自倉鼠基因體另外的基因座之基因具有低於99.9%相同度之倉鼠基因)，或並非在自然界中發現存在CHO天然基因體內的任何其他基因。
隨機整合事件係不同於定點整合事件，而將一基因插入細胞的基因體在隨機整合並非位置-特定的。隨機(非同源性)整合係指所產生的整合體位置並非已知的或定點。隨機整合被認為係藉由非同源末端接合(NHEJ)所發生，然而並不限於此方法。
選擇效率係指表現可選擇標記之存活細胞的族群百分比，且，若適當，在可選擇標記之控制下的關注蛋白。。
相同度百分率，當描述一Tn-抗藥蛋白時，係指包括沿著鄰接同源區域展現所述的相同度之同源序列，但在相比的序列中不具同源性的缺位、刪除或插入之存在不能納入計算相同度百分率中。於本內文中在解釋「相同度百分率」的使用上，下列胺基酸序列之比較係指：1 MWAFPELPLPLPLLVNLIGSLLGFVATVTLIPAFRSHFIAARLCGQDLNKLSQQQIPESQ 60 GPT_小鼠1 MWAFPELPL--PLLVNLFGSLLGFVATVTLIPAFRSHFIAARLCGQDLNKLSRQQIPESQ 58 GPT_CRIG
如文中所用，上述「GPT_CRIG」序列(中國倉鼠GPT)與小鼠同源物(「GPT_小鼠」)之間「相同度百分率」測定不應包括倉鼠胺基酸10和11之比較，因為在一比對中此倉鼠同源物並不具有同源的序列用以相比較(亦即小鼠的GPT在此點具有一個插入，或此倉鼠同源物具有一缺位或刪除，視情況而定)。因此，在上述的比較中，相同度百分率比較應從5’端的「MWA」延伸至3’端的「ESQ」。在該事件中，小鼠同源物之差異僅在其於倉鼠GPT位置51具有一個「R」。因為此比較係在60個展開鹼基對中58個連接的鹼基上，其中僅有一個胺基酸差異(其並非缺位、刪除或插入)，因此二個序列(小鼠和倉鼠)間，從倉鼠GPT位置1至倉鼠GPT位置58有超過98%相同度(因為「相同度百分率」並不包括缺位、刪除和插入的罰值)。雖然上述實例係以胺基酸序列為基礎，請了解，核酸序列的相同度百分率應以相同的方式來計算。
術語「細胞」係包括適合表現一重組核酸序列之任何細胞。細胞係包括該等原核和真核細胞(單細胞或多細胞)、細菌細胞(例如大腸桿菌(E.coli)、芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)及鏈黴菌屬(Streptomyces spp)菌株等)、分歧桿菌細胞、真菌細胞、酵母細胞(例如釀酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵 母(S.pombe)、畢赤酵母(P.partoris)、嗜甲醇畢赤酵母(P.methanolica)等)、植物細胞、昆蟲細胞(例如SF-9,SF-21、桿狀病毒感染的昆蟲細胞、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人類動物細胞、哺乳動物細胞、人類細胞或細胞融合物，例如雜交瘤或四源雜交瘤。在特定的實施例中，此細胞為一人類、猴子、猿、倉鼠、大鼠或小鼠細胞。在其他的實施例中，此細胞為真核性且係由下列細胞中選出：CHO(例如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、視網膜細胞、Vero、CV1、腎(例如HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB 8065、HL-60、Jurkat、Daudi、A431(上皮)、CV-1、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS-0、MMT細胞、腫瘤細胞及衍生自前述細胞之細胞株。在某些實施例中，此細胞係包括一或多個病毒基因，例如表現一病毒基因之視網膜細胞(例如一PER.C6®細胞)。
「累積的細胞密度」或「ICD」一詞係指在一段時間內整體而言培養基中細胞的密度，係以每毫升的細胞-天數來表示。在某些實施例中，ICD係以培養中約第12天的細胞來測量。
「糖基化」或「糖基化一蛋白」一詞係包括形成糖蛋白，而寡糖係與一蛋白的天門冬醯胺(Asn)殘基(亦即N-連接的)或絲胺酸(Ser)/蘇胺酸(Thr)殘基(亦即O-連接的)之側鏈相連接。聚糖可為單糖殘基之同源或異源聚合物，其可為直鏈或支鏈。N-連接的糖基化已知主要係在內質網中開始，而O-連接的糖基化係顯示在ER或高爾基體中開始。
「N-聚糖蛋白」或「N-聚糖蛋白基質」包括含有或可接受N-連接寡糖之蛋白。N-聚糖可由N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)、甘露糖(Man)、果糖(Fuc)、半乳糖(Gal)、神經胺酸(NANA)及其他單糖所組成，然而N-聚糖通常具有一共通的中心五糖結構，包括：3個甘露糖和2個N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)糖。帶有連續胺基酸序列(亦即序列段(sequon))Asn-X-Ser或 Asn-X-Thr之蛋白，其中X為脯胺酸以外的任何胺基酸，可提供N-聚糖一連接位置。
一般說明
本發明至少部份係基於以在特定條件下可在一其中編碼此蛋白的基因係操作上連接一Tn-抗藥基因GPT的細胞中生產重組蛋白，且蛋白-生產細胞的選擇係設定為在細胞基因體中增加隨機整合事件並因此增加關注基因之複製數及最終蛋白生產量之發現。
本發明亦至少部份係基於蛋白-生產細胞可經最佳化，以一致和可靠的後轉譯修飾表現蛋白。GPT表現匣亦可，如以表現結構，例如經由表現載體，使用本項技術中已知的各種基因編輯技術，整合在一細胞基因體中。包括GPT的表現載體可藉由隨機或定點重組，例如同源重組或由辨識特定重組位置之重組酶所媒介的重組(例如，Cre-lox-媒介的重組)整合至一基因體中。
可藉由在整合位置的染色體DNA中導入一破裂來幫助真核細胞中的同源重組。模型系統已顯示，若雙股破裂係導入至染色體標的序列中，則在基因標定期間同源重組之頻率會增加。此項可藉由讓特定核酸酶以整合的特異位置為目標來進行。在標的基因座辨識DNA序列的DNA-結合蛋白已為本項技術所知。基因標的載體亦用於幫助同源性重組。在缺乏用於同源性導向修復之基因標的載體下，細胞常會藉由非同源末端接合(NHEJ)(其可能在裂解位置導致多重核苷酸刪除或插入)來關閉此雙股破裂。基因標的載體結構和核酸酶選擇係在本發明所屬的技術者之技術範圍內。
在某些實施例中，鋅指核酸酶(zinc finger nuclease；ZFN)，其具有一模組式結構及含有個別的鋅指區，係在標的序列中辨識一特定的3-核苷酸序列(例如定點整合之位置)。某些實施例可利用ZFN結合以多重目 標序列對目標之個別鋅指區。
