JP6994560B2 - 標的化されたゲノム修飾を増強するためのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインの使用 - Google Patents
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Description
本開示の種々の局面には、融合タンパク質の提供があり、各融合タンパク質は、プログラム可能なDNA修飾タンパク質に連結される少なくとも1つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含む。
本開示は、CRISPRシステムを含むプログラム可能なDNA修飾タンパク質への染色体DNAのアクセシビリティを増加させるための組成物および方法を提供する。特に、本開示は、プログラム可能なDNA修飾タンパク質に連結される少なくとも1つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含む融合タンパク質を提供する。該ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ヌクレオソームおよび/またはクロマチン構造を変えるかまたは改造し、その結果該プログラム可能なDNA修飾タンパク質が標的化された染色体配列への増加したアクセスを有し、それにより標的化されたゲノム修飾、標的化された転写調節、または標的化されたエピジェネティックな修飾の効率が増加する。
本開示の1つの局面は、融合タンパク質を提供し、ここで各融合タンパク質は、プログラム可能なDNA修飾タンパク質に連結される少なくとも1つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含む。該プログラム可能なDNA修飾タンパク質は、ヌクレアーゼ活性(以下のセクション(I)(b)(i)を参照)または非ヌクレアーゼ活性(以下のセクション(I)(b)(ii)を参照)を有することができる。ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは以下のセクション(I)(a)で、該ドメイン間の連結は以下のセクション(I)(c)で記載される。
ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ヌクレオソーム再配列および/またはクロマチンリモデリングを促進するために、ヌクレオソームおよび/または染色体タンパク質と相互作用する染色体タンパク質またはその断片を指す。いくつかの実施形態において、該ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、高移動度群(HMG)ボックス(HMGB)タンパク質由来であることができる。他の実施形態において、該ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、HMGヌクレオソーム結合(HMGN)タンパク質またはその断片であることができる。さらなる実施形態において、該ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、リンカーヒストンH1バリアント由来であることができる。さらに他の実施形態において、該ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、クロマチンリモデリング複合体タンパク質由来であることができる。
いくつかの実施形態において、少なくとも1つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、HMGBタンパク質由来であることができる。HMGBタンパク質は、ヌクレオソームおよび他の染色体タンパク質と相互作用して、クロマチン構造および機能を調節する。適切なHMGBタンパク質は、哺乳動物HMGB1、哺乳動物HMGB2、および哺乳動物HMGB3を含む。例えば、該ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ヒトHNGB1(RefSeq遺伝子、U51677)、ヒトHMGB2(RefSeq遺伝子、M83665)、またはヒトHMGB3(RefSeq遺伝子、NM_005342)由来であることができる。他の実施形態において、該ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、他の脊椎動物、無脊椎動物(例えば、ショウジョウバエDSP1)、植物、酵母、または他の単一の細胞真核生物からのHMGBタンパク質またはHMGB様タンパク質由来であることができる。
