KR20200021529A - 표적된 게놈 변형을 개선하기 위한 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인 사용 - Google Patents

표적된 게놈 변형을 개선하기 위한 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인 사용 Download PDF

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Abstract

염색체 서열들을 표적하기 위해 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인을 사용하여 프로그램가능한 DNA 변형 단백질들의 접근성을 증가시킴으로써, 진핵 세포들에서 표적된 게놈/후성 변형의 효율성을 증가시키는 조성물 및 방법.

Description

표적된 게놈 변형을 개선하기 위한 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인 사용
분야
본 발명은 표적된 게놈 변형, 표적된 전사 조절, 또는 표적된 후성 변형의 효율성을 증가시키기 위한 조성물 및 방법들에 관한 것이다.
배경
프로그래밍 가능한 엔도뉴클레아제는 진핵생물에서 표적된 게놈 조작 또는 변형에 있어 점점 중요한 툴이 되어왔다. 최근, RNA-유도된 클러스터링된 규칙적으로 산재된 짧은 회문식 반복부 (RNA-guided clustered regularly interspersed short palindromic repeats) (CRISPR) 시스템이 새로운 세대의 게놈 변형 툴로서 등장하였다. 이러한 새로운 프로그램 가능한 엔도뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFNs) 및 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALENs)와 같은 이전 세대의 뉴클레아제들과 비교하여 전례없는 단순성 및 다양성을 제공하였다. 그러나, 진핵 세포에서 염색질 장벽은 원핵생물-유래 CRISPR 시스템에 의한 표적 접근 및 절단을 방해할 수 있다 (Hinz 외, Biochemistry, 2015, 54:7063-66; Horlbeck 외., eLife, 2016, 5:e12677).
실제로, 현재까지 가장 활동적인 CRISPR 뉴클레아제로 간주되는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 (SpCas9)를 사용할 때 특정 포유 동물 게놈 부위에서 편집 활성이 없거나 낮다. 더욱이, 지금까지 특성화된 많은 CRISPR 뉴클레아제는 비록 박테리아 또는 정제된 DNA 기질에서 활성이더라도 포유동물 세포에서 활성을 나타내지 않는다. 따라서, 진핵생물에서 염색질 방해를 극복하여 표적되는 게놈 또는 후성 변형의 효율성을 증가시키기 위해 CRISPR 뉴클레아제 시스템 및 다른 프로그램 가능한 DNA 변형 단백질의 능력을 개선할 필요가 있다.
요약
본 발명의 다양한 양상들 중에는 융합 단백질의 제공이 있으며, 각 융합 단백질은 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 연결되는 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인을 포함한다.
최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 HMGB1, HMGB2, 또는 HMGB3에서 선택된 고 이동성 그룹 (HMG) 박스 (HMGB) 단백질; HMGN1, HMGN2, HMGN3a, HMGN3b, HMGN4, 또는 HMGN5에서 선택된 HMG 뉴클레오솜-결합 (HMGN) 단백질로부터의 DNA 결합 도메인; 히스톤 H1 변이체로부터의 중심 구형 도메인; 스위치/수크로스 비-발효성 (SWI/SNF) 복합체, 모방 스위치 (ISWI) 복합체, 크로모도메인-헬리케이스-DNA 결합 (CHD) 복합체, 뉴클레오솜 재형성 및 탈아세틸화효소 (NuRD) 복합체, INO80 복합체, SWR1 복합체, RSC 복합체, 또는 이의 조합에서 선택된 염색질 재형성 복합체 단백질로부터의 DNA 결합 도메인이 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 HMGB1 박스 A 도메인, HMGN1 단백질, HMGN2 단백질, HMGN3a 단백질, HMGN3b 단백질, 히스톤 H1 중심 구형 도메인, ISWI 단백질 DNA 결합 도메인, CHD1 단백질 DNA 결합 도메인, 또는 이의 조합일 수 있다.
일부 구체예들에서, 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 뉴클레아제 활성을 가지며, 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 클러스터된 규칙적으로 산재된 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 뉴클레아제 또는 니카아제, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 메가뉴클레아제, 또는 뉴클레아제 도메인에 연결된 프로그램가능한 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질일 수 있다.
다른 구체예들에서, 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 비-뉴클레아제 활성을 가지며, 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 비-뉴클레아제 도메인에 연결된 프로그램가능한 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질일 수 있다. 키메라 단백질의 프로그램가능한 DNA 결합 도메인은 모든 뉴클레아제 활성이 없도록 변형된 CRISPR 단백질, 징크 핑거 단백질, 또는 전사 활성화제-유사 이펙터 일 수 있으며, 그리고 키메라 단백질의 비-뉴클레아제 도메인은 아세틸전이효소 활성, 탈아세틸화효소 활성, 메틸전이효소 활성, 탈메틸화효소 활성, 키나아제 활성, 인산분해효소 활성, 유비퀴틴 연결효소 활성, 탈유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, 수모화 (SUMOylating) 활성, 탈수모화 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성, 탈미리스토일화 활성, 시트룰린화 활성, 헬리케이스 활성, 아미노화 활성, 탈아미노화 활성, 알킬화 활성, 탈알킬화 활성, 산화 활성, 전사 활성화 활성, 또는 전사 억제인자 활성을 가질 수 있다. 특정 구체예들에서, 키메라 단백질의 비-뉴클레아제 도메인은 시토신 탈아미노효소 활성, 히스톤 아세틸전이효소 활성, 전사 활성화 활성, 또는 전사 억제인자 활성을 가질 수 있다.
최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 화학적 결합에 의해 직접적으로, 링커에 의해 간접적으로, 또는 이의 조합에 의해 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 연결될 수 있다. 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 프로그램가능한 DNA 변형 단백질의 N-말단, C-말단, 및/또는 내부 위치에 연결될 수 있다. 일부 구체예들에서, 융합 단백질은 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 연결된 최소한 2개의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인을 포함한다.
본 명세서에 개시된 융합 단백질은 최소한 하나의 핵 위치화 신호, 최소한 하나의 세포-침투 도메인, 최소한 하나의 마커 도메인, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인에 연결된 CRISPR 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
일반적으로, 상기 융합 단백질의 CRISPR 단백질은 유형 II CRISPR/Cas9 단백질 또는 유형 V CRISPR/Cpf1 단백질일 수 있다. 특정 구체예들에서, CRISPR 단백질은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (Streptococcus pyogenes Cas9, SpCas9), 스트렙토코쿠스 써모필루스 Cas9 (Streptococcus thermophilus Cas9, StCas9), 스트렙토코쿠스 파스테우리아누스 (Streptococcus pasteurianus, SpaCas9), 캄필로박터 제주니 Cas9 (Campylobacter jejuni Cas9, CjCas9), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus, SaCas9), 프란시셀라 노비시다 Cas9 (Francisella novicida Cas9, FnCas9), 나이세리아 시네레아 Cas9 (Neisseria cinerea Cas9, NcCas9), 나이세리아 메닌지티스 Cas9 (Neisseria meningitis Cas9, NmCas9), 프란시셀라 노비시다 Cpf1 (Francisella novicida Cpf1, FnCpf1), 아시다미노코쿠스 속 Cpf1 (Acidaminococcus sp. Cpf1, AsCpf1), 또는 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006 Cpf1 (Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cpf1, LbCpf1) 일 수 있다.
일부 구체예들에서, CRISPR 단백질은 뉴클레아제 또는 니카아제 활성을 가진다. 예를 들면, CRISPR 단백질은 유형 II CRISPR/Cas9 뉴클레아제 또는 니카아제, 또는 유형 V CRISPR/Cpf1 뉴클레아제 또는 니카아제 일 수 있다. 다른 구체예들에서, CRISPR 단백질은 비-뉴클레아제 활성을 가진다. 이러한 반복에서, CRISPR 단백질은 모든 뉴클레아제 활성이 없도록 변형되고 비-뉴클레아제 도메인에 연결된 유형 II CRISPR/Cas9 단백질, 또는 모든 뉴클레아제 활성이 없도록 변형되고 비-뉴클레아제 도메인에 연결된 유형 V CRISPR/Cpf1 단백질 일 수 있으며, 이 때 상기 비-뉴클레아제 도메인은 시토신 탈아미노효소 활성, 히스톤 아세틸전이효소 활성, 전사 활성화 활성, 또는 전사 억제인자 활성을 가질 수 있다.
CRISPR 융합 단백질의 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 고 이동성 그룹 (HMG) 박스 (HMGB) DNA 결합 도메인, HMG 뉴클레오솜-결합 (HMGN) 단백질, 히스톤 H1 변이체로부터의 중심 구형 도메인, 염색질 재형성 복합체 단백질로부터의 DNA 결합 도메인, 또는 이의 조합일 수 있다. 특정 구체예들에서, CRISPR 융합 단백질의 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 HMGB1 박스 A 도메인, HMGN1 단백질, HMGN2 단백질, HMGN3a 단백질, HMGN3b 단백질, 히스톤 H1 중심 구형 도메인, 모방 스위치 (ISWI) 단백질 DNA 결합 도메인, 크로모도메인-헬리케이스-DNA 단백질 1 (CHD1) DNA 결합 도메인, 또는 이의 조합일 수 있다.
최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 화학적 결합에 의해 직접적으로, 링커에 의해 간접적으로, 또는 이의 조합에 의해 CRISPR 단백질에 연결될 수 있다. 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 CRISPR 단백질의 N-말단, C-말단, 및/또는 내부 위치에 연결될 수 있다. 일부 구체예들에서, 융합 단백질은 CRISPR 단백질에 연결된 최소한 2개의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인을 포함한다.
본 명세서에 개시된 CRISPR 융합 단백질은 최소한 하나의 핵 위치화 신호, 최소한 하나의 세포-침투 도메인, 최소한 하나의 마커 도메인, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
특정 구체예들에서, CRISPR 융합 단백질은 서열 번호:61, 서열 번호:62, 서열 번호:63, 서열 번호:64, 서열 번호:65, 서열 번호:66, 서열 번호:67, 서열 번호:68, 서열 번호:69, 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:72, 서열 번호:73, 서열 번호:74, 서열 번호:75, 서열 번호:76, 서열 번호:77, 서열 번호:78, 또는 서열 번호:79와 최소한 약 90% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
다른 구체예들에서, CRISPR 융합 단백질은 서열 번호:61, 서열 번호:62, 서열 번호:63, 서열 번호:64, 서열 번호:65, 서열 번호:66, 서열 번호:67, 서열 번호:68, 서열 번호:69, 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:72, 서열 번호:73, 서열 번호:74, 서열 번호:75, 서열 번호:76, 서열 번호:77, 서열 번호:78, 또는 서열 번호:79에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 명세서에 개시된 CRISPR-함유 융합 단백질들 중 최소한 하나 및 최소한 하나의 가이드 RNA를 포함하는 단백질-RNA 복합체를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 명세서에 개시된 임의의 융합 단백질을 인코드하는 핵산을 제공한다. 핵산은 진핵 세포에서 번역을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 일부 구체예들에서, 핵산은 벡터, 가령, 예를 들어, 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 또는 자가-복제 RNA의 일부일 수 있다.