轉錄活化因子樣(TAL)效應子核酸酶(TALEN)亦可用於位點-特異性基因體編輯。TAL效應子蛋白DNA-結合區典型地係與限制性核酸酶之非特異性裂解區，例如FokI組合來使用。在某些實施例中，包括一TAL效應子蛋白DNA-結合區和限制性核酸酶裂解區之融合蛋白係用於辨識及裂解本發明基因座內之標的序列的DNA(Boch J et al.,2009 Science 326：1509-1512)。
RNA-引導的核酸內切酶(RGEN)為從細菌適應性免疫機制所發展之可編程的基因體工程化工具。在此系統中-成簇的規律間隔性短回文重復序列(CRISPR)/CRISPR-相關的(Cas)免疫反應-蛋白Cas9形成一序列-特異性核酸內切酶，當與二個RNA複合時，其中一個係引導標的選擇。RGEN係由組份(Cas9和tracrRNA)及標的特異性CRISPR RNA(crRNA)所組成。二者之DNA標的裂解之效率及裂解位置之所在係基於前間區連接模組(PAM)，就目標辨識之額外的需求而變(Chen,H.et al.,J.Biol.Chem.2014年3月14線上公開，底稿M113.539726)。
又有其他同源重組之方法可供熟習技術者取用，例如帶有精確DNA-結合特異性之BuD-衍生的核酸酶(BuDN)(Stella,S.et al.Acta Cryst.2014,D70,2042-2052)。精確的基因體修飾法係以在基因體中可取得的工具與獨特標的序列相容為基礎來選擇，使其避免細胞表現型之破壞。
提供細胞和方法用以穩定地將核酸序列(關注基因)整合至哺乳動物細胞中，其中該核酸序列能利用與GPT序列整合增強表現。亦提供組成物和方法供使用有關表現結構之GPT，例如供加入一外源性GPT至特定的哺乳動物細胞中。提供細胞和方法供用於一致但堅實的製造糖蛋白，特別是治療性糖蛋白之方法中。
GPT選擇標記匣之建構
在文中係提供包括一操作GPT表現匣之表現載體。此表現匣係包括必須的調控元素以允許和驅動哺乳動物GPT和所欲基因產物之轉錄和轉譯。
亦可開發各種文中所述的基因和調控序列之組合。亦可開發之文中所述的適當序列之其他組合實例包括含有多重複製之文中所揭示的GPT基因之序列，或藉由將揭示的GPT與其他核苷酸序列組合以達到最佳調控元素組合所衍生的序列。此等組合可連續地連接或排列以提供導向關注基因及調控元素之最佳的GPT間隔。
編碼GPT之基因的同源序列已知係存在於來自其他哺乳動物物種之細胞中(例如，如人類；參見圖2)以及衍生自其他哺乳動物組織類型之細胞株中，且可藉由本項技術中熟知的技術來分離。一示例性哺乳動物GPT胺基酸序列之列表係提供於圖2中。可對SEQ ID NO：2及11-17中所述之核苷酸進行核苷酸序列之改變，例如密碼子最佳化，以便於得到SEQ ID NO：3-10中所述的對應GPT蛋白之最佳表現。此外，可藉由改變編碼GPT之核酸序列，改變SEQ ID NO：3-10中所述的胺基酸序列。此等技術包括(但不限於)定位或隨機突變技術，已為本項技術所熟知。
然後可將生成的GPT變體就文中所述的GPT活性，例如對衣黴素的抗藥性進行試驗。藉由例行的實驗，將胺基酸序列中與具有GPT活性之SEQ ID NO：3為至少約93%相同度，或至少約95%相同度，或至少約96%相同度，或至少約97%相同度，或至少約98%相同度之GPT蛋白分離出，且預期具有如同SEQ ID NO：3之相同的Tn抗藥性、選擇性效率及後轉譯利益。因此，GPT之哺乳動物同源物及GPT變體亦可涵蓋在本發明實施例中。圖2A至2C係顯示各種哺乳動物GPT胺基酸序列(亦即SEQ ID NO：3-10)之比對。哺乳動物GPT序列(核酸和胺基酸)在倉鼠、人類、小鼠和大 鼠基因體間為保守的。表1係鑑別示例的哺乳動物GPT蛋白及其同源性程度。
可使用文中所提供的GPT/衣黴素法來發展關注蛋白之細胞群族表現增強量。依照此蛋白為細胞所處理之效率，表現的絕對量將隨特定蛋白而變。
因此，本發明亦包括由SEQ ID NO：2及11-17組成之群中選出的GPT-表現核苷酸序列。本發明亦涵蓋一GPT-表現的核苷酸序列，其與選自SEQ ID NO：2及11-17組成之群的核苷酸序列為至少92%相同，至少93%相同，至少94%相同，至少95%相同，至少96%相同，至少98%相同，至少99%相同。
本發明包括含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：12之載體。包括哺乳動物GPT基因及視需要調控元素之載體係包括供過渡或穩定轉染之載體。
在一實施例中，GPT基因係用於增強GOI表現，如圖1所示。圖1係顯示可操作連接一IRES序列及一GPT可選擇標記之GOI。GPT匣進一步係包括一啟動子序列，例如SV40啟動子，及一多聚腺苷酸化(poly(A))序列，例如SV40 poly(A)。
表現增強匣(包括GPT及一上游啟動子)最佳地係整合在一細胞基因體中。使用本發明之方法，GOI係在以增加的Tn濃度為基礎的培養條件下於GPT表現匣中表現(圖3A或圖3B)。FACS讀出，例如圖5B、5C、5E和5F中所示，係為穩定轉染的細胞族群中表現之分部的示例，特別是使用哺乳動物Tn-抗藥選擇標記CHO-GPT和hGPT在選擇效率上戲劇性增加。哺乳動物GPT表現進一步增強了關注基因產物之表現，例如生產螢光蛋白eGFP。相較於使用GPT以一種Tn濃度為基礎的培養條件表現在一表現系統中的GOI，漸增的Tn濃度之連續培養造成約2-倍的增強表現，例如圖6B所示例。
本發明包括一包含此一GPT基因之哺乳動物細胞，其中該GPT基因為外源性且係藉由本發明之方法整合至該細胞基因體中。包括此一GPT基因之細胞，具有至少一外源上加入的關注基因(GOI)，其為此GPT基因之上游或下游。
在各種實施例中，可藉由在哺乳動物可選擇標記GPT之控制下放置GOI來增強GOI之表現。在其他的實施例中，可藉由在哺乳動物可選擇標記GPT之控制下放置GOI並提供包括大於0.5μg/mL Tn濃度的細胞培養條件，而增強GOI的隨機整合事件。在某些實施例中，細胞培養條件係包括大於1μg/mL Tn濃度。調控元素可操作連接此GOI，其中GOI之 表現-與GOI和GPT的選擇距離(在5’或3’方向)-保留增強GOI表現之能力，例如，超過典型地由於隨機整合事件所觀察到的表現。在各種實施例中，增強量為至少約1.5-倍至約2-倍或更多。相較於一隨機整合或隨機表現，表現的增強量為約1.5-倍或約2-倍或更多。
在另外的實施例中，使用本發明之方法和組成物可得到一致地糖基化蛋白。如表4中所示，經Tn處理的GPT/GOI重組蛋白批件使得複製批件具有同等的糖基化性質。因此，增強的蛋白表現例如一致的糖基化性質可直接藉由計算如文中所教導的Z-數來作比較。Z-數方程式係將層析圖上代表唾液酸(SA)基團的相對波峰數以及各波峰的相對銳度和密度列入考慮。Z-數係以各波峰所佔據的面積為基礎並可用作複合糖蛋白之一致性測量值(參見，例如圖7A-7D、圖8及實例3，如文中述。
蛋白表現最佳化亦可就各GOI來進行，包括，例如表現匣向位或密碼子最佳化。蛋白最佳化亦可藉由在細胞培養法中變化遞增的Tn濃度來進行。