他の実施形態において、少なくとも1つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、HMGNタンパク質またはその断片であることができる。HMGNタンパク質は、クロマチンの構造および機能を調節する染色体タンパク質である。適切な哺乳動物HMGNタンパク質は、HMGN1、HMGN2、HMGN3、HMGN3、HMGN4、およびHMGN5を含む。種々の実施形態において、該ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ヒトHMGN1(RefSeq遺伝子、M21339)、ヒトHMGN2(RefSeq遺伝子、X13546)、ヒトHMGN3aまたはヒトHMGN3b(RefSeq遺伝子、L40357)、ヒトHMGN4(RefSeq遺伝子、NM_030763)、ヒトHMGN5(RefSeq遺伝子、NM_016710)、その断片、またはその誘導体であることができる。他の実施形態において、ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、非ヒトHMGNタンパク質、その断片、またはその誘導体であることができる。HMGNタンパク質は比較的小さいタンパク質である。そのため、HMGNタンパク質全体が、プログラム可能なDNA修飾タンパク質に連結されることができる。しかしながら、いくつかの実施形態において、HMGNタンパク質の断片(例えば、中央に位置するヌクレオソーム結合ドメイン)は、プログラム可能なDNA修飾タンパク質に連結されることができる。
さらに他の実施形態において、少なくとも1つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、リンカーヒストンH1バリアント由来であることができる。例えば、ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ヒストンH1バリアントからの中央グロビュールドメインであることができる。ヒストンH1バリアントは、ヌクレオソーム間のリンカーDNAに結合し、該中央グロビュールドメイン(約80アミノ酸の)は、ヌクレオソームダイアドに近いヌクレオソームの入口および出口部位で該リンカーDNAに結合する。ヒストンH1バリアントは、組織、発生段階、およびそれらが発現される生物に対して明確な特異性を有する関連タンパク質の大きなファミリーを含む。例えば、ヒトおよびマウスは、11個のヒストンH1バリアントを含有し、ニワトリは6個のバリアント(ヒストンH5と呼ばれる)を有し、カエルは5個のバリアントを有し、線虫は8個のバリアントを有し、ミバエ種は1から3個のバリアントを有し、そしてタバコは6つのバリアントを有する。いくつかの実施形態において、該ヒストンH1バリアントは、以下に示すようなヒトバリアントであることができる。
さらなる実施形態において、少なくとも1つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、クロマチンリモデリング複合タンパク質由来であることができる。例えば、該ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、クロマチンリモデリング複合タンパク質からのDNA結合ドメインであることができる。クロマチンリモデリング複合体は、クロマチンの構造を改造する能力を有するマルチサブユニット酵素複合体である。これらのリモデリング複合体は、ATP加水分解のエネルギーを使用して、ヌクレオソームを移動、不安定化、排出、または再構築する。
プログラム可能なDNA修飾タンパク質は、染色体DNAにおける特異的配列に結合するように標的化されたタンパク質であり、標的化された配列でのまたはその近くのDNAまたは該DNAと関連するタンパク質を修飾する。ゆえに、プログラム可能なDNA修飾タンパク質は、プログラム可能なDNA結合ドメインおよび触媒的に活性な修飾ドメインを含む。
ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なDNA修飾タンパク質の例は、CRISPRヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびヌクレアーゼドメインに連結されるプログラム可能なDNA結合ドメインを含むが、これらに限定されない。
代替的な実施形態において、プログラム可能なDNA修飾タンパク質は、非ヌクレアーゼドメインに連結されるプログラム可能なDNA結合ドメインを含むキメラタンパク質であることができる。該プログラム可能なDNA結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター、触媒的に不活性な(死んだ)CRISPRタンパク質、または触媒的に不活性な(死んだ)メガヌクレアーゼであることができる。例えば、該触媒的に不活性なCRISPRタンパク質は、RuvCドメインが、D10A、D8A、E762A、および/またはD986A変異を含み、HNHドメインが、H840A、H559A、N854A、N865A、および/またはN863A変異を含む触媒的に不活性な(死んだ)Cas9(dCas9)であることができる。あるいは、該触媒的に不活性なCRISPRタンパク質は、ヌクレアーゼドメインにおける同等な変異を含む触媒的に不活性な(死んだ)Cpf1タンパク質であることができる。
本明細書において開示される融合タンパク質は、プログラム可能なDNA修飾タンパク質に連結される少なくとも1つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含む。少なくとも1つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインおよびプログラム可能なDNA修飾タンパク質との間の連結は、化学結合を介して直接的であることができ、または該連結は、リンカーを介して間接的であることができる。
本明細書において開示される融合タンパク質は、少なくとも1つの核局在化シグナル、細胞透過性ドメイン、および/またはマーカードメインをさらに含むことができる。