또한 본 발명의 또 다른 양상은 진핵 세포에서 표적된 게놈 또는 후성 변형의 효율성을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 진핵 세포에 (a) 본 명세서에 개시된 최소한 하나의 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질(들)을 인코드하는 핵산을 도입하는 것을 포함하고, 이 때 최소한 하나의 융합 단백질의 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 최소한 하나의 융합 단백질의 표적 염색체 서열에 대한 접근이 증가되도록 뉴클레오솜 또는 염색질 구조를 변형시킴으로써, 표적된 게놈 또는 후성 변형의 효율성을 증가시킨다.
일부 반복에서, 상기 방법은 진핵 세포에 다음을 도입하는 것을 포함하며: (a) 본 명세서에 개시된 최소한 하나의 CRISPR 융합 단백질 또는 상기 CRISPR 융합 단백질(들)을 인코드하는 핵산, 이 때 CRISPR 단백질은 (i) 뉴클레아제 또는 니카아제 활성을 가지거나 (ii) 모든 뉴클레아제 활성이 없도록 변형되어 비-뉴클레아제 도메인에 연결되고; 및 (b) 최소한 하나의 가이드 RNA 또는 최소한 하나의 가이드 RNA를 인코드하는 핵산; 이 때 최소한 하나의 CRISPR 융합 단백질의 CRISPR 단백질은 표적 염색체 서열에 대해 표적되고 최소한 하나의 CRISPR 융합 단백질의 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 최소한 하나의 CRISPR 융합 단백질의 표적 염색체 서열에 대한 접근이 증가되도록 뉴클레오솜 또는 염색질 구조를 변화시킴으로써, 표적된 게놈 또는 후성 변형의 효율성을 증가시킨다.
특정 구체예들에서, 상기 방법은 진핵 세포에 최소한 하나의 공여체 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 공여체 폴리뉴클레오티드는 최소한 하나의 공여체 서열을 포함한다.
본 명세서에 개시된 방법들에서 사용되는 진핵 세포들은 포유동물 세포일 수 있다. 일부 구체예들에서, 세포들은 인간 세포일 수 있다. 세포들은 시험관내 또는 생체내에 존재할 수 있다.
본 발명의 다른 양상들 및 특징들은 이하에서 상세히 설명한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 야생형 sgRNA 스캐폴드 또는 변형된 sgRNA 스캐폴드의 존재하에서 야생형 CjCas9 (CjeCas9)의 절단 효율성 (삽입-결실의 퍼센트), HMGN1 및 HMGB1 박스 A에 연결된 CjCas9를 포함하는 융합 단백질 (CjeCas9-HN1HB1), 및 HMGN1 및 히스톤 H1 중심 구형 도메인에 연결된 CjCas9를 포함하는 융합 단백질 (CjeCas9-HN1H1G)을 나타낸다.
상세한 설명
본 발명은 CRISPR 시스템을 포함하는 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 대한 염색체 DNA의 접근성을 증가시키는 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 연결된 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 프로그램가능한 DNA 변형 단백질의 표적된 염색체 서열들에 대한 접근이 증가되도록 뉴클레오솜 및/또는 염색질 구조를 변형 또는 재형성시킴으로써, 표적된 게놈 변형, 표적된 전사 조절, 또는 표적된 후성 변형의 효율성을 증가시킨다.
(I) 융합 단백질
본 발명의 한 양상은 융합 단백질을 제공하는데, 이 때 각 융합 단백질은 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 연결된 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인을 포함한다. 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 뉴클레아제 활성 (아래 섹션 (I)(b)(i) 참고) 또는 비-뉴클레아제 활성 (아래 섹션 (I)(b)(ii) 참고)을 가질 수 있다. 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 아래 섹션 (I)(a)에서 설명되며 도메인들 사이의 링키지는 아래 섹션 (I)(c)에서 설명된다.
(a) 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인
뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 뉴클레오솜 재배열 및/또는 염색질 재형성을 용이하게 하기 위하여 뉴클레오솜 및/또는 염색체 단백질들과 상호작용하는 염색체 단백질 또는 이의 단편들을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 고 이동성 그룹 (HMG) 박스 (HMGB) 단백질들로부터 유래할 수 있다. 다른 구체예들에서, 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 HMG 뉴클레오솜-결합 (HMGN) 단백질 또는 이의 단편들일 수 있다. 추가 구체예들에서, 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 링커 히스톤 H1 변이체들로부터 유래될 수 있다. 또 다른 구체예들에서, 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 염색질 재형성 복합체 단백질들로부터 유래될 수 있다.
(i) HMGB 단백질
일부 구체예들에서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 HMGB 단백질로부터 유래될 수 있다. HMGB 단백질들은 뉴클레오솜 및 다른 염색체 단백질들과 상호작용하여 염색질 구조 및 기능을 조절한다. 적합한 HMGB 단백질들에는 포유동물 HMGB1, 포유동물 HMGB2, 및 포유동물 HMGB3가 포함된다. 예를 들면, 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 인간 HNGB1 (RefSeqGene, U51677), 인간 HMGB2 (RefSeqGene, M83665), 또는 인간 HMGB3 (RefSeqGene, NM_005342)으로부터 유래될 수 있다. 다른 구체예들에서, 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 다른 척추동물, 무척추동물 (예컨대, 초파리 DSP1), 식물, 효모, 또는 다른 단일 세포 진핵생물로부터의 HMGB 단백질 또는 HMGB-유사 단백질로부터 유래될 수 있다.
특정 구체예들에서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 HMGB 단백질의 단편일 수 있다. 특히, HMGB 단백질의 단편은 DNA-결합 도메인이다. HMGB 단백질들은 전형적으로 박스 A 및 박스 B로 불리는 2개의 DNA-결합 도메인들을 내포한다. 일부 구체예들에서, 뉴클레오솜 상호작용 도메인은 HMGB 단백질로부터의 박스 A 도메인 또는 박스 B 도메인일 수 있다. 특정 구체예들에서, 뉴클레오솜 상호작용 도메인은 HMGB1 박스 A 도메인, HMGB2 박스 A 도메인, 또는 HMGB3 박스 A 도메인일 수 있다.
(ii) HMGN 단백질
다른 구체예들에서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 HMGN 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. HMGN 단백질들은 염색질의 구조 및 기능을 조절하는 염색체 단백질이다. 적합한 포유동물 HMGN 단백질들에는 HMGN1, HMGN2, HMGN3, HMGN3, HMGN4, 및 HMGN5가 포함된다. 다양한 구체예들에서, 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 인간 HMGN1 (RefSeqGene, M21339), 인간 HMGN2 (RefSeqGene, X13546), 인간 HMGN3a 또는 인간 HMGN3b (RefSeqGene, L40357), 인간 HMGN4 (RefSeqGene, NM_030763), 인간 HMGN5 (RefSeqGene, NM_016710), 이의 단편, 또는 이의 유도체일 수 있다. 다른 구체예들에서, 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 비-인간 HMGN 단백질, 단편, 또는 이의 유도체일 수 있다. HMGN 단백질들은 비교적 작은 단백질이다. 이와 같이, 전체 HMGN 단백질은 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 연결될 수 있다. 그러나, 일부 구체예들에서, HMGN 단백질의 단편 (예컨대, 중심에 위치한 뉴클레오솜-결합 도메인)은 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 연결될 수 있다.
(iii) 히스톤 H1 변이체
또 다른 구체예들에서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 링커 히스톤 H1 변이체로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 히스톤 H1 변이체로부터의 중심 구형 도메인일 수 있다. 히스톤 H1 변이체들은 뉴클레오솜들 사이의 링커 DNA에 결합하고 중심 구형 도메인 (약 80개 아미노산)은 뉴클레오솜 이중염색체에 인접한 뉴클레오솜 유입 및 배출 부위들에서 링커 DNA에 결합한다. 히스톤 H1 변이체는 이들이 발현되는 조직, 발달기, 및 유기체에 대한 뚜렷한 특이성을 가지는 관련 단백질들의 거대 패밀리를 포함한다. 예를 들면, 인간 및 마우스는 11개의 히스톤 H1 변이체들을 내포하고, 닭은 6개의 변이체들 (히스톤 H5라 불림)을 가지며, 개구리는 5개의 변이체들을 가지고, 선충은 8개의 변이체들을 가지고, 과일 파리 종들은 1 내지 3개 변이체들을 가지고, 담배는 6개의 변이체들을 가진다. 일부 구체예들에서, 히스톤 H1 변이체는 아래와 같은 인간 변이체 일 수 있다.
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(iv) 염색질 재형성 복합체 단백질
추가 구체예들에서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 염색질 재형성 복합체 단백질로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 염색질 재형성 복합체 단백질로부터의 DNA 결합 도메인 일 수 있다. 염색질 재형성 복합체들은 염색질의 구조를 재형성할 수 있는 능력을 가진 다중-소단위 효소 복합체들이다. 이러한 재형성 복합체들은 ATP 가수분해 에너지를 사용하여 뉴클레오솜들을 이동, 탈안정화, 방출 또는 재구성한다.
염색질 재형성 복합체들의 예들에는 SWI/SNF (스위치/수크로스 비-발효성), ISWI (모방 스위치), CHD (크로모도메인-헬리케이스-DNA 결합), Mi-2/NuRD (뉴클레오솜 재형성 및 탈아세틸화효소), INO80, SWR1, 및 RSC 복합체들이 포함된다. 다양한 구체예들에서, 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 ATPase, 헬리케이스, 및/또는 염색질 재형성 복합체의 DNA 결합 단백질로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예들에서, 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 ISWI 복합체의 ATPase ISWI, CHD 복합체의 DNA-결합 단백질 CHD1, ATP-의존성 헬리케이스 SMARCA4 또는 SWI/SNF 복합체의 ATPase Snf2, Mi-1/NuRD 복합체의 ATPase Mi-2α 또는 ATPase Mi2-β, INO80 복합체의 RuvB-유사 AAA ATPase 1 또는 RuvB-유사 AAA ATPase 2, SWR1 복합체의 ATPase Swr1, 또는 RSC 복합체의 ATPase Rsc1 또는 ATPase Rcs2로부터 유래될 수 있다. 특정 구체예들에서, 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 ISWI 단백질의 DNA 결합 도메인 또는 CHD1 단백질의 DNA 결합 도메인 일 수 있다.
(b) 프로그램가능한 DNA 변형 단백질
프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 염색체 DNA의 특정 서열에 결합하도록 표적되는 단백질로서, 표적된 서열에서의 또는 서열 근방의 DNA 또는 DNA와 관련된 단백질을 변형시킨다. 그러므로, 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 프로그램가능한 DNA 결합 도메인 및 촉매적 활성 변형 도메인을 포함한다.
프로그램가능한 DNA 변형 단백질들의 DNA 결합 도메인은 프로그램가능하며, 이는 이것이 상이한 DNA 서열들을 인식하여 결합하도록 설계 또는 조작될 수 있음을 의미한다. 일부 구체예들에서, 예를 들면, DNA 결합은 DNA 변형 단백질과 표적 DNA 사이의 상호작용에 의해 매개된다. 그러므로, DNA 결합 도메인은 단백질 조작에 의해 관심 DNA 서열에 결합하도록 프로그램될 수 있다. 다른 구체예들에서, 예를 들면, DNA 결합은 DNA 변형 단백질 및 표적 DNA와 상호작용하는 가이드 RNA에 의해 매개된다. 이러한 예들에서, 프로그램가능한 DNA 결합 단백질은 적절한 가이드 RNA를 설계함으로써 관심 DNA 서열에 대해 표적될 수 있다.
