JP2020174681A - 組み換え型タンパク質の効率的な選択性 - Google Patents

Abstract

【課題】哺乳類細胞内の組み換え型タンパク質の発現を一貫した効率的な様式で提供する。【解決手段】本発明は、哺乳類選択マーカーを採用することによる哺乳類細胞内のタンパク質の改善された発現のための方法および組成物を含む。本発明は、哺乳類細胞内の組み換え型タンパク質の選択性および強化した発現コピーだけでなくタンパク質収量を増強する方法、ならびにかかる発現系を使用する方法を含む。本発明は、調節可能な選択マーカーとして哺乳類Ｔｎ耐性遺伝子、ＧＰＴを利用する哺乳類細胞系内の組み換え型タンパク質の生成のための改善した方法を提供し、また、組み換え型タンパク質のグリコシル化のための改善された方法、すなわち所望のタンパク質の一貫した質の収量を提供するために哺乳類細胞系内で糖タンパク質を作製するための方法も提供する。【選択図】図１

Description

（参照による組み込み）
本出願は、２０１５年８月３日に作成されたファイル「８７００ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」（７５，７６９バイト）としてコンピュータ可読形式で提出される配列表を参照により組み込む。

本発明は、哺乳類細胞内の組み換え型タンパク質の発現を一貫した効率的な様式で提供する。特に、本発明は、哺乳類選択マーカーを採用することによる哺乳類細胞内のタンパク質の改善された発現のための方法および組成物を含む。本発明は、哺乳類細胞内の組み換え型タンパク質の選択性および強化した発現コピーだけでなくタンパク質収量を増強する方法、ならびにかかる発現系を使用する方法を含む。

細胞発現系の開発は、研究用途および治療用途のために、所与のタンパク質の信頼性がありかつ効率的な供給源を提供するための重要な目標である。哺乳類細胞内での組み換え型タンパク質発現は、例えば、哺乳類発現系は組み換え型タンパク質を翻訳後に適切に修飾できる能力のため、治療用タンパク質を製造するためには好ましいことが多い。

哺乳類の宿主内での発現のために様々なベクターが利用可能であり、各々が細胞培養の間に組み換え型タンパク質を発現する細胞の容易な単離を可能にする選択マーカーを含有する。選択マーカー遺伝子（ＳＭＧ）は目的タンパク質を発現する細胞に選択的な利点を与えるので、かかる系ではＳＭＧが利用されるが、ＳＭＧは、数ある理由の中でも、その表現型の中立性、効率、および多用途性のために最適化される必要がある。

ＳＭＧの宿主となる多数のベクターおよび発現系の可用性にもかかわらず、哺乳類系内で達成される組み換え型タンパク質の発現は、数量、もしくは質、またはこれらの両方のいずれかの面でしばしば満足のいかないものである。分子の生物学的な「フィンガープリント」、例えば、グリコシル化のような翻訳後の修飾は、組み換え型タンパク質治療の開発では分子の有用性および有効性を画定するうえで特に重要である（Ｃｕｍｍｉｎｇ、Ｄ．Ａ．，１９９０，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１（２）：１１５−１３０）。発現された目的タンパク質の生物学的特性に悪影響を及ぼさないＳＭＧは特に有用である。

Ｃｕｍｍｉｎｇ、Ｄ．Ａ．，１９９０，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１（２）：１１５−１３０

大部分のＳＭＧは細菌起源であり、また哺乳類系での使用に対して、細菌性抗生物質耐性遺伝子の環境細菌への水平伝播のリスクに対する懸念が高まることによる他の不利点がもたらされる（Ｂｒｅｙｅｒ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３３：２８６−３３０）。細菌性抗生物質耐性遺伝子の使用を除去することは、消費者受容に良い影響を有し、かつかかる知覚リスクを軽減する可能性がある。

遺伝子操作した自己細胞は急速に臨床的な成功を収めてきている（例えば、Ｋｅｒｓｈａｗ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｃａｎｃｅｒ １３：５２５−５４１を参照のこと）。特に非ヒト構成要素のヒト自己細胞への望ましくない導入は患者の安全性に対する深刻な結果を有する可能性があるので、ヒト自己細胞産物での遺伝子修飾のためのベクターの選択および設計は重要である。（Ｅａｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ． ２：８７１−８８３；ｆｉｒｓｔ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ｉｎ ＳＣＴＭ ＥＸＰＲＥＳＳ Ｏｃｔｏｂｅｒ ７，２０１３）。細菌性ではなく、哺乳類起源の構成要素のみを有するベクター系は、養子免疫療法のための患者に特異的なＴ細胞での使用に対して有用であることになる。

したがって、哺乳類の目的タンパク質の生成のために、哺乳類選択性遺伝子、特に形質転換した細胞に表現型の利点または代謝的な利点を与えるものを発現系内に導入することが望ましい。さらに、十分に高いレベルの治療用タンパク質を確実に発現し、また翻訳後に治療用タンパク質を適切かつ一貫して修飾する細胞株がたいへん望ましい。したがって、当該技術分野において、改善された哺乳類発現系に対する必要性がある。

哺乳類発現系内での哺乳類ツニカマイシン（Ｔｎ）耐性遺伝子の選択マーカーとしての使用は、効率およびトランスフェクタントのコピー数を増加することができる。目的遺伝子に操作可能にリンクしたＴｎ耐性遺伝子の使用が哺乳類細胞の集団上に選択圧力を作り出し、これによってトランスフェクタント（すなわち、目的遺伝子）のランダム組み込みが増加することが観察された。選択マーカー系が所望のトランスフェクタントの選択を育成する場合があることが理解されるが、しかしながら本発明の方法は、効率および目的遺伝子のランダム組み込みの両方の予想外の増加だけでなく、望ましいタンパク質の信頼性のある生物学的質を付与する。したがって、本発明の組成物および方法は発現されたタンパク質に対する質的に好ましい翻訳後の修飾の有用な選択を可能にする。

一態様では、本発明は、配列番号：３のアミノ酸配列に少なくとも９３％の同一性を有するタンパク質をコードする哺乳類ツニカマイシン（Ｔｎ）耐性遺伝子を含み、目的遺伝子（ＧＯＩ）および少なくとも１つの調節要素に操作可能にリンクした、単離細胞を提供する。

別の態様では、本発明は、組み換え型の目的タンパク質（ＰＯＩ）を生成する方法を提供し、この方法は、（ｉ）哺乳類ツニカマイシン（Ｔｎ）耐性遺伝子および（ｉｉ）ＰＯＩをコードする遺伝子を含む核酸分子をコードする哺乳類宿主細胞を提供することと、第１の濃度のＴｎの存在下で細胞を培養することと、Ｔｎ耐性遺伝子の少なくとも１つのコピーを発現する細胞集団を単離することと、Ｔｎの増加する濃度の存在下で細胞集団を培養することであって、Ｔｎの増加する濃度がＰＯＩの生成を増加することと、ＰＯＩを細胞培養から単離することとを含む。

また別の態様では、本発明は、Ｎ−グリカンタンパク性基質をグリコシル化する方法を提供し、この方法は、グリコシル化を必要としてタンパク性基質をコードする遺伝子に操作可能にリンクした哺乳類ツニカマイシン（Ｔｎ）耐性遺伝子を含む核酸分子をコードする哺乳類宿主細胞を提供することと、第１の濃度のＴｎの存在下で細胞を培養することと、Ｔｎ耐性遺伝子の少なくとも１つのコピーを発現する細胞集団を単離することと、Ｔｎの増加する濃度の存在下で細胞集団を培養することであって、Ｔｎの増加する濃度がＰＯＩの生成を増加する、ことと、タンパク性基質を細胞培養から単離することとを含む。

この方法の一部の実施形態では、Ｔｎ耐性遺伝子は、ＰＯＩをコードする遺伝子に操作可能にリンクし、またＰＯＩをコードする遺伝子は少なくとも１つの調節要素に操作可能にリンクする。

一部の実施形態では、Ｔｎ耐性遺伝子は細胞に外因的に添加される。他の実施形態では、Ｔｎ耐性遺伝子は、配列番号：３のアミノ酸配列と少なくとも９３％の同一性を有するタンパク質をコードする。他の実施形態では、Ｔｎ耐性遺伝子は、配列番号：３のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するタンパク質をコードする。一部の実施形態では、Ｔｎ耐性遺伝子は、配列番号：４のアミノ酸配列と少なくとも９３％の同一性を有するタンパク質をコードする。さらに他の実施形態では、Ｔｎ耐性遺伝子は、配列番号：４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するタンパク質をコードする。

一部の実施形態では、哺乳類Ｔｎ耐性遺伝子は、チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）Ｔｎ耐性遺伝子を含む。他の実施形態では、哺乳類Ｔｎ耐性遺伝子はヒトＴｎ耐性遺伝子を含む。

Ｔｎ耐性遺伝子は、配列番号：２、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、および配列番号：１７から成る群から選択される核酸配列も含んでもよい。

前述の発明の一定の実施形態では、哺乳類Ｔｎ耐性遺伝子は、配列番号：２の核酸配列と少なくとも９２％の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、哺乳類Ｔｎ耐性遺伝子は、配列番号：１２の核酸配列と少なくとも９２％の同一性を有する核酸配列を含む。

Ｔｎ耐性遺伝子に操作可能にリンクした少なくとも１つの調節要素が本発明の単離細胞の中に提供され、調節要素は、プロモーター、リボソーム結合部位、およびエンハンサーを含むが、これに限定されない。さらに別の実施形態では、ＧＯＩはプロモーターに操作可能にリンクする。別の実施形態では、ＧＯＩはＩＲＥＳなどのリボソーム結合部位に操作可能にリンクする。

一部の実施形態では、本発明の単離細胞および方法は第２の目的遺伝子（ＧＯＩ）をさらに含み、一方でＧＯＩは目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする。一実施形態では、目的遺伝子（ＧＯＩ）は外因的に添加されたＧＯＩである。別の実施形態では、外因的に添加されたＧＯＩは、ヒトの遺伝子である。また別の実施形態では、調節要素は外因的に添加された調節要素である。

他の実施形態では、ＰＯＩをコードする第１のＧＯＩおよび／または第２のＧＯＩは、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗原結合断片、および／またはＦｃ融合タンパク質を含むがこれに限定されない。

別の実施形態では、第１のＧＯＩおよび第２のＧＯＩは、抗体軽鎖またはその抗原特異的な断片、抗体重鎖またはその抗原特異的な断片、Ｆｃ融合タンパク質またはその断片、および受容体またはそのリガンド特異的な断片をコードする遺伝子、から成る群から独立して選択される。一実施形態では、リコンビナーゼ認識部位は、第１のＧＯＩと第２のＧＯＩとの間に存在する。他の実施形態では、本発明は、第１のＧＯＩに対するリコンビナーゼ認識部位５’と、前記第２のＧＯＩに対するリコンビナーゼ認識部位３’と、をさらに含む。

さらに別の実施形態では、ＧＯＩは、抗体軽鎖またはその抗原結合断片、抗体重鎖またはその抗原結合断片、Ｆｃ融合タンパク質またはその断片、リガンド、および受容体またはそのリガンド結合断片から選択される糖タンパク質をコードする。

本発明の単離した自然発生的でない細胞は、真核細胞に由来する場合がある。一実施形態では、細胞は哺乳類細胞である。一部の実施形態では、単離細胞はエクスビボヒト細胞である。他の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ−１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、リンパ球、幹細胞、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ細胞、腫瘍細胞、および前述の細胞に由来する細胞株から成る群から選択される。ある一定の実施形態では、本発明の単離細胞はＣＨＯ−Ｋ１細胞、リンパ球、網膜細胞、または幹細胞である。

一実施形態では、Ｔｎの第１の濃度は１μｇ／ｍＬである。別の実施形態では、Ｔｎの増加する濃度は、Ｔｎの第２の濃度および第３の濃度である。

一部の実施形態では、Ｔｎの第２の濃度は第１の濃度より大きく、またＴｎの第３の濃度は第２の濃度より大きい。ある一定の実施形態では、Ｔｎの第２の濃度は２．５μｇ／ｍＬであり、また第３の濃度は５μｇ／ｍＬである。

さらに他の実施形態では、Ｔｎの増加する濃度はＴｎの第２の濃度を含み、Ｔｎの第２の濃度は２．５μｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬである。

別の方法で特定されない限り、または文脈から明らかでない限り、本発明の態様および実施形態のいずれかを、本発明の任意の他の態様または実施形態と併せて使用することができる。