一般に、融合タンパク質の少なくとも1つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、HMGB1ボックスAドメイン、HMGN1タンパク質、HMGN2タンパク質、HMGN3aタンパク質、HMGN3bタンパク質、ヒストンH1中央グロビュールドメイン、模倣スイッチ(ISWI)タンパク質DNA結合ドメイン、クロモドメイン-ヘリカーゼ-DNAタンパク質1(CHD1)DNA結合ドメイン、またはそれらの組み合わせから選択される。
本開示の別の局面は、少なくとも1つのCRISPRシステム(すなわち、CRISPRタンパク質およびガイドRNA)および、少なくとも1つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含む複合体を包含する。いくつかの実施形態において、少なくとも1つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、CRISPRシステムのCRISPRタンパク質(すなわち、セクション(I)で上に記載されているCRISPR融合タンパク質を含む複合体)に連結されることができる。他の実施形態において、少なくとも1つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、CRISPRシステムのガイドRNAに連結することができる。該連結は、セクション(I)(c)で上に記載されているように、本質的に直接または間接であることができる。例えば、ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、RNAアプタマー結合タンパク質に連結されることができ、ガイドRNAは、アプタマー配列を含むことができ、その結果アプタマー結合タンパク質のRNAアプタマー配列への結合は、クレオソーム相互作用タンパク質ドメインを該ガイドRNAへ連結させる。
本開示のさらなる局面は、セクション(I)で上に記載される融合タンパク質およびセクション(II)で上に記載されるCRISPR複合体をコードする核酸を提供する。CRISPR複合体は、単一の核酸または複数の核酸によりコードされることができる。核酸は、DNAまたはRNA、線形または円形、単一鎖または二本鎖であることができる。RNAまたはDNAは、目的の真核細胞におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化できる。コドン最適化プログラムは、フリーウェアとして、または商業的なソースから入手できる。
本開示のさらなる局面は、セクション(I)で上に詳述される融合タンパク質の少なくとも1つ、セクション(II)で上に記載されるCRISPR複合体の少なくとも1つ、および/またはセクション(III)で上に記載される核酸の少なくとも1つを含むキットを提供する。キットは、核酸導入試薬、細胞増殖培地、選択培地、インビトロ転写試薬、核酸精製試薬、タンパク質精製試薬、バッファー等をさらに含むことができる。ここで提供されるキットは、一般に以下に詳述される方法を実行するための指示を含む。キットに含まれる指示は、梱包材に添付されていても、または添付文書として含まれていてもよい。指示は典型的に書かれたまたは印刷されたものだが、それらに限定されない。かかる指示を保存し、それらをエンドユーザーに伝えることができる任意の媒体が、該開示により意図される。かかる媒体は、電子記憶媒体(例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学媒体(例えばCD ROM)等を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される「指示」なる用語は、指示を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
本開示は、セクション(I)で上に詳述される融合タンパク質の少なくとも1つ、セクション(II)で上に記載されるCRISPR複合体の少なくとも1つ、および/またはセクション(III)で上に記載される核酸の少なくとも1つを含む細胞をも提供する。一般に、細胞は真核細胞である。例えば、細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、または単一細胞真核生物であることができる。
本開示の別の局面は、染色体DNAにおけるその標的配列へのプログラム可能なDNA修飾タンパク質のアクセシビリティを増加させることにより、真核細胞における標的化されたゲノム修飾、標的化された転写修飾、または標的化されたエピジェネティックな修飾の効率を増加させるための方法を包含する。いくつかの実施形態において、該方法は、セクション(I)で上に記載される融合タンパク質の少なくとも1つ、セクション(II)で上に記載されるCRISPR複合体の少なくとも1つ、またはセクション(III)で上に記載される融合タンパク質またはCRISPR複合体の少なくとも1つをコードする核酸、および所望によりドナーポリヌクレオチドを目的の真核細胞中に導入することを含む。
上記のように、該方法は、少なくとも1つの融合タンパク質、少なくとも1つのCRISPR複合体、または該融合タンパク質またはCRISPR複合体をコードする核酸(および、所望により、ドナーポリヌクレオチド)を細胞中に導入することを含む。様々な手段により、少なくとも1つの融合タンパク質、CRISPR複合体、または核酸は、目的の細胞中に導入されることができる。