重組表現載體可包括編碼一蛋白之合成的或cDNA-衍生的DNA片段，其可操作連接一衍生自哺乳動物、病毒或昆蟲基因的適合轉錄及/或轉譯調控元素。此等調控元素包括轉錄啟動子、增強子、編碼適合mRNA核醣體結合位置之序列及控制轉錄和轉譯終止之序列，如文中詳細描述。哺乳動物表現載體亦可包括非轉錄元素，例如一複製源、其他5'或3'側區非轉錄序列，及5'或3'非轉譯序列例如剪接供體和受體位置。亦可併入幫助辨識轉染物之另外的可選擇標記基因(例如螢光標記)。
在另外的實施例中，載體係包括一編碼一關注蛋白之核酸分子(或關注基因)，其包括一包含所述的核酸分子(基因)之表現載體，其中該核酸分子(基因)可操作連接一表現控制序列。
提供包括一關注基因(GOI)之載體，其中該GOI可操作連接 一適合在哺乳動物宿主細胞中表現的表現控制序列。
可用於本發明之有用的啟動子包括(但不限於)SV40早期啟動子區、包含在3'長末端重複的勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)之啟動子、金屬硫蛋白(metallothionein)基因之調控序列、小鼠或人類巨細胞病毒IE啟動子(Gossen et al.,(1995)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 89：5547-5551)、花椰菜嵌紋病毒(cauliflower mosaic virus)35S RNA啟動子及光合成酵素核酮糖二磷酸羧化酶之啟動子、來自酵母或其他真菌之啟動子元素例如Gal 4啟動子、ADC(酒精去氫酶)啟動子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動子、鹼性磷酸酶啟動子及下列動物轉錄控制區，其具有組織特異性並已用於基因轉殖動物中：彈性蛋白酶I(elastase I)；胰島素；免疫球蛋白；小鼠乳腺腫瘤病毒；白蛋白；α-胎兒蛋白；α1-抗胰蛋白；β-球蛋白；及肌凝蛋白輕鏈-2。
本發明之核酸分子亦可操作連接一有效的poly(A)終止序列，例如SV40 poly(A)，一種用於大腸桿菌中質體產物之來源，及/或方便的選殖位置(例如多位點接頭)。核酸可包括一與組成型啟動子相反之可調節的誘導型啟動子(可誘導、可抑制、發育性調節)，例如CMV IE(熟習技術者應了解此等術語實際上為在特定條件下基因表現程度之描述符)。
本發明係提供製造關注蛋白之方法，而表現載體係提供包括關注基因(GOI)。此等表現載體可用於重組製造任何關注蛋白。可用於轉染脊椎動物細胞之表現載體中的轉錄和轉譯控制序列可藉由病毒性來源來提供。例如，常用的啟動子和增強子係衍生自病毒，例如多瘤病毒、腺病毒2、猴病毒40(SV40)及人類巨細胞病毒(CMV)。病毒性基因體啟動子、控制及/或訊號序列可用於驅動表現，所提供的此等控制序列與所選的宿主細胞為相容的。依照於其中表現重組蛋白之細胞類型，亦可使用非病毒性細胞啟動子(例如，β-球蛋白及EF-1α啟動子)。
衍生自SV40病毒基因體之DNA序列，例如SV40來源、 早期和晚期啟動子、增強子、剪接和多聚腺苷化可用於提供對異源DNA序列之表現有用的其他基因元素。早期和晚期啟動子為特別有用，因為二者可容易地從SV40病毒得到，為一亦含有SV40病毒複製源之片段(Fiers et al..,Nature 273：113,1978)。亦可使用較小或較大的SV40片段。典型地，係包括從位於SV40複製源之Hind III位置往前延伸到BglI位置的大約250bp序列。
用於表現多重轉錄之雙順反子表現載體先前已有描述(Kim S.K.and Wold B.J.,Cell 42：129,1985；Kaufman et al..1991,supra)並可與GPT表現系統組合使用。其他類型的表現載體亦為有用的，例如該等描述於美國專利第4,634,665號(Axel等人)及美國專利第4,656,134號(Ringold等人)中。
一整合位置，例如一重組酶辨識位置，可放置5’或3’於編碼POI的基因序列。一適合的整合位置之實例為一lox p位置。適合的整合位置之另外實例為二個重組酶辨識位，例如由lox p位置、lox和lox 5511位置組成之群中選出。
基因增幅匣及其表現載體
先前已描述或本項技術中已知的有用調控元素亦可包括在用於轉染哺乳動物細胞之核酸中。圖1為一GPT載體中的操作匣之示例，其進一步包括一啟動子序列、IRES序列、關注基因及poly(A)序列。
在本發明內文中一表現載體可為任何適合的載體，包括染色體、非染色體及合成的核酸載體(包括一組適合的表現控制元素之核酸序列)。此等載體之實例包括SV40之衍生物、細菌質體、嗜菌體DNA、桿狀病毒、酵母質體、衍生自質體和嗜菌體DNA組合之載體及病毒性核酸(RNA或DNA)載體。在一實施例中，一抗體-編碼核酸分子係包含在一裸DNA或 RNA載體中，包括，例如線性表現元素(如描述於，例如Sykes and Johnston,Nat Biotech 12,355-59(1997)中)，一緊實的核酸載體(如描述於，例如US6,077,835及/或WO00/70087中)或質體載體例如pBR322、pUC 19/18或pUC 118/119。此等核酸載體和其用法已為本項技術所熟知(參見，例如US5,589,466和US5,973,972)。
另一種選擇，一表現載體可為適合在酵母系統中表現的載體。可使用任何適合在酵母系統中表現的載體。適合的載體包括，例如包括組成型或誘導型啟動子，例如酵母α因子、酒精氧化酶及PGH之載體(參見：F.Ausubel et al.,ed.Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley InterScience New York(1987)，及Grant et al.,Methods in Enzymol 153,516-544(1987))。
在特定的實施例中，此載體係包括一編碼關注蛋白之核酸分子(或關注基因)，其包括一包含所述的核酸分子(基因)之表現載體，其中該核酸分子(基因)可操作連接一適合在宿主細胞中表現的表現控制序列。
表現控制序列係經工程化用以控制及驅動關注基因之轉錄，及後續在各種細胞系統中的蛋白表現。質體係將一可表現的關注基因與包括所欲的調控元素，例如啟動子、增強子、可選擇標記、操縱子等之表現控制序列(亦即表現匣)組合。在本發明一表現載體中，GPT和關注蛋白，例如抗體-編碼核酸分子，可包括或與任何適合的啟動子、增強子、操縱子、阻遏蛋白、poly(A)終止序列及其他表現-促進性元素結合。
關注基因之表現，例如抗體-編碼核苷酸序列，可在任何本項技術中已知的啟動子或增強子元素的控制下置入。此等元素的實例包括強表現啟動子(例如，人類CMV IE啟動子/增強子或CMV主要'IE(CMV-MIE)啟動子，以及RSV、SV40晚期啟動子、SL3-3、MMTV、泛素(Ubi)、泛素C(UbC)及HIV LTR啟動子)。