他の目的および利点は、次の発明を実施するための形態の検討から明らかになるであろう。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
配列番号：３の前記アミノ酸配列に少なくとも９３％の同一性を有するタンパク質をコードする哺乳類ツニカマイシン（Ｔｎ）耐性遺伝子を含み、目的遺伝子（ＧＯＩ）および少なくとも１つの調節要素に操作可能にリンクした、単離細胞。
（項目２）
前記細胞に前記Ｔｎ耐性遺伝子が外因的に添加された、項目１に記載の単離細胞。
（項目３）
前記Ｔｎ耐性遺伝子が、配列番号：３の前記アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する前記タンパク質をコードする、項目１または２に記載の単離細胞。
（項目４）
前記Ｔｎ耐性遺伝子が配列番号：３の前記アミノ酸配列と少なくとも９８％の同一性を有する前記タンパク質をコードする、項目１〜３のいずれか一項に記載の単離細胞。
（項目５）
前記Ｔｎ耐性遺伝子が、配列番号：２、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、および配列番号：１７から成る群から選択される核酸配列を含む、項目１または２に記載の単離細胞。
（項目６）
前記Ｔｎ耐性遺伝子が、配列番号：１２を含む前記核酸配列を含む、項目１または２に記載の単離細胞。
（項目７）
前記少なくとも１つの調節要素が、プロモーター、リボソーム結合部位、およびエンハンサーから成る群から選択される、項目１〜６のいずれか一項に記載の単離細胞。
（項目８）
第２の目的遺伝子（ＧＯＩ）をさらに含む、項目１〜７のいずれか一項に記載の単離細胞。
（項目９）
前記目的遺伝子（ＧＯＩ）が外因的に添加されたＧＯＩである、項目１〜８のいずれか一項に記載の単離細胞。
（項目１０）
前記外因的に添加されたＧＯＩがヒトの遺伝子である、項目１〜９のいずれか一項に記載の単離細胞。
（項目１１）
前記調節要素が外因的に添加された調節要素である、項目１〜１０のいずれか一項に記載の単離細胞。
（項目１２）
前記第１のおよび／または第２のＧＯＩが、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗原結合断片、およびＦｃ融合タンパク質から成る群から選択される、項目１〜１１のいずれか一項に記載の単離細胞。
（項目１３）
前記第１のＧＯＩおよび前記第２のＧＯＩが、抗体軽鎖またはその抗原特異的な断片、抗体重鎖またはその抗原特異的な断片、Ｆｃ融合タンパク質またはその断片、および受容体またはそのリガンド特異的な断片をコードする遺伝子、から成る群から独立して選択される、項目１〜１２のいずれか一項に記載の単離細胞。
（項目１４）
前記ＧＯＩがプロモーターに操作可能にリンクした、項目１〜１１３のいずれか一項に記載の単離細胞。
（項目１５）
前記ＧＯＩは、抗体軽鎖またはその抗原結合断片、抗体重鎖またはその抗原結合断片、Ｆｃ融合タンパク質またはその断片、リガンド、および受容体またはそのリガンド結合断片から選択される糖タンパク質をコードする、項目１〜１４のいずれか一項に記載の単離細胞。
（項目１６）
リコンビナーゼ認識部位が前記第１のＧＯＩと前記第２のＧＯＩとの間に存在する、項目８〜１５のいずれか一項に記載の単離細胞。
（項目１７）
前記第１のＧＯＩに対するリコンビナーゼ認識部位５’と、前記第２のＧＯＩに対するリコンビナーゼ認識部位３’と、をさらに含む、項目８に記載の単離細胞。
（項目１８）
前記細胞が真核細胞である、項目１〜１７のいずれか一項に記載の単離細胞。
（項目１９）
前記細胞が哺乳類細胞である、項目１〜１８のいずれか一項に記載の単離細胞。
（項目２０）
前記細胞が、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、腫瘍細胞、リンパ球、網膜細胞、および幹細胞から成る群から選択される、項目１〜１８のいずれか一項に記載の単離細胞。
（項目２１）
前記細胞がＣＨＯ−Ｋ１細胞である、項目１〜２０のいずれか一項に記載の単離細胞。
（項目２２）
組み換え型の目的タンパク質（ＰＯＩ）を生成する方法であって、
ａ． （ｉ）哺乳類ツニカマイシン（Ｔｎ）耐性遺伝子および（ｉｉ）前記ＰＯＩをコードする遺伝子を含む核酸分子をコードする哺乳類宿主細胞を提供することと、
ｂ． 前記Ｔｎの第１の濃度の存在下で前記細胞を培養することと、
ｃ． 前記Ｔｎ耐性遺伝子の少なくとも１つのコピーを発現する細胞集団を単離することと、
ｄ． 前記Ｔｎの増加する濃度の存在下で前記細胞集団を培養することであって、前記Ｔｎの増加する濃度が前記ＰＯＩの生成を増加することと、
ｅ． 前記ＰＯＩを前記細胞培養から単離することとを含む、方法。
（項目２３）
前記哺乳類Ｔｎ耐性遺伝子が配列番号：２の前記核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記哺乳類Ｔｎ耐性遺伝子が配列番号：２の前記核酸配列と少なくとも９８％の同一性を有する核酸配列を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記哺乳類Ｔｎ耐性遺伝子が、チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）Ｔｎ耐性遺伝子を含む、項目２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記哺乳類Ｔｎ耐性遺伝子がヒトＴｎ耐性遺伝子を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２７）
前記哺乳類Ｔｎ耐性遺伝子が、配列番号：２、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、および配列番号：１７から成る群から選択される核酸配列を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２８）
前記Ｔｎ耐性遺伝子が、前記ＰＯＩをコードする前記遺伝子に操作可能にリンクする、項目２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記ＰＯＩをコードする前記遺伝子が、少なくとも１つの調節要素に操作可能にリンクする、項目２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記少なくとも１つの調節要素が、プロモーター、リボソーム結合部位、およびエンハンサーから成る群から選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記ＰＯＩをコードする第２の遺伝子をさらに含む、項目２２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記遺伝子が外因的に添加された目的遺伝子（ＧＯＩ）である、項目２２〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記外因的に添加されたＧＯＩがヒトの遺伝子である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記調節要素が外因的に添加された調節要素である、項目２９または３０に記載の方法。
（項目３５）
前記ＰＯＩが、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗原結合断片、およびＦｃ融合タンパク質から成る群から選択される、項目２２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記Ｔｎの第１の濃度が、１μｇ／ｍＬである、項目２２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
Ｔｎの前記増加する濃度が、Ｔｎの第２の濃度およびＴｎの第３の濃度を含む、項目２２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記Ｔｎの第２の濃度が前記Ｔｎの第１の濃度より大きく、かつ前記Ｔｎの第３の濃度が前記Ｔｎの第２の濃度より大きい、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記Ｔｎの第２の濃度が２．５μｇ／ｍＬであり、また前記Ｔｎの第３の濃度が５μｇ／ｍＬである、項目３７または３８に記載の方法。
（項目４０）
前記Ｔｎの増加する濃度がＴｎの第２の濃度を含み、前記Ｔｎの第２の濃度が２．５μｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬである、項目２２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
Ｎ−グリカンタンパク性基質をグリコシル化する方法であって、
ａ． グリコシル化を必要として前記タンパク性基質をコードする遺伝子に操作可能にリンクした哺乳類ツニカマイシン（Ｔｎ）耐性遺伝子を含む核酸分子をコードする哺乳類宿主細胞を提供することと、
ｂ． 前記Ｔｎの第１の濃度の存在下で前記細胞を培養することと、
ｃ． 前記Ｔｎ耐性遺伝子の少なくとも１つのコピーを発現する細胞集団を単離することと、
ｄ． 前記Ｔｎの増加する濃度の存在下で前記細胞集団を培養することであって、前記Ｔｎの増加する濃度が前記ＰＯＩの生成を増加することと、
ｅ． 前記タンパク性基質を前記細胞培養から単離することとを含む、方法。
（項目４２）
前記哺乳類Ｔｎ耐性遺伝子が配列番号：２の前記核酸配列と少なくとも９３％の同一性を有する核酸配列を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記哺乳類Ｔｎ耐性遺伝子が配列番号：２の前記核酸配列と少なくとも９８％の同一性を有する核酸配列を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４４）
前記哺乳類Ｔｎ耐性遺伝子が、チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）Ｔｎ耐性遺伝子を含む、項目４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記哺乳類Ｔｎ耐性遺伝子がヒトＴｎ耐性遺伝子を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４６）
前記哺乳類Ｔｎ耐性遺伝子が、配列番号：２、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、および配列番号：１７から成る群から選択される核酸配列を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４７）
前記Ｔｎ耐性遺伝子が、前記ＰＯＩをコードする前記遺伝子に操作可能にリンクする、項目４１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記ＰＯＩをコードする前記遺伝子が、少なくとも１つの調節要素に操作可能にリンクする、項目４１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記少なくとも１つの調節要素が、プロモーター、リボソーム結合部位、およびエンハンサーから成る群から選択される、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
第２の目的遺伝子（ＧＯＩ）をさらに含む、項目４１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記目的遺伝子（ＧＯＩ）が外因的に添加されたＧＯＩである、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記外因的に添加されたＧＯＩがヒトの遺伝子である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記調節要素が外因的に添加された調節要素である、項目４８または４９に記載の方法。
（項目５４）
前記ＰＯＩが、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗原結合断片、およびＦｃ融合タンパク質から成る群から選択される、項目４１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記Ｔｎの第１の濃度が、１μｇ／ｍＬである、項目４１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
Ｔｎの前記増加する濃度が、Ｔｎの第２の濃度およびＴｎの第３の濃度を含む、項目４１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記Ｔｎの第２の濃度が前記Ｔｎの第１の濃度より大きく、かつ前記Ｔｎの第３の濃度が前記Ｔｎの第２の濃度より大きい、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記Ｔｎの第２の濃度が２．５μｇ／ｍＬであり、また前記Ｔｎの第３の濃度が５μｇ／ｍＬである、項目５６または５７に記載の方法。
（項目５９）
前記Ｔｎの増加する濃度がＴｎの第２の濃度を含み、前記Ｔｎの第２の濃度が２．５μｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬである、項目４１〜５５のいずれか一項に記載の方法。