融合タンパク質またはCRISPR複合体の1以上のヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、標的染色体配列でのまたはその近くのヌクレオソームおよび/または染色体DNAと相互作用し、その結果ヌクレオソームおよび/またはクロマチン構造は変えられ/改造され、それにより、融合タンパク質のプログラム可能なDNA修飾タンパク質またはCRISPR複合体のCRISPRタンパク質の標的染色体配列へのアクセシビリティが増加する。標的染色体配列への増加したアクセスは、標的化されたゲノム、転写、またはエピジェネティックな修飾の増加した頻度/効率をもたらす。
融合タンパク質が、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なDNA修飾タンパク質を含む実施形態において、該方法は、少なくとも1つのドナーポリヌクレオチドを細胞中に導入することをさらに含むことができる。ドナーポリヌクレオチドは、単一鎖または二本鎖、線形または円形、および/またはRNAまたはDNAであることができる。いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドはベクター、例えばプラスミドベクターであることができる。
様々な細胞は、本明細書において開示される方法における使用に適している。一般に、細胞は真核細胞である。例えば、細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、または単一細胞真核生物であることができる。いくつかの実施形態において、細胞は単細胞胚であることもできる。例えば、非ヒト哺乳動物胚は、ラット、ハムスター、げっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、および霊長類の胚を含む。さらに他の実施形態において、細胞は、胚性幹細胞、ES様幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞等の幹細胞であることができる。ある実施形態において、幹細胞はヒト胚性幹細胞ではない。さらに、幹細胞は、その全体が本明細書に組み込まれているWO2003/046141またはChung et al.(Cell Stem Cell, 2008, 2:113-117)に開示された技術により作製されたものを含んでもよい。細胞は、インビトロまたはインビボ(すなわち生物内)であることができる。例示的な実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞または哺乳動物細胞系である。特定の実施形態において、細胞は、ヒト細胞またはヒト細胞系である。
融合タンパク質が非DNA活性を有するプログラム可能なDNA修飾を含むか、またはCRISPR複合体が非ヌクレアーゼ活性を有する触媒的に不活性なCRISPRタンパク質を含む実施形態において、該融合タンパク質またはCRISPR複合体は、真核細胞における特異的ゲノム遺伝子座を検出または視覚化する方法において使用されることができる。かかる実施形態において、融合タンパク質またはCRISPRタンパク質は、フルオロフォア(例えば、FAM、TMR、Cy3、Cy5、Texas Red、Oregon Green、Alexa Fluor、Haloタグ、または適切な蛍光色素)、検出タグ(例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン等)、量子ドット、または金粒子等の少なくとも1つの検出可能な標識をさらに含む。あるいは、CRISPR複合体のガイドRNAは、in situ検出用の検出可能な標識(例えば、FISHまたはCISH)をさらに含むことができる。融合タンパク質またはCRISPR複合体の少なくとも1つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、非ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なDNA修飾タンパク質またはCRISPRタンパク質の標的染色体配列へのアクセスを増加させ、それにより特異的ゲノム遺伝子座または標的化された染色体配列の検出が増強される。
本明細書において開示される組成物および方法は、様々な治療、診断、産業、および研究適用において使用されることができる。いくつかの実施形態において、本開示は、細胞、動物、または植物における目的の任意の染色体配列を修飾し、遺伝子の機能をモデル化および/または研究し、遺伝的またはエピジェネティックな目的の条件を研究し、または種々の疾患または障害に関与する生化学経路を研究するために、使用されることができる。例えば、疾患または障害をモデル化するトランスジェニック生物が作成されることができる。ここで、疾患または障害に関連する1以上の核酸配列の発現が変えられる。疾患モデルは、生物への変異の効果を研究し、疾患の発生および/または進行を研究し、疾患に対する薬学的活性化合物の効果を研究し、および/または潜在的な遺伝子治療戦略の効果を評価するために使用されることができる。
