JP2022529063A - 安定的な標的組み込み - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2019年4月18日に出願された米国仮特許出願第62/835,810号の優先権の利益を主張するものであり、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。
本開示は、予測可能かつ確実に外因性配列が機能し得るゲノムローカスへの外因性配列の安定的な組み込みに関する。
従来の細胞株工学のアプローチは、宿主細胞のゲノム内にランダムに導入遺伝子を挿入する方法を用いていた。このような工学的アプローチにより、組み換え治療用タンパク質発現のための高生産性細胞株が開発されてきた。しかし、かかる組み換え方法は、不安定な細胞株、および同じ分子の発現における発現量やタンパク質の不均一性が著しく異なるクローン集団の原因となる。これらの問題を回避するために、導入遺伝子の部位特異的な標的組み込みが、組み換え治療用タンパク質の発現には望まれている。
本開示の様々な態様のうち、少なくとも1つの外因性配列を細胞のゲノムDNAへ安定的に組み込むための方法を提供する。この方法は、NCBI参照配列、NW_003613934.1、NW_003614159.1、NW_003613732.1、またはそのホモログから選択されたゲノム配列内の部位へ、この少なくとも1つの外因性配列を組み込む事を含む。
(a)細胞に(i)NCBI参照配列NW_003613934.1、NW_003614159.1、NW_003613732.1、またはそのホモログから選択されたゲノム配列内の標的部位を標的とする、標的指向性エンドヌクレアーゼまたは標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および(ii)外因性配列を含むドナーポリヌクレオチド、を導入する事:および
b)ゲノム配列の標的部位に外因性配列が組み込まれるような条件下で細胞を維持する事、を含む。
本開示は外因性配列の安定的な組み込みのためのゲノムローカス、および外因性配列を該ゲノムローカスに組み込むための方法を提供する。外因性配列は、それらが予測可能かつ確実に機能し得るこれらのゲノムローカスへと安定的に組み込まれる。したがって、該ゲノムローカスは「セーフハーバー」と呼ぶことができる。組み込まれた配列は、該ゲノムローカスにとどまり、かついかなる方法でも切除されず、または変更されない。例えば、この組み込まれた配列および隣接する配列は遺伝子サイレンシングまたは位置効果の対象とならない。加えて、組み込まれた外因性配列は、細胞内の遺伝子またはその他の染色体配列の機能に影響を与えない、すなわち全体的または局所的な遺伝子発現を変更せず、細胞の異常または欠損が無く、位置的な突然変異またはその他の副作用が無い、等。さらに、外因性配列がタンパク質またはRNA分子をコードする場合、外因性配列の発現は安定的、効率的、一貫した、および予測可能なものである。
本開示の1つの態様は、外因性配列を組み込むことができる、および外因性配列が予測可能かつ確実に機能し得る、哺乳類ゲノムローカスを提供する。安定的な組み込みのために適したゲノムローカスは、NCBI参照配列(RefSeq)NW_003613934.1(CriGri_1.0スキャフォールド979)、NW_003614159.1(CriGri_1.0スキャフォールド3466)、NW_003613732.1(CriGri_1.0スキャフォールド1721)、またはそのホモログから選択されたゲノム配列内に位置する。上記のRefSeqは、チャイニーズハムスターのゲノムからのコンティグ/スキャフォールドであるが、相同配列はその他の哺乳類(例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウシ、など)のゲノムにも存在しており、これらの哺乳類細胞における安定的な組み込みのために用いることができる。
本開示の別の態様は、1以上の外因性配列を細胞のゲノムDNAへ安定的に組み込むための方法であって、NCBI参照配列NW_003613934.1、NW_003614159.1、NW_003613732.1、またはそのホモログから選択されたゲノム配列内の部位に、該少なくとも1つの外因性配列を組み込む事を含む、方法を提供する。この組み込まれた配列は細胞に副作用を及ぼさず、および組み込まれた配列の機能は予測可能であり、一貫しており、かつ再現性がある。
本明細書で使用する場合、「外因性」配列とは、細胞にとって固有ではないヌクレオチド配列、または細胞ゲノム内でその本来の位置とは異なる位置にあるヌクレオチド配列を指す。