目的遺伝子をコードする核酸配列の導入、例えばｅＧＦＰの細胞ゲノム内への導入、のために使用されるクローニングベクター構築体内の操作的な発現カセットの概略的な略図を図示する。ＳＶ４０プロモーター：シミアンウイルス４０プロモーター；ＧＰＴ：ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐトランスフェラーゼ（例えば、ＣＨＯ−ＧＰＴ、配列番号：２；またはｈＧＰＴ、配列番号：１２）；ＩＲＥＳ：内部リボソーム侵入部位；ｅＧＦＰ：強化型緑色蛍光タンパク質；ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ：シミアンウイルス４０ ｐｏｌｙＡ。 図２Ａ〜図２Ｃは、チャイニーズハムスター（ＧＰＴ＿ＣＲＩＧＲ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｐ２４１４０；配列番号：３）ＧＰＴアミノ酸配列と比較した哺乳類ＧＰＴアミノ酸配列、すなわちヒト（ＧＰＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｑ９Ｈ３Ｈ５；配列番号：４）、アカゲザル（ＧＰＴ＿ＭＡＣＭＵ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｆ６ＴＸＭ３；配列番号：５）、チンパンジー（ＧＰＴ＿ＰＡＮＴＲ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｈ２Ｒ３４６；配列番号：６）、イヌ（ＧＰＴ＿ＣＡＮＦＡ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｅ２ＲＱ４７；配列番号：７）、モルモット（ＧＰＴ＿ＣＡＶＰＯ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｅ２ＲＱ４７；配列番号：８）、ラット（ＧＰＴ＿ＲＡＴ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｑ６Ｐ４Ｚ８；配列番号：９）、およびマウス（ＧＰＴ＿ＭＯＵＳＥ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｐ４２８６７；配列番号：１０）のアラインメントを代表する。 図２Ａ〜図２Ｃは、チャイニーズハムスター（ＧＰＴ＿ＣＲＩＧＲ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｐ２４１４０；配列番号：３）ＧＰＴアミノ酸配列と比較した哺乳類ＧＰＴアミノ酸配列、すなわちヒト（ＧＰＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｑ９Ｈ３Ｈ５；配列番号：４）、アカゲザル（ＧＰＴ＿ＭＡＣＭＵ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｆ６ＴＸＭ３；配列番号：５）、チンパンジー（ＧＰＴ＿ＰＡＮＴＲ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｈ２Ｒ３４６；配列番号：６）、イヌ（ＧＰＴ＿ＣＡＮＦＡ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｅ２ＲＱ４７；配列番号：７）、モルモット（ＧＰＴ＿ＣＡＶＰＯ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｅ２ＲＱ４７；配列番号：８）、ラット（ＧＰＴ＿ＲＡＴ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｑ６Ｐ４Ｚ８；配列番号：９）、およびマウス（ＧＰＴ＿ＭＯＵＳＥ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｐ４２８６７；配列番号：１０）のアラインメントを代表する。 図２Ａ〜図２Ｃは、チャイニーズハムスター（ＧＰＴ＿ＣＲＩＧＲ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｐ２４１４０；配列番号：３）ＧＰＴアミノ酸配列と比較した哺乳類ＧＰＴアミノ酸配列、すなわちヒト（ＧＰＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｑ９Ｈ３Ｈ５；配列番号：４）、アカゲザル（ＧＰＴ＿ＭＡＣＭＵ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｆ６ＴＸＭ３；配列番号：５）、チンパンジー（ＧＰＴ＿ＰＡＮＴＲ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｈ２Ｒ３４６；配列番号：６）、イヌ（ＧＰＴ＿ＣＡＮＦＡ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｅ２ＲＱ４７；配列番号：７）、モルモット（ＧＰＴ＿ＣＡＶＰＯ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｅ２ＲＱ４７；配列番号：８）、ラット（ＧＰＴ＿ＲＡＴ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｑ６Ｐ４Ｚ８；配列番号：９）、およびマウス（ＧＰＴ＿ＭＯＵＳＥ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｐ４２８６７；配列番号：１０）のアラインメントを代表する。 図３Ａおよび図３Ｂは、本発明の方法および組成物を使用してどのようにタンパク質最適化を達成することができるかを例示する。図３Ａは、ポジティブな細胞トランスフェクタントを１μｇ／ｍＬツニカマイシン（Ｔｎ）を用いて培養した第１の細胞プールから選択する方法を示す。これに続いて、第２の細胞培養は、ツニカマイシンの濃度を、例えば、２．５μｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬに増加してタンパク質発現を強化した。図３Ｂは、ポジティブ細胞トランスフェクタントを、１μｇ／ｍＬツニカマイシン（Ｔｎ）を用いて培養した第１の細胞プールから選択し、次いでタンパク質発現を最適化するためにそれに続く細胞培養内でＴｎの濃度を連続的に増加する方法を示す。 図３Ａおよび図３Ｂは、本発明の方法および組成物を使用してどのようにタンパク質最適化を達成することができるかを例示する。図３Ａは、ポジティブな細胞トランスフェクタントを１μｇ／ｍＬツニカマイシン（Ｔｎ）を用いて培養した第１の細胞プールから選択する方法を示す。これに続いて、第２の細胞培養は、ツニカマイシンの濃度を、例えば、２．５μｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬに増加してタンパク質発現を強化した。図３Ｂは、ポジティブ細胞トランスフェクタントを、１μｇ／ｍＬツニカマイシン（Ｔｎ）を用いて培養した第１の細胞プールから選択し、次いでタンパク質発現を最適化するためにそれに続く細胞培養内でＴｎの濃度を連続的に増加する方法を示す。 図４Ａ〜図４Ｂはハイグロマイシン選択性の様々なパラメータを代表するＦＡＣＳ散布図を示す。修飾されたＣＨＯ細胞はｌｏｘ部位に隣接するＹＦＰ遺伝子を含む。ｌｏｘ部位に隣接する選択マーカー（抗生物質耐性遺伝子およびｅＧＦＰ）は、ＹＦＰ部位においてＣｒｅリコンビナーゼ組み込み、かつ標的化された組み込みを介してＹＦＰをＣｒｅリコンビナーゼを用いて置き換える。ランダム組み込み体はＹＦＰおよびｅＧＦＰの両方を発現する。図４Ａ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むｈｐｔ発現ベクターを用いて形質移入されるが、培養内にハイグロマイシンなしで培養される。図４Ｂ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むｈｐｔ発現ベクターを用いて、４００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンの存在下で形質移入される。 図４Ａ〜図４Ｂはハイグロマイシン選択性の様々なパラメータを代表するＦＡＣＳ散布図を示す。修飾されたＣＨＯ細胞はｌｏｘ部位に隣接するＹＦＰ遺伝子を含む。ｌｏｘ部位に隣接する選択マーカー（抗生物質耐性遺伝子およびｅＧＦＰ）は、ＹＦＰ部位においてＣｒｅリコンビナーゼ組み込み、かつ標的化された組み込みを介してＹＦＰをＣｒｅリコンビナーゼを用いて置き換える。ランダム組み込み体はＹＦＰおよびｅＧＦＰの両方を発現する。図４Ａ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むｈｐｔ発現ベクターを用いて形質移入されるが、培養内にハイグロマイシンなしで培養される。図４Ｂ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むｈｐｔ発現ベクターを用いて、４００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンの存在下で形質移入される。 図５Ａ〜図５Ｆは、ツニカマイシン（Ｔｎ）選択性の様々なパラメータを代表するＦＡＣＳ散布図を示す。修飾されたＣＨＯ細胞はｌｏｘ部位に隣接するＹＦＰ遺伝子を含む。ｌｏｘ部位に隣接する選択マーカー（抗生物質耐性遺伝子およびｅＧＦＰ）は、ＹＦＰ部位においてＣｒｅリコンビナーゼ組み込み、かつ標的化された組み込みを介してＹＦＰをＣｒｅリコンビナーゼを用いて置き換える。ランダム組み込み体はＹＦＰおよびｅＧＦＰの両方を発現する。図５Ａ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むＣＨＯ−ＧＰＴ発現ベクターを用いて形質移入されるが、培養内にツニカマイシンなしで培養される。図５Ｂ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むＣＨＯ−ＧＰＴ発現ベクターを用いて、１μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。図５Ｃ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むＣＨＯ−ＧＰＴ発現ベクターを用いて、２．５μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。図５Ｄ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むヒトＧＰＴ発現ベクターを用いて形質移入されるが、培養内にツニカマイシンなしで培養される。図５Ｅ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むヒトＧＰＴ発現ベクターを用いて、１μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。図５Ｆ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むヒトＧＰＴ発現ベクターを用いて、２．５μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。 図５Ａ〜図５Ｆは、ツニカマイシン（Ｔｎ）選択性の様々なパラメータを代表するＦＡＣＳ散布図を示す。修飾されたＣＨＯ細胞はｌｏｘ部位に隣接するＹＦＰ遺伝子を含む。ｌｏｘ部位に隣接する選択マーカー（抗生物質耐性遺伝子およびｅＧＦＰ）は、ＹＦＰ部位においてＣｒｅリコンビナーゼ組み込み、かつ標的化された組み込みを介してＹＦＰをＣｒｅリコンビナーゼを用いて置き換える。ランダム組み込み体はＹＦＰおよびｅＧＦＰの両方を発現する。図５Ａ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むＣＨＯ−ＧＰＴ発現ベクターを用いて形質移入されるが、培養内にツニカマイシンなしで培養される。図５Ｂ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むＣＨＯ−ＧＰＴ発現ベクターを用いて、１μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。図５Ｃ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むＣＨＯ−ＧＰＴ発現ベクターを用いて、２．５μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。図５Ｄ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むヒトＧＰＴ発現ベクターを用いて形質移入されるが、培養内にツニカマイシンなしで培養される。図５Ｅ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むヒトＧＰＴ発現ベクターを用いて、１μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。図５Ｆ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むヒトＧＰＴ発現ベクターを用いて、２．５μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。 図５Ａ〜図５Ｆは、ツニカマイシン（Ｔｎ）選択性の様々なパラメータを代表するＦＡＣＳ散布図を示す。修飾されたＣＨＯ細胞はｌｏｘ部位に隣接するＹＦＰ遺伝子を含む。ｌｏｘ部位に隣接する選択マーカー（抗生物質耐性遺伝子およびｅＧＦＰ）は、ＹＦＰ部位においてＣｒｅリコンビナーゼ組み込み、かつ標的化された組み込みを介してＹＦＰをＣｒｅリコンビナーゼを用いて置き換える。ランダム組み込み体はＹＦＰおよびｅＧＦＰの両方を発現する。図５Ａ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むＣＨＯ−ＧＰＴ発現ベクターを用いて形質移入されるが、培養内にツニカマイシンなしで培養される。図５Ｂ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むＣＨＯ−ＧＰＴ発現ベクターを用いて、１μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。図５Ｃ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むＣＨＯ−ＧＰＴ発現ベクターを用いて、２．５μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。図５Ｄ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むヒトＧＰＴ発現ベクターを用いて形質移入されるが、培養内にツニカマイシンなしで培養される。図５Ｅ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むヒトＧＰＴ発現ベクターを用いて、１μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。図５Ｆ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むヒトＧＰＴ発現ベクターを用いて、２．５μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。 図５Ａ〜図５Ｆは、ツニカマイシン（Ｔｎ）選択性の様々なパラメータを代表するＦＡＣＳ散布図を示す。修飾されたＣＨＯ細胞はｌｏｘ部位に隣接するＹＦＰ遺伝子を含む。ｌｏｘ部位に隣接する選択マーカー（抗生物質耐性遺伝子およびｅＧＦＰ）は、ＹＦＰ部位においてＣｒｅリコンビナーゼ組み込み、かつ標的化された組み込みを介してＹＦＰをＣｒｅリコンビナーゼを用いて置き換える。ランダム組み込み体はＹＦＰおよびｅＧＦＰの両方を発現する。図５Ａ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むＣＨＯ−ＧＰＴ発現ベクターを用いて形質移入されるが、培養内にツニカマイシンなしで培養される。図５Ｂ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むＣＨＯ−ＧＰＴ発現ベクターを用いて、１μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。図５Ｃ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むＣＨＯ−ＧＰＴ発現ベクターを用いて、２．５μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。図５Ｄ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むヒトＧＰＴ発現ベクターを用いて形質移入されるが、培養内にツニカマイシンなしで培養される。図５Ｅ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むヒトＧＰＴ発現ベクターを用いて、１μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。図５Ｆ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むヒトＧＰＴ発現ベクターを用いて、２．５μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。 図５Ａ〜図５Ｆは、ツニカマイシン（Ｔｎ）選択性の様々なパラメータを代表するＦＡＣＳ散布図を示す。修飾されたＣＨＯ細胞はｌｏｘ部位に隣接するＹＦＰ遺伝子を含む。ｌｏｘ部位に隣接する選択マーカー（抗生物質耐性遺伝子およびｅＧＦＰ）は、ＹＦＰ部位においてＣｒｅリコンビナーゼ組み込み、かつ標的化された組み込みを介してＹＦＰをＣｒｅリコンビナーゼを用いて置き換える。ランダム組み込み体はＹＦＰおよびｅＧＦＰの両方を発現する。図５Ａ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むＣＨＯ−ＧＰＴ発現ベクターを用いて形質移入されるが、培養内にツニカマイシンなしで培養される。図５Ｂ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むＣＨＯ−ＧＰＴ発現ベクターを用いて、１μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。図５Ｃ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むＣＨＯ−ＧＰＴ発現ベクターを用いて、２．５μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。図５Ｄ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むヒトＧＰＴ発現ベクターを用いて形質移入されるが、培養内にツニカマイシンなしで培養される。図５Ｅ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むヒトＧＰＴ発現ベクターを用いて、１μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。図５Ｆ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むヒトＧＰＴ発現ベクターを用いて、２．５μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。 図５Ａ〜図５Ｆは、ツニカマイシン（Ｔｎ）選択性の様々なパラメータを代表するＦＡＣＳ散布図を示す。修飾されたＣＨＯ細胞はｌｏｘ部位に隣接するＹＦＰ遺伝子を含む。ｌｏｘ部位に隣接する選択マーカー（抗生物質耐性遺伝子およびｅＧＦＰ）は、ＹＦＰ部位においてＣｒｅリコンビナーゼ組み込み、かつ標的化された組み込みを介してＹＦＰをＣｒｅリコンビナーゼを用いて置き換える。ランダム組み込み体はＹＦＰおよびｅＧＦＰの両方を発現する。図５Ａ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むＣＨＯ−ＧＰＴ発現ベクターを用いて形質移入されるが、培養内にツニカマイシンなしで培養される。図５Ｂ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むＣＨＯ−ＧＰＴ発現ベクターを用いて、１μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。図５Ｃ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むＣＨＯ−ＧＰＴ発現ベクターを用いて、２．５μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。図５Ｄ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むヒトＧＰＴ発現ベクターを用いて形質移入されるが、培養内にツニカマイシンなしで培養される。図５Ｅ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むヒトＧＰＴ発現ベクターを用いて、１μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。図５Ｆ：細胞は、ＣｒｅリコンビナーゼベクターおよびｅＧＦＰを含むヒトＧＰＴ発現ベクターを用いて、２．５μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で形質移入される。 図６Ａおよび図６Ｂは、操作可能にリンクしたｅＧＦＰなどのＧＯＩの発現を強化する相対的な能力で、ＧＰＴを発現する細胞プールを、ＧＰＴを発現しないプールと比較して示す。図６Ａ：細胞プールについてＰＣＲによって測定されたＣＨＯ-ＧＰＴの遺伝子コピーの相対的な数を以下のように例示する。プール−４９細胞（外因性ＧＰＴの添加なし）、Ｔｎ選択を含まない；プール−４９細胞（外因性ＧＰＴなし）、５μｇのＴｎ選択を含む；プール−１細胞、ＧＰＴのより高い量を自然に発現し（データ非表示）、かつＴｎ選択を含まずに試験された；プール−７８細胞（外因性ＧＰＴなし）、Ｔｎ選択を含まない；ＣＨＯ細胞、外因的に添加されたｈｐｔおよび４００μｇ／ｍＬハイグロマイシン選択を発現する；ＣＨＯ細胞、１μｇ／ｍＬのＴｎ選択条件下で外因性ＧＰＴを発現する；ＣＨＯ細胞、１μｇ／ｍＬ Ｔｎ選択プールから選択される外因性ＧＰＴを発現し、１μｇ／ｍＬ Ｔｎ内でさらに培養した；ＣＨＯ細胞、１μｇ／ｍＬＴｎ選択プールから選択される外因性ＧＰＴを発現し、２．５μｇ／ｍＬ Ｔｎ内でさらに培養した；ＣＨＯ細胞、１μｇ／ｍＬ Ｔｎ選択プールから選択される外因性ＧＰＴを発現する、５μｇ／ｍＬ Ｔｎ中でさらに培養した。図６Ｂ：ｑＰＣＲによって測定された目的遺伝子、ｅＧＦＰの遺伝子コピーの（図６Ａと）同一の細胞プールに対する相対的な数を例示する。 図６Ａおよび図６Ｂは、操作可能にリンクしたｅＧＦＰなどのＧＯＩの発現を強化する相対的な能力で、ＧＰＴを発現する細胞プールを、ＧＰＴを発現しないプールと比較して示す。図６Ａ：細胞プールについてＰＣＲによって測定されたＣＨＯ-ＧＰＴの遺伝子コピーの相対的な数を以下のように例示する。プール−４９細胞（外因性ＧＰＴの添加なし）、Ｔｎ選択を含まない；プール−４９細胞（外因性ＧＰＴなし）、５μｇのＴｎ選択を含む；プール−１細胞、ＧＰＴのより高い量を自然に発現し（データ非表示）、かつＴｎ選択を含まずに試験された；プール−７８細胞（外因性ＧＰＴなし）、Ｔｎ選択を含まない；ＣＨＯ細胞、外因的に添加されたｈｐｔおよび４００μｇ／ｍＬハイグロマイシン選択を発現する；ＣＨＯ細胞、１μｇ／ｍＬのＴｎ選択条件下で外因性ＧＰＴを発現する；ＣＨＯ細胞、１μｇ／ｍＬ Ｔｎ選択プールから選択される外因性ＧＰＴを発現し、１μｇ／ｍＬ Ｔｎ内でさらに培養した；ＣＨＯ細胞、１μｇ／ｍＬＴｎ選択プールから選択される外因性ＧＰＴを発現し、２．５μｇ／ｍＬ Ｔｎ内でさらに培養した；ＣＨＯ細胞、１μｇ／ｍＬ Ｔｎ選択プールから選択される外因性ＧＰＴを発現する、５μｇ／ｍＬ Ｔｎ中でさらに培養した。図６Ｂ：ｑＰＣＲによって測定された目的遺伝子、ｅＧＦＰの遺伝子コピーの（図６Ａと）同一の細胞プールに対する相対的な数を例示する。 図７Ａ〜図７Ｄは、以下のような細胞培養から生成されたＦｃ融合タンパク質１（ＦｃＦＰ１）の糖型特性を例示する。図７Ａ：標準プロトコル（Ｌｏｔ Ｂ１０００２Ｍ４１０）を使用するＧＰＴを発現しないＣＨＯ細胞、これに対して、図７Ｂ：ＣＨＯ−ＧＰＴを発現し、かつＴｎ選択のないＣＨＯ細胞（Ｌｏｔ １１０７２８）。図７Ｃ：ＣＨＯ−ＧＰＴを発現し、かつ１μｇ／ｍＬのＴｎを選択したＣＨＯ細胞（Ｌｏｔ １１０７２８−０１）、これに対して、図７Ｄ：ＣＨＯ−ＧＰＴを発現し、かつ５μｇ／ｍＬのＴｎを選択したＣＨＯ細胞（Ｌｏｔ １１０７２８−０２）。各クロマトグラムは、以下のようなシアル化された残基を含有する断片を示す。０ＳＡ＝シアル酸残基が０個；１ＳＡ＝シアル酸残基が１個；２ＳＡ＝シアル酸残基が２個；３ＳＡ＝シアル酸残基が３個；４ＳＡ＝シアル酸残基が４個。 図７Ａ〜図７Ｄは、以下のような細胞培養から生成されたＦｃ融合タンパク質１（ＦｃＦＰ１）の糖型特性を例示する。図７Ａ：標準プロトコル（Ｌｏｔ Ｂ１０００２Ｍ４１０）を使用するＧＰＴを発現しないＣＨＯ細胞、これに対して、図７Ｂ：ＣＨＯ−ＧＰＴを発現し、かつＴｎ選択のないＣＨＯ細胞（Ｌｏｔ １１０７２８）。図７Ｃ：ＣＨＯ−ＧＰＴを発現し、かつ１μｇ／ｍＬのＴｎを選択したＣＨＯ細胞（Ｌｏｔ １１０７２８−０１）、これに対して、図７Ｄ：ＣＨＯ−ＧＰＴを発現し、かつ５μｇ／ｍＬのＴｎを選択したＣＨＯ細胞（Ｌｏｔ １１０７２８−０２）。各クロマトグラムは、以下のようなシアル化された残基を含有する断片を示す。０ＳＡ＝シアル酸残基が０個；１ＳＡ＝シアル酸残基が１個；２ＳＡ＝シアル酸残基が２個；３ＳＡ＝シアル酸残基が３個；４ＳＡ＝シアル酸残基が４個。 図７Ａ〜図７Ｄは、以下のような細胞培養から生成されたＦｃ融合タンパク質１（ＦｃＦＰ１）の糖型特性を例示する。図７Ａ：標準プロトコル（Ｌｏｔ Ｂ１０００２Ｍ４１０）を使用するＧＰＴを発現しないＣＨＯ細胞、これに対して、図７Ｂ：ＣＨＯ−ＧＰＴを発現し、かつＴｎ選択のないＣＨＯ細胞（Ｌｏｔ １１０７２８）。図７Ｃ：ＣＨＯ−ＧＰＴを発現し、かつ１μｇ／ｍＬのＴｎを選択したＣＨＯ細胞（Ｌｏｔ １１０７２８−０１）、これに対して、図７Ｄ：ＣＨＯ−ＧＰＴを発現し、かつ５μｇ／ｍＬのＴｎを選択したＣＨＯ細胞（Ｌｏｔ １１０７２８−０２）。各クロマトグラムは、以下のようなシアル化された残基を含有する断片を示す。０ＳＡ＝シアル酸残基が０個；１ＳＡ＝シアル酸残基が１個；２ＳＡ＝シアル酸残基が２個；３ＳＡ＝シアル酸残基が３個；４ＳＡ＝シアル酸残基が４個。 図７Ａ〜図７Ｄは、以下のような細胞培養から生成されたＦｃ融合タンパク質１（ＦｃＦＰ１）の糖型特性を例示する。図７Ａ：標準プロトコル（Ｌｏｔ Ｂ１０００２Ｍ４１０）を使用するＧＰＴを発現しないＣＨＯ細胞、これに対して、図７Ｂ：ＣＨＯ−ＧＰＴを発現し、かつＴｎ選択のないＣＨＯ細胞（Ｌｏｔ １１０７２８）。図７Ｃ：ＣＨＯ−ＧＰＴを発現し、かつ１μｇ／ｍＬのＴｎを選択したＣＨＯ細胞（Ｌｏｔ １１０７２８−０１）、これに対して、図７Ｄ：ＣＨＯ−ＧＰＴを発現し、かつ５μｇ／ｍＬのＴｎを選択したＣＨＯ細胞（Ｌｏｔ １１０７２８−０２）。各クロマトグラムは、以下のようなシアル化された残基を含有する断片を示す。０ＳＡ＝シアル酸残基が０個；１ＳＡ＝シアル酸残基が１個；２ＳＡ＝シアル酸残基が２個；３ＳＡ＝シアル酸残基が３個；４ＳＡ＝シアル酸残基が４個。 （Ａ）Ｌｏｔ Ｂ１０００２Ｍ４１０、（Ｂ）Ｌｏｔ １１０７２８、（Ｃ）Ｌｏｔ １１０７２８−０１、および（Ｄ）Ｌｏｔ １１０７２８−０２からサンプリングされたＦｃ融合タンパク質１（ＦｃＦＰ１）の重複グリコシル化プロファイルを例示する。ＧＰＴロットから生成された各タンパク質の糖プロファイルは参照標準タンパク質と両立し、また主な糖型の種が一貫して生成される。糖型の参照標準タンパク質と比較して新しくかつ特有の種がＧＰＴロット内に生成されないことが明らかである。