以下に列挙される実施形態は、本発明の特定の局面を実証するために示され、その範囲を限定することは意図されない。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、該発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、当業者に、本発明で使用される用語の多くの一般的定義を提供する:Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 第5版, R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991);およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用される場合、以下の用語は、他に特定されない限り、それらに帰せられる意味を有する。
ヒトHMGB1ボックスAドメイン(配列番号:40)を、Cas9およびHMGB1ボックスAドメインとの間のリンカーLEGGGS(配列番号:1)を用いて、ヌクレアーゼカルボキシル末端でSpCas9(+NLS)と融合させた。ヒトK562細胞(1x106)を、融合タンパク質または野生型SpCas9タンパク質をコードするモル当量のプラスミドDNA(融合タンパク質および野生型Cas9タンパク質それぞれについて、5.2および5.0μg)をヒトシトクロムp450酸化還元酵素(POR)遺伝子座におけるゲノム部位(#1)を標的とするための3μgのsgRNAプラスミドと組み合わせて用いて、核酸導入した。核酸導入を、Amaxi nucleofectorでヌクレオフェクションを使用して実行した。核酸導入の3日後、細胞をDNA抽出溶液(QuickExtractTM)を用いて溶解させ、標的化されたゲノム領域をPCR増幅した。Cas9ヌクレアーゼ標的開裂活性(%インデル)を、Cel-Iアッセイを使用して測定した。表3に示すように、ヒトHMGB1ボックスAドメインと抗原との融合は、標的部位でのSpCas9開裂効率を増加させた。
ヒトHMGN1、HMGN2、HMGN3a、およびHMGN3b(それぞれ配列番号:41-44)を、Cas9および該HMGNペプチドのそれぞれとの間のリンカーLEGGGS(配列番号:1)を用いて、それぞれ、ヌクレアーゼカルボキシル末端でSpCas9(+NLS)と融合させた。ヒトK562細胞(1x106)を、ヒトシトクロムp450酸化還元酵素(POR)遺伝子座におけるゲノム部位(#1)を標的とするためのsgRNAプラスミド3μgと組み合わせて、融合タンパク質のそれぞれまたは野生型SpCas9タンパク質をコードするモル当量のプラスミドDNA(融合タンパク質および野生型Cas9タンパク質について、それぞれ5.2および5.0μg)を用いて核酸導入した。核酸導入を、Amaxi nucleofectorでヌクレオフェクションを使用して実行した。核酸導入の3日後、細胞をDNA抽出溶液(QuickExtractTM)を用いて溶解させ、標的化されたゲノム領域をPCR増幅した。Cas9標的開裂活性(%インデル)を、Cel-Iアッセイを使用して測定した。結果は、表4に要約されるように、ヒトHMGNペプチドのそれぞれのヌクレアーゼとの融合が、標的部位でのSpCas9開裂効率を増加させたことを示す。
ヒトヒストンH1中央グロビュールドメイン(配列番号:45)を、Cas9およびグロビュールドメインとの間のリンカーLEGGGS(配列番号:1)を用いて、ヌクレアーゼカルボキシル末端でSpCas9(+NLS)と融合させた。ヒトK562細胞(1x106)を、ヒトシトクロムp450酸化還元酵素(POR)遺伝子座におけるゲノム部位(#1)を標的とするためのsgRNAプラスミド3μgと組み合わせて、融合タンパク質または野生型SpCas9タンパク質をコードするモル当量のプラスミドDNA(融合タンパク質および野生型Cas9タンパク質について、それぞれ5.2および5.0μg)を用いて核酸導入した。核酸導入を、Amaxinucleofectorでヌクレオフェクションを使用して実行した。核酸導入の3日後、細胞をDNA抽出溶液(QuickExtractTM)を用いて溶解させ、標的化されたゲノム領域をPCR増幅した。Cas9標的開裂活性(%インデル)を、Cel-Iアッセイを使用して測定した。結果を表5に示す。ヒトヒストンH1中央グロビュールドメインのヌクレアーゼとの融合は、標的部位でのSpCas9開裂効率を増加させた。
SpCas9(+NLS)を、Cas9およびDNA結合ドメインとの間のリンカーTGSG(配列番号:2)を用いて、酵母ISWIクロマチンリモデリング複合体ATPアーゼISW1(配列番号:46)のDNA結合ドメインとヌクレアーゼアミノ末端で融合した。独立して、野生型SpCas9を、ヒトシトクロムp450酸化還元酵素(POR)遺伝子座におけるゲノム部位(#1)を標的とするためのsgRNAプラスミド3μgと組み合わせて、Cas9およびDNA結合ドメインとの間のリンカーLEGGGS(配列番号:1)を用いて、酵母クロモドメイン含有タンパク質1(CHD1)(配列番号:47)のDNA結合ドメインとヌクレアーゼカルボキシル末端で融合した。ヒトK562細胞(1x106)を、融合タンパク質のそれぞれまたは野生型SpCas9タンパク質をコードするモル当量のプラスミドDNA(融合タンパク質および野生型Cas9タンパク質について、それぞれ6.0および5.0μg)を用いて核酸導入した。核酸導入を、Amaxi nucleofectorでヌクレオフェクションを使用して実行した。核酸導入の3日後、細胞をDNA抽出溶液(QuickExtractTM)を用いて溶解させ、標的化されたゲノム領域をPCR増幅した。Cas9標的開裂活性(%インデル)を、Cel-Iアッセイを使用して測定した。結果は、表6に要約されるように、DNA結合ドメインのそれぞれのヌクレアーゼとの融合が、標的部位でのSpCas9開裂効率を増加させたことを示す。