在某些實施例中，此載體係包括由下列組成之群中選出的啟動子：SV40、CMV、CMV-IE、CMV-MIE、RSV、SL3-3、MMTV、Ubi、UbC及HIV LTR。
本發明之核酸分子亦可操作連接一有效的poly(A)終止序列，例如SV40 poly(A)、一用於大腸桿菌中質體產物之複製源、一抗生素抗藥基因作為可選擇標記，及/或一方便的選殖位置(例如多位點接頭)。核酸亦可包括一與組成型啟動子相反之可調節的誘導型啟動子(可誘導、可抑制、發育性調節)，例如CMV IE(熟習技術者應了解此等術語實際上為在特定條件下基因表現程度之描述符)。
可選擇標記已為本項技術所熟知。在某些情況下，除了GPT之外，可使用另外的可選擇標記，其中此等標記能使細胞顯現出。可使用正選擇或負選擇。
在某些實施例中，此載體係包括一或多種編碼綠色螢光蛋白(GFP)、增強的綠色螢光蛋白(eGFP)、氰基螢光蛋白(CFP)、增強的氰基螢光蛋白(eCFP)、黃色螢光蛋白(YFP)或增強的黃色螢光蛋白(eYFP)之可選擇標記基因。
就本發明之目的，真核細胞中的基因表現可使用一強啟動子緊密調節，其係藉由一操縱子來控制，而此操縱子轉而由調節融合蛋白(RFP)來調節。此RFP基本上係由轉錄阻斷區及一調節其活性之配體結合區所組成。此等表現系統之實例係描述於US20090162901A1中，其係以全文引用的方式併入本文中。
許多真核細胞及嗜菌體中的操縱子已經完全定性(Neidhardt,ed.Escherichia coli and Salmonella；Cellular and Molecular Biology 2d.Vol 2 ASM Press,Washington D.C.1996)。這些包括(但不限於)大腸桿菌之LexA基因的操縱子區，其係與LexA多肽結合，及乳糖和色胺酸，其係與由大腸桿 菌的LacI和trpR基因所編碼的阻遏蛋白相結合。這些亦包括來自λ PR和嗜菌體P22 ant/mnt基因之嗜菌體操縱子，其係與由λ cI和P22 arc所編碼的阻遏蛋白相結合。在某些實施例中，當阻遏蛋白的轉錄阻斷區為一限制酵素時，例如NotI，此操縱子為該酵素之辨識序列。熟習本項技術應了解，操縱子必須與鄰接啟動子相鄰或3'朝向啟動子，使其能藉由該啟動子控制轉錄。例如美國專利第5,972,650號，其係以引用的方式併入本文中，說明了tetO序列係在TATA盒之一特定的距離內。在特定的實施例中，此操縱子較佳地係置於啟動子的正下游。在其他的實施例中，此操縱子係置於啟動子的10對鹼基以內。
在特定的實施例中，此操縱子係由下列組成之群中選出：tet操縱子(tetO)、NotI辨識序列、LexA操縱子、乳糖操縱子、色胺酸操縱子及Arc操縱子(AO)。在某些實施例中，阻遏蛋白係由下列組成之群中選出：TetR、LexA、LacI、TrpR、Arc、λ C1及GAL4。在其他的實施例中，此轉錄阻斷區係衍生自一真核阻遏蛋白，例如衍生自GAL4之阻遏區。
在一示例的細胞表現系統中，細胞係經工程化以表現四環素(tetracycline)阻遏蛋白(TetR)且一關注蛋白係在啟動子的轉錄控制下置入，而該啟動子活性係受TetR所調控。二個縱排的TetR操縱子(tetO)係放置在載體之CMV-MIE啟動子/增強子的正下游。由此載體中CMV-MIE啟動子所引導之編碼該關注蛋白的基因轉錄，在缺乏四環素(tetracycline)或在某些其他適合的誘導劑(例如多西環素(doxycycline))下，可能被TetR阻斷。在一誘導劑的存在下，TetR蛋白能結合tetO，因而使關注蛋白之轉錄然後轉譯(表現)發生(參見，例如美國專利第7,435,553號，其係以全文引用的方式併入本文中)。
另外的示例細胞表現系統包括調控融合蛋白，例如TetR-ERLBDT2融合蛋白，其中該融合蛋白的轉錄阻斷區為TetR而配體結合 區為帶有T2突變之雌激素受體配體結合區(ERLBD)(ERLBDT2；Feil et al.(1997)Biochem.Biophys.Res.Commun.237：752-757)。當tetO序列放置在下游及接近強CMV-MIE啟動子時，來自CMV-MIE/tetO啟動子之關注核苷酸序列的轉錄，在他莫昔分(tamoxifen)的存在下受到阻斷並藉由移除他莫昔分解除阻斷。在另外的實例中，使用融合蛋白Arc2-ERLBDT2，一種由二個Arc蛋白所組成之單鏈二聚體連接一15個胺基酸連接子和ERLBDT2(前文)所組成的融合蛋白，係涉及一Arc操縱子(AO)，特言之，二個縱排的CMV-MIE啟動子/增強子正下游之arc操縱子。細胞株可由Arc2-ERLBDT2來調節，其中表現關注蛋白之細胞係由CMV-MIE/ArcO2啟動子所驅動並可用移除他莫昔分來誘導(參見，例如US 20090162901A1，其係以引用的方式併入本文中)。
在某些實施例中，本發明之載體係包括一CMV-MIE/TetO或CMV-MIE/AO2雜交啟動子。
本發明之載體亦可將Cre-lox工具用於重組技術，以便於幫助關注基因之複製。Cre-lox策略需要至少二個組份：1)Cre重組酶，一種催化二個loxP位置間重組之酵素；及2)loxP位置(例如由一中心序列(重組係在其中進行)及二個側邊13-bp插入重複序列所組成的特異性34-鹼基對bp序列)或突變lox位置(參見，例如Araki et al..PNAS 92：160-4(1995)；Nagy,A.et al..Genesis 26：99-109(2000)；Araki et al..Nuc Acids Res 30(19)：e103(2002)；及US20100291626A1，其全部係以引用的方式併入本文中)。在另外的重組策略中，酵母-衍生的FLP重組酶可利用共有序列FRT(亦參見，例如Dymecki,S.PNAS 93(12)：6191-6196(1996))。
在另外方面，一基因(亦即編碼一本發明重組多肽之核苷酸序列)係插入表現匣的GPT基因之上游或下游，且視需要可操作連接一啟動子，其中該啟動子-連接的基因5’側邊為第一重組酶辨識位置及3’側邊為第 二重組酶辨識位置。此等重組酶辨識位置讓表現系統之宿主細胞中Cre-媒介的重組得以進行。在某些情況下，第二啟動子連接的基因為第一基因之下游(3’)且3’的側邊為第二重組酶辨識位置。又在其他的情況下，第二啟動子連接的基因5’側邊為第二重組酶辨識位置，而3’側邊為第三重組酶辨識位置。在某些實施例中，重組酶辨識位置係選自loxP位置、lox511位置、lox2272位置及FRT位置。在其他的實施例中，重組酶辨識位置為不同的。在一另外的實施例中，此宿主細胞係包括一能表現Cre重組酶之基因。
在一實施例中，此載體係包括一編碼本發明之抗體輕鏈或抗體重鏈的第一基因，及一編碼本發明之抗體輕鏈或抗體重鏈的第二基因。