本方法について記述する前に、本発明が本明細書に記述された特定の方法および実験条件に限定されず、それはこのような方法および条件が変化する場合があるからであることが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって制限されるので、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態のみを記述する目的で使用されており、制限することを意図しないことも理解されるべきである。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈がこれに反すると明らかに述べていない限り、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」は複数の言及を含む。したがって例えば、「１つの方法」への言及は１つ以上の方法、および／または本明細書に記述され、かつ／もしくは当業者には本開示を読むと明らかになるタイプの工程、を含む。

別途定義されない限り、または別途特定されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。

本明細書に記述したものと類似または同等な任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、特定の方法および材料をこれから記述する。本明細書に述べたすべての出版物はその全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。

当該技術分野において周知の様々な遺伝子は、培養中の哺乳類細胞に選択可能な表現型を与える場合がある。一般に、選択マーカー遺伝子は、細胞培養中の様々な抗生物質に耐性を与えるタンパク質、通常は酵素を発現する。一部の選択的な条件では、蛍光タンパク質マーカーを発現する細胞は見えるようになり、したがって選択可能になる。当該技術分野における例としては、ベータラクタマーゼ（ｂｌａ；ベータラクタム抗生物質耐性遺伝子またはａｍｐＲ；アンピシリン耐性遺伝子）、ｂｌｓ（ブラストサイジン耐性アセチルトランスフェラーゼ遺伝子）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ；ハイグロマイシン耐性遺伝子）、およびその他が挙げられる。

本明細書に記述される方法はツニカマイシンおよびツニカマイシンが細胞培養中で成長することに細胞が抵抗することができるようにする酵素（マーカー）の使用に依存する。ツニカマイシン（Ｔｎ）は、Ｎ−アセチルグルコサミン脂質中間体の形成および新たに合成された糖タンパク質グリコシル化を妨げる、細菌性および真核生物Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼの阻害剤として作用する抗生物質の混合物である。（Ｋｉｎｇ，Ｉ．Ａ．，ａｎｄ Ｔａｂｉｏｗｏ，Ａ．，１９８１，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ ｏｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９８（２）：３３１−３３８）。Ｔｎは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：ドリコールリン酸Ｎ−アセチルグルコサミン−１−Ｐトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）、ドリコールにリンクしたオリゴ糖の生合成の初期工程に触媒作用を及ぼす酵素、を特異的に阻害するので、細胞毒性である。ツニカマイシンの存在下で、小胞体（ＥＲ）内に作製されたアスパラギンにリンクした糖タンパク質はＮ−リンクしたグリシンによってグリコシル化されず、したがってＥＲ内で正しく折り畳まれない場合があり、ひいては分解の標的とされる場合がある（Ｋｏｉｚｕｍｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２１（２）：３５３−３６２）。それ故、Ｔｎは、細菌性細胞および真核細胞内にアポトーシスをもたらす注目に値する変性タンパク質応答（ＵＰＲ）の誘導物質である。

ウリジン二リン酸ＧＰＴ遺伝子（ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐトランスフェラーゼとしても知られる）は、ある一定の細胞条件下でＴｎに耐性を与えるために過剰発現されるとして識別される（Ｃｒｉｓｃｕｏｌｏ ａｎｄ Ｋｒａｇ，１９８２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６３（３６）：１９７９６−１９８０３；Ｋｏｉｚｕｍｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２１，ｐｐ．３５３−３６１）。ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｎ．Ｎｏ．Ｍ３６８９９（配列番号：２）にも記述されているＧＰＴをコードする遺伝子は、Ｔｎ耐性チャイニーズハムスターの卵巣細胞株から単離され、かつ４０８アミノ酸タンパク質（配列番号：３）をコードする（Ｓｃｏｃｃａ ａｎｄ Ｋｒａｇ， １９９０， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５（３３）：２０６２１−２０６２６； Ｌｅｈｒｍａｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３（３６）：１９７９６−８０３）。ハムスターＧＰＴは酵母細胞内で過剰発現され（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、かつこれらの細胞内でＴｎ耐性を与えられ；またＧＰＴ酵素の精製のために都合のよい供給源も提供する（Ｓｃｏｃｃａ ＪＲ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，５（１）：１２９−３６）。ハイブリドーマ細胞内でＧＰＴの転写レベルが解析され（ＩｇＧを発現するＢ細胞対休止Ｂ細胞）、一方でＩｇＧを生成する細胞がＧＰＴ転写または活性のレベルの増加を呈しないことが観察されたが、それでも休止から活性Ｂ細胞への転移中にＧＰＴの小さな増加は見られた。結論として、ＧＰＴレベルはＢ細胞内のＬＰＳ（抗原）刺激への増殖の応答の早期の開発に対応する場合がある（Ｃｒｉｃｋ，Ｄ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９（１４）：１０５５９−６５）。

さらに、細胞発現系内にＴｎの存在があるかないかでＧＰＴの発現が変化するかどうかは以前は未知であり、タンパク質産物のグリコシル化、したがって産物の質に影響を及ぼすことになる。治療用糖タンパク質の生成のうえで、最適かつ一貫したグリコシル化が重要なタンパク質特質であることが理解される。

本発明は、調節可能な選択マーカーとして哺乳類Ｔｎ耐性遺伝子、ＧＰＴを利用する哺乳類細胞系内の組み換え型タンパク質の生成のための改善した方法を提供し、一方でＧＰＴに操作可能にリンクした目的遺伝子のコピー数の増加は、ＧＰＴ発現カセットの細胞内へのランダム組み込みの増加と相関する。

当該技術は、治療用タンパク質（特に糖タンパク質）の製造が、かかるタンパク質の天然のグリコシル化を模倣する哺乳類タイプの発現系に依存することが識別される。（検討のために、Ｂｏｒｋ，Ｋ．ｅｔ ａｌ，２００９，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．９８（１０）：３４９９−３５０８を参照のこと。）例えば、Ｎ−リンクした複合体グリカンなどのある一定の糖タンパク質の末端単糖類は、典型的にはシアル酸によって占有される。シアル化は、糖タンパク質の薬物動態特性（吸収、血清半減期、およびクリアランスなどの）、または糖タンパク質の他の物理化学特性若しくは免疫原性特性に影響を与える場合がある。過剰発現組み換え型糖タンパク質は、しばしば不完全または一貫性のないグリコシル化を有する。プロセスの一貫性および哺乳類細胞株内で生成された治療用糖タンパク質の質のためには、信頼性のある方法が重要である。

本発明は、組み換え型タンパク質のグリコシル化のための改善された方法、すなわち所望のタンパク質の一貫した質の収量を提供するために哺乳類細胞系内で糖タンパク質を作製するための方法も提供する。

（用語の定義）
相互に機能的に関係しているとき、ＤＮＡ領域は操作可能にリンクされる。例えば、プロモーターが配列の転写に参画する能力を有す場合、プロモーターはコード配列に操作可能にリンクし；リボソーム結合部位は、翻訳を許容するように位置する場合、コード配列に操作可能にリンクする。一般的に、操作可能にリンクしているとは、連続性を含むことができるが、連続性を必要としない。分泌リーダーなどの配列の場合には、連続性およびリーディングフレーム内での適正な配置は典型的な特徴である。プロモーターなどの生成強化配列は、目的遺伝子（ＧＯＩ）と機能的に関係している場合、例えば、その存在が結果としてＧＯＩの発現の増加をもたらす場合、ＧＯＩに操作可能にリンクしている。

このように、「操作可能にリンクした」という句は、ＤＮＡ発現ベクター構築の文脈の中などでは、例えば、プロモーター、オペレーター、またはマーカーなどの制御配列がコード配列と相対的な位置に適切に定置され、これによって制御配列がコード配列によってコードされた目的のポリペプチド／タンパク質の生成を指示または許容する。例えば、ある一定の培養条件で細胞が生存するために選択マーカーが必要とされる場合、操作可能な選択マーカータンパク質の存在なしには発現は生じないため、目的遺伝子は選択マーカー遺伝子に操作可能にリンクする。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、操作可能にリンクした、すなわち適切な信号が存在するときに目的遺伝子および／または選択マーカー遺伝子の転写を許容するようなやり方でリンクしたＤＮＡ配列の転写を指示するのに十分なＤＮＡ配列を示す。遺伝子の発現は、当該技術分野で既知の任意のプロモーターまたはエンハンサー要素の制御下で定置される場合がある。

本発明の状況では、「発現ベクター」は、染色体ベクター、非染色体ベクター、および合成核酸ベクター（好適な一連の発現制御要素を含む核酸配列）を含む任意の好適なベクターであってもよい。かかるベクターの例としては、ＳＶ４０の誘導体、細菌性プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合せに由来するベクター、およびウイルス性核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ベクターが挙げられる。一実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸分子は、例えば、線形発現要素（例えば、Ｓｙｋｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，１９９７，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １２，３５５−５９に記述されるように）、圧縮した核酸ベクター（例えば、米国特許第６，０７７，８３５号および／または国際特許出願第００／７００８７号に記述される）、またはプラスミドベクター（ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ １９／１８、またはｐＵＣ １１８／１１９などの）を含む、裸のＤＮＡまたはＲＮＡベクター内に含まれる。かかる核酸ベクターおよびその使用法は当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，５８９，４６６号および米国特許第５，９７３，９７２号を参照のこと）。

本明細書で使用される場合「オペレーター」は、抑制タンパク質のオペレーターへの結合によって遺伝子が調整される場合があり、そしてその結果、ＧＯＩ、すなわち、ポリペプチドまたは目的タンパク質をコードするヌクレオチドの転写を防止または可能にするようなやり方で遺伝子内または遺伝子付近で導入されたＤＮＡ配列を示す。

リボソーム結合部位は、「内部リボソーム侵入部位」（ＩＲＥＳ）を含み、または５’キャップを含んでもよい。数多くのＩＲＥＳ配列が当該技術分野において周知である。ＩＲＥＳは翻訳制御配列を代表し、ＩＲＥＳ部位は典型的には目的遺伝子の５’を位置付け、かつキャップと無関係な様式でＲＮＡの翻訳を可能にする。翻訳のためにｍＲＮＡの開始コドンの場所がリボソーム内で適正に配向されるように、転写されたＩＲＥＳはリボソームサブユニットを直接結合する場合がある。ＩＲＥＳ配列は典型的にはｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内に位置付けられる（開始コドンのすぐ上流）。ＩＲＥＳは真核生物翻訳機構と相互作用する様々なタンパク質因子に対する必要性を機能的に置き換える。

タンパク質発現を記述するために使用されるとき、「強化された」または「改善された」という用語は、本発明の発現系または方法によって生成されたタンパク質（すなわち、遺伝子産物）の数量および／または質の一貫性の増加を含む。このように、これは少なくとも約1.5倍〜少なくとも約3倍の発現の強化を含み、その上で、例えば、別の選択マーカー構築体を使用する組み込み体のプールと比較してゲノムの中へのランダム組み込みによって典型的には観察される。このように、目的タンパク質に対して観察された発現強化の倍率を、ＧＰＴ遺伝子を含む発現カセットまたは本発明の細胞の無い状態で、または異なる選択マーカーを含む発現カセットまたは細胞の存在下で、実質的に同一の条件下で測定された同一の遺伝子の発現レベルと比較した。発現強化は、結果として得られるランダム組み込みイベントの数によっても測定される場合がある。強化された組み換え効率は遺伝子座の組み換え能力の強化を含む（例えば、リコンビナーゼ認識部位を採用する）。強化とはランダム組み換え上の測定可能な効率を指し、これは典型的には0.1％である。ある一定の条件では、強化された組み換え効率はランダムの約１０倍であり、または約１％である。特定されない限り、特許請求される発明は特定の組み換え効率に限定されない。発現強化は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応法（ｑＰＣＲ）、または他の周知の技法によって測定された結果として得られる遺伝子コピーの数によっても測定されうる。