SpCas9(+NLS)を、ヒトシトクロムp450酸化還元酵素(POR)遺伝子座におけるゲノム部位(#1、#2、#3)、またはヒト核受容体サブファミリー1グループIメンバー3(CAR)遺伝子座におけるゲノム部位(#1)、またはヒト空白気門ホメオボックス1(EMX1)遺伝子座におけるゲノム部位(#1、#2)を標的とするためのsgRNAプラスミド3μgと組み合わせて、Cas9およびHMGN1との間のリンカーTGSG(配列番号:2)を用いて、ヒトHMGB1(配列番号41)とヌクレアーゼアミノ末端で、およびCas9およびタンパク質ドメインのぞれぞれの間のリンカーLEGGGS(配列番号:1)を用いて、ヒトHMGB1ボックスAドメイン(配列番号:40)またはヒトヒストンH1中央グロビュールドメイン(配列番号:45)または酵母クロモドメイン含有タンパク質1(CHD1)DNA結合ドメイン(配列番号:47)とヌクレアーゼカルボキシル末端で融合させた。ヒトK562細胞(1x106)を、融合タンパク質のそれぞれまたは野生型SpCas9タンパク質をコードするモル等量のプラスミドDNA(HMGB1ボックスAおよびH1中央グロビュールドメイン融合タンパク質について5.4μg、CHD1DNA結合ドメイン融合タンパク質について6.0μg、および野生型Cas9タンパク質について5.0μg)を用いて核酸導入した。核酸導入を、Amaxi nucleofectorでヌクレオフェクションを使用して実行した。核酸導入の5日後、細胞をDNA抽出溶液(QuickExtractTM)を用いて溶解させ、各標的化されたゲノム領域をPCR増幅した。Cas9標的開裂活性(%インデル)を、Cel-Iアッセイを使用して測定した。結果は、表7に要約されるように、これらのタンパク質ドメインのヌクレアーゼとの組み合わせ融合が、標的部位でのSpCas9開裂効率を増加させたことを示す。
Streptococcus pasteurianus Cas9(SpaCas9)(+NLS)を、ヒトシトクロムp450酸化還元酵素(POR)遺伝子座におけるゲノム部位(#1、#2)を標的とするためのsgRNAプラスミド3μgと組み合わせて、Cas9およびHMGN1との間のリンカーTGSG(配列番号:2)を用いて、ヒトHMGN1(配列番号:41)とヌクレアーゼアミノ末端で、およびCas9およびタンパク質ドメインのそれぞれの間のリンカーLEGGGS(配列番号:1)を用いて、ヒトHMGB1ボックスAドメイン(配列番号:41)またはヒトヒストンH1中央グロビュールドメイン(配列番号:45)または酵母クロモドメイン含有タンパク質1(CHD1)DNA結合ドメイン(配列番号:47)とヌクレアーゼカルボキシル末端で融合させた。ヒトK562細胞(1x106)を、融合タンパク質のそれぞれまたは野生型SpaCas9タンパク質をコードするモル当量のプラスミドDNA(融合タンパク質および野生型Cas9タンパク質について、それぞれ5.4および5.0μg)を用いて核酸導入した。核酸導入を、Amaxi nucleofectorでヌクレオフェクションを使用して実行した。核酸導入の3日後、細胞をDNA抽出溶液(QuickExtractTM)を用いて溶解させ、標的化されたゲノム領域をPCR増幅した。Cas9標的開裂活性(%インデル)を、Cel-Iアッセイを使用して測定した。表8に要約されるように、これらのタンパク質ドメインのヌクレアーゼとの組み合わせ融合は、標的部位でのSpaCas9開裂効率を増加させた。
Francisella novicida Cpf1(FnCpf1)(+NLS)を、Cpf1およびHMGN1との間のリンカーTGSG(配列番号:2)を用いて、ヒトアミノHMGN1(配列番号:41)とヌクレアーゼアミノ末端で、およびCpf1およびタンパク質ドメインのそれぞれとの間のリンカーLEGGGS(配列番号:1)を用いて、ヒトHMGB1ボックスAドメイン(配列番号:40)またはヒトヒストンH1中央グロビュールドメイン(配列番号:45)または酵母クロモドメイン含有タンパク質1(CHD1)DNA結合ドメイン(配列番号:47)とヌクレアーゼカルボキシル末端で融合させた。ヒトK562細胞(1x106)を、ヒトシトクロムp450酸化還元酵素(POR)遺伝子座におけるゲノム部位(#1、#2、#3)を標的とするためのsgRNAプラスミド3μgとの組み合わせにおいて、融合タンパク質のそれぞれまたは野生型FnCpf1タンパク質をコードするモル当量のプラスミドDNA(融合タンパク質および野生型Cas9タンパク質のそれぞれで5.4および5.0μg)を用いて核酸導入した。核酸導入を、Amaxi nucleofectorでヌクレオフェクションを使用して実行した。核酸導入の3日後、細胞をDNA抽出溶液(QuickExtractTM)を用いて溶解させ、標的化されたゲノム領域をPCR増幅した。Cas9標的開裂活性(%インデル)を、Cel-Iアッセイを使用して測定した。結果は、表9に要約されるように、これらのタンパク質ドメインのヌクレアーゼとの組み合わせ融合が、標的部位でのFnCpf1開裂効率を増加させたことを示す。