本方法は、外因性配列を含むドナーポリヌクレオチドを細胞に導入する事を含む。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチド内の外因性配列は、ゲノム配列内の標的部位を挟む配列に対する実質的な配列同一性を有する配列によって挟まれ得る。例えば、外因性配列は上流の配列と下流の配列によって挟まれ得、ここで、上流および下流の配列は、ゲノム配列内の標的部位の両側の配列に対する実質的な配列同一性を有する。本明細書で使用する場合、上流の配列とは、標的部位のすぐ上流のゲノム配列に対する実質的な配列同一性を共有する核酸配列を指す。同様に下流の配列とは、標的部位のすぐ下流のゲノム配列に対する実質的な配列同一性を共有する核酸配列を指す。外因性配列を含むドナーポリヌクレオチド内の上流および下流の配列は、標的ゲノム配列とドナーポリヌクレオチド(外因性配列を含む)間の組み換えを促進するように選択される。
本方法はまた、標的指向性エンドヌクレアーゼまたは標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞内に導入する事を含む。標的指向性エンドヌクレアーゼはDNA結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む。標的指向性エンドヌクレアーゼのDNA結合ドメインはプログラム可能であり、つまりそれが異なるDNA配列を認識して結合するように設計または操作されることができることを意味する。いくつかの実施形態において、DNA結合は、標的指向性エンドヌクレアーゼのDNA結合ドメインおよび標的DNAとの間の相互作用により媒介される。ゆえに、DNA結合ドメインは、タンパク質工学により目的のDNA配列に結合するようにプログラムされることができる。その他の実施形態において、DNA結合は、標的指向性エンドヌクレアーゼのDNA結合ドメインおよび標的DNAと相互作用するガイドRNAによって媒介される。かかる場合、DNA結合ドメインは、好適なガイドRNAを設計することにより、目的のDNA配列を標的とする事ができる。
いくつかの実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)であり得る。ZFNはDNA結合ジンクフィンガー領域、およびヌクレアーゼドメインを含む。ジンクフィンガー領域は、約2から7個のジンクフィンガー、例えば約4から6個のジンクフィンガーを含み得、各ジンクフィンガーは3つのヌクレオチドに結合し、およびジンクフィンガーは好適なリンカー配列を用いて一緒に連結され得る。ジンクフィンガー領域は任意のDNA配列を認識し、かつ結合するように操作される。例えば、Beerli et al.(2002)Nat.Biotechnol.20:135-141;Pabo et al.(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340;Isalan et al.(2001)Nat.Biotechnol.19:656-660;Segal et al.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637;Choo et al.(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416;Zhang et al.(2000)J.Biol.Chem.275(43):33850-33860;Doyon et al.(2008)Nat.Biotechnol.26:702-708;およびSantiago et al.(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:5809-5814、を参照。DNA配列内の潜在的な標的部位を同定する、およびジンクフィンガー結合ドメインを設計するための、一般に公開されているウェブベースのツールは当技術分野で公知である。
その他の実施形態において、標的指向性エンドヌクレアーゼはRNAにガイドされたCRISPR/Casヌクレアーゼシステムであり得、これはDNAに二本鎖切断を導入する。CRISPR/CasヌクレアーゼシステムはCRISPR/CasヌクレアーゼおよびガイドRNAを含む。
その他の実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼはペアCRISPR/Casニッカーゼシステムであり得る。CRISPR/Casニッカーゼシステムは、CRISPR/CasヌクレアーゼがDNAの一本鎖のみを切断するように改変されている事を除いて上記のCRISPR/Casヌクレアーゼシステムに類似している。したがって、単一CRISPR/Casニッカーゼシステムは二本鎖DNAに一本鎖切断またはニックを作り出す。あるいは、オフセットgRNAのペアを含むペアCRISPR/Casニッカーゼシステム(または二重ニッカーゼシステム)は、一本鎖切断をDNAの反対の鎖にも発生させることで、DNAの二本鎖切断を生成し得る。