다양한 변형 도메인들이 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 포함될 수 있다. 일부 구체예들에서, 변형 도메인은 뉴클레아제 활성을 가지며 이중-가닥 DNA 서열 중 하나 또는 두 개 모두의 가닥들을 절단할 수 있다. 이후 DNA 파열은 세포 DNA 복구 과정, 가령, 비-상동 단부-결합(NHEJ) 또는 상동 재조합 (HDR)에 의해 복구될 수 있으며, 그 결과 DNA 서열은 최소한 하나의 염기쌍의 결실, 삽입, 및/또는 치환에 의해 변형될 수 있다. 뉴클레아제 활성을 가지는 프로그램가능한 DNA 변형 단백질들의 예들에는, 제한 없이, CRISPR 뉴클레아제 (또는 니카아제), 징크 핑거 뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 뉴클레아제 도메인에 연결된 프로그램가능한 DNA 결합 도메인이 포함된다. 뉴클레아제 활성을 가지는 프로그램가능한 DNA 변형 단백질들은 아래 섹션 (I)(b)(i)에 상세히 설명된다.
다른 구체예들에서, 프로그램가능한 DNA 변형 단백질의 변형 도메인은 비-뉴클레아제 활성 (예컨대, 후성 변형 활성 또는 전사 조절 활성)을 가지며 그 결과 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 DNA 및/또는 DNA와 관련된 단백질(들)의 구조 및/또는 활성을 변형시킨다. 그러므로, 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 연결된 비-뉴클레아제 도메인에 연결된 프로그램가능한 DNA 결합 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 단백질들은 아래 섹션 (I)(b)(ii)에 상세히 설명된다.
프로그램가능한 DNA 변형 단백질들은 야생형 또는 자연-발생 DNA 결합 및/또는 변형 도메인, 자연-발생 DNA 결합 및/또는 변형 도메인의 변형된 형태들, 합성 또는 인공 DNA 결합 및/또는 변형 도메인, 및 이의 조합을 포함할 수 있다.
(i) 뉴클레아제 활성을 가지는 프로그램가능한 DNA 변형 단백질
뉴클레아제 활성을 가지는 프로그램가능한 DNA 변형 단백질들의 예들에는, 제한 없이, CRISPR 뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 및 뉴클레아제 도메인에 연결된 프로그램가능한 DNA 결합 도메인이 포함된다.
CRISPR 뉴클레아제 . CRISPR 뉴클레아제는 유형 I, 유형 II (즉, Cas9), 유형 III, 유형 V (즉, Cpf1), 또는 유형 VI (즉, Cas13) CRISPR 단백질로부터 유래될 수 있으며, 이는 다양한 박테리아 및 고세균류에 존재한다. 추가 구체예들에서, CRISPR 뉴클레아제는 고세균류 CRISPR 시스템, CRISPR/CasX 시스템, 또는 CRISPR/CasY 시스템으로부터 유래될 수 있다 (Burstein 외., Nature, 2017, 542(7640):237-241). 다양한 구체예들에서, CRISPR 뉴클레아제는 스트렙토코쿠스 (Streptococcus)속 (예컨대, S. 피오게네스 (S. pyogenes), S. 써모필루스 (S. thermophilus), S. 파스테우리아누스 (S. pasteurianus)), 캄필로박터 (Campylobacter) 속 (예컨대, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni)), 프란시셀라 (Francisella)속 (예컨대, 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida)), 아카리오클로리스 (Acaryochloris) 속, 아세토할로비움 (Acetohalobium) 속, 아시다미노코쿠스 (Acidaminococcus ) 속, 아시디티오바실루스 (Acidithiobacillus) 속, 알리사이클로바실루스 (Alicyclobacillus) 속, 알로크로마티움 (Allochromatium) 속, 암모니펙스 (Ammonifex) 속, 아나바에나 (Anabaena) 속, 아르트로스피라 (Arthrospira) 속, 바실루스 (Bacillus) 속, 부르크홀데리알레스 (Burkholderiales) 속, 칼디셀룰로시롭토 (Caldicelulosiruptor) 속, 칸디다투스 (Candidatus) 속, 클로스트리디움 (Clostridium) 속, 크로코스파에라 (Crocosphaera) 속, 사이아노테세 (시안othece) 속, 엑시구오박테리움 (Exiguobacterium) 속, 피네골디아 (Finegoldia) 속, 크테도노박터 (Ktedonobacter) 속, 라크노스피라세아에 (Lachnospiraceae) 속, 락토바실루스 (Lactobacillus) 속, 린그비아 (Lyngbya) 속, 마리노박터 (Marinobacter) 속, 메타노할로비움 (Methanohalobium) 속, 마이크로실라 (Microscilla) 속, 마이크로콜레우스 (Microcoleus) 속, 마이크로시스티스 (Microcystis) 속, 나트라나에로비우스 (Natranaerobius) 속, 나이세리아 (Neisseria) 속, 니트로소코쿠스 (Nitrosococcus) 속, 노카르디옵시스 (Nocardiopsis) 속, 노둘라리아 (Nodularia) 속, 노스톡 (Nostoc) 속, 오실라토리아 (Oscillatoria) 속, 폴라로모나스 (Polaromonas) 속, 펠로토마쿨럼 (Pelotomaculum) 속, 슈도알테로모나스 (Pseudoalteromonas) 속, 페트로토가 (Petrotoga) 속, 프레보텔라 (Prevotella) 속, 스타필로코쿠스 (Staphylococcus) 속, 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속, 스트렙토스포란기움 (Streptosporangium) 속, 시네코코쿠스 (Synechococcus) 속, 써모시포 (Thermosipho) 속, 또는 베루코마이크로비아 (Verrucomicrobia) 속으로부터 얻을 수 있다.
CRISPR 뉴클레아제는 야생형 또는 자연-발생 단백질일 수 있다. 대안적으로, CRISPR 뉴클레아제는 개선된 특이성, 변형된 PAM 특이성, 감소된 오프-타겟 효과, 증가된 안정성, 등을 가지도록 조작될 수 있다.
일부 구체예들에서, CRISPR 뉴클레아제는 유형 II CRISPR/Cas 9 단백질일 수 있다. 예를 들면, CRISPR 뉴클레아제는 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (SpCas9), 스트렙토코쿠스 써모필루스 Cas9 (StCas9), 스트렙토코쿠스 파스테우리아누스 (SpaCas9), 캄필로박터 제주니 Cas9 (CjCas9), 스타필로코쿠스 아우레우스 (SaCas9), 프란시셀라 노비시다 Cas9 (FnCas9), 나이세리아 시네레아 Cas9 (NcCas9), 또는 나이세리아 메닌지티스 Cas9 (NmCas9) 일 수 있다. 다른 구체예들에서, CRISPR 뉴클레아제는 유형 V CRISPR/Cpf1 단백질, 예컨대, 프란시셀라 노비시다 Cpf1 (FnCpf1), 아시다미노코쿠스 속 Cpf1 (AsCpf1), 또는 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006 Cpf1 (LbCpf1) 일 수 있다. 추가 구체예들에서, CRISPR 뉴클레아제는 유형 VI CRISPR/Cas13 단백질, 예컨대, 펩토트리키아 와데이 (Leptotrichia wadei) Cas13a (LwaCas13a) 또는 펩토트리키아 샤히이 (Leptotrichia shahii) Cas13a (LshCas13a) 일 수 있다.
일반적으로, CRISPR 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 최소한 하나의 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 예를 들면, Cas9 뉴클레아제는 가이드 RNA 상보적 가닥을 절단하는 HNH 도메인, , 및 비-상보적 가닥을 절단하는 RuvC 도메인을 포함하고, Cpf1 단백질은 RuvC 도메인 및 NUC 도메인을 포함하고, Cas13a 뉴클레아제는 2개의 HNEPN 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 두 뉴클레아제 도메인들 모두는 활성이며 CRISPR 뉴클레아제는 이중-가닥 절단 활성을 가진다 (즉, 이중-가닥 핵산 서열의 가닥들 모두를 절단함). 다른 구체예들에서, 뉴클레아제 도메인 중 하나는 하나 이상의 돌연변이 및/또는 결실에 의해 비활성화되고, CRISPR 변이체는 이중-가닥 핵산 서열 중 하나의 가닥을 절단하는 니카아제이다. 예를 들면, Cas9 단백질의 RuvC 도메인 내 하나 이상의 돌연변이들 (예컨대, D10A, D8A, E762A, 및/또는 D986A)은 가이드 RNA 상보적 가닥을 절단하는 HNH 니카아제를 생성하고; Cas9 단백질 (예컨대, H840A, H559A, N854A, N856A, 및/또는 N863A)의 HNH 도메인 내 하나 이상의 돌연변이들은 가이드 RNA 비-상보적 가닥을 절단하는 RuvC 니카아제를 생성한다. 비교가능한 돌연변이들은 Cpf1 및 Cas13a 뉴클레아제를 니카아제로 전환시킬 수 있다.
징크 핑거 뉴클레아제 . 또 다른 구체예들에서, 뉴클레아제 활성을 가지는 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)의 쌍 일 수 있다. ZFN은 DNA 결합 징크 핑거 영역 및 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 징크 핑거 영역은 약 2 내지 7개의 징크 핑거, 예를 들면, 약 4 내지 6개의 징크 핑거를 포함할 수 있고, 이 때 각 징크 핑거는 3개의 연속 염기쌍에 결합한다. 징크 핑거 영역은 임의의 DNA 서열을 인식하여 결합하도록 조작될 수 있다. 징크 핑거 설계 툴 또는 알고리즘은 인터넷 또는 상업적 출처들로부터 이용가능하다. 징크 핑거는 적합한 링커 서열들을 사용하여 함께 연결될 수 있다.
ZFN은 또한 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻을 수 있는 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 뉴클레아제 도메인이 유도될 수 있는 엔도뉴클레아제의 비-제한적 예들은, 제한 엔도뉴클레아제 및 호밍 엔도뉴클레아제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구체예들에서, 뉴클레아제 도메인은 유형 II-S 제한 엔도뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 유형 II-S 엔도뉴클레아제는 인식/결합 부위로부터 전형적으로 여러 개 염기쌍 떨어져있는 부위들의 DNA를 절단하고, 그리하여 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 가진다. 이들 효소들은 일반적으로 엇갈린 위치들에서 DNA 각 가닥을 절단하기 위해 일시적으로 결합하여 이량체를 형성하는 단량체이다. 적합한 유형 II-S 엔도뉴클레아제의 비-제한적 예들에는 BfiI, BpmI, BsaI, BsgI, BsmBI, BsmI, BspMI, FokI, MboII, 및 SapI가 포함된다. 일부 구체예들에서, 뉴클레아제 도메인은 FokI 뉴클레아제 도메인 또는 이의 유도체일 수 있다. 유형 II-S 뉴클레아제 도메인은 2개의 상이한 뉴클레아제 도메인의 이량체화를 용이하게 하도록 변형될 수 있다. 예를 들면, FokI의 절단 도메인은 특정 아미노산 잔기들을 돌연변이시킴으로써 변형될 수 있다. 비-제한적 예로서, FokI 뉴클레아제 도메인의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538의 아미노산 잔기들은 변형을 위한 표적이다. 특정 구체예들에서, FokI 뉴클레아제 도메인은 Q486E, I499L, 및/또는 N496D 돌연변이들을 포함하는 제 1 FokI 절반-도메인, 및 E490K, I538K, 및/또는 H537R 돌연변이들을 포함하는 제 2 FokI 절반-도메인을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, ZFN은 이중-가닥 절단 활성을 가진다. 다른 구체예들에서, ZFN은 니카아제 활성을 가진다 (즉, 뉴클레아제 도메인들 중 하나는 비활성화되어 있다).