強化または改善された産物は、より一貫した質、例えば、本発明のＧＰＴ発現系で観察される翻訳後の修飾をも指す。一貫した質は、例えば、複製生成ライン後の望ましいグリコシル化プロファイルを有することを含む。質に対する一貫性とは、均質性および標準化の程度を指し、一方で複製生成バッチは本質的に変化がない。一貫性を測定するためのＺ番号の計算が本明細書に教示される。一貫性を測定するための他の統計的測定は、当該技術分野で既知である。

「選択圧力」という句は、生きている生命体（例えば、細胞）または系（例えば、発現系としての）に適用される力または刺激であって、所与の環境内で生きている生命体または系の挙動および生存（生存する能力などの）を変化させる力または刺激である。

「遺伝子増幅」という句は、遺伝子配列の同一のコピーの数の増加を意味する。ある一定の細胞プロセスは、遺伝子が細胞上に与える表現型（例えば、抗生物質耐性）を増幅する特定の遺伝子(複数可)の複数のコピーの生成によって特徴付けられる。

発現カセットを参照して「外因的に添加された遺伝子」または「外因的に添加されたＧＯＩ」という句が採用される場合、この句は細胞ゲノム内に天然で見出されるようには存在しない任意の遺伝子、またはゲノム（の中の異なる遺伝子座）の中に組み込まれた追加的な遺伝子コピーを指す。例えば、ＣＨＯゲノム内の「外因的に添加された遺伝子」（例えば、選択マーカー遺伝子）は、天然では特定のＣＨＯ遺伝子座内には見出されないハムスター遺伝子（すなわち、ハムスターゲノム内の別の遺伝子座由来のハムスター遺伝子）、任意の他の種（例えば、ヒトの遺伝子）由来の遺伝子、キメラ遺伝子（例えば、ヒト／マウス）、もしくはＣＨＯゲノムの中には天然で見出されないハムスター遺伝子（すなわち、ハムスターゲノム内の別の遺伝子座由来の遺伝子と99.9％未満の同一性を有するハムスター遺伝子）とすることができ、またはＣＨＯ天然ゲノムの中に存在することが天然では見出されない任意の他の遺伝子とすることができる。

ランダム組み込みイベントは標的とされる組み込みイベントとは異なり、一方で細胞のゲノムの中への遺伝子の挿入はランダム組み込みイベント中では部位特異的ではない。標的とされる組み込みの実施例は相同的組み換えである。ランダム（非相同）組み込みは、結果として得られる組み込み体の場所（遺伝子座）が既知であるまたは特定されていることを意味する。ランダム組み込みは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって生じると考えられるが、しかしながらこの方法に限定されない。

選択効率とは、選択マーカーおよび、適用可能な場合、選択マーカーの制御下の目的タンパク質を発現する生存細胞の個体数のパーセントを意味する。

Ｔｎ耐性タンパク質を記述するとき、同一性のパーセントは、連続相同物の領域に沿って示された同一性を表示する相同性配列を含むことを意味するが、同一性のパーセントを計算するうえで比較された配列内に相同物を有しないギャップ、欠失、または挿入の存在は考慮されない。この状況で「同一性のパーセント」の使用を説明するうえで、以下のアミノ酸配列比較を参照する。

本明細書で使用される場合、ハムスターホモログはアラインメントで比較する相同体配列を有しないので、上方の「ＧＰＴ＿ＣＲＩＧ」配列（チャイニーズハムスターＧＰＴに対する）とマウスホモログ（「ＧＰＴ＿ＭＯＵＳＥ」）との間の「同一性のパーセント」の判定は、ハムスターアミノ酸１０と１１との比較は含まないことになる（すなわち、場合によってはマウスＧＰＴはその時点で挿入を有し、またはハムスターホモログはギャップもしくは欠失を有する）。したがって、上記の比較では、同一性のパーセントの比較は５’端部における「ＭＷＡ」から３’端部における「ＥＳＱ」へと延びることになる。その場合、マウスホモログはその中でハムスターＧＰＴ位置５１において「Ｒ」を有することのみが異なる。比較は６０塩基対区間中の５８連続塩基に及ぶので、１つのアミノ酸の違い（ギャップ、欠失、または挿入ではない）のみでは、２つの配列（ハムスターおよびマウス）の間にはハムスターＧＰＴ位置１からハムスターＧＰＴ位置５８までの間に９８％を超える同一性がある（「同一性のパーセント」はギャップ、欠失、および挿入に対するペナルティを含まないので）。上記の実施例はアミノ酸配列に基づくが、核酸配列の同一性のパーセントは同一の様式で計算されることになることが理解される。

「細胞」という用語は、組み換え型核酸配列の発現のために好適な任意の細胞を含む。細胞としては、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）の細胞、細菌細胞（例えば、大腸菌、バチルス属、ストレプトマイセス属などの株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、出芽酵母、分裂酵母、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、イラクサギンウワバなど）、非ヒト動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、または、例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合が挙げられる。ある一定の実施形態では、細胞は，ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。他の実施形態では、細胞は真核性であり以下の細胞から選択される。ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ−１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ細胞、腫瘍細胞、および前述の細胞に由来する細胞株。一部の実施形態では、細胞は１つ以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）を含む。

「細胞密度積分値」、または「ＩＣＤ」という句は、ある期間にわたり積分したものとして取られた培地内の細胞の密度を意味し、細胞−日／ｍＬとして表現される。一部の実施形態では、ＩＣＤは、細胞の培養での２１日目の周辺で測定される。

「グリコシル化」または「タンパク質をグリコシル化する」という句は糖タンパク質の形成を含むが、一方でオリゴ糖は、アスパラギン（Ａｓｎ）残基（すなわち、Ｎ−リンクした）の側鎖、またはタンパク質のセリン（Ｓｅｒ）／スレオニン（Ｔｈｒ）残基（すなわち、Ｏ−リンクした）のいずれかに付着される。グリカンは、単糖類残基のホモポリマーまたはヘテロポリマーとすることができ、これは直鎖または分枝鎖とすることができる。Ｎ−リンクしたグリコシル化は、主に小胞体内で開始することが周知であり、一方でＯ−リンクしたグリコシル化はＥＲまたはＧｏｌｇｉ装置のいずれかの中で開始することが示される。

「Ｎ−グリカンタンパク質」または「Ｎ−グリカンタンパク性基質」は、Ｎ−リンクしたオリゴ糖を含有または受容することができるタンパク質を含む。Ｎ−グリカンは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、ノイラミン酸（ＮＡＮＡ）、および他の単糖類ので構成することができるが、しかしながらＮ−グリカンは、３個のマンノースと２個のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）糖を含む一般的なコア五糖類構造を通常有する。連続したアミノ酸配列（すなわち、シークオン）Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ここでプロリン以外のＸは任意のアミノ酸）を有するタンパク質は、Ｎ−グリカンのために付着部位を提供することができる。

（概要）
本発明は、ある一定の条件下で組み換え型タンパク質が細胞内に生成されうるという発見に少なくとも部分的に基づき、タンパク質をコードする遺伝子は、Ｔｎ耐性遺伝子、ＧＰＴに操作可能にリンクし、また細胞ゲノム内でランダム組み込みイベントを増加し、したがって目的遺伝子のコピー数、および最終的にタンパク質生成を増加するためにタンパク質を生成する細胞の選択物の形式を整える。

本発明は、タンパク質を生成する細胞は、一貫していて、かつ信頼性のある翻訳後の修飾を用いてタンパク質を発現するように最適化されうるという所見にも少なくとも部分的に基づく。ＧＰＴ発現カセットを、発現構築体内でのように、発現ベクターを介して当該技術分野で既知の様々な遺伝子編集技法を使用するなどにより、細胞ゲノム内に組み込むこともできる。ＧＰＴを含む発現ベクターを、特定の組み換え部位を識別する相同的組み換えまたはリコンビナーゼによって媒介された組み換えなどのランダム組み換えまたは標的化組み換え（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘ−媒介された組み換え）によってゲノムの中に組み込むことができる。

染色体のＤＮＡ内の組み込み部位に切断を導入することによって真核細胞内での相同的組み換えを容易にすることができる。モデル系は、染色体の標的配列の中へと二本鎖の切断が導入された場合、遺伝子標的化の間の相同的組み換えの頻度が増加することを実証した。これは、ある一定の核を組み込みの特定の部位へと標的化することによって遂行されてもよい。標的の遺伝子座においてＤＮＡ配列を識別するＤＮＡ結合したタンパク質は当該技術分野で既知である。遺伝子標的化ベクターは、相同的組み換えを容易にするためにも採用される。修復を対象とする相同性のための遺伝子標的化ベクターが無い状態で、細胞は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって二本鎖切断を頻繁に閉じ、これは開裂部位において多重ヌクレオチドの欠失または挿入をもたらす場合がある。遺伝子標的化ベクター構築およびヌクレアーゼ選択は、本発明が関連する当該技術分野の当業者の技能の範疇内である。

一部の実施例では、モジュラー構造を有し、かつ個別のジンクフィンガードメインを含有するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、標的配列内の特定の３−ヌクレオチド配列を識別する（例えば、標的とされる組み込みの部位）。一部の実施形態は、多重標的配列を標的化する個別のジンクフィンガードメインの組み合せを用いてＺＦＮを利用することができる。

転写活性化物質様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、部位特異的なゲノム編集にも採用されてもよい。ＴＡＬエフェクタータンパク質ＤＮＡ結合ドメインは、典型的にはＦｏｋＩなどの制限ヌクレアーゼの非特定的な開裂ドメインと組み合せて利用される。一部の実施形態では、ＴＡＬエフェクタータンパク質ＤＮＡ結合したドメインおよび制限ヌクレアーゼ開裂ドメインを含む融合タンパク質は、本発明の遺伝子座内の標的配列においてＤＮＡを識別および分割するために採用される（Ｂｏｃｈ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９−１５１２）。

ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）は、細菌性適応性免疫機構から開発されたプログラム可能なゲノムエンジニアリングツールである。この系、すなわちクラスター化された規則的な配置の短い回文の繰返し（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲに関連付けられた（Ｃａｓ）免疫応答では、２つのＲＮＡで複合化されたときタンパク質Ｃａｓ９は、配列特異的なエンドヌクレアーゼを形成し、そのうちの１つは標的選択を誘導する。ＲＧＥＮは構成要素（Ｃａｓ９およびｔｒａｃｒＲＮＡ）および標的に特異的なＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）から成る。ＤＮＡ標的開裂の効率と開裂部位の場所との両方とも、標的認識のための追加要件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の位置に基づいて変化する（Ｃｈｅｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４年３月１４日にオンラインで出版、マニュスクリプトとしてはＭ１１３．５３９７２６）。

当業者には、厳密にＤＮＡ結合した特異性を用いたＢｕＤに由来するヌクレアーゼ（ＢｕＤＮｓ）などの相同的組み換えのさらに他の方法が利用可能である（Ｓｔｅｌｌａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．２０１４，Ｄ７０，２０４２−２０５２）。ゲノム内で特有の標的配列と両立する利用可能なツールに基づいて厳密なゲノム修飾方法が選ばれ、これにより細胞表現型の妨害が回避される。

核酸配列（目的遺伝子）を哺乳類細胞の中へと安定して組み込むために細胞および方法が提供され、ＧＰＴ配列を用いて組み込まれたおかげで核酸配列は強化した発現の能力を有する。発現構築体（例えば、発現ベクター）と併せてＧＰＴを使用するため、および外因性ＧＰＴを対象となる哺乳類細胞の中へと追加するための組成物および方法も提供される。一貫していて、しかも頑強な糖タンパク質、特に治療用糖タンパク質を作製する方法での使用のために細胞および方法が提供される。

ＧＰＴ選択マーカーカセットの構築
操作的なＧＰＴ発現カセットを含む発現ベクターが本明細書に提供される。発現カセットは、哺乳類ＧＰＴおよび所望の遺伝子産物の転写および翻訳を許容および駆動するために必要な調節要素を含む。

本明細書に記述される遺伝子および調節配列の様々な組み合せも開発することができる。開発することができる本明細書に記述される適切な配列の他の組み合せの実施例としては、本明細書に開示されるＧＰＴ遺伝子の多重コピーを含む配列、または調節要素の最適な組み合せを達成するために開示されたＧＰＴを他のヌクレオチド配列と組み合わせることによって誘導される配列が挙げられる。目的遺伝子および調節要素に配向されたＧＰＴの最適な間隔を提供するために、かかる組み合せを連続的にリンクまたは配列することができる。

ＧＰＴをコードする遺伝子の相同体配列は、他の哺乳類種（例えば、ヒト、図２を参照のこと）からの細胞内だけでなく、他の哺乳類組織タイプに由来する細胞株内に存在することが既知であり、また当該技術分野において周知の技法によって単離することができる。哺乳類ＧＰＴアミノ酸配列の例示的なリストが図２に提供される。配列番号：３〜１０に示される対応するＧＰＴタンパク質の最適な発現を許容するために、配列番号：２および配列番号：１１〜１７に示されるヌクレオチド配列に対してコドン最適化などのヌクレオチド配列を変更させることができる。さらに、ＧＰＴをコードするヌクレオチド配列を変更することによって配列番号：３〜１０に示されるアミノ酸配列を変更させることができる。部位特異的またはランダムな突然変異生成技法を含むがこれに限定されない、かかる技法は当該技術分野で周知である。

次いで、本明細書に記述されるように、結果として得られるＧＰＴ変異型をＧＰＴ活性について試験することができ、例えば、ツニカマイシンに対する耐性について試験することができる。アミノ酸配列がＧＰＴ活性を有する、配列番号：３と少なくとも約９３％同一、または少なくとも約９５％同一、または少なくとも約９６％同一、または少なくとも約９７％同一、または少なくとも約９８％同一であるＧＰＴタンパク質は、規定通りの実験によって単離可能であり、また配列番号：３に対するものと同一のＴｎに対する耐性、選択性効率および翻訳後の恩恵を呈することが予期される。したがって、ＧＰＴの哺乳類ホモログおよびＧＰＴの変異型も本発明の実施形態によって包含される。図２Ａ〜図２Ｃは、様々な哺乳類ＧＰＴアミノ酸配列（すなわち、配列番号：３〜１０）のアラインメントを示す。哺乳類ＧＰＴ配列（核酸およびアミノ酸）、中でもハムスター、ヒト、マウス、およびラットのゲノムが保存される。表１は、例示的な哺乳類ＧＰＴタンパク質およびその相同性の程度を識別する。