代替的な実施形態において、標的指向性エンドヌクレアーゼは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)であり得る。TALENは、ヌクレアーゼドメインに連結した、転写活性化因子様エフェクター(TALE)に由来する高度に保存された反復配列で構成されるDNA結合ドメインを含む。TALEは植物病原菌キサントモナスによって分泌されるタンパク質であり、宿主植物細胞において遺伝子の転写を変化させる(Bai et al.,2000,Mol.Plant Microbe Interact.,13(12):1322-9)。TALE反復アレイは目的の任意のDNA配列を標的とするように、モジュラータンパク質設計を介して操作され得る。TALENのヌクレアーゼドメインは、上記のセクション(II)(c)(i)に記載されているあらゆるヌクレアーゼドメインであり得る。具体的な実施形態において、ヌクレアーゼドメインはFokIに由来する(Sanjana et al.,2012,Nat Protoc,7(1):171-192)。
さらなる他の実施形態において、標的指向性エンドヌクレアーゼはメガヌクレアーゼまたはその誘導体であり得る。メガヌクレアーゼは、長い認識配列(すなわち、認識配列が一般に約12塩基対~約45塩基対の範囲である)によって特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼである。この要求の結果として、認識配列は一般に、所定のあらゆるゲノムにおいて一度しか生じない。メガヌクレアーゼの中で、LAGLIDADGと名付けられたホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーはゲノムの研究およびゲノム操作のための有用なツールとなっている(Arnould et al.,2011,Protein Engineering,Design &Selection,24(1-2):27-31)。その他の好適なメガヌクレアーゼは、I-CreI、I-Dmol、I-SceI、I-TevIおよびそれらのバリアントであり得る。メガヌクレアーゼは当技術分野で当業者に公知の技術を用いてその認識配列を改変することによって、特定の染色体配列を標的とし得る。
さらなる他の実施形態において、標的指向性エンドヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインおよびプログラム可能なDNA結合ドメインを含む融合タンパク質であり得る。このヌクレアーゼドメインは、上記のセクション(II)(c)(i)に記載されているヌクレアーゼドメインのいずれか、CRISPR/Casヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメイン(例えば、Cas9のRuvC様ヌクレアーゼドメインもしくはHNH様ヌクレアーゼドメイン、またはCpf1のヌクレアーゼドメイン)、またはメガヌクレアーゼもしくはレアカットエンドヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインであり得る。
標的指向性エンドヌクレアーゼは、追加ドメインをさらに含み得る。例えば、標的指向性エンドヌクレアーゼは、少なくとも1つの核移行シグナル、少なくとも1つの細胞透過性ドメイン、および/または少なくとも1つのマーカードメインをさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼは、標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸として細胞内に導入される。標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸はDNAまたはRNA、直鎖状または環状、一本鎖または二本鎖であり得る。RNAまたはDNAは、目的の真核細胞内で効率的にタンパク質に翻訳されるために、コドン最適化され得る。コドン最適化プログラムは、フリーウェアとして、または市販のソースから入手できる。いくつかの実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸はmRNAであり得る。標的指向性エンドヌクレアーゼをコードするmRNAは、in vitroで転写され、および細胞への導入のために精製され得る。mRNAは5’キャッピングおよび/または3’ポリアデニル化され得る。その他の実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、DNAであり得る。標的指向性エンドヌクレアーゼをコードするDNA配列は、目的の細胞における発現のために、少なくとも1つのプロモーター調節配列と作動可能に連結され得る。さらなる態様では、標的指向性エンドヌクレアーゼをコードするDNA配列はまた、ポリアデニル化シグナル(例えば、SV40ポリAシグナル、ウシ成長ホルモン(BGH)ポリAシグナルなど)および/または少なくとも1つの転写終結配列と連結され得る。