在某些實施例中，此載體進一步係包括一能經由涉及內質網(ER)中蛋白摺疊之基因表現的控制，另再增強蛋白生產/蛋白分泌之X-盒-結合-蛋白1(mXBP1)基因(參見，例如Ron D，及Walter P.Nat Rev Mol Cell Biol.8：519-529(2007))。
任何細胞皆適用於表現本發明之重組核酸序列。用於本發明之細胞包括哺乳動物細胞，例如非人類動物細胞、人類細胞或細胞融合物，例如雜交瘤或四源雜交瘤。在特定的實施例中，此細胞為一人類、猴子、倉鼠、大鼠或小鼠細胞。在其他的實施例中，此細胞為真核性且係由下列細胞中選出：CHO(例如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS(e.g.COS-7)、視網膜細胞、Vero、CV1、腎(例如HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB 8065、HL-60、Jurkat、Daudi、A431(上皮)、CV-1、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS-0、MMT細胞、腫瘤細胞及衍生自前述細胞之細胞株。在某些實施例中，此細胞係包括一或多個病毒基因，例如表現一病毒基因之視網膜細胞(例如一PER.C6®細胞)。
又在另外的方面，本發明係關於重組的哺乳動物宿主細胞， 例如轉染瘤，其係產生一免疫球蛋白，例如一抗體或一雙特異性分子。此等宿主細胞的實例包括工程化的哺乳動物細胞，例如CHO或HEK細胞。例如，在一實施例中，本發明係提供一包括穩定整合至細胞基因體中的核酸之細胞，其係包括一編碼抗體表現之序列，而該抗體係包括一本發明之重組多肽。在另外的實施例中，本發明係提供包括一非整合(亦即附加型)核酸，例如質體、黏粒(cosmid)、噬粒(phagemid)或線性表現元素之細胞，其包括一編碼抗體表現之序列，而該抗體係包括本發明之重組多肽。在其他的實施例中，本發明係提供以包括本發明表現載體之質體穩定轉染宿主細胞所產生的細胞株。
因此，在一方面，本發明係提供包含下列之細胞：(a)一編碼外源上-加入的哺乳動物GPT基因之重組聚核苷酸及(b)編碼一多亞基蛋白之多肽。在某些實施例中，外源上加入的GPT基因與SEQ ID NO：2之核酸序列為90%相同度，其非限定實例係提供於SEQ ID NO：11-17中，且該多亞基蛋白為一抗體。在其他的實施例中，此係亦含有一外源上加入的GPT基因及調控元素。在一實施例中，此細胞為一哺乳動物細胞，例如用於製造生物製藥之CHO細胞。
在另外方面，本發明係提供衍生自前面方面所述的細胞之細胞株。「衍生自」係指由個別細胞無性繁殖的細胞族群並具有某些選擇質性，例如產生一特定效價的活性蛋白之能力，或增生至特定密度的能力。在某些實施例中，一細胞株，其係衍生自藏有編碼哺乳動物GPT基因及一編碼多亞基蛋白之聚核苷酸的重組聚核苷酸之細胞，能以每公升培養基至少3克的效價(g/L)，至少5g/L或至少8g/L產生多亞基蛋白。在某些實施例中，此細胞株可達到至少30%大於，至少50%大於，至少60%大於，至少90%大於由基本上相同但無編碼GPT之重組聚核苷酸所衍生的細胞株所達到的整體細胞密度(ICD)。
提供一擴增GOI之方法。作為示例的方法係將增加濃度的衣黴素施用於一真核GPT表現系統，因而擴增可操作連接一外源上加入的哺乳動物GPT基因之GOI的基因複製數
關注蛋白
編碼關注基因之核酸序列可方便地整合至一包括Tn抗藥標記基因和一IRES，及視需要側邊有重組酶辨識位置之細胞中。可使用任何適合在哺乳動物細胞中表現的關注蛋白，然而糖蛋白就本發明之方法為特別有利。例如，關注蛋白可為一抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗體或其片段、一嵌合抗體或其片段、一ScFv或其片段、一Fc-標籤蛋白(例如Trap蛋白)或其片段、一生長因子或其片段、一細胞激素或其片段、一細胞表面受體之胞外區或其片段。
帶有天門冬醯胺-連接的(N-連接的)聚糖之糖蛋白係普遍存在真核細胞中。這些聚糖的生物合成及其轉化成多肽係在內質網(ER)中進行。藉由許多糖苷酶和糖基-轉移酶在ER和高爾基複合體中進一步修飾N-聚糖結構。使用本發明之蛋白製造係針對天然N-聚糖結構之一致性，以消除致免疫性表位(「糖表位(glycotope)」)。
使用本發明之方法，重組蛋白堆展現有利的特質。複製蛋白生產批件之HPLC(以螢光偵測)驗證了糖蛋白具有統一的表現和糖基化模式，如文中圖7-8所示例。提供一糖基化N-聚糖蛋白基質的方法，然而編碼一核酸分子的哺乳動物宿主細胞，包括可操作連接一編碼糖基化所需蛋白基質之基因的哺乳動物衣黴素(Tn)-抗藥基因；將此細胞於第一Tn濃度之存在下培養；將表現至少一複製之Tn-抗藥基因的細胞群族分離；將此細胞群族於增加的Tn濃度之存在下培養；及從細胞培養中分離N-聚糖蛋白基質。蛋白基質的N-聚糖含量可就單糖、寡糖的存在，藉由本項技術中已知的方 法來評估。
詳細的聚糖-連接蛋白之結構分析可能與蛋白的功能特性相關聯。此定性蛋白糖基化之分析典型地係涉及數個步驟：i)酵素或化學釋放連接的聚糖；ii)經由以芳香系或脂肪系胺之還原性胺化或泛甲基化將釋放的聚糖衍生化；iii)分析聚糖。許多分析糖化模式之變化已為熟習技術者所知。糖蛋白可帶有以特定數量佔據各種位置之數種形式的糖型，且因此其複雜性可能使其難以用特定的生產方法再製。糖型的種類和數量的一致性為可測量的且係代表對治療蛋白製造之所希望的結果。
宿主細胞及轉染
用於本發明方法之哺乳動物宿主細胞為真核宿主細胞，通常為哺乳動物細胞，包括，例如CHO細胞和小鼠細胞。在一實施例中，本發明係提供包括一編碼衍生自中國倉鼠(Cricetulus griseus)Tn抗藥標記蛋白之核酸序列(如前述SEQ ID NO：3)或其同源物或變體的細胞。在某些實施例中，此細胞係包括多基因複製之Tn抗藥標記基因。在其他的實施例中，本發明係提供編碼一衍生自人類(SEQ ID NO：4)、獼猴(SEQ ID NO：5)、黑猩猩(SEQ ID NO：6)、狗(SEQ ID NO：7)、天竺鼠(SEQ ID NO：8)、大鼠(SEQ ID NO：9)或小鼠(SEQ ID NO：10)之Tn抗藥標記蛋白的核酸序列。
本發明包括一以本發明表現載體轉染之哺乳動物宿主細胞。轉染的宿主細胞包括經表現載體轉染之細胞，而該表現載體係包括一編碼關注蛋白或多肽之序列。表現的蛋白，依照所選的核酸序列，典型地係分泌至細胞培養基中，但可能保留在細胞或儲存在細胞膜中。各種哺乳動物細胞培養系統皆可用於表現重組的蛋白。適合的哺乳動物宿主細胞株之實例包括Gluzman(1981)Cell 23：175所描述之猴子腎臟細胞的COS-7細胞株，以及能表現一適當載體之其他細胞株，包括，例如CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478)、L細胞、C127、3T3、CHO、HeLa和BHK細胞株。開發用於特定選擇或增幅流程之其他細胞株亦可用於文中所提供的方法和組成物。在本發明一實施例中，此細胞為稱為K1之CHO細胞株(亦即CHO K1細胞)。為了達到高生產量的重組蛋白之目標，此宿主細胞在適當的情況下應預-適應於生物反應器培養基。