本明細書に提供されるＧＰＴ/ツニカマイシン法を使用して、目的タンパク質の強化したレベルを発現する細胞集団を開発することができる。発現の絶対的なレベルは、細胞によってどれぐらい効率的にタンパク質が処理されるかに依存して、特定のタンパク質によって変化することになる。

したがって、本発明は、配列番号：２および配列番号：１１〜１７から成る群から選択されるＧＰＴを発現するヌクレオチド配列も含む。本発明は、配列番号：２および配列番号：１１〜１７から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一である、ＧＰＴを発現するヌクレオチド配列も包含する。

本発明は、配列番号：１、配列番号：２、または配列番号：１２を含むベクターを含む。哺乳類ＧＰＴ遺伝子および随意による調節要素を含むベクターとしては、一時的なトランスフェクションベクターまたは安定したトランスフェクションベクターが挙げられる。

一実施形態では、図１に例示されるように、ＧＰＴ遺伝子はＧＯＩの発現を強化するために採用される。図１は、ＩＲＥＳ配列およびＧＰＴ選択マーカーに操作可能にリンクしたＧＯＩを示す。ＧＰＴカセットは、プロモーター配列（例えば、ＳＶ４０プロモーター）、およびポリアデニル化（ｐｏｌｙ（Ａ））配列（例えば、ＳＶ４０ ｐｏｌｙ（Ａ））をさらに含む。

（ＧＰＴおよび上流プロモーターを含む）発現強化カセットは、細胞ゲノム内に最適に組み込まれる。本発明の方法を使用して、Ｔｎの濃度の増加に基づく培養条件の下でＧＰＴ発現カセットの中にＧＯＩが発現される（図３Ａまたは図３Ｂ）。図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｅ、および図５Ｆに示すようなＦＡＣＳ読み出しは、安定して形質移入された細胞の集団内の発現の分布を例示し、特に哺乳類Ｔｎ耐性選択マーカー、ＣＨＯ−ＧＰＴ、およびｈＧＰＴを使用する選択効率の劇的な増加を例示する。哺乳類ＧＰＴ発現は、目的遺伝子産物の発現、例えば蛍光タンパク質、ｅＧＦＰの生成をさらに強化する。増加するＴｎの濃度の連続する培養は、図６Ｂに例示するもののように、Ｔｎの濃度に基づく培養条件の下でＧＰＴを使用して発現系で発現されたＧＯＩと比較して、約２倍の強化された発現を結果としてもたらす。

本発明は、かかるＧＰＴ遺伝子を含む哺乳類細胞を含み、ＧＰＴ遺伝子は外因性であり、また本発明の方法によって細胞ゲノムに組み込まれる。少なくとも１つの外因的に添加された目的遺伝子（ＧＯＩ）を有するかかるＧＰＴ遺伝子を含む細胞は、ＧＰＴ遺伝子の上流または下流である。

様々な実施形態で、ＧＯＩを哺乳類選択マーカーＧＰＴの制御下に置くことによってＧＯＩの発現を強化することができる。他の実施形態では、ＧＯＩを哺乳類選択マーカーＧＰＴの制御下に置き、また０．５μｇ／ｍＬより大きいＴｎ濃度から成る細胞培養条件を提供することによってＧＯＩのランダム組み込みイベントを強化することができる。一部の実施形態では、細胞培養条件は、１μｇ／ｍＬより大きいＴｎ濃度から成る。調節要素は、ＧＯＩに操作可能にリンクしてもよく、ＧＯＩの発現（ＧＯＩおよびＧＰＴから選択された距離における（５’または３’方向で））は、例えば、典型的にはランダム組み込みイベントに起因して観察される発現にわたるＧＯＩの発現を強化する能力を保持する。様々な実施形態では、強化は少なくとも約１．５倍〜約２倍、またはそれ以上である。ランダム組み込み、またはランダム発現と比較した発現の強化は、約１．５倍〜約２倍、またはそれ以上である。

別の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用して均質にグリコシル化されたタンパク質を達成することができる。表４に示すように、Ｔｎを用いて処置されたＧＰＴ／ＧＯＩ組み換え型タンパク質バッチは、同等なグリコシル化プロファイルを有するバッチを複製することができる。このように、一貫したグリコシル化プロファイルなどの強化したタンパク質発現は、本明細書に教示するように、Ｚ番号を計算することによって直接比較することができる。Ｚ番号の式は、シアル酸（ＳＡ）部分を代表するクロマトグラム上のピークの相対的な数だけでなく各ピークの相対的な形状および強度を考慮に入れ考慮する。Ｚ番号は、各ピークによって占有される面積に基づき、また複合化された糖タンパク質に対する一貫性の測定単位として使用されてもよい（例えば、図７Ａ〜７Ｄ、図８、および本明細書に記述される実施例３を参照のこと）。

例えば、発現カセットの配向またはコドン最適化を含む、各ＧＯＩに対するタンパク質発現の最適化も達成することができる。タンパク質最適化も、細胞培養方法での異なる漸増Ｔｎ濃度によって達成される場合がある。

組み換え型発現ベクターは、哺乳類、ウイルス性、または昆虫遺伝子に由来する好適な転写的および／または翻訳的調節要素に操作可能にリンクしたタンパク質をコードする合成またはｃＤＮＡ由来ＤＮＡ断片を含むことができる。本明細書に詳細に記述されるように、かかる調節要素としては、転写プロモーター、エンハンサー、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の停止を制御する配列が挙げられる。哺乳類発現ベクターは、複製の起源、他の５’または３’に隣接する非転写配列、およびスプライスドナーおよびアクセプター部位などの５’または３’非翻訳配列などの非転写要素も含むことができる。トランスフェクタントの認識を容易にするさらなる選択マーカー遺伝子（蛍光マーカーなどの）も組み込まれてもよい。

別の実施形態では、ベクターは記述される核酸分子（遺伝子）を含む発現ベクターを含む目的タンパク質をコードする核酸分子（または目的遺伝子）を含み、核酸分子（遺伝子）は発現制御配列に操作可能にリンクされる。

目的遺伝子（ＧＯＩ）を含むベクターが提供され、ＧＯＩは哺乳類宿主細胞内での発現のために好適な発現制御配列に操作可能にリンクされる。

本発明で使用されてもよい有用なプロモーターとしては、ＳＶ４０前期プロモーター領域、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルスの３’の長い末端反復内に含まれるプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の調節配列、マウスまたはヒトサイトメガロウイルスＩＥプロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター、および光合成酵素リブロース２リン酸カルボキシラーゼのプロモーター、酵母または他の菌類（Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホノグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、および以下の動物転写対照領域など）からのプロモーター要素であって、動物転写対照領域は組織特異的を呈し、かつトランスジェニック動物内で利用されるもの（エラスターゼＩ；インシュリン；免疫グロブリン；マウス乳腺腫瘍ウイルス；アルブミン；α−フェトプロテイン；α１−アンチトリプシン；β−グロビン；およびミオシン軽鎖−２）が挙げられるがこれに限定されない。

本発明の核酸分子は、効果的なｐｏｌｙ（Ａ）終結配列（例えば、ＳＶ４０ ｐｏｌｙ（Ａ））、大腸菌内でのプラスミド産物に対する複製の起源、および／または都合のよいクローニング部位（例えば、ポリリンカー）にも操作可能にリンクしてもよい。核酸は、ＣＭＶ ＩＥなどの構造性のプロモーターとは対照的に調節可能な誘導性プロモーター（誘導性、再現性、開発的に調節された）も含んでもよい（かかる用語は実際にはある一定の条件下での遺伝子発現の程度の記述子であることを当業者は認識するであろう）。

本発明は、目的タンパク質を生成するための方法を提供する一方で、目的遺伝子（ＧＯＩ）を含む発現ベクターが提供される。かかる発現ベクターは、任意の目的タンパク質の組み換え型生成のために使用されてもよい。脊椎動物細胞を形質移入するために有用である発現ベクター内の転写制御配列および翻訳制御配列は、ウイルス性供給源によって提供されてもよい。例えば、一般に使用されるプロモーターおよびエンハンサーは、ポリオーマ、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などのウイルスに由来する。ウイルス性ゲノムプロモーター、制御配列、および／またはシグナル配列は、発現を駆動するために利用されてもよく、提供されたかかる制御配列は、選ばれた宿主細胞と両立する。組み換え型タンパク質が発現される細胞タイプに依存して、非ウイルス性細胞プロモーター（例えば、β−グロビンおよびＥＦ−１αプロモーター）も使用することができる。

異種ＤＮＡ配列の発現のために有用な他の遺伝子要素を提供するために、ＳＶ４０ウイルス性ゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起源、前期プロモーターおよび後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位を使用されてもよい。前期プロモーターおよび後期プロモーターは、両者ともＳＶ４０ウイルスから断片として簡単に得られ、これらも複製のＳＶ４０ウイルス起源を含むので、特に有用である（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３，１９７８）。より小さいＳＶ４０断片またはより大きいＳＶ４０断片も使用されてもよい。典型的には、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位から複製のＳＶ４０起源に位置付けられたＢｇｌＩ部位に向かって延在するほぼ２５０ｂｐの配列が含まれる。

多重転写の発現のために使用される２シストロン性の発現ベクターは、以前に記述され（Ｋｉｍ Ｓ．Ｋ．ａｎｄ Ｗｏｌｄ Ｂ．Ｊ．，Ｃｅｌｌ ４２：１２９，１９８５；Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ｓｕｐｒａ）、またＧＰＴ発現系と組み合せて使用することができる。発現ベクターの他のタイプも有用であり、例えば、米国特許第４，６３４，６６５号（Ａｘｅｌら、）および米国特許第４，６５６，１３４号（Ｒｉｎｇｏｌｄら）に記述されるものがある。

組み込み部位、例えば、ＰＯＩをコードする遺伝子配列への５’または３’にリコンビナーゼ認識部位を定置することができる。好適な組み込み部位の一実施例は、ｌｏｘ ｐ部位である。好適な組み込み部位の別の実施例は、例えば、ｌｏｘ ｐ部位、ｌｏｘ、およびｌｏｘ ５５１１部位から成る群から選択される２つのリコンビナーゼ認識部位である。

遺伝子増幅カセットおよびその発現ベクター
以前記述されたまたは当該技術分野で既知の有用な調節要素を、哺乳類細胞をトランスフェクトするために使用される核酸構築体内に含むこともできる。図１は、プロモーター配列、ＩＲＥＳ配列、目的遺伝子、およびｐｏｌｙ（Ａ）配列をさらに含むＧＰＴベクター内の操作的なカセットを例示する。

本発明の状況での発現ベクターは、染色体核酸ベクター、非染色体核酸ベクター、および合成核酸ベクター（発現制御要素の好適な組を含む核酸配列）を含む任意の好適なベクターであってもよい。かかるベクターの例としては、ＳＶ４０の誘導体、細菌性プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合せに由来するベクター、およびウイルス性核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ベクターが挙げられる。一実施形態では、抗体をコードする核酸分子は、例えば、線形発現要素（例えば、Ｓｙｋｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １２，３５５−５９（１９９７）に記述されるように）、圧縮した核酸ベクター（例えば、米国特許第６，０７７，８３５号および／または国際特許出願第００／７００８７号に記述されるように）、またはプラスミドベクター（ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ １９／１８、またはｐＵＣ １１８／１１９などの）を含む、裸のＤＮＡまたはＲＮＡベクター内に含まれる。かかる核酸ベクターおよびその使用法は当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，５８９，４６６号および米国特許第５，９７３，９７２号を参照のこと）。

発現ベクターは代替的に酵母系内での発現のために好適なベクターであってもよい。酵母系内での発現のために好適な任意のベクターが採用されてもよい。好適なベクターとしては、例えば、酵母アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨなどの構造性のプロモーターまたは誘発性のプロモーターを含むベクターが挙げられる（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）、およびＧｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３，５１６−５４４（１９８７）で検討されている）。

ある一定の実施形態では、ベクターは記述される核酸分子（遺伝子）を含む発現ベクターを含む目的タンパク質をコードする核酸分子（または目的遺伝子）を含み、核酸分子（遺伝子）は宿主細胞内での発現のために好適な発現制御配列に操作可能にリンクされる。

発現制御配列は、目的遺伝子の転写およびそれに続くタンパク質の様々な細胞系内での発現を制御および駆動するために改変される。プラスミドは、発現可能な目的遺伝子を、例えば、プロモーター、エンハンサー、選択マーカー、オペレーター等などの望ましい調節要素を含む発現制御配列（すなわち、発現カセット）と組み合せる。本発明の発現ベクターでは、ＧＰＴおよび目的タンパク質（抗体をコードする核酸分子などの）は、任意の好適なプロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサータンパク質、ｐｏｌｙ（Ａ）終結配列、および他の発現促進要素を含んでもよく、またはこれと関連付けられてもよい。

抗体をコードするヌクレオチド配列などの目的遺伝子の発現は、当該技術分野で既知の任意のプロモーターまたはエンハンサー要素の制御下で定置される場合がある。かかる要素の実施例としては、強い発現プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター／エンハンサーまたはＣＭＶ主要ＩＥ（ＣＭＶ−ＭＩＥ）プロモーター、ならびにＲＳＶ、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＬ３−３、ＭＭＴＶ、ユビキチン（Ｕｂｉ）、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）、およびＨＩＶ ＬＴＲプロモーター）が挙げられる。

一部の実施形態では、ベクターは、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＣＭＶ−ＩＥ、ＣＭＶ−ＭＩＥ、ＲＳＶ、ＳＬ３−３、ＭＭＴＶ、Ｕｂｉ、ＵｂＣおよびＨＩＶ ＬＴＲから成る群から選択されるプロモーターを含む。

本発明の核酸分子は、効果的なｐｏｌｙ（Ａ）終結配列、大腸菌内でのプラスミド産物に対する複製の起源、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子、および／または都合のよいクローニング部位（例えば、ポリリンカー）にも操作可能にリンクしてもよい。核酸は、ＣＭＶ ＩＥなどの構造性のプロモーターとは対照的に調節可能な誘導性プロモーター（誘導性、再現性、開発的に調節された）も含んでもよい（かかる用語は実際にはある一定の条件下での遺伝子発現の程度の記述子であることを当業者は認識するであろう）。

選択マーカーは、当該技術分野において周知の要素である。一部の状況では、ＧＰＴに加えて追加的な選択マーカーを採用してもよく、かかるマーカーは細胞を見えるようにする。ポジティブまたはネガティブ選択を使用してもよい。

一部の実施形態では、ベクターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、強化シアン蛍光タンパク質（ｅＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、または強化黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）をコードする１つ以上の選択マーカー遺伝子を含む。