本方法は、(i)標的指向性エンドヌクレアーゼまたは標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および(ii)外因性配列を含むドナーポリヌクレオチド、を細胞に導入することを含む。標的化ヌクレアーゼがタンパク質(すなわち、ZFN、TALEN、メガヌクレアーゼ)である実施形態では、標的化ヌクレアーゼは、(i)精製タンパク質、(ii)コーディングRNA、または(iii)コーディングDNA、として細胞に導入され得る。標的指向性エンドヌクレアーゼがCRISPR/CASシステムである実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼは、(i)タンパク質-ガイドRNA複合体として、(ii)ガイドRNAをコードするDNAと一緒に、タンパク質として、(iii)ガイドRNAをコードするDNAと一緒に、CRISPR/CAS ヌクレアーゼをコードするRNAとして、または(iv)ヌクレアーゼおよびガイドRNAの両者をコードするDNAとして、細胞に導入され得る。
本方法は、外因性配列がゲノム配列の標的部位に組み込まれるのに適切な条件下で細胞を維持する事をさらに含む。ドナーポリヌクレオチド内の外因性配列が、ゲノム配列内の標的部位を挟む配列に対する実質的な配列同一性を有する配列に挟まれている実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼはゲノム配列内の標的部位に二本鎖切断を導入し、外因性配列は、相同配列指向性プロセスによってゲノム配列に組み込まれる。ドナーポリヌクレオチド内の外因性配列が標的指向性エンドヌクレアーゼによって認識される配列に挟まれている実施形態では、標的指向性エンドヌクレアーゼはゲノム配列内の標的部位およびドナーポリヌクレオチド内の外因性配列を挟む認識配列に二本鎖切断を導入し、外因性配列は直接的なライゲーションプロセスによってゲノム配列に組み込まれる。
好適な細胞には哺乳類細胞または哺乳類細胞株を含む。好適な哺乳類細胞の非限定的な例は、以下を含む:チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞;マウス骨髄腫NS0細胞;ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞;マウス胚線維芽細胞3T3細胞(NIH3T3)、マウスBリンパ腫A20細胞;マウス黒色腫B16細胞;マウス筋芽細胞C2C12細胞;マウス骨髄腫SP2/0細胞;マウス胚間葉C3H-10T1/2細胞;マウス癌CT26細胞、マウス前立腺DuCuP細胞;マウス乳房EMT6細胞;マウス肝癌Hepa1c1c7細胞;マウス骨髄腫J5582細胞;マウス上皮MTD-1A細胞;マウス心筋MyEnd細胞;マウス腎RenCa細胞;マウス膵臓RIN-5F細胞;マウス黒色腫X64細胞;マウスリンパ腫YAC-1細胞;ラット膠芽腫9L細胞;ラットBリンパ腫RBL細胞;ラット神経芽細胞腫B35細胞;ラット肝癌細胞(HTC);バッファローラット肝臓BRL3A細胞;イヌ腎細胞(MDCK);イヌ乳腺(CMT)細胞;ラット骨肉腫D17細胞;ラット単球/マクロファージDH82細胞;サル腎臓SV-40形質転換線維芽細胞(COS7)細胞;サル腎臓CVI-76細胞;アフリカミドリザル腎臓(VERO-76)細胞;ヒト胎児腎細胞(HEK293、HEK293T);ヒト子宮頸癌細胞(HELA);ヒト肺細胞(W138);ヒト肝細胞(HepG2);ヒトU2-OS骨肉腫細胞、ヒトA549細胞、ヒトA-431細胞、またはヒトK562細胞。哺乳動物細胞系の広範なリストは、アメリカ培養細胞系統保存機関カタログ(ATCC,Manassas,VA)において見いだされてもよい。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する。Singleton et al.,Dictionary of Microbiology およびMolecular Biology(2nd ed.1994)、The Cambridge Dictionary of Science およびTechnology(Walker ed.,1988)、The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991)、およびHale &Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。本明細書で使用される場合、以下の用語は、特別の定めのない限り、それらに帰する意味を有する。