전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 . 다른 구체예들에서, 뉴클레아제 활성을 가지는 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 일 수 있다. TALEN은 뉴클레아제 도메인에 연결된 전사 활성화제-유사 이펙터 (TALE)로부터 유래한 고도로 보존된 반복부들로 구성된 DNA 결합 도메인을 포함한다. TALE는 식물 병원체 잔토모나스에 의해 분비되어 숙주 식물 세포에서 유전자들의 전사를 변형시키는 단백질이다. TALE 반복 배열은 임의의 관심 DNA 서열을 표적하기 위한 모듈 단백질 설계를 통해 조작될 수 있다. TALEN의 뉴클레아제 도메인은 상기 ZFN을 설명하는 서브섹션에 설명된 바와 같은 임의의 뉴클레아제 도메인 일 수 있다. 특정 구체예들에서, 뉴클레아제 도메인은 FokI로부터 유래된다 (Sanjana 외., 2012, Nat Protoc, 7(1):171-192). TALEN은 이중-가닥 절단 활성 또는 니카아제 활성을 가질 수 있다.
메가뉴클레아제 또는 희소-절단 엔도뉴클레아제 . 또 다른 구체예들에서, 뉴클레아제 활성을 가지는 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 메가뉴클레아제 또는 이의 유도체 일 수 있다. 메가뉴클레아제는 긴 인식 서열들로 특징되는 엔도데옥시리보뉴클레아제로서, 즉, 이러한 인식 서열은 일반적으로 약 12개 염기쌍 내지 약 45개 염기쌍 범위이다. 이러한 요건의 결과로, 상기 인식 서열은 일반적으로 임의의 주어진 게놈에서 1회만 나타난다. 메가뉴클레아제 중에서, LAGLIDADG로 명명되는 호밍 엔도뉴클레아제 군은 게놈 연구 및 게놈 조작을 위한 유용한 툴이 되어 왔다. 일부 구체예들에서, 메가뉴클레아제는 I-SceI, I-TevI, 또는 이의 변이체 일 수 있다. 메가뉴클레아제는 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 널리 공지된 기술들을 사용하여 그 인식 서열을 변형시킴으로써 특정 염색체 서열에 표적될 수 있다. 다른 구체예들에서, 뉴클레아제 활성을 가지는 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 희소-절단 엔도뉴클레아제 또는 이의 유도체 일 수 있다. 희소-절단 엔도뉴클레아제는 그 인식 서열이 하나의 게놈에서 드물게, 바람직하게는 1회만 나타나는 부위-특이적 엔도뉴클레아제이다. 희소-절단 엔도뉴클레아제는 7-뉴클레오티드 서열, 8-뉴클레오티드 서열, 또는 보다 긴 인식 서열을 인식할 수 있다. 희소-절단 엔도뉴클레아제의 비-제한적 예들에는 NotI, AscI, PacI, AsiSI, SbfI, 및 FseI가 포함된다.
뉴클레아제 도메인에 연결된 프로그램가능한 DNA 결합 도메인 . 또한 추가 구체예들에서, 뉴클레아제 활성을 가지는 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 뉴클레아제 도메인에 연결된 프로그램가능한 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질 일 수 있다. 뉴클레아제 도메인은 상기 ZFN을 설명하는 서브섹션에 기재된 것들 (예컨대, 뉴클레아제 도메인은 FokI 뉴클레아제 도메인 일 수 있음), CRISPR 뉴클레아제로부터 유래된 뉴클레아제 도메인 (예컨대, Cas9의 RuvC 또는 HNH 뉴클레아제 도메인), 또는 메가뉴클레아제 또는 희소-절단 엔도뉴클레아제로부터 유래된 뉴클레아제 도메인 중 어느 하나 일 수 있다.
키메라 단백질의 프로그램가능한 DNA 결합 도메인은 임의의 프로그램가능한 DNA 결합 단백질, 가령, 예컨대, 징크 핑거 단백질 또는 전사 활성화제-유사 이펙터 일 수 있다. 대안적으로, 프로그램가능한 DNA 결합 도메인은 모든 뉴클레아제 활성을 없애기 위해 결실 또는 돌연변이에 의해 변형되어 있는 촉매적 비활성 (사멸) CRISPR 단백질 일 수 있다. 예를 들면, 촉매적으로 비활성인 CRISPR 단백질은 촉매적 비활성 (사멸) Cas9 (dCas9) 일 수 있으며 여기서 RuvC 도메인은 D10A, D8A, E762A, 및/또는 D986A 돌연변이를 포함하고 HNH 도메인은 H840A, H559A, N854A, N865A, 및/또는 N863A 돌연변이를 포함한다. 대안적으로, 촉매적 비활성 CRISPR 단백질은 뉴클레아제 도메인에 균등한 (comparable) 돌연변이들을 포함하는 촉매적 비활성 (사멸) Cpf1 단백질 일 수 있다. 또 다른 구체예들에서, 프로그램가능한 DNA 결합 도메인은 촉매적 비활성 메가뉴클레아제 일 수 있으며 여기서 뉴클레아제 활성은 돌연변이 및/또는 결실에 의해 제거될 수 있는데, 예컨대, 촉매적 비활성 메가뉴클레아제는 C-말단 절두를 포함할 수 있다.
(ii) 비-뉴클레아제 활성을 가진 프로그램가능한 DNA 변형 단백질
다른 구체예들에서, 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 비-뉴클레아제 도메인에 연결된 프로그램가능한 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질 일 수 있다. 프로그램가능한 DNA 결합 도메인은 징크 핑거 단백질, 전사 활성화제-유사 이펙터, 촉매적 비활성 (사멸) CRISPR 단백질, 또는 촉매적 비활성 (사멸) 메가뉴클레아제 일 수 있다. 예를 들면, 촉매적으로 비활성인 CRISPR 단백질은 촉매적 비활성 (사멸) Cas9 (dCas9) 일 수 있으며 여기서 RuvC 도메인은 D10A, D8A, E762A, 및/또는 D986A 돌연변이를 포함하고 HNH 도메인은 H840A, H559A, N854A, N865A, 및/또는 N863A 돌연변이를 포함한다. 대안적으로, 촉매적 비활성 CRISPR 단백질은 뉴클레아제 도메인에 균등한 (comparable) 돌연변이들을 포함하는 촉매적 비활성 (사멸) Cpf1 단백질 일 수 있다.
일부 구체예들에서, 키메라 단백질의 비-뉴클레아제 도메인은 후성 변형 도메인 일 수 있으며, 이는 DNA 또는 염색질 구조를 변화시킨다 (그리고 DNA 서열을 변화시키거나 변화시키지 않을 수 있다). 적합한 후성 변형 도메인의 비-제한적 예들에는 DNA 메틸전이효소 활성 (예컨대, 시토신 메틸전이효소), DNA 탈메틸화효소 활성, DNA 탈아미노화 (예컨대, 시토신 탈아미노효소, 아데노신 탈아미노효소, 구아닌 탈아미노효소), DNA 아미노화, DNA 산화 활성, DNA 헬리케이스 활성, 히스톤 아세틸전이효소 (HAT) 활성 (예컨대, E1A 결합 단백질 p300으로부터 유래한 HAT 도메인), 히스톤 탈아세틸화효소 활성, 히스톤 메틸전이효소 활성, 히스톤 탈메틸화효소 활성, 히스톤 키나아제 활성, 히스톤 인산분해효소 활성, 히스톤 유비퀴틴 연결효소 활성, 히스톤 탈유비퀴틴화 활성, 히스톤 아데닐화 활성, 히스톤 탈아데닐화 활성, 히스톤 수모화 (SUMOylating) 활성, 히스톤 탈수모화 활성, 히스톤 리보실화 활성, 히스톤 탈리보실화 활성, 히스톤 미리스토일화 활성, 히스톤 탈미리스토일화 활성, 히스톤 시트룰린화 활성, 히스톤 알킬화 활성, 히스톤 탈알킬화 활성, 또는 히스톤 산화 활성을 가진 도메인들이 포함된다. 특정 구체예들에서, 후성 변형 도메인은 시티딘 탈아미노효소 활성, 히스톤 아세틸전이효소 활성, 또는 DNA 메틸전이효소 활성을 포함할 수 있다.
다른 구체예들에서, 키메라 단백질의 비-뉴클레아제 변형 도메인은 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제인자 도메인 일 수 있다. 적합한 전사 활성화 도메인들에는, 제한 없이, 단순 헤르페스 바이러스 VP16 도메인, VP64 (VP16의 사량체 유도체임), VP160, NFκB p65 활성화 도메인, p53 활성화 도메인 1 및 2, CREB (cAMP 반응 요소 결합 단백질) 활성화 도메인, E2A 활성화 도메인, 인간 열-충격 인자 1 (HSF1)의 활성화 도메인, 또는 NFAT (활성화된 T-세포들의 핵 인자) 활성화 도메인이 포함된다. 적합한 전사 억제인자 도메인의 비-제한적 예들에는 유도성 cAMP 조기 억제자 (ICER) 도메인, 크루펠-관련 박스 (KRAB) 억제자 도메인, YY1 글리신 풍부 억제자 도메인, Sp1-유사 억제자, E(spl) 억제자, IκB 억제자, 또는 메틸-CpG 결합 단백질 2 (MeCP2) 억제자가 포함된다. 전사 활성화 또는 전사 억제인자 도메인은 DNA 결합 단백질에 유전적으로 융합되거나 비공유 단백질-단백질, 단백질-RNA, 또는 단백질-DNA 상호작용에 의해 결합될 수 있다.
특정 구체예들에서, 키메라 단백질의 비-뉴클레아제 도메인은 시티딘 탈아미노효소 활성, 히스톤 아세틸전이효소 활성, 전사 활성화 활성, 또는 전사 억제인자 활성을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 비-뉴클레아제 활성을 가지는 키메라 단백질은 최소한 하나의 탐지가능한 표지를 추가로 포함할 수 있다. 탐지가능한 표지는 형광단 (예컨대, FAM, TMR, Cy3, Cy5, 텍사스 레드, 오레곤 그린, 알렉사 플루오르, 할로 태그, 또는 적합한 형광 염료), 탐지 태그 (예컨대, 비오틴, 디곡시제닌, 등), 양자 점, 또는 금 입자들 일 수 있다.
(c) 링키지
본 명세서에 개시된 융합 단백질은 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 연결된 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인을 포함한다. 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인과 프로그램가능한 DNA 변형 단백질 사이의 링키지는 화학적 결합에 의해 직접적으로 이루어질 수 있고, 또는 상기 링키지는 링커에 의해 간접적으로 이루어질 수 있다.