Campylobacter jejuni Cas9(CjCas9)(+NLS)を、Cas9およびHMGN1との間のリンカーTGSG(配列番号:2)を用いて、ヒトアミノHNG1(配列番号:41)とヌクレアーゼアミノ末端で、およびCas9およびタンパク質ドメインのそれぞれとの間のリンカーLEGGGS(配列番号:1)を用いて、ヒトHMGB1ボックスAドメイン(配列番号:40)またはヒトヒストンH1中央グロビュールドメイン(配列番号:45)とヌクレアーゼカルボキシル末端で融合させた。野生型CjCas9 gRNAを、crRNA定常反復領域中にUからCへの変異を導入し、tracrRNA配列の5’領域中に対応するAからGへの変異を導入することにより修飾した。修飾されたsgRNA配列は次のとおりである。
ヒトシトクロムp450酸化還元酵素遺伝子(POR)における2つの異なる部位(#1、#2)を標的とするガイド配列を、それぞれ野生型および修飾されたCjCas9 sgRNA骨格にクローン化した。sgRNAの発現を、U6プロモーターの制御下にした。ヒトK562細胞(1x106)を、CjCas9プラスミドDNA4μgおよびsgRNAプラスミドDNA3μgを用いて核酸導入した。核酸導入を、Amaxi nucleofectorでヌクレオフェクションを使用して実行した。核酸導入の3日後、細胞をQuickExtractを用いて溶解させ、標的化されたゲノム領域をPCR増幅した。CjCas9標的DNA開裂活性(%インデル)を、Cel-Iアッセイを使用して測定した。結果は図1に示され、融合タンパク質が標的部位での開裂効率を増加させたこと、および修飾されたCjCas9 sgRNA骨格が標的部位でのCjCas9開裂効率を効果的に増加させたことを示す。
Claims (21)
- 少なくとも1つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインに連結されるクラスター化規則的散在短パリンドローム反復(CRISPR)タンパク質を含む融合タンパク質であって、ここで該CRISPRタンパク質が、II型CRISPR/Cas9ヌクレアーゼまたはニッカーゼである、または該CRISPRタンパク質が、V型CRISPR/Cpf1ヌクレアーゼまたはニッカーゼであり、そして、該少なくとも1つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、高移動度群(HMG)ボックス(HMGB)DNA結合ドメイン、HMGヌクレオソーム結合(HMGN)タンパク質、ヒストンH1バリアントからの中央グロビュールドメイン、クロマチンリモデリング複合体タンパク質からのDNA結合ドメイン、またはそれらの組み合わせである、融合タンパク質。
- 該CRISPRタンパク質が、全てのヌクレアーゼ活性を欠くように修飾され、かつ非ヌクレアーゼドメインに連結されるII型CRISPR/Cas9タンパク質、または全てのヌクレアーゼ活性を欠くように修飾され、かつ非ヌクレアーゼドメインに連結されるV型CRISPR/Cpf1タンパク質である、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 該非ヌクレアーゼドメインが、シトシンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有する、請求項2に記載の融合タンパク質。
- 少なくとも1つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、HMGB1ボックスAドメイン、HMGN1タンパク質、HMGN2タンパク質、HMGN3aタンパク質、HMGN3bタンパク質、ヒストンH1中央グロビュールドメイン、模倣スイッチ(ISWI)タンパク質DNA結合ドメイン、クロモドメイン-ヘリカーゼ-DNAタンパク質1(CHD1)DNA結合ドメイン、またはそれらの組み合わせである、請求項1-3のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- ヒストンH1中央グロビュールドメインが配列番号45を含む、請求項4に記載の融合タンパク質。
- 融合タンパク質が1つのみのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含む、または融合タンパク質が2つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含む、請求項1-5のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 該少なくとも1つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、化学結合を介して直接的に、リンカーを介して間接的に、またはそれらの組み合わせにより該CRISPRタンパク質に連結される、請求項1-6のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 該少なくとも1つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインが、そのN末端、C末端、内部位置またはそれらの組み合わせで該CRISPRタンパク質に連結される、請求項1-7のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 