本項技術中已知有數種轉染方法，並檢視Kaufman(1988)Meth.Enzymology 185：537。所選的轉染方法將依照宿主細胞種類和GOI性質而定，且可以例行的實驗為基礎來做選擇。任何此法之基本需求為首先將編碼關注蛋白之DNA導入一適合的宿主細胞中，及然後以一相對穩定、可表現的方式鑑定和分離已併入異源DNA之宿主細胞。
可用於將異源DNA導入哺乳細胞之有用的特定試劑包括LipofectinTM試劑及LipofectamineTM試劑(Gibco BRL,Gaithersburg,Md.)。此二種試劑為用於形成脂質-核酸複合物(或微脂體)之市面上可購得的試劑，當其應用於培養細胞時，係幫助核酸攝入細胞中。
所選的轉染方法和選擇用於文中之元素將依照所用的宿主細胞類型而定。熟習本項技術者知道許多不同的方法和宿主細胞，以所用的細胞培養系統的要求為基礎，並可選擇一適當的系統表現所欲的蛋白。在另一方面，本發明係關於編碼一多肽之表現載體，其包括(但不限於)抗體、雙特異性抗體、嵌合抗體、ScFv、抗原結合蛋白或Fc融合蛋白。此等表現載體可使用本發明之方法和組成物用於重組的多肽製造。
本發明之其他的特色，在下列用於說明本發明且不希望限制本發明之示例性實施例的說明過程中，將變得顯而易見。
實例
提出下列實例以提供本項技術之一般技術者如何製造和使 用文中所述之方法和組成物，且並不希望限制本發明者所認為之其發明的內容。已努力確保有關所用的數字(例如量、溫度等)之正確性，但可能有某些實驗誤差和偏差。除非另有指出，否則份數為重量份，分子量為平均分子量，溫度為攝氏度數，而壓力為大氣壓或接近大氣壓。
實例1.表現GPT之轉染細胞的選擇效率
將經修飾的CHO K1細胞以一含有CHO-GPT(SEQ ID NO：2)、人類GPT(SEQ ID NO：12)之質體載體或含有一效高黴素磷酸轉移酶(Hpt，效高黴素抗藥基因)之質體載體轉染；例如可選擇標記基因(CHO-GPT或hpt)，在其各別的載體上係經由一IRES序列轉錄上連接一下游Egfp基因。例如，各質體係經導入，由5’至3’方向，含有下列基因序列：一Lox位置、SV40晚期啟動子、CHO-GPT(或Hpt)、IRES、增強的綠色螢光蛋白(eGFP)及一第二Lox位置。純化的重組質體係與表現Cre的重組酶共同轉染至一含有下列的經修飾的CHO宿主細胞：在一轉錄上活化的基因座中，從5'至3'為lox位置、YFP及第二lox位置。因此，此宿主CHO細胞可藉由流式細胞儀加以分離為綠色-陽性或黃色-陰性的細胞。當重組的質體表現eGFP(轉錄上受GPT或hpt基因所調控)與表現Cre重組酶之載體共同轉染時，由Cre重組酶所媒介的組合在含有lox位置之染色體基因座中使得GPT/eGFP匣之定點整合及YFP基因取代發生(亦即綠色陽性細胞)。當eGFP隨機整合，則將產生綠色-陽性或黃色-陽性的細胞。
將細胞族群以0、1μg/ml、2.5μg/ml或5μg/ml衣黴素(Tn)或400μg效高黴素(Hyg)培養，如表2所概述。以螢光-激活的細胞分選(FACS)分析測量觀察到的重組群族。分選細胞用以定量各細胞群族，並針對僅表現GFP而不表現YFP的細胞計算選擇效率(圖4或5)。
比較Tn或Hyg抗藥性細胞之集池間的選擇效率(存活的表 現GFP細胞之群組百分率)(表2)。
觀察到，衣黴素選擇與效高黴素選擇同樣有效。CHO-GPT和人類GPT二者在1ug/ml或2.5ug/ml衣黴素的存在下就整合物的選擇為有效的。
實例2.基因產物之增幅
藉由將增加濃度的衣黴素施予GPT表現系統來進行增量選擇。以一含有如上CHO-GPT基因(SEQ ID NO：2)之質體載體轉染CHO K1細胞。此質體以5’至3’方向，係含有一Lox位置、一SV40晚期啟動子、CHO-GPT基因、一IRES、eGFP和第二Lox位置。CRE-lox位置引導關注基因整合至基因體中，產生每個細胞帶有至少一GPT分泌之穩定的轉染物 的細胞集池(如上所見，由於隨機整合，可能產生更多的整合物)。起初在1μg/ml衣黴素(Tn)的存在下培養CHO細胞。然後從穩定的集池(稱為細胞集池2)中選擇轉染物及隨後在1μg/ml、2.5μg/ml或5μg/ml Tn的存在下擴增。進行數回選擇以鑑別能增強eGFP表現(多重複製)的細胞族群。在2.5μg/ml或5μg/ml Tn的存在下，隨機整合事件大大增加。
使用標準qPCR法測量基因產物CHO GPT、eGFP或mGapdh的複製數(正常化控制)。來自1μg/ml Tn-抗藥性集池另再以2.5ug/ml Tn培養之細胞eGFP的複製數為來自1μg/ml Tn-抗藥性集池另再以1μg/ml Tn培養的eGFP複製數至少2倍。當1μg/ml Tn-處理的集池另再以5μg/ml Tn培養時，基因複製數進一步增加。eGFP基因複製數的增加係與增加的CHO-GPT基因複製相關聯(參見圖6A和6B)。
就測定基因數增加是否會轉譯增加的蛋白表現，係藉由FACS針對經數回Tn選擇，亦即1、2.5或5μg Tn處理過的表現GPT和eGFP之小細胞集池，測量平均螢光強度(MFI)(參見，例如圖6B中的實例7、8和9)。這些細胞集池的eGFP表現之比較係如表3所示。
就eGFP生產量，進行第二輪5μg Tn選擇之表現GPT的細胞集池，相較於1μg Tn處理，生產量恰好大2.5倍，及相較於2.5μg Tn處理的生產量則大1.5倍(表3)。
不受限於任一理論，累加的Tn濃度之增加以一控制的方式擴增了對細胞的選擇壓力，因此增加生產量。
如下所述，亦將Tn-抗藥性表現載體用於另外的實驗，用以檢測Tn選擇對糖基化模式的效應。
實例3.示例的二聚蛋白之表現和糖基化性質
以含有GPT的表現載體轉染表現「Trap」蛋白(Fc融合蛋白-1，以下稱為FcFP1)之CHO細胞。此質體具有，以5’至3’方向，一Lox位置、一SV40晚期啟動子、一Tn-抗藥基因(CHO-GPT)、一IRES、eGFP、SV40 polyA和第二Lox位置。使用1μg/mL Tn或5μg/mL Tn進行GPT可選擇標記之選擇。以懸浮培養於無-血清生產培養基中擴增選擇的集池細胞。藉由FACS分析以eGFP之表現確認GPT轉染。將從選擇的集池所收集之團塊進行GPT表現之複製數分析，及設定一12天的生產率分析，用以測定以不同衣黴素濃度所選擇的集池中之FcFP1表現量。
FcFP1係就其複合糖基化模式作選擇，具有充足糖基化位置。就測定糖基化性質，係將表現FcF1蛋白之細胞，如表4所示，以細胞培養於標準的方法(無Tn)或Tn處理的條件下擴增，然後分離及純化蛋白。