일부 구체예들에서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 공유 결합 (예컨대, 펩티드 결합, 에스터 결합, 등)에 의해 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 직접적으로 연결될 수 있다. 대안적으로, 화학적 결합은 비-공유적 일 수 있다 (예컨대, 이온, 정전기, 수소, 소수성, 반 데르 발스 상호작용, 또는 Π-효과).
다른 구체예들에서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 링커에 의해 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 연결될 수 있다. 링커는 최소한 하나의 공유 결합에 의해 하나 이상의 다른 화학적 작용기를 연결시키는 화학적 작용기이다. 적합한 링커들에는 아미노산, 펩티드, 뉴클레오티드, 핵산, 유기 링커 분자들 (예컨대, 말레이미드 유도체, N-에톡시벤질이미다졸, 바이페닐-3, 4',5-트라이카르복시산, p-아미노벤질옥시카르보닐, 등), 다이설파이드 링커, 및 폴리머 링커 (예컨대, PEG)가 포함된다. 링커는 알킬렌, 알켄일렌, 알킨일렌, 알킬, 알켄일, 알킨일, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아랄킬, 아랄켄일, 아랄킨일 등을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 하나 이상의 스페이싱 작용기들을 포함할 수 있다. 링커는 중성일 수 있거나, 양 또는 음 전하를 지닐 수 있다. 추가적으로, 링커는 절단가능할 수 있어서, 링커를 또 다른 화학적 작용기에 연결시키는 링커의 공유 결합이, pH, 온도, 염 농도, 빛, 촉매 또는 효소를 포함한 특정 조건하에서 파열되거나 절단될 수 있다.
또 다른 구체예들에서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 펩티드 링커에 의해 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 연결될 수 있다. 펩티드 링커는 가요성 아미노산 링커 (예컨대, 소형, 비-극성 또는 극성 아미노산을 포함) 일 수 있다. 가요성 링커들의 비-제한적 예들에는 LEGGGS (서열 번호:1), TGSG (서열 번호:2), GGSGGGSG (서열 번호:3), (GGGGS)1-4 (서열 번호:4), 및 (Gly)6-8 (서열 번호:5)이 포함된다. 대안적으로, 펩티드 링커는 뻣뻣한 아미노산 링커일 수 있다. 이러한 링커들에는 (EAAAK)1-4 (서열 번호:6), A(EAAAK)2-5A (서열 번호:7), PAPAP (서열 번호:8), 및 (AP)6-8 (서열 번호:9)이 포함된다. 적합한 링커들의 예는 해당 분야에 잘 공지되어 있으며 링커들을 설계하는 프로그램들은 용이하게 이용가능하다 (Crasto 외., Protein Eng., 2000, 13(5):309-312).
최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 프로그램가능한 DNA 변형 단백질의 N-말단, the C-말단, 및/또는 내부 위치에 연결될 수 있다. 일부 구체예들에서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 프로그램가능한 DNA 변형 단백질의 N-말단에 연결될 수 있다. 다른 구체예들에서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 프로그램가능한 DNA 변형 단백질의 C-말단에 연결될 수 있다. 또 다른 구체예들에서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 N-말단에 연결될 수 있으며 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 프로그램가능한 DNA 변형 단백질의 C-말단에 연결될 수 있다.
일부 구체예들에서, 융합 단백질은 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인을 포함할 수 있다. 다른 구체예들에서, 융합 단백질은 2개의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예들에서, 융합 단백질은 3개의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인을 포함할 수 있다. 추가 구체예들에서, 융합 단백질은 4, 5, 또는 5개 이상의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인을 포함할 수 있다. 하나 이상의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 동일할 수 있거나 상이할 수 있다.
융합 단백질이 2개 이상의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인을 포함하는 구체예들에서, 상기 2개 이상의 뉴클레오솜 상호작용 도메인은 프로그램가능한 DNA 변형 단백질의 어느 한 쪽 단부, 양쪽 단부, 및/또는 내부 위치에 연결될 수 있다. 상기 2개 이상의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 동일할 수 있거나 상이할 수 있다. 예를 들면, 상기 복합체는 최소한 2개의 HMG DNA-결합 도메인, 최소한 2개의 HMGN 단백질, 최소한 하나의 HMG DNA-결합 도메인 및 최소한 하나의 HMGN 단백질, 최소한 하나의 HMG DNA-결합 도메인 또는 HMGN 단백질 및 히스톤 H1 변이체의 최소한 하나의 중심 도메인, 최소한 하나의 HMG DNA-결합 도메인 또는 HMGN 단백질 및 염색질 재형성 복합체 단백질의 최소한 하나의 도메인, 최소한 하나의 HMG DNA-결합 도메인 또는 HMGN 단백질, 최소한 하나의 히스톤 H1 변이체 중심 도메인, 및 염색질 재형성 복합체 단백질의 최소한 하나의 도메인, 등을 포함할 수 있다.
(d) 선택적 핵 위치화 신호, 세포-침투 도메인, 및/또는 마커 도메인
본 명세서에 개시된 융합 단백질은 최소한 하나의 핵 위치화 신호, 세포-침투 도메인, 및/또는 마커 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
핵 위치화 신호들의 비-제한적 예들에는 PKKKRKV (서열 번호:10), PKKKRRV (서열 번호:11), KRPAATKKAGQAKKKK (서열 번호:12), YGRKKRRQRRR (서열 번호:13), RKKRRQRRR (서열 번호:14), PAAKRVKLD (서열 번호:15), RQRRNELKRSP (서열 번호:16), VSRKRPRP (서열 번호:17), PPKKARED (서열 번호:18), PQPKKKPL (서열 번호:19), SALIKKKKKMAP (서열 번호:20), PKQKKRK (서열 번호:21), RKLKKKIKKL (서열 번호:22), REKKKFLKRR (서열 번호:23), KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK (서열 번호:24), RKCLQAGMNLEARKTKK (서열 번호:25), NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY (서열 번호:26), 및 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV (서열 번호:27)이 포함된다.
적합한 세포-침투 도메인의 예들에는, 제한 없이, GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV (서열 번호:28), PLSSIFSRIGDPPKKKRKV (서열 번호:29), GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV (서열 번호:30), GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV (서열 번호:31), KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (서열 번호:32), YARAAARQARA (서열 번호:33), THRLPRRRRRR (서열 번호:34), GGRRARRRRRR (서열 번호:35), RRQRRTSKLMKR (서열 번호:36), GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (서열 번호:37), KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (서열 번호:38), 및 RQIKIWFQNRRMKWKK (서열 번호:39)가 포함된다.
마커 도메인은 형광 단백질 및 정제 또는 에피토프 태그를 포함한다. 적합한 형광 단백질들에는, 제한 없이, 녹색 형광 단백질 (예컨대, GFP, eGFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), 황색 형광 단백질 (예컨대, YFP, EYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), 청색 형광 단백질 (예컨대, BFP, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), 시안 형광 단백질 (예컨대, ECFP, Cerulean, CyPet, AmCyan1, Midoriishi-Cyan), 적색 형광 단백질 (예컨대, mKate, mKate2, mPlum, DsRed 단량체, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomer, HcRed-Tandem, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred), 및 오렌지색 형광 단백질 (예컨대, mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Monomeric Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato)이 포함된다. 적합한 정제 또는 에피토프 태그의 비-제한적 예들에는 6xHis, FLAG®, HA, GST, Myc, 등이 포함된다.
최소한 하나의 핵 위치화 신호, 세포-침투 도메인, 및/또는 마커 도메인은 융합 단백질의 N-말단, C-말단, 및/또는 내부 위치에 위치할 수 있다.
(e) 특이적 융합 단백질
일반적으로, 융합 단백질의 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 HMGB1 박스 A 도메인, HMGN1 단백질, HMGN2 단백질, HMGN3a 단백질, HMGN3b 단백질, 히스톤 H1 중심 구형 도메인, 모방 스위치 (ISWI) 단백질 DNA 결합 도메인, 크로모도메인-헬리케이스-DNA 단백질 1 (CHD1) DNA 결합 도메인, 또는 이의 조합에서 선택된다.
특정 구체예들에서, 융합 단백질의 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 CRISPR 단백질이다. 예를 들면, CRISPR 단백질은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (SpCas9), 스트렙토코쿠스 써모필루스 Cas9 (StCas9), 스트렙토코쿠스 파스테우리아누스 (SpaCas9), 캄필로박터 제주니 Cas9 (CjCas9), 스타필로코쿠스 아우레우스 (SaCas9), 프란시셀라 노비시다 Cas9 (FnCas9), 나이세리아 시네레아 Cas9 (NcCas9), 나이세리아 메닌지티스 Cas9 (NmCas9), 프란시셀라 노비시다 Cpf1 (FnCpf1), 아시다미노코쿠스 속 Cpf1 (AsCpf1), 또는 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006 Cpf1 (LbCpf1) 일 수 있다.
일부 구체예들에서, 융합 단백질은 서열 번호: 61-79 중 어느 하나와 최소한 약 80% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가진다. 일반적으로, 임의의 아미노산 치환은 보존적이다, 즉, 그룹 1: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 아이소류신; 그룹 2: 세린, 시스테인, 트레오닌, 및 메티오닌; 그룹 3: 프롤린; 그룹 4: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; 및 그룹 5: 아스파테이트, 글루타메이트, 아스파라긴, 및 글루타민의 구성원들 내에서의 교환에 제한된다. 다양한 구체예들에서, 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호:61-79 중 어느 하나와 최소한 약 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98, 또는 99% 서열 동일성을 가진다. 일부 구체예들에서, 융합 단백질은 서열 번호:61, 서열 번호:62, 서열 번호:63, 서열 번호:64, 서열 번호:65, 서열 번호:66, 서열 번호:67, 서열 번호:68, 서열 번호:69, 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:72, 서열 번호:73, 서열 번호:74, 서열 번호:75, 서열 번호:76, 서열 번호:77, 서열 번호:78, 또는 서열 번호:79에 제시된 아미노산 서열을 가진다.
(II) 복합체
본 발명의 또 다른 양상은 최소한 하나의 CRISPR 시스템 (즉, CRISPR 단백질 및 가이드 RNA) 및 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인을 포함하는 복합체들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 CRISPR 시스템의 CRISPR 단백질에 연결될 수 있다 (즉, 상기 복합체는 상기 섹션 (I)에 설명된 CRISPR 융합 단백질을 포함한다). 다른 구체예들에서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 CRISPR 시스템의 가이드 RNA에 연결될 수 있다. 링키지는 본질적으로 상기 섹션 (I)(c)에 설명된 바와 같이 직접 또는 간접적일 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 RNA 압타머 결합 단백질에 연결될 수 있고, 가이드 RNA는 압타머 서열들을 포함하여, RNA 압타머 결합 단백질의 RNA 압타머 서열에 대한 결합이 links the 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인을 가이드 RNA에 연결할 수 있다.
뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 상기 섹션 (I)(a)에 설명되어 있으며, CRISPR 단백질들은 상기 섹션 (I)(b)에 상세히 설명되어 있다. CRISPR 단백질은 뉴클레아제 또는 니카아제 활성을 가질 수 있다 (예컨대, 유형 II CRISPR/Cas9, 유형 V CRISPR/Cpf1, 또는 유형 VI CRISPR/Cas13 일 수 있다). 예를 들면, 복합체는 CRISPR 뉴클레아제를 포함할 수 있고, 또는 복합체는 2개의 CRISPR 니카아제를 포함할 수 있다. 대안적으로, CRISPR 단백질은 모든 뉴클레아제 활성이 없도록 변형되어 비-뉴클레아제 도메인 (예컨대, 시토신 탈아미노효소 활성, 히스톤 아세틸전이효소 활성, 전사 활성화 활성, 또는 전사 억제인자 활성을 가지는 도메인)에 연결될 수 있다. 일부 구체예들에서, 비-뉴클레아제 도메인은 또한 RNA 압타머 결합 단백질에 연결될 수 있다.
가이드 RNA는 (i) 표적 서열과 혼성화하는, 5' 단부에 가이드 서열을 내포하는 CRISPR RNA (crRNA) 및 (ii) CRISPR 단백질과 상호작용하는 트랜스작용 crRNA (tracrRNA) 서열을 포함한다. 각 가이드 RNA의 crRNA 가이드 서열은 상이하다 (즉, 서열 특이적이다). tracrRNA 서열은 일반적으로 특정 박테리아 종들의 CRISPR 단백질과 복합체를 형성하도록 설계된 가이드 RNA에서 동일하다.
crRNA 가이드 서열은 이중-가닥 서열에서 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 의해 경계지어진 표적 서열 (즉, 프로토스페이서)와 혼성화하도록 설계된다. Cas9 단백질들에 대한 PAM 서열은 5'-NGG, 5'-NGGNG, 5'-NNAGAAW, 및 5'-ACAY를 포함하고, Cpf1에 대한 PAM 서열은 5'-TTN을 포함한다 (이 때 N은 임의의 뉴클레오티드로 정의되고, W는 A 또는 T로 정의되고, Y는 C 또는 T로 정의된다). 일반적으로, crRNA 가이드 서열과 표적 서열 간의 상보성은 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 또는 최소한 99%이다. 특정 구체예들에서, 상보성은 완전하다 (즉, 100%). 다양한 구체예들에서, crRNA 가이드 서열의 길이는 약 15개 뉴클레오티드 내지 약 25개 뉴클레오티드 범위일 수 있다. 예를 들면, crRNA 가이드 서열은 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 특정 구체예들에서, crRNA는 약 19, 20, 21, 또는 22개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
crRNA 및 tracrRNA는 하나 이상의 하나의 스템 루프 구조를 형성하는 반복 서열들을 포함하며, 이는 CRISPR 단백질과 상호작용할 수 있다. 각 루프 및 스템의 길이는 다를 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 루프들은 약 3 내지 약 10개 뉴클레오티드 길이 범위일 수 있으며, 하나 이상의 스템들은 약 6개 내지 약 20개 염기쌍 길이 범위일 수 있다. 하나 이상의 스템들은 하나 이상의 1 내지 약 10개 뉴클레오티드 팽창부를 포함할 수 있다.
crRNA는 약 25개 뉴클레오티드 내지 약 100개 뉴클레오티드 길이 범위일 수 있다. 다양한 구체예들에서, crRNA는 약 25 내지 약 50개 뉴클레오티드,약 590 내지 약 75개 뉴클레오티드, 또는 약 75 내지 약 100개 뉴클레오티드 길이 범위일 수 있다. tracrRNA는 약 50개 뉴클레오티드 내지 약 300개 뉴클레오티드 길이 범위일 수 있다. 다양한 구체예들에서, tracrRNA는 약 50 내지 약 90개 뉴클레오티드, 약 90 내지 약 110개 뉴클레오티드, 약 110 내지 약 130개 뉴클레오티드, 약 130 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 150 내지 약 170개 뉴클레오티드, 약 170 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 200 내지 약 250개 뉴클레오티드, 또는 약 250 내지 약 300개 뉴클레오티드 길이 범위일 수 있다.
가이드 RNA에서 tracrRNA 서열은 일반적으로 관심 박테리아 종들에서의 야생형 tracrRNA의 코딩 서열에 기초한다. 일부 구체예들에서, 야생형 tracrRNA 서열 (또는 crRNA 불변 반복 영역 및 crRNA 불변 반복 영역과 이중나선 구조를 형성하는 상응하는 tracrRNA의 5' 영역)은 이차 구조 형성을 용이하게 하기 위해, 이차 구조 안정성을 증가시키기 위해, 진핵 세포들에서 발현을 용이하게 하기 위해, 편집 효율성을 증가시키는 등을 위해 변형될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 뉴클레오티드 변화가 불변 가이드 RNA 서열에 도입될 수 있다 (아래 실시예 8 참고).
가이드 RNA는 단일 분자 (즉, 단일 가이드 RNA 또는 sgRNA) 일 수 있으며, 이 때 crRNA 서열은 tracrRNA 서열에 연결된다. 대안적으로, 가이드 RNA는 2개 분리된 분자들 일 수 있다. 5' 단부에 crRNA 가이드 서열 그리고 3' 단부에 또 다른 서열을 포함하는 제 1 분자는 제 2 분자의 5' 단부와 염기쌍을 이룰 수 있으며, 이 때 제 2 분자는 상기 제 1 분자의 3' 단부와 염기쌍을 이룰 수 있는 5' 서열, 뿐만 아니라 또 다른 tracrRNA 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 유형 V CRISPR/Cpf1 시스템의 가이드 RNA는 crRNA 만을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 가이드 RNA의 하나 이상의 스템-루프 영역은 하나 이상의 압타머 서열들을 포함하도록 변형될 수 있다 (Konermann 외., Nature, 2015, 517(7536):583-588; Zalatan 외., Cell, 2015, 160(1-2):339-50). 적합한 RNA 압타머 단백질 도메인의 예들에는 MS2 외피 단백질 (MCP), PP7 박테리오파지 외피 단백질 (PCP), Mu 박테리오파지 Com 단백질, 람다 박테리오파지 N22 단백질, 스템-루프 결합 단백질 (SLBP), 취약 X 정신 지체 증후군-관련 단백질 1 (FXR1), 박테리오파지로부터 유래한 단백질, 가령, AP205, BZ13, f1, f2, fd, fr, ID2, JP34/GA, JP501, JP34, JP500, KU1, M11, M12, MX1, NL95, PP7, φCb5, φCb8r, φCb12r, φCb23r, Qβ, R17, SP-β, TW18, TW19, 및 VK, 이의 단편, 또는 이의 유도체가 포함된다. 또 다른 압타머 서열의 길이는 약 20개 뉴클레오티드 내지 약 200개 뉴클레오티드 범위일 수 있다.
가이드 RNA는 표준 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드 (예컨대, 수도우리딘), 리보뉴클레오티드 이성질체, 및/또는 리보뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 가이드 RNA는 최소한 하나의 탐지가능한 표지를 추가로 포함할 수 있다. 탐지가능한 표지는 형광단 (예컨대, FAM, TMR, Cy3, Cy5, Texas Red, Oregon Green, Alexa Fluors, Halo tags, 또는 적합한 형광 염료), 탐지 태그 (예컨대, 비오틴, 디곡시제닌, 등), 양자 점, 또는 금 입자들 일 수 있다. 해당 분야의 숙련된 기술자들은 gRNA 설계 및 구조를 잘 알고 있으며, 예컨대, gRNA 설계 툴은 인터넷에서 또는 상업적 공급업체로부터 구입가능하다.
가이드 RNA는 화학적으로 합성되거나, 효소적으로 합성되거나, 또는 이의 조합일 수 있다. 예를 들면, 가이드 RNA는 표준 포스포로아미다이트-기반 고체-상 합성 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 대안적으로, 가이드 RNA는 가이드 RNA를 인코드하는 DNA를 파지 RNA 중합효소에 의해 인식되는 프로모터 제어 서열에 작동적으로 연결시킴으로써 시험관내에서 합성될 수 있다. 적합한 파지 프로모터 서열들의 예들에는 T7, T3, SP6 프로모터 서열, 또는 이의 변이체가 포함된다. 가이드 RNA가 2개의 별도의 분자들 (즉, crRNA 및 tracrRNA)을 포함하는 구체예에서, crRNA는 화학적으로 합성될 수 있으며 tracrRNA는 효소적으로 합성될 수 있다.
(III) 핵산
본 발명의 추가 양상은 상기 섹션 (I)에 설명된 융합 단백질 및 상기 섹션 (II)에 설명된 CRISPR 복합체를 인코드하는 핵산을 제공한다. CRISPR 복합체는 단일 핵산 또는 복수의 핵산들에 의해 인코드 될 수 있다. 핵산은 DNA 또는 RNA, 선형 또는 원형, 단일-가닥 또는 이중-가닥 일 수 있다. RNA 또는 DNA는 관심 진핵 세포에서 단백질로의 효율적인 번역을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화 프로그램은 프리웨어로서 또는 상업적 공급업체들로부터 이용가능하다.
일부 구체예들에서, 융합 단백질 또는 CRISPR 복합체의 단백질 성분들을 인코드하는 핵산은 RNA 일 수 있다. RNA는 시험관내에서 효소적으로 합성될 수 있다. 이를 위하여, 관심 단백질을 인코드하는 DNA는 시험관내 RNA 합성을 위해 파지 RNA 중합효소에 의해 인식되는 프로모터 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 예를 들면, 프로모터 서열은 T7, T3, 또는 SP6 프로모터 서열 또는 T7, T3, 또는 SP6 프로모터 서열의 변이 일 수 있다. 단백질을 인코드하는 DNA는 아래 상세히 설명된 벡터의 일부 일 수 있다. 이러한 구체예들에서, 시험관내-전사된 RNA는 정제, 캡핑, 및/또는 폴리아데닐화 될 수 있다. 다른 구체예들에서, 복합체의 융합 단백질 또는 단백질 성분을 인코드하는 RNA는 자가-복제 RNA의 일부 일 수 있다 (Yoshioka 외., Cell Stem Cell, 2013, 13:246-254). 자가-복제 RNA는 비감염성, 자가-복제 Venezuelan 말 뇌염 (VEE) 바이러스 RNA 레플리콘으로부터 유래될 수 있는데, 이는 제한된 세포 분열수를 위하여 자가-복제할 수 있는 양성-센스, 단일-가닥 RNA로서, 관심 단백질들을 코드화하기 위해 변형될 수 있다 (Yoshioka 외., Cell Stem Cell, 2013, 13:246-254).