以下の実施例は本発明の特定の態様を説明する。
アプローチ1。GFP発現カセットランディングパッドと、それを挟むLox部位、Lox71およびLox2272を含む、プラスミドCLE385のランダムな組み込み(図1Aを参照)。GFP高発現な単一コピークローンを同定し、評価した。そこで、ランダムに組み込まれたランディングパッドのコンティグアクセッション番号およびコンティグ内の位置を決定するために、組み込みイベントを挟むゲノム配列を、入手可能なCHOデータベースに対してBlastした。
ランディングパッドCLE385を持つクローン(クローンD145)を単離した。このクローンにおいて、リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)を行った。簡単に説明すると、ランディングパッドCLE385と互換性のあるLox部位に挟まれたmAbカセットを含むプラスミドドナー(CLE389、図1A)を、Cre mRNAと一緒に、このクローンにエレクトロポレーション法で導入した。RMCEが成功した後では、CLE385ランディングパッドはCLE389のドナーカセットと交換されているだろう。グルタミン選択の後、得られたプールをフローサイトメトリーで解析し(図2)、D145親クローン、およびCre mRNA非添加でドナーのみを用いて生成されたプールと比較した。ドナーのみプールと比較すると、RMCEプールの大多数の細胞がGFP発現からmAb発現へとシフトしていた。PCRプライマーを、その増幅イベントが、mAb発現カセットがD145ローカスに特異的かつ正しく挿入された場合にのみ生じるように設計した。増幅は、5プライムおよび3プライムのジャンクションの両方で成功した(図3)。
MP7部位は、アプローチ2で同定され、およびCLE416を用いて再標的化し、GFPランディングパッドを持つ細胞を含むプールを作成した。そして、このプールを、対応するLox部位を含むmAb発現プラスミドで標的化し、抗体の分泌を試験した。MP7をZFNおよび新規のランディングパッドで再標的化する試みが進行中である(図4)。
MP58部位は、アプローチ2で同定され、およびCLE416を用いて再標的化し、GFPランディングパッドを持つ細胞を含むプールを作成した。ZNFはこの部位に新規のランディングパッドを設置する事を目的として設計された(図5)。
Claims (29)
- 細胞のゲノムDNAに少なくとも1つの外因性配列を安定的に組み込むための方法であって、NCBIの参照配列、NW_003613934.1、NW_003614159.1、NW_003613732.1、またはそのホモログから選択されたゲノム配列内の部位に、該少なくとも1つの外因性配列を組み込む事を含む、方法。
- 該細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項1に記載の方法。
- 該少なくとも1つの外因性配列がタンパク質またはRNA分子をコードする、請求項1または2に記載の方法。
- 該タンパク質が治療用タンパク質、組み換えタンパク質、または工業用タンパク質である、請求項3に記載の方法。
- 該RNA分子が低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、ガイドRNA(gRNA)、またはその前駆体である、請求項3に記載の方法。
- 該少なくとも1つの外因性配列がプロモーター調節配列と作動可能に連結している、請求項3-5の何れか1項に記載の方法。
- 該外因性配列の発現が安定的であり、予測可能であり、および再現性がある、請求項3-6の何れか1項に記載の方法。
- 該少なくとも1つの外因性配列が、ポリヌクレオチド改変酵素の少なくとも1つの認識配列を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 該少なくとも1つの認識配列が、哺乳類細胞のゲノムに内因性に存在しない核酸配列を含む、請求項8に記載の方法。
- 該ポリヌクレオチド改変酵素が部位特異的リコンビナーゼまたは標的指向性エンドヌクレアーゼである、請求項8に記載の方法。
- 該部位特異的リコンビナーゼが、Bxb1インテグラーゼ、Creリコンビナーゼ、FLPリコンビナーゼ、ガンマデルタリゾルバーゼ、ラムダインテグラーゼ、ファイC31インテグラーゼ、R4インテグラーゼ、Tn3リゾルバーゼ、またはTP901-1リコンビナーゼである、請求項10に記載の方法。
- 該標的指向性エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、クラスター化規則的散在短パリンドローム反復(clustered regularly interspersed short palindromic repeats)(CRISPR)/CRISPR関連(Cas)(CRISPR/Cas)ヌクレアーゼシステム、CRISPR/Cas二重ニッカーゼシステム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、メガヌクレアーゼ、またはプログラム可能なDNA結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質である、請求項10に記載の方法。