使用層析以熟知的HPLC方法和螢光鄰胺苯甲酸(AA)標籤為基準(Anumula，和Dhume,Glycobiology,8(7)：685-694,1998)，就各批件的 糖蛋白進行詳細的聚糖分析，用以測定Tn對糖基化是否具有負面影響。亦將生產批件與代表治療上可接受蛋白批件之參照標準作比較。代表性的聚糖分析係如圖7A-7D所示。各批，相較於參照批件，一致地產生相同的波峰數目、相對形狀和相對強度。重疊的各層析圖(圖8)顯示，並無單獨或異常的波峰未顯露出。
以熟知的HPLC法對參照標準批件就FcFP1蛋白進行寡糖性質分析。就FcFP1 trap蛋白批件測量唾液酸化之量並計算各批件(3重複)的Z-數。Z-數係代表各批件間變異的測量值。Z-數係考量相對波峰數，以及各波峰的相對波形和強度。例如，圖7A-7D中各0SA、1SA、2SA、3SA和4SA波峰的面積係如表5經定量。
OS=寡糖；0SA=0個唾液酸殘基；1SA=1個唾液酸殘基；2SA=2個唾液酸殘基；3SA=3個唾液酸殘基；4SA=4個唾液酸殘基
相較於參照批件，各批所計算的Z-數係在可接受範圍內，因此請了解，各蛋白批件係達到如同治療分子的相同物質。因為Tn的存在已知對於N-連接的糖蛋白之糖基化具有負面效應，因此並未預期蛋白生產以及生產率，在Tn所給予之增加的選擇壓力條件下為可靠且一致。
在無悖離本發明之精神或要素下，本發明可以其他特定的實施例具體化。
【序列表】(請換頁單獨記載)
本申請案係以引用方式併入電腦可讀取形式所提出之序列表，該序列表係於2015年8月3日所製，存檔為8700WO_ST25.txt(75,769個位元)。
<110> 再生元醫藥公司 Regeneron Pharmaceuticals,Inc.
<120> 重組蛋白之有效選擇性 EFFICIENT SELECTIVITY OF RECOMBINANT PROTEINS
<130> 8700WO
<150> US 62/039,416
<151> 2014-08-19
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6964
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
<210> 2
<211> 1231
<212> DNA
<213> 中國倉鼠(Cricetulus griseus)
<400> 2
<210> 3
<211> 408
<212> PRT
<213> 中國倉鼠(Cricetulus griseus)
<400> 3
<210> 4
<211> 408
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
<210> 5
<211> 408
<212> PRT
<213> 恆河獼猴(Macaca mulatta)
<400> 5
<210> 6
<211> 408
<212> PRT
<213> 黑猩猩(Pan troglodytes)
<400> 6
<210> 7
<211> 408
<212> PRT
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 7
<210> 8
<211> 408
<212> PRT
<213> 天竺鼠(Cavia porcellus)
<400> 8
<210> 9
<211> 410
<212> PRT
<213> 大鼠(Rattus norvegicus)
<400> 9
<210> 10
<211> 410
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 10
<210> 11
<211> 1920
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 11
<210> 12
<211> 2150
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
<210> 13
<211> 1840
<212> DNA
<213> 大鼠(Rattus norvegicus)
<400> 13
<210> 14
<211> 5424
<212> DNA
<213> 恆河獼猴(Macaca mulatta)
<400> 14
<210> 15
<211> 5894
<212> DNA
<213> 黑猩猩(Pan troglodytes)
<220>
<221> misc_feature
<222> (3408)..(3408)
<223> n為a,c,g或t
<400> 15
<210> 16
<211> 4557
<212> DNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 16
<210> 17
<211> 5374
<212> DNA
<213> 中國倉鼠(Cricetulus griseus)
<400> 17

Claims (59)

  1. 一種單離細胞，係包括一編碼與SEQ ID NO：3胺基酸序列具有至少93%相同度之蛋白的哺乳動物衣黴素(tunicamycin)(Tn)-抗藥基因，而該基因可操作連接一關注基因(gene of interest；GOI)和至少一調控元素。
  2. 如請求項1之單離細胞，其中該Tn-抗藥基因係外源上加入細胞。
  3. 如請求項1或2之單離細胞，其中該Tn-抗藥基因係編碼與SEQ ID NO：3之胺基酸序列具有至少95%相同度之蛋白。
  4. 如請求項1至3中任一項之單離細胞，其中該Tn-抗藥基因係編碼與SEQ ID NO：3之胺基酸序列具有至少98%相同度之蛋白。
  5. 如請求項1或2之單離細胞，其中該Tn-抗藥基因係包括由下列組成之群中選出的核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：17。
  6. 如請求項1或2之單離細胞，其中該Tn-抗藥基因係包括包含SEQ ID NO：12之核酸序列。
  7. 如請求項1至6中任一項之單離細胞，其中該至少一調控元素係由下列組成之群中選出：啟動子、核醣體-結合位置及增強子。
  8. 如請求項1至7中任一項之單離細胞，其進一步係包括一第二關注基因(GOI)。
  9. 如請求項1至8中任一項之單離細胞，其中該關注基因(GOI)為一外源上加入的GOI。
  10. 如請求項1至9中任一項之單離細胞，其中該外源上加入的GOI為一人類基因。
  11. 如請求項1至10中任一項之單離細胞，其中該調控元素為一外源上 加入的調控元素。
  12. 如請求項1至11中任一項之單離細胞，其中該第一及/或第二GOI係由下列組成之群中選出：抗體重鏈、抗體輕鏈、抗原結合片段及Fc-融合蛋白。
  13. 如請求項8至12中任一項之單離細胞，其中該第一GOI和第二GOI係獨立地由下列組成之群中選出：編碼一抗體輕鏈或其抗原-特異性片段、一抗體重鏈或其抗原-特異性片段、一Fc-融合蛋白或其片段，及一受體或其配體-特異性片段之基因。