다른 구체예들에서, 융합 단백질 또는 CRISPR 단백질 및 복합체의 가이드 RNA를 인코드하는 핵산은 DNA 일 수 있다. DNA 코딩 서열은 관심 세포에서 발현을 위해 최소한 하나의 프로모터 제어 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 특정 구체예들에서, DNA 코딩 서열은 박테리아 (예컨대, 대장균) 세포 또는 진핵생물 (예컨대, 효모, 곤충, 또는 포유동물) 세포에서 단백질 또는 RNA의 발현을 위해 프로모터 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 적합한 박테리아 프로모터에는, 제한 없이, T7 프로모터, lac 오페론 프로모터, trp 프로모터, tac 프로모터 (이들은 trp과 lac 프로모터의 하이브리드임), 전술한 것들 중 어느 하나의 변이형, 및 전술한 것들의 임의의 조합이 포함된다. 적합한 진핵생물 Pol II 프로모터의 비-제한적 예들에는 항시성의, 조절된 또는 세포- 또는 조직-특이적 프로모터가 포함된다. 적합한 진핵생물 항시적 프로모터 제어 서열에는, 거대세포바이러스 즉시 초기 프로모터 (CMV), 원숭이 바이러스 (SV40) 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 마우스 젖 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제 (PGK) 프로모터, 연장 인자 (ED1)-알파 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 액틴 프로모터, 튜불린 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 이의 단편, 또는 전술한 것들의 임의의 조합이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 진핵생물 조절된 프로모터 제어 서열의 예들에는 제한 없이 열 충격, 금속, 스테로이드, 항생제, 또는 알콜에 의해 조절되는 것들이 포함된다. 조직-특이적 프로모터의 비-제한적 예들에는 B29 프로모터, CD14 프로모터, CD43 프로모터, CD45 프로모터, CD68 프로모터, 데스민 프로모터, 엘라스타제-1 프로모터, 엔도글린 프로모터, 피브로넥틴 프로모터, Flt-1 프로모터, GFAP 프로모터, GPIIb 프로모터, ICAM-2 프로모터, INF-
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프로모터, Mb 프로모터, NphsI 프로모터, OG-2 프로모터, SP-B 프로모터, SYN1 프로모터, 및 WASP 프로모터가 포함된다. 프로모터 서열은 야생형 일 수 있거나 보다 효율적인 또는 효과적인 발현을 위해 변형될 수 있다. 일부 구체예들에서, DNA 코딩 서열은 또한 폴리아데닐화 신호 (예컨대, SV40 폴리A 신호, 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리A 신호, 등) 및/또는 최소한 하나의 전사 종결 서열에 연결될 수 있다. 가이드 RNA를 인코드하는 서열은 진핵 세포에서의 발현을 위해 Pol III 프로모터 제어 서열에 작동적으로 연결된다. 적합한 Pol III 프로모터의 예들에는, 포유동물 U6, U3, H1, 및 7SL RNA 프로모터가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 상황들에서, 융합 단백질 또는 복합체의 성분들은 박테리아 또는 진핵 세포들로부터 정제될 수 있다.
다양한 구체예들에서, 복합체의 가이드 RNA 및 융합 단백질 또는 CRISPR 단백질을 인코드하는 핵산은 벡터에 존재할 수 있다. 적합한 벡터들에는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 및 자가-복제 RNA가 포함된다 (Yoshioka 외., Cell Stem Cell, 2013, 13:246-254). 일부 구체예들에서, 복합체의 성분들 또는 융합 단백질을 인코드하는 핵산은 플라스미드 벡터에 존재할 수 있다. 적합한 플라스미드 벡터의 비-제한적 예들에는 pUC, pBR322, pET, pBluescript, 및 이의 변이체들이 포함된다. 다른 구체예들에서, 복합체의 성분들 또는 융합 단백질을 인코드하는 핵산은 바이러스 벡터의 일부 일 수 있다 (예컨대, 렌티바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 등). 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 또 다른 발현 제어 서열 (예컨대, 인핸서 서열, 코작 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열, 등.), 선별 마커 서열 (예컨대, 항생제 내성 유전자), 복제 원점, 등을 포함할 수 있다. 벡터 및 이의 용도에 관한 추가 정보는 "Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel 외., John Wiley & Sons, New York, 2003 또는 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001에서 찾을 수 있다.
(IV) 키트
본 발명의 추가 양상은 상기 섹션 (I)에 상세히 설명된 융합 단백질들 중 최소한 하나, 상기 섹션 (II)에 설명된 CRISPR 복합체 중 최소한 하나, 및/또는 상기 섹션 (III)에 설명된 핵산 중 최소한 하나를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 형질감염 시약, 세포 성장 배지, 선별 배지, 시험관내 전사 시약, 핵산 정제 시약, 단백질 정제 시약, 완충액, 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 제공되는 키트는 일반적으로 이하에 상세히 설명된 방법들을 실시하기 위한 지침들을 포함한다. 키트에 포함되는 지침들은 포장재에 고정될 수 있거나 포장 삽입물로 포함될 수 있다. 지침들은 전형적으로 필기 또는 인쇄물이지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 지침들을 저장하여 최종 사용자에게 이들을 전달할 수 있는 임의의 매체가 본 발명에서 고려된다. 이러한 매체들에는, 제한없이, 전자 저장 매체 (예컨대, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체 (예컨대, CD ROM), 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "지침"은 해당 지침을 제공하는 인터넷 사이트의 주소를 포함할 수 있다.
(V) 세포
본 발명은 또한 상기 섹션 (I)에 상세히 설명된 융합 단백질들 중 최소한 하나, 상기 섹션 (II)에 설명된 CRISPR 복합체 중 최소한 하나, 및/또는 상기 섹션 (III)에 설명된 핵산 중 최소한 하나를 포함하는 세포를 제공한다. 일반적으로, 세포는 진핵 세포이다. 예를 들면, 세포는 인간 세포, 비-인간 포유동물 세포, 비-포유동물 척추동물 세포, 무척추동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 세포, 또는 단세포 진핵생물 기관일 수 있다.
(VI) 표적된 게놈, 전사, 또는 후성 변형의 효율성을 증가시키는 방법
본 발명의 또 다른 양상은 염색체 DNA 내 그 표적 서열에 대한 프로그램가능한 DNA 변형 단백질의 접근가능성을 증가시킴으로써 진핵 세포에서 표적된 게놈 변형, 표적된 전사 변형, 또는 표적된 후성 변형의 효율성을 증가시키는 방법을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 상기 섹션 (I)에 기재된 융합 단백질들 중 최소한 하나, 상기 섹션 (II)에 기재된 CRISPR 복합체들 중 최소한 하나, 또는 상기 섹션 (III)에 기재된 최소한 하나의 융합 단백질 또는 CRISPR 복합체를 인코드하는 핵산, 및 선택적으로, 공여체 폴리뉴클레오티드를 관심 진핵 세포에 도입하는 단계를 포함한다.
상기 융합 단백질의 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 염색체 DNA 내 표적 서열을 인식하여 이에 결합하도록 조작되고, 상기 융합 단백질의 하나 이상의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 뉴클레오솜 및/또는 염색질 구조를 변화 또는 재형성하기 위해 표적 서열의 또는 표적 서열 근방의 뉴클레오솜들과 상호작용한다. 결과적으로, DNA 변형 단백질은 표적 염색체 서열에 대한 접근이 증가되어, 변형 단백질에 의한 변형의 효율성이 증가된다. 특정 구체예들에서, 상기 융합 단백질은 CRISPR 뉴클레아제에 연결된 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인을 포함하고, 그리하여, 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인(들)과 표적 서열의 또는 표적 서열 근방의 뉴클레오솜/염색질 간의 상호작용들은 표적된 게놈 변형들에 대한 효율성을 증가시킨다 (실시예 1-8 참고).
그러므로, 본 명세서에 개시된 방법들은 표적된 게놈 편집 (예컨대, 유전자 보정, 유전자 녹아웃, 유전자 녹인 등), 표적된 후성 변형, 및 표적된 전사 조절의 효율성을 증가시킬 수 있다.
(a) 세포로의 도입
상기 언급한 바와 같이, 상기 방법은 최소한 하나의 융합 단백질, 최소한 하나의 CRISPR 복합체, 또는 상기 융합 단백질 또는 CRISPR 복합체를 인코드하는 핵산(들) (그리고, 선택적으로, 공여체 폴리뉴클레오티드)을 세포 내부에 도입하는 단계를 포함한다. 최소한 하나의 융합 단백질, CRISPR 복합체, 또는 핵산(들)은 다양한 수단들에 의해 관심 세포 내에 도입될 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 세포는 적절한 분자들 (즉, 단백질, DNA, 및/또는 RNA)로 형질감염될 수 있다. 적합한 형질감염 방법들에는 뉴클레오펙션 (또는 전기천공), 칼슘 포스페이트-매개된 형질감염, 양이온 폴리머 형질감염 (예컨대, DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민), 바이러스 형질도입, 비로좀 형질감염, 비리온 형질감염, 리포좀 형질감염, 양이온 리포좀 형질감염, 면역리포좀 형질감염, 비리포좀 지질 형질감염, 덴드리머 형질감염, 열 충격 형질감염, 자기주입법, 리포펙션, 유전자 총 전달, 임팔레펙션, 초음파천공법, 광학 형질감염, 및 특정상표 제제 (proprietary agent)-개선된 핵산의 흡수가 포함된다. 형질감염 방법들은 해당 분야에 잘 공지되어 있다 (예컨대, "Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel 외., John Wiley & Sons, New York, 2003 또는 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001 참고). 다른 구체예들에서, 상기 분자들은 미세주입에 의하여 세포 내부에 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 분자들은 관심 세포들의 세포질 또는 핵 내부에 주사될 수 있다. 세포 내부에 도입되는 각 분자의 양은 변화할 수 있으나, 해당 분야의 숙련된 기술자는 적절한 양을 결정하는 수단을 잘 알고 있다.
다양한 분자들은 동시에 또는 순차적으로 세포 내부에 도입될 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질 또는 CRISPR 복합체 (또는 인코딩 핵산) 및 공여체 폴리뉴클레오티드는 동시에 도입될 수 있다. 대안적으로, 하나를 먼저 도입한 다음 다른 하나를 차후에 세포 내에 도입할 수 있다.
일반적으로, 세포는 세포 성장 및/또는 유지에 적절한 조건하에서 유지된다. 적합한 세포 배양 조건들은 해당 분야에 널리 공지이며, 예를 들면, Santiago 외., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 105:5809-5814; Moehle 외. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, 104:3055-3060; Urnov 외., Nature, 2005, 435:646-651; 및 Lombardo 외., Nat. Biotechnol., 2007, 25:1298-1306에 기재되어 있다. 해당 분야의 숙련된 기술자들은 세포의 배양 방법들이 해당 분야에 공지이며 세포 유형에 따라 달라질 것임을 이해하고 있을 것이다. 모든 사례에서, 특정 세포 유형에 대한 가장 우수한 기술들을 결정하기 위해 관례적인 최적화가 사용될 수 있다.
(b) 표적된 게놈 또는 후성 변형
융합 단백질 또는 CRISPR 복합체의 하나 이상의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 표적 염색체 서열의 또는 근방의 뉴클레오솜 및/또는 염색체 DNA와 상호작용하여, 뉴클레오솜 및/또는 염색질 구조가 변형/재형성되고, 이에 의해 융합 단백질의 프로그램가능한 DNA 변형 단백질 또는 CRISPR 복합체의 CRISPR 단백질의 표적 염색체 서열에 대한 접근가능성을 증가시킨다. 표적 염색체 서열에 대한 접근 증가는 표적된 게놈, 전사, 또는 후성 변형의 빈도/효율성을 증가시킨다.