少なくとも1つの核局在化シグナル、少なくとも1つの細胞透過性ドメイン、少なくとも1つのマーカードメイン、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項1-8のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 核局在化シグナルをさらに含む、請求項1-8のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 該CRISPRタンパク質が、Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)、Streptococcus thermophilus Cas9 (StCas9)、Streptococcus pasteurianus (SpaCas9)、Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9)、 Staphylococcus aureus (SaCas9)、Francisella novicida Cas9 (FnCas9)、Neisseria cinerea Cas9 (NcCas9)、Neisseria meningitis Cas9 (NmCas9)、Francisella novicida Cpf1 (FnCpf1)、Acidaminococcus sp. Cpf1 (AsCpf1)、またはLachnospiraceae 細菌ND2006 Cpf1 (LbCpf1)である、請求項1-10のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 該CRISPRタンパク質が、Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)、Streptococcus thermophilus Cas9 (StCas9)、Streptococcus pasteurianus (SpaCas9)、Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9)、Francisella novicida Cas9 (FnCas9)、またはNeisseria cinerea Cas9 (NcCas9)である、請求項1-10のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 該融合タンパク質が、配列番号:61、配列番号:62、配列番号:63、配列番号:64、配列番号:65、配列番号:66、配列番号:67、配列番号:68、配列番号:69、配列番号:70、配列番号:71、配列番号:72、配列番号:73、配列番号:74、配列番号:75、配列番号:76、配列番号:77、配列番号:78、または配列番号:79と少なくとも90%配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1-12のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 該融合タンパク質が、配列番号:61、配列番号:62、配列番号:63、配列番号:64、配列番号:65、配列番号:66、配列番号:67、配列番号:68、配列番号:69、配列番号:70、配列番号:71、配列番号:72、配列番号:73、配列番号:74、配列番号:75、配列番号:76、配列番号:77、配列番号:78、または配列番号:79に記載のアミノ酸配列を有する、請求項1-13のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 請求項1-14のいずれか一項に記載の少なくとも1つの融合タンパク質および少なくとも1つのガイドRNAを含む、複合体。
- 請求項1-14のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
- 真核細胞における翻訳のためにコドン最適化される、請求項16に記載の核酸。
- ウイルスベクター、プラスミドベクター、または自己複製RNAの一部である、請求項16または17に記載の核酸。
- 真核細胞における標的化されたゲノムまたはエピジェネティックな修飾の効率を増加させるためのインビトロ方法であって、該真核細胞中へ、請求項1-14のいずれか一項に記載の少なくとも1つの融合タンパク質、または請求項16-18のいずれか一項に記載の少なくとも1つの融合タンパク質をコードする核酸を導入することを含み、ここで、該少なくとも1つの融合タンパク質の該CRISPRタンパク質は、標的染色体配列に標的化され、かつ該少なくとも1つの融合タンパク質の該少なくとも1つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ヌクレオソームまたはクロマチン構造を変え、その結果該少なくとも1つの融合タンパク質は該標的染色体配列への増加したアクセスを有し、それにより標的化されたゲノムまたはエピジェネティックな修飾の効率が増加する、インビトロ方法。
- 請求項19に記載の方法であって、ここで、該方法は、真核細胞中へ少なくとも1つのガイドRNAまたは該少なくとも1つのガイドRNAをコードする核酸を導入することをさらに含む、方法。
- 請求項19または20に記載の方法であって、ここで、該方法は、少なくとも1つのドナー配列を含む少なくとも1つのドナーポリヌクレオチドを該真核細胞中へ導入することをさらに含む、方法。
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