  14. 如請求項1至13中任一項之單離細胞，其中該GOI可操作連接一啟動子。
  15. 如請求項1至14中任一項之單離細胞，其中該GOI係編碼一選自一抗體輕鏈或其抗原-結合片段、一抗體重鏈或其抗原-結合片段、一Fc-融合蛋白或其片段，一配體及一受體或其配體-結合片段之糖蛋白。
  16. 如請求項8至15中任一項之單離細胞，其中一重組酶辨識位置存在於第一GOI和第二GOI之間。
  17. 如請求項8之單離細胞，其進一步係包括一第一GOI之重組酶辨識位置5’及一有關第二GOI之重組酶辨識位置3’。
  18. 如請求項1至17中任一項之單離細胞，其中該細胞為一真核細胞。
  19. 如請求項1至18中任一項之單離細胞，其中該細胞為一哺乳動物細胞。
  20. 如請求項1至18中任一項之單離細胞，其中該細胞係由下列組成之群中選出：CHO-K1、COS-7、HEK293、腫瘤細胞、淋巴細胞、視網膜細胞及幹細胞。
  21. 如請求項1至20中任一項之單離細胞，其中該細胞為一CHO-K1細胞。
  22. 一種製造重組的關注蛋白(protein of interest；POI)之方法，其中該方 法係包括：a.提供一編碼核酸分子之哺乳動物宿主細胞，其包括(i)一哺乳動物衣黴素(Tn)-抗藥性基因及(ii)編碼該POI之基因；b.在第一Tn濃度的存在下培養此細胞；c.分離表現至少一複製的Tn-抗藥基因之細胞族群；d.在增加的Tn濃度之存在下培養此細胞群族，其中增加Tn的濃度係增加POI產生；及e.從細胞培養中分離此POI。
  23. 如請求項22之方法，其中該哺乳動物Tn-抗藥基因係包括一與SEQ ID NO：2核酸序列具有至少95%相同度之核酸序列。
  24. 如請求項22之方法，其中該哺乳動物Tn-抗藥基因係包括一與SEQ ID NO：2核酸序列具有至少98%相同度之核酸序列。
  25. 如請求項22至24中任一項之方法，其中該哺乳動物Tn-抗藥基因係包括一中國倉鼠(Cricetulus griseus)Tn-抗藥基因。
  26. 如請求項22之方法，其中該哺乳動物Tn-抗藥基因係包括一人類Tn-抗藥基因。
  27. 如請求項22之方法，其中該哺乳動物Tn-抗藥基因係包括由下列組成之群中選出的核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：17。
  28. 如請求項22至27中任一項之方法，其中該Tn-抗藥基因可操作連接該編碼POI的基因。
  29. 如請求項22至27中任一項之方法，其中該編碼POI的基因可操作連接至少一調控元素。
  30. 如請求項29之方法，其中該至少一調控元素係由下列組成之群中選出：啟動子、核醣體結合位置及增強子。
  31. 如請求項22至30中任一項之方法，其進一步係包括一編碼POI的第二基因。
  32. 如請求項22至31中任一項之方法，其中該基因為一外源上加入的關注基因(GOI)。
  33. 如請求項32之方法，其中該外源上加入的GOI為一人類基因。
  34. 如請求項29或30之方法，其中該調控元素為一外源上加入的調控元素。
  35. 如請求項22至34中任一項之方法，其中該POI係由下列組成之群中選出：抗體重鏈、抗體輕鏈、抗原結合片段及Fc-融合蛋白。
  36. 如請求項22至35中任一項之方法，其中該第一Tn濃度為1μg/mL。
  37. 如請求項22至36中任一項之方法，其中該增加的Tn濃度係包括一第二和第三Tn濃度。
  38. 如請求項37之方法，其中該第二濃度係大於第一Tn濃度，而該第三濃度係大於第二Tn濃度。
  39. 如請求項37或38之方法，其中該第二Tn濃度為2.5ug/ml，而第三濃度為5μg/mL。
  40. 如請求項22至36中任一項之方法，其中該增加的Tn濃度係包括一第二Tn濃度，其中該第二Tn濃度為2.5ug/ml或5μg/mL。
  41. 一種糖基化N-聚糖蛋白基質之方法，其中該方法係包括：a.提供一編碼核酸分子之哺乳動物宿主細胞，其係包括一可操作連接一編碼糖基化所需的蛋白基質之基因的哺乳動物衣黴素(Tn)-抗藥性基因；b.在第一Tn濃度的存在下培養此細胞；c.分離表現至少一複製的Tn-抗藥基因之細胞族群；d.在增加的Tn濃度之存在下培養此細胞群族，其中增加Tn的濃度係增加POI生產量；及 e.從細胞培養中分離此蛋白基質。
  42. 如請求項41之方法，其中該哺乳動物Tn-抗藥基因係包括一與SEQ ID NO：2核酸序列具有至少93%相同度之核酸序列。
  43. 如請求項39之方法，其中該哺乳動物Tn-抗藥基因係包括一與SEQ ID NO：2核酸序列具有至少98%相同度之核酸序列。
  44. 如請求項41至43中任一項之方法，其中該哺乳動物Tn-抗藥基因係包括一中國倉鼠(Cricetulus griseus)Tn-抗藥基因。
  45. 如請求項41之方法，其中該哺乳動物Tn-抗藥基因係包括一人類Tn-抗藥基因。
  46. 如請求項41之方法，其中該哺乳動物Tn-抗藥基因係包括由下列組成之群中選出的核酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17。
  47. 如請求項41至46中任一項之方法，其中該Tn-抗藥基因可操作連接該編碼POI之基因。
  48. 如請求項41至47中任一項之方法，其中該編碼POI之基因係可操作連接至少一調控元素。
  49. 如請求項48之方法，其中該至少一調控元素係由下列組成之群中選出：啟動子、核醣體結合位置及增強子。
  50. 如請求項41至47中任一項之方法，其進一步係包括一第二關注基因(GOI)。
  51. 如請求項50之方法，其中該關注基因(GOI)為一外源上加入的GOI。
  52. 如請求項51之方法，其中該外源上加入的GOI為一人類基因。
  53. 如請求項48或49之方法，其中該調控元素為一外源上加入的調控元素。
  54. 如請求項41至53中任一項之方法，其中該POI係由下列組成之群中 選出：抗體重鏈、抗體輕鏈、抗原結合片段及Fc-融合蛋白。
  55. 如請求項41至54中任一項之方法，其中該第一Tn濃度為1μg/mL。
  56. 如請求項41至55中任一項之方法，其中該增加的Tn濃度係包括一第二和第三Tn濃度。
  57. 如請求項56之方法，其中該第二濃度係大於第一Tn濃度，而該第三濃度係大於第二Tn濃度。
  58. 如請求項56或57之方法，其中該第二Tn濃度為2.5ug/ml，而第三濃度為5μg/mL。
  59. 如請求項41至55任一項中之方法，其中該增加的Tn濃度係包括一第二Tn濃度，其中該第二Tn濃度為2.5ug/ml或5μg/mL。
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