- ゲノムDNAに組み込まれる外因性配列を含む細胞を調製するための方法であって、
a)細胞に(i)NCBI参照配列、NW_003613934.1、NW_003614159.1、NW_003613732.1、またはそのホモログから選択されたゲノム配列内の標的部位を標的とする、標的指向性エンドヌクレアーゼまたは標的指向性エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および(ii)該外因性配列を含むドナーポリヌクレオチド、を導入する事:および
b)該外因性配列がゲノム配列の標的部位に組み込まれるような条件下で該細胞を維持する事、
を含む、方法。 - 該細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項13に記載の方法。
- 該ドナーポリヌクレオチド内の該外因性配列が、ゲノム配列内の標的部位を挟む配列に対する実質的な配列同一性を有する配列によって挟まれている、請求項13または14に記載の方法。
- 該外因性配列が、相同配列指向性プロセスによってゲノムに組み込まれる、請求項15に記載の方法。
- 該ドナーポリヌクレオチド内の該外因性配列が、少なくとも1つの該標的指向性エンドヌクレアーゼによって認識される配列によって挟まれている、請求項13または14に記載の方法
- 該外因性配列が、直接的なライゲーションプロセスによってゲノムに組み込まれる、請求項17に記載の方法。
- 該標的指向性エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、クラスター化規則的散在短パリンドローム反復(CRISPR)/CRISPR関連(Cas)(CRISPR/Cas)ヌクレアーゼシステム、CRISPR/Cas二重ニッカーゼシステム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、メガヌクレアーゼ、またはプログラム可能なDNA結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質である、請求項13-18の何れか1項に記載の方法。
- 該外因性配列がタンパク質またはRNA分子をコードする、請求項13-19の何れか1項に記載の方法。
- 該タンパク質が、治療用タンパク質、組み換えタンパク質、または工業用タンパク質である、請求項20に記載の方法。
- 該RNA分子が、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、ガイドRNA(gRNA)、またはその前駆体である、請求項20に記載の方法。
- 該外因性配列が、プロモーター調節配列と作動可能に連結している、請求項20-22の何れか1項に記載の方法。
- 該外因性配列の発現が安定的であり、予測可能であり、および再現性がある、請求項20-23の何れか1項に記載の方法。
- 該外因性配列が、ポリヌクレオチド改変酵素の少なくとも1つの認識配列を含む、請求項13-19の何れか1項に記載の方法。
- 該少なくとも1つの認識配列が、哺乳類細胞のゲノムに内因性に存在しない核酸配列を含む、請求項25に記載の方法。
- 該ポリヌクレオチド改変酵素が、部位特異的リコンビナーゼまたは標的指向性エンドヌクレアーゼである、請求項27に記載の方法。
- 該部位特異的リコンビナーゼが、Bxb1インテグラーゼ、Creリコンビナーゼ、FLPリコンビナーゼ、ガンマデルタリゾルバーゼ、ラムダインテグラーゼ、ファイC31インテグラーゼ、R4インテグラーゼ、Tn3リゾルバーゼ、またはTP901-1リコンビナーゼである、請求項27に記載の方法。
- 該標的指向性エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、クラスター化規則的散在短パリンドローム反復(CRISPR)/CRISPR関連(Cas)(CRISPR/Cas)ヌクレアーゼシステム、CRISPR/Cas二重ニッカーゼシステム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、メガヌクレアーゼ、またはプログラム可能なDNA結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質である、請求項27に記載の方法。
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