本発明の目的のために、真核細胞内での遺伝子発現は、オペレーターによって制御される強いプロモーターを使用して厳しく調整され、これは次いで調整融合タンパク質（ＲＦＰ）によって調整される。ＲＦＰは、本質的に転写ブロッキングドメインおよびその活性を調整するリガンド結合ドメインから構成される。かかる発現系の実施例は米国特許第ＵＳ２００９０１６２９０１Ａ１号に記述され、この特許は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。

原核生物細胞およびバクテリオファージ内の多数のオペレーターが良好に特徴付けられている（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，ｅｄ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｄ．Ｖｏｌ ２ ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．１９９６）。これらは、ＬｅｘＡペプチドを結合する大腸菌のＬｅｘＡ遺伝子のオペレーター領域、ならびに大腸菌のＬａｃＩおよびｔｒｐＲ遺伝子によってコードされるリプレッサータンパク質を結合するラクトースおよびトリプトファンオペレーターを含むがこれに限定されない。これらは、ラムダｃＩおよびＰ２２ａｒｃによってコードされたリプレッサータンパク質を結合するラムダＰ_ＲおよびファージＰ２２ ａｎｔ／ｍｎｔ遺伝子からのバクテリオファージオペレーターも含む。一部の実施形態では、リプレッサータンパク質の転写ブロッキングドメインが、ＮｏｔＩなどの制限酵素であるとき、オペレーターはその酵素のための認識配列である。オペレーターがプロモーターに隣接する、またはプロモーターに対して３’に位置付けられる必要があり、これによりプロモーターによって転写を制御する能力を有することを当業者は認識するであろう。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９７２，６５０号は、ｔｅｔＯ配列がＴＡＴＡ ｂｏｘから特定の距離以内であることを特定する。特定の実施形態では、オペレーターはプロモーターのすぐ下流に定置されることが好ましい。他の実施形態では、オペレーターはプロモーターの１０塩基対内に定置される。

ある一定の実施形態では、オペレーターは、ｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）、ＮｏｔＩ認識配列、ＬｅｘＡオペレーター、ラクトースオペレーター、トリプトファンオペレーター、およびＡｒｃオペレーター（ＡＯ）から成る群から選択される。一部の実施形態では、リプレッサータンパク質は、ＴｅｔＲ、ＬｅｘＡ、ＬａｃＩ、ＴｒｐＲ、Ａｒｃ、ラムダＣ１、およびＧＡＬ４から成る群から選択される。他の実施形態では、転写ブロッキングドメインは、真核性リプレッサータンパク質（例えば、ＧＡＬ４に由来するリプレッサードメイン）に由来する。

例示的な細胞発現系では、細胞はテトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）を発現するために改変され、また目的タンパク質はプロモーターの転写制御下に置かれ、その活性はＴｅｔＲによって調整される。２つのタンデムＴｅｔＲオペレーター（ｔｅｔＯ）は、ベクター内でＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター／エンハンサーのすぐ下流に置かれる。かかるベクター内のＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターによって向けられた目的タンパク質をコードする遺伝子の転写は、テトラサイクリンまたは一部の他の好適な誘導物質（例えば、ドキシサイクリン）が無い状態でＴｅｔＲによってブロックされる場合がある。誘導物質の存在下で、ＴｅｔＲタンパク質はｔｅｔＯを結合する能力を有さず、それ故目的タンパク質の転写次いで翻訳（発現）を生じる。（例えば、米国特許第７，４３５，５５３号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。）

別の例示的な細胞発現系は、ＴｅｔＲ−ＥＲ_ＬＢＤＴ２融合タンパク質などの調節性融合タンパク質を含み、この中で融合タンパク質の転写ブロッキングドメインはＴｅｔＲであり、またリガンド結合したドメインはＴ２突然変異を含むエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ＥＲ_ＬＢＤ）である（ＥＲ_ＬＢＤＴ２；Ｆｅｉｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３７：７５２−７５７）。ｔｅｔＯ配列が強いＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターの下流および近位に置かれたとき、ＣＭＶ−ＭＩＥ／ｔｅｔＯプロモーターからの対象となるヌクレオチド配列の転写は、タモキシフェンの存在下でブロックされ、またタモキシフェンの除去によってブロックされなくなる。別の実施例では、融合タンパク質Ａｒｃ２−ＥＲ_ＬＢＤＴ２、１５アミノ酸リンカーおよびＥＲ_ＬＢＤＴ２（ｓｕｐｒａ）によって接続された２つのＡｒｃタンパク質から成る一本鎖二量体から成る融合タンパク質の使用は、Ａｒｃオペレーター（ＡＯ）、より具体的にはＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター／エンハンサーのすぐ下流の２つのタンデムアークオペレーターに関与する。細胞株はＡｒｃ２−ＥＲ_ＬＢＤＴ２によって調整されてもよく、目的タンパク質を発現する細胞は、ＣＭＶ−ＭＩＥ／ＡｒｃＯ２プロモーターによって駆動され、またタモキシフェンの除去により誘発性である。（例えば、米国特許第２００９０１６２９０１Ａ１号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。）

一部の実施形態では、本発明のベクターは、ＣＭＶ−ＭＩＥ／ＴｅｔＯまたはＣＭＶ−ＭＩＥ／ＡＯ２ハイブリッドプロモーターを含む。

本発明のベクターは、目的遺伝子の複製を容易にするために組み換え技術用のＣｒｅ-ｌｏｘツールも採用してもよい。Ｃｒｅ−ｌｏｘストラテジは少なくとも２つの構成要素を要する。１）Ｃｒｅリコンビナーゼ、２つのｌｏｘＰ部位の間の組み換えに触媒作用を及ぼす酵素、および２）ｌｏｘＰ部位（例えば、組み換えが行われる場合、特異的な３４−塩基対ｂｐ配列から成る８−ｂｐコア配列、および２つの隣接する１３−ｂｐの逆転した繰返し）または突然変異体ｌｏｘ部位。（例えば、これらのすべてが参照により本明細書に組み込まれる、Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９２：１６０−４（１９９５）；Ｎａｇｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓｉｓ ２６：９９−１０９（２０００）；Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０（１９）：ｅ１０３（２００２）；および米国特許第ＵＳ２０１００２９１６２６Ａ１号を参照のこと）。別の組み換えストラテジでは、酵母に由来するＦＬＰリコンビナーゼが共通配列ＦＲＴとともに利用されてもよい（例えばＤｙｍｅｃｋｉ，Ｓ．ＰＮＡＳ ９３（１２）：６１９１−６１９６（１９９６）も参照のこと）。

別の態様では、遺伝子（すなわち、本発明の組み換え型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）は、発現カセットのＧＰＴ遺伝子の上流または下流に挿入され、また随意によりプロモーターに操作可能にリンクし、プロモーターにリンクした遺伝子は第１のリコンビナーゼ認識部位によって５’に隣接し、かつ第２のリコンビナーゼ認識部位によって３’に隣接する。かかるリコンビナーゼ認識部位は、発現系の宿主細胞内でＣｒｅが媒介する組み換えを可能にする。一部の事例では、第２のプロモーターにリンクした遺伝子は、第１の遺伝子の下流（３’）であり、また第２のリコンビナーゼ認識部位によって３’に隣接する。さらに他の事例では、第２のプロモーターにリンクした遺伝子は、第２のリコンビナーゼ部位によって５’に隣接し、かつ第３のリコンビナーゼ認識部位によって３’に隣接する。一部の実施形態では、リコンビナーゼ認識部位は、ｌｏｘＰ部位、ｌｏｘ５１１部位、ｌｏｘ２２７２部位、およびＦＲＴ部位から選択される。他の実施形態では、リコンビナーゼ認識部位は異なる。さらなる実施形態では、宿主細胞は、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する能力を有する遺伝子を含む。

一実施形態では、ベクターは、本発明の抗体の軽鎖または抗体の重鎖をコードする第１の遺伝子と、本発明の抗体の軽鎖または抗体の重鎖をコードする第２の遺伝子と、を含む。

一部の実施形態では、ベクターは、小胞体（ＥＲ）内のタンパク質フォールディングに関与する遺伝子の発現の制御を通してタンパク質生成／タンパク質分泌をさらに強化する能力を有すＸ−ボックス結合タンパク質１（ｍＸＢＰ１）遺伝子をさらに含む。（例えば、Ｒｏｎ Ｄ，ａｎｄ Ｗａｌｔｅｒ Ｐ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：５１９−５２９（２００７）を参照のこと）。

本発明の組み換え型核酸配列を発現するためにはあらゆる細胞が好適である。本発明で使用される細胞としては、非ヒト細胞、ヒト細胞、または細胞融合（例えば、ハイブリドーマまたはクアドローマなどの）などの哺乳類細胞が挙げられる。ある一定の実施形態では、細胞は，ヒト、サル、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。他の実施形態では、細胞は真核性であり以下の細胞から選択される。ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ−１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ細胞、腫瘍細胞、および前述の細胞に由来する細胞株。一部の実施形態では、細胞は１つ以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）を含む。

またさらなる態様では、本発明は、抗体または二重特異性分子などの免疫グロブリンを生成するトランスフェクトーマなどの組み換え型哺乳類宿主細胞に関する。かかる宿主細胞の実施例としては、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ細胞などの遺伝子操作された哺乳類細胞が挙げられる。例えば、一実施形態では、本発明は、本発明の組み換え型ポリペプチドを含む抗体の発現のための配列コード化を含む細胞ゲノムの中へと安定して組み込まれた核酸を含む細胞を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の組み換え型ポリペプチドを含む抗体の発現のための配列コード化を含む、プラスミド、コスミド、ファージミド、または線形発現要素などの組み込まれていない（すなわち、エピソーム性）核酸を含む細胞を提供する。他の実施形態では、本発明は、本発明の発現ベクターを含むプラスミドを用いて宿主細胞を安定してトランスフェクトすることによって生成された細胞株を提供する。

したがって、一態様では、本発明は、（ａ）外因的に添加された哺乳類ＧＰＴ遺伝子をコードする組み換え型ポリヌクレオチド、および（ｂ）マルチサブユニットタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供する。一部の実施形態では、外因的に添加されたＧＰＴ遺伝子は、配列番号：２の核酸配列と９０％同一であり、その非限定的実施例が配列番号：１１〜１７に提供され、またマルチサブユニットタンパク質が抗体である。他の実施形態では、細胞は外因的に添加されたＧＰＴ遺伝子および調節要素も含有する。一実施形態では、細胞は、バイオ医薬品の製造で使用されるＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞である。

別の態様では、本発明は以前の態様に記述される細胞に由来する細胞株を提供する。「に由来する」ことによって意味されることは、個別の細胞から細胞の個体数がクローン的に子孫に伝わり、また活性タンパク質を所与の力価で生成する能力、または特定の密度まで増殖する能力などの一部の選択品質を有することである。一部の実施形態では、哺乳類ＧＰＴ遺伝子をコードする組み換え型ポリヌクレオチド、およびマルチサブユニットタンパク質をコードするポリヌクレオチドを寄生する細胞に由来する細胞株は、マルチサブユニットタンパク質を少なくとも培地１リットルあたり３グラム（ｇ／Ｌ）、少なくとも５ｇ／Ｌ、または少なくとも８ｇ／Ｌの力価で生成する能力を有する。一部の実施形態では、細胞株は、本質的に同一の細胞であるがＧＰＴをコードする組み換え型ポリヌクレオチドを含まないものに由来する細胞株によって達成可能な細胞密度積分値より少なくとも３０％大きい、少なくとも５０％大きい、少なくとも６０％大きい、または少なくとも９０％大きい細胞密度積分値（ＩＣＤ）を達成することができる。

ＧＯＩを増幅するための方法が提供される。例示する方法は、ツニカマイシンの濃度の増加を真核性ＧＰＴ発現系に適用し、ひいては外因的に添加された哺乳類ＧＰＴ遺伝子に操作可能にリンクしたＧＯＩの遺伝子コピーを増幅する。

目的タンパク質
目的タンパク質をコードする核酸配列を、Ｔｎ耐性マーカー遺伝子およびＩＲＥＳを含む細胞内に都合よく組み込み、また随意によりリコンビナーゼ認識部位と隣接することができる。哺乳類細胞内での発現のために好適な任意の目的タンパク質を使用することができるが、特に糖タンパク質は本発明の方法からの恩恵を受ける。例えば、目的タンパク質は、抗体もしくはその抗原結合断片、二重特異性抗体もしくはその断片、キメラ型抗体もしくはその断片、ＳｃＦｖもしくはその断片、Ｆｃタグ付きタンパク質（例えば、Ｔｒａｐタンパク質）もしくはその断片、成長因子もしくはその断片、サイトカインもしくはその断片、または細胞表面受容体の細胞外ドメインもしくはその断片とすることができる。

アスパラギンとリンクした（Ｎ−リンクした）グリカンを有する糖タンパク質は真核細胞内に遍在する。これらのグリカンの生合成およびこれらのポリペプチドへの移動は、小胞体（ＥＲ）内で行われる。Ｎ−グリカン構造は、ＥＲおよびゴルジ複合体内のグリコシダーゼおよびグリコシル−トランスフェラーゼの数によってさらに修飾される。本発明を使用するタンパク質生成は、免疫原性エピトープ（「グリコトープ」）を除去するためのネイティブのＮ−グリカン構造の一貫性を目的とする。

本発明の方法を使用して、組み換え型タンパク質ロットは好ましい特性を示す。本明細書の図７〜図８に例示するように、複製タンパク質生成バッチのＨＰＬＣ（蛍光検出付き）は、糖タンパク質が均質な発現およびグリコシル化パターンを有することを実証した。Ｎ−グリカンタンパク性基質をグリコシル化する方法が提供され、一方でグリコシル化を必要としてタンパク性基質をコードする遺伝子に操作可能にリンクした哺乳類ツニカマイシン（Ｔｎ）耐性遺伝子を含む核酸分子をコードする哺乳類宿主細胞が提供され、第１の濃度のＴｎの存在下で細胞が培養され、Ｔｎ耐性遺伝子の少なくとも１つのコピーを発現する細胞集団が単離され、Ｔｎの増加する濃度の存在下で細胞集団が培養され、そしてＮ−グリカンタンパク性基質が細胞培養から単離される。タンパク性基質のＮ−グリカン含有量は、当該技術分野で既知の任意の方法によって単糖類およびオリゴ糖の存在のために評価されてもよい。

グリカンにリンクしたタンパク質の詳細な構造解析は、タンパク質の機能的特徴と相関する場合がある。タンパク質のグリコシル化を特徴付けるかかる解析は、典型的にはいくつかの工程を含む。ｉ）付着したグリカンの酵素的または化学的放出；ｉｉ）芳香族アミンもしくは脂肪族アミンを用いた還元的なアミノ化または完全メチル化を介した放出されたグリカンの誘導体化；ｉｉｉ）グリカンの解析。グリコシル化を解析するパターンの数多くの変形が当業者には既知である。糖タンパク質には、様々な部位を特異的な量で占有するいくつかのタイプの糖型がある場合があり、したがってある一定の生成方法での再生をこれらの複合性が困難にしている場合がある。糖型のタイプおよび数量の一貫性は測定可能であり、また治療用タンパク質生成のために望ましい転帰を表す。

宿主細胞およびトランスフェクション
本発明の方法で使用される哺乳類宿主細胞は、真核性宿主細胞、通常哺乳類細胞であり、例えば、ＣＨＯ細胞およびマウス細胞が含まれる。一実施形態では、本発明は、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（チャイニーズハムスター）（配列番号：３で示される）に由来するＴｎ耐性マーカータンパク質またはそのホモログまたはその変異型をコードする核酸配列を含む細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞はＴｎ耐性マーカー遺伝子の多重遺伝子コピーを含む。他の実施形態では、本発明は、ヒト（配列番号：４）、アカゲザル（配列番号：５）、チンパンジー（配列番号：６）、イヌ（配列番号：７）、モルモット（配列番号：８）、ラット（配列番号：９）、またはマウス（配列番号：１０）に由来するＴｎ耐性マーカータンパク質をコードする核酸配列を提供する。

本発明は、本発明の発現ベクターで形質移入された哺乳類宿主細胞を含む。形質移入された宿主細胞は、目的タンパク質またはポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクターで形質移入された細胞を含む。発現されたタンパク質は、典型的には選択された核酸配列に依存して培地の中へと分泌されるが、細胞内に保持されてもよく、または細胞膜内に沈着されてもよい。組み換え型タンパク質を発現するために様々な哺乳類細胞培養系を採用することができる。好適な哺乳類宿主細胞株の実施例としては、サル腎臓の細胞ＣＯＳ−７株（Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ ２３：１７５に記述される）、および適切なベクターを発現する能力を有する他の細胞株（例えば、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０４７８）、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株を含む）が挙げられる。特定の選択スキームまたは増幅スキームのために開発された他の細胞株も、本明細書に提供される方法および組成物で有用であることになる。本発明の一実施形態では、細胞はＫ１と指名されたＣＨＯ細胞株（すなわち、ＣＨＯ Ｋ１細胞）である。組み換え型タンパク質の大量生産の目標を達成するために、宿主細胞株は適切な事例でバイオリアクター媒体に予め適合するべきである。

いくつかのトランスフェクションプロトコルが当該技術分野で既知であり、またＫａｕｆｍａｎ（１９８８）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：５３７で検討されている。選ばれたトランスフェクションプロトコルは、宿主細胞タイプおよびＧＯＩの性質に依存することになり、そしてこれを規定通りの実験に基づいて選ぶことができる。任意のかかるプロトコルの基本的な要件は、まず目的タンパク質をコードするＤＮＡを好適な宿主細胞の中へと導入すること、そして次いで異種ＤＮＡを相対的な安定した発現的な様式で組み込んだ宿主細胞を識別および単離することである。

哺乳類細胞の中へ異種ＤＮＡを導入するために有用なある一定の試薬としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）ＲｅａｇｅｎｔおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、米国メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）が挙げられる。これらの試薬は両方とも脂質−核酸複合体（またはリポソーム）を形成するために使用される市販されている試薬であり、培養した細胞に適用されたとき、細胞内への核酸の摂取を容易にする。

選ばれたトランスフェクションプロトコルおよびその中で使用するために選択された要素は、使用される宿主細胞のタイプに依存することになる。当業者は多数の異なるプロトコルおよび宿主細胞を承知しており、そして使用される細胞培養系の要件に基づいて所望のタンパク質の発現のために適切な系を選択することができる。さらなる態様では、本発明は、抗体、二重特異性抗体、キメラ型抗体、ＳｃＦｖ、抗原結合タンパク質、またはＦｃ融合タンパク質を含むがこれに限定されないポリペプチドをコードする発現ベクターに関する。かかる発現ベクターは、本発明の方法および組成物を使用するポリペプチドの組み換え型生成のために使用されてもよい。

本発明の他の特徴は、本発明の例示のために与えられ、かつその限定を意図しない例示的な実施形態の以下の記述の過程で明らかになるであろう。

以下の実施例は、本明細書に記述される方法および組成物をどのように作製し使用するかを当業者に提供するために提示されており、発明者がその発明として見なすものの範囲を制限することを意図していない。使用した数字（例えば、量、温度等）に対する正確さを確保するために努力がなされたが、一部の実験誤差および偏差を考慮に入れるべきである。別途示さない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は大気圧でまたは大気圧付近での℃（摂氏）である。

（実施例１）
トランスフェクタント細胞発現ＧＰＴの選択効率
修飾したＣＨＯ Ｋ１細胞を、ＣＨＯ−ＧＰＴ（配列番号：２）、ヒトＧＰＴ（配列番号：１２）を含有するプラスミドベクター、またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｈｐｔ、ハイグロマイシン耐性遺伝子）を含有するプラスミドベクターを用いて形質移入し、例えば、選択マーカー遺伝子（ＣＨＯ−ＧＰＴまたはｈｐｔ）をＩＲＥＳ配列を介してそれらのそれぞれのベクター内で下流ｅＧＦＰ遺伝子に転写的にリンクした。例えば、５’〜３’方向に以下の遺伝子配列を含有するように各プラスミドを構築した。Ｌｏｘ部位、ＳＶ４０後期プロモーター、ＣＨＯ−ＧＰＴ（またはＨｐｔ）のいずれか、ＩＲＥＳ、強化した緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、および第２のＬｏｘ部位。精製した組み換え型プラスミドをＣｒｅリコンビナーゼを発現するプラスミドと一緒に修飾したＣＨＯ宿主細胞株へと形質移入し、この細胞株は、転写的に活性の遺伝子座において、５’〜３’に、ｌｏｘ部位、ＹＦＰ、および第２のｌｏｘ部位を含有した。その結果として、フローサイトメトリーによって宿主ＣＨＯ細胞を緑色陽性細胞または黄色陰性細胞として単離することができる。ｅＧＦＰ（ＧＰＴまたはｈｐｔ遺伝子によって転写的に調整された）を発現する組み換え型プラスミドが、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するプラスミドと一緒に形質移入されたとき、Ｃｒｅリコンビナーゼによって媒介された組み換えは結果として、ｌｏｘ部位の置き換えを含有する染色体の遺伝子座において、ＧＰＴ／ｅＧＦＰカセットの部位特異的な組み込みをもたらし、ＹＦＰ遺伝子を生じる（すなわち緑色陽性細胞）。ｅＧＦＰがランダムに組み込む場合、緑色陽性および黄色陽性細胞の両方がもたらされることになる。

細胞集団は、表２に概要を示すように、０、１μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、もしくは５μｇ／ｍＬのツニカマイシン（Ｔｎ）で、または４００μｇハイグロマイシン（Ｈｙｇ）でのいずれかでインキュベートされる。観察された組み換え型集団（ＯＲＰ）は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）解析によって測定された。細胞の各集団を定量するために細胞が選別され、またＧＦＰのみを発現し、ＹＦＰを発現しない細胞に対して選択効率が計算された（図４または図５）。

選択効率（ＧＦＰを発現する生存している細胞の集団のパーセント）がＴｎまたはＨｙｇのいずれかに対して耐性を示す細胞プールの間で比較された（表２）。

ツニカマイシン選択がハイグロマイシン選択と同じぐらい効率的であることが観察された。ＣＨＯ−ＧＰＴとヒトＧＰＴとの両方は、１μｇ／ｍＬまたは２．５μｇ／ｍＬのツニカマイシンの存在下で組み込み体の選択において効率的であった。

（実施例２）
遺伝子産物の増幅
ツニカマイシンのＧＰＴ発現系に対する濃度の増加を適用することによって漸増選択が行われた。ＣＨＯ Ｋ１細胞は、上記のようにＣＨＯ−ＧＰＴ遺伝子（配列番号：２）を含有するプラスミドベクターを用いて形質移入された。プラスミドは、５’〜３’方向に、第１のＬｏｘ部位、ＳＶ４０後期プロモーター、ＣＨＯ−ＧＰＴ遺伝子、ＩＲＥＳ、ｅＧＦＰ、および第２のＬｏｘ部位を含有する。ＣＲＥ−ｌｏｘ部位は、目的遺伝子のゲノムへの組み込みを指示し、結果として細胞当たり少なくとも１つのＧＰＴ挿入を有する細胞の安定したトランスフェクタントプールが得られる。（上に示したように、ランダム組み込みに起因してより多くの組み込み体が生じうる）。ＣＨＯ細胞は当初１μｇ／ｍＬのツニカマイシン（Ｔｎ）の存在下で培養された。次いで、トランスフェクタントは安定したプール（細胞プール２と名付けられる）から選択され、これに続いて１μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、または５μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で拡張された。ｅＧＦＰの強化した発現の能力（多重コピー）を有する細胞集団を識別するために選択ラウンドが実施された。ランダム組み込みイベントは２．５μｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬのＴｎの存在下で大幅に増加した。

標準的なｑＰＣＲ方法を使用してＣＨＯ ＧＰＴ、ｅＧＦＰ、またはｍＧａｐｄｈ（正規化対照）のいずれかの遺伝子産物のコピー数を測定した。２．５μｇ／ｍＬのＴｎでさらにインキュベートした１μｇ／ｍＬ Ｔｎ耐性プールからの細胞中のｅＧＦＰのコピー数は、１μｇ／ｍＬのＴｎでさらにインキュベートした１μｇ／ｍＬ Ｔｎ耐性プールからの細胞中のｅＧＦＰのコピー数の少なくとも２倍である。１μｇ／ｍＬのＴｎ処置したプールが５μｇ／ｍＬのＴｎでさらにインキュベートされたとき、遺伝子コピー数はさらに増加する。ｅＧＦＰに対する遺伝子コピー数の増加はＣＨＯ−ＧＰＴの遺伝子コピーの増加に相関する。（図６Ａおよび図６Ｂを参照のこと。）

遺伝子コピー数の増加が、タンパク質発現の増加につながるかどうかを判定するために、Ｔｎの選択の複数のラウンド、すなわち、１、２．５、または５μｇのＴｎで処置された、ＧＰＴおよびｅＧＦＰを発現する同一の細胞プールについて、ＦＡＣＳによって平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した（例えば、図６Ｂのサンプル７、８、および９を参照のこと）。これらの細胞プールに対するｅＧＦＰ発現の比較が表３に表される。

５μｇのＴｎでの選択の第２ラウンドを受けたＧＰＴを発現する細胞プールは、結果としてｅＧＦＰ生成について、１μｇのＴｎ処置と比較して生産性出力がまさに２．５倍より大きく、また２．５μｇのＴｎ処置と比較して生産性出力が１．５倍より大きい（表３）。

いかなる一つの理論にも束縛されるものではないが、Ｔｎの濃度の漸増的な増加は細胞に対する選択的な圧力を制御された様式で増幅し、ひいては生産的な出力を増加する。

以下に記述されるさらなる実験でも、グリコシル化パターン上でのＴｎ選択の効果を試験するためにＴｎ耐性発現ベクターが採用される。

（実施例３）
例示的な二量体タンパク質の発現およびグリコシル化プロファイル
「トラップ」タンパク質（Ｆｃ融合タンパク質−１、以下ＦｃＦＰ１と記載する）を発現するＣＨＯ細胞はＧＰＴを含有する発現ベクターで形質移入される。プラスミドは、５’〜３’方向に、Ｌｏｘ部位、ＳＶ４０後期プロモーター、Ｔｎ耐性遺伝子（ＣＨＯ−ＧＰＴ）、ＩＲＥＳ ｅＧＦＰ、ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ、および第２のＬｏｘ部位を有する。ＧＰＴ選択マーカーの選択のために１μｇ／ｍＬ Ｔｎまたは５μｇ／ｍＬ Ｔｎが使用された。選択されたプール細胞は、血清を含まない生成媒体中の懸濁液培養内で拡張される。ＧＰＴトランスフェクションはＦＡＣＳ解析によるｅＧＦＰの発現によって確認される。選択されたプールから回収されたペレットはＧＰＴ発現に対するコピー数解析のために送られ、また異なる濃度のツニカマイシンを用いて選択されたプール内でのＦｃＦＰ１の発現レベルを判定するために１２日間生産性アッセイが設定された。

ＦｃＦＰ１は、豊富なグリコシル化部位を有する、その複雑なグリコシル化パターンのために選択された。グリコシル化プロファイルを判定するために、ＦｃＦ１タンパク質を発現する細胞は、細胞培養物内で、標準プロトコル（Ｔｎなし）下、または表４に表すＴｎの処置条件の下で拡張され、次いでタンパク質は単離および精製された。

糖タンパク質の各ロットに対してＴｎがグリコシル化プロファイルに悪影響を有するかどうかを判定するために、ＨＰＬＣおよび蛍光アントラニル酸（ＡＡ）タグ（Ａｎｕｍｕｌａ，ａｎｄ Ｄｈｕｍｅ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，８（７）：６８５−６９４，１９９８）についての周知の方法に基づくクロマトグラフィーを使用して詳細なグリカン解析が実施された。生産ロットは、タンパク質の治療的な許容できるバッチを代表する参照標準とも比較された。代表的なグリカン解析を図７Ａ〜図７Ｄに示す。参照ロットと比較すると、各ロットは同一の数のピーク、相対的な形状、および相対的な強度を一貫して生成する。各クロマトグラムの重ね合わせ（図８）は、特有のまたは異常なピークが明らかにされることがなかったことを示している。

ＦｃＦＰ１タンパク質のためのオリゴ糖プロファイリングが、周知のＨＰＬＣ方法によって参照標準ロットに対して行われた。ＦｃＦＰ１トラップタンパク質ロットに対してシアル化のレベルが測定され、かつ各ロットに対してＺ番号が計算された（３回の反復）。Ｚ番号はロット間の変化の測定を代表する。Ｚ番号は、ピークの相対的な数だけでなく、各ピークの相対的な形状および強度を考慮に入れる。例えば、図７Ａ〜図７Ｄの０ＳＡ、１ＳＡ、２ＳＡ、３ＳＡ、および４ＳＡの各々のピークの面積は表５に示すように定量される。

各ロットのために計算されたＺ番号は参照ロットと比較して許容できる範囲内であり、したがって各タンパク質ロットは治療用分子と同一の材料を達成していると理解される。Ｔｎの存在はＮ−リンクした糖タンパク質グリコシル化に悪影響を有することが既知であるため、Ｔｎによる選択圧力の増加の条件を仮定するとタンパク質生成が信頼性があり、かつ一貫しているだけでなく、生産性が高いものになることは予想外であった。

本発明は、趣旨またはその本質から逸脱することなく他の特定の実施形態で具現化されてもよい。

Claims (1)

1. 明細書に記載の発明。