융합 단백질이 뉴클레아제 활성을 가지는 프로그램가능한 DNA 변형 단백질을 포함하는 구체예들에서, 융합 단백질은 표적된 염색체 서열 중 하나 또는 두 가닥 모두를 절단할 수 있다. 이중-가닥 파열은 비-상동 단부-결합(NHEJ) 복구 공정에 의해 복구될 수 있다. NHEJ는 오류가 발생하기 쉽기 때문에, 파열의 복구 동안 최소한 하나의 염기쌍의 삽입-결실 (즉, 결실 또는 삽입), 최소한 하나의 염기쌍의 치환, 또는 이의 조합이 발생할 수 있다. 따라서, 표적된 염색체 서열은 변형, 돌연변이, 또는 비활성화될 수 있다. 예를 들면, 코딩 서열의 리딩 프레임에서 결실, 삽입, 또는 치환은 변형된 단백질 생성물을 초래하거나, 또는 단백질 생성물이 없을 수 있다 (이는 "녹아웃"이라 명명된다). 일부 반복에서, 상기 방법은 표적 염색체 서열의 한 쪽에 위치한 서열들에 대해 실질적인 서열 동일성을 가지는 서열에 의해 연접되는 공여체 서열을 포함하는 공여체 폴리뉴클레오티드 (이하 참고)를 세포 내부에 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 그 결과 상동 재조합 (HDR)에 의한 이중-가닥 파열의 복구 동안 상기 공여체 폴리뉴클레오티드 내 공여체 서열은 표적 염색체 서열의 염색체 서열과 교환되거나 이에 통합될 수 있다. 외인성 서열의 통합은 "녹인"이라 명명한다.
그러므로, 다양한 반복에서, 표적된 게놈 변형의 효율성은 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인에 연결되지 않은 프로그램가능한 모체 DNA 변형 단백질에 비해 최소한 약 0.1-배, 최소한 약 0.5-배, 최소한 약 1-배, 최소한 약 2-배, 최소한 약 5-배, 최소한 약 10-배, 또는 최소한 약 20-배, 최소한 약 50-배, 최소한 약 100-배, 또는 약 100-배 이상 만큼 증가될 수 있다.
융합 단백질이 비-뉴클레아제 활성을 가지는 프로그램가능한 DNA 변형 단백질을 포함하는 구체예들에서, 융합 단백질은 표적 염색체 서열에서 DNA 또는 관련 단백질들을 변형시키거나 표적 염색체 서열의 발현을 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 프로그램가능한 DNA 변형 단백질이 후성 변형 활성을 포함하는 경우, 히스톤 아세틸화, 메틸화, 인산화, 아데닐화 등의 상태가 변형될 수 있고 또는 DNA 메틸화, 아미노화 등의 상태가 변형될 수 있다. 한 예로서, 프로그램가능한 DNA 변형 단백질이 시티딘 탈아미노효소 활성을 포함하는 구체예들에서, 표적 염색체 서열에서 하나 이상의 시티딘 잔기들은 우리딘 잔기들로 전환될 수 있다. 대안적으로, 프로그램가능한 DNA 변형 단백질이 전사 활성화 또는 억제자 활성을 포함하는 경우, 표적 염색체 서열에서 전사는 증가 또는 감소될 수 있다.
생성된 후성 변형 또는 전사 조절은 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인에 연결되지 않는 프로그램가능한 모체 DNA 변형 단백질에 비해 최소한 약 0.1-배, 최소한 약 0.5-배, 최소한 약 1-배, 최소한 약 2-배, 최소한 약 5-배, 최소한 약 10-배, 또는 최소한 약 20-배, 최소한 약 50-배, 최소한 약 100-배, 또는 약 100-배 이상 만큼 증가될 수 있다.
상기 설명한 표적된 게놈, 전사, 후성 변형은 단일적으로 또는 다중으로 (즉, 둘 이상의 염색체 서열들이 동시에 표적될 수 있다) 실시될 수 있다.
(c) 선택적 공여체 폴리뉴클레오티드
융합 단백질이 뉴클레아제 활성을 가지는 프로그램가능한 DNA 변형 단백질을 포함하는 구체예들에서, 상기 방법은 최소한 하나의 공여체 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 공여체 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 또는 이중-가닥, 선형 또는 원형, 및/또는 RNA 또는 DNA 일 수 있다. 일부 구체예들에서, 공여체 폴리뉴클레오티드는 벡터, 예컨대, 플라스미드 벡터일 수 있다.
공여체 폴리뉴클레오티드는 최소한 하나의 공여체 서열을 포함한다. 일부 양상들에서, 공여체 폴리뉴클레오티드의 공여체 서열은 내인성 또는 고유 염색체 서열의 변형된 형태일 수 있다. 예를 들면, 공여체 서열은 DNA 변형 단백질에 의해 표적되는 서열의 또는 서열 근방의 염색체 서열의 일부분과 실질적으로 동일할 수 있지만, 이는 최소한 하나의 뉴클레오티드 변화를 포함한다. 그러므로, 고유 서열과 통합 또는 교환시, 표적된 염색체 위치의 서열은 최소한 하나의 뉴클레오티드 변화를 포함한다. 예를 들면, 이러한 변화는 하나 이상의 뉴클레오티드 삽입, 하나 이상의 뉴클레오티드 결실, 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 또는 이의 조합일 수 있다. 변형된 서열의 "유전자 교정" 통합의 결과로서, 세포는 표적된 염색체 서열로부터 변형된 유전자 생성물을 생성할 수 있다.
다른 양상들에서, 공여체 폴리뉴클레오티드의 공여체 서열은 외인성 서열일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, "외인성" 서열은 세포에 대해 고유적이지 않은 서열, 또는 그 고유 위치가 세포의 게놈에서 상이한 위치에 존재하는 서열을 지칭한다. 예를 들면, 외인성 서열은 단백질 코딩 서열을 포함할 수 있는데, 이는 외인성 프로모터 제어 서열에 작동적으로 연결될 수 있으므로, 게놈에 통합시, 세포는 통합된 서열에 의해 코드되는 단백질을 발현할 수 있다. 대안적으로, 외인성 서열은 염색체 서열에 통합될 수 있으며, 그리하여 그 발현은 내인성 프로모터 제어 서열에 의해 조절된다. 다른 반복들에서, 외인성 서열은 전사 제어 서열, 또 다른 발현 제어 서열, RNA 코딩 서열, 등일 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 외인성 서열의 염색체 서열로의 통합은 "녹인"이라 명명한다.
해당 분야의 숙련된 기술자가 이해할 수 있는 바와 같이, 공여체 서열의 길이는 달라질 수 있으며 달라질 것이다. 예를 들면, 공여체 서열은 수개의 뉴클레오티드에서 수백개의 뉴클레오티드까지의 길이에서 수십만개 뉴클레오티드까지 변화할 수 있다.
전형적으로, 공여체 폴리뉴클레오티드의 공여체 서열은 상류 서열 및 하류 서열에 의해 연접되고, 이는 각각 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 의해 표적되는 서열의 상류 및 하류에 위치한 서열들과 실질적 서열 동일성을 가진다. 이들 서열 유사성으로 인해, 공여체 폴리뉴클레오티드의 상류 및 하류 서열들은 공여체 폴리뉴클레오티드와 표적되는 염색체 서열 간의 상동 재조합을 가능하게 하여 공여체 서열이 염색체 서열 내에 통합 (또는 염색체 서열과 교환) 될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 상류 서열은, 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 의해 표적되는 서열의 상류 염색체 서열과 실질적인 서열 동일성을 공유하는 핵산 서열을 지칭한다. 유사하게, 하류 서열은 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 의해 표적되는 서열의 하류 염색체 서열과 실질적인 서열 동일성을 공유하는 핵산 서열을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는, 어구 "실질적 서열 동일성"은 최소한 약 75% 서열 동일성을 가지는 서열들을 지칭한다. 그러므로, 공여체 폴리뉴클레오티드 내 상류 및 하류 서열들은 표적 서열에 대한 상류 또는 하류 서열과 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. 한 예시적 구체예에서, 공여체 폴리뉴클레오티드 내 상류 및 하류 서열들은 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 의해 표적되는 서열에 대한 상류 또는 하류 염색체 서열과 약 95% 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다.
일부 구체예들에서, 상류 서열은 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 의해 표적되는 서열의 바로 상류에 위치한 염색체 서열과 실질적 서열 동일성을 공유한다. 다른 구체예들에서, 상류 서열은 표적 서열로부터 약 백 (100)개 뉴클레오티드 상류 이내에 위치한 염색체 서열과 실질적 서열 동일성을 공유한다. 그러므로, 예를 들면, 상류 서열은 표적 서열로부터 약 1 내지 약 20, 약 21 내지 약 40, 약 41 내지 약 60, 약 61 내지 약 80, 또는 약 81 내지 약 100 뉴클레오티드 상류에 위치한 염색체 서열과 실질적 서열 동일성을 공유할 수 있다. 일부 구체예들에서, 하류 서열은 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 의해 표적되는 서열의 바로 하류에 위치한 염색체 서열과 실질적 서열 동일성을 공유한다. 다른 구체예들에서, 하류 서열은 표적 서열로부터 약 백 (100)개 뉴클레오티드 하류 이내에 위치한 염색체 서열과 실질적 서열 동일성을 공유한다. 그러므로, 예를 들면, 하류 서열은 표적 서열로부터 약 1 내지 약 20, 약 21 내지 약 40, 약 41 내지 약 60, 약 61 내지 약 80, 또는 약 81 내지 약 100 뉴클레오티드 하류에 위치한 염색체 서열과 실질적 서열 동일성을 공유할 수 있다.
각 상류 또는 하류 서열은 약 20개 뉴클레오티드 내지 약 5000개 뉴클레오티드 길이 범위일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상류 및 하류 서열들은 약 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2800, 3000, 3200, 3400, 3600, 3800, 4000, 4200, 4400, 4600, 4800, 또는 5000개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 상류 및 하류 서열들은 약 50 내지 약 1500개 뉴클레오티드 길이 범위일 수 있다.
(d) 세포 유형
다양한 세포들이 본 발명에 개시된 방법에서 사용하기에 적합하다. 일반적으로, 세포는 진핵 세포이다. 예를 들면, 세포는 인간 세포, 비-인간 포유동물 세포, 비-포유동물 척추동물 세포, 무척추동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 세포, 또는 단세포 진핵생물 기관일 수 있다. 일부 구체예들에서, 세포는 또한 하나의 세포 배아 일 수도 있다. 예를 들면, 비-인간 포유동물 배아는 쥐, 햄스터, 설치류, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 및 영장류 배아를 포함한다. 또 다른 구체예들에서, 세포는 줄기 세포, 가령, 배아 줄기 세포, ES-유사 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 등일 수 있다. 한 구체예에서, 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포가 아니다. 더욱이, 줄기 세포들은 그 전문이 본 명세서에 포함되는 WO2003/046141, 또는 Chung 외. (Cell Stem Cell, 2008, 2:113-117)에 개시된 기술들에 의해 제조되는 것들을 포함할 수 있다. 세포는 시험관내 또는 생체내 (즉, 유기체 내부)에 존재할 수 있다. 예시적 구체예들에서, 세포는 포유동물 세포 또는 포유동물 세포주이다. 특정 구체예들에서, 세포는 인간 세포 또는 인간 세포주이다.
적합한 포유동물 세포 또는 세포주들의 비-제한적 예들에는 인간 배아 신장 세포 (HEK293, HEK293T); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 인간 U2-OS 골육종 세포, 인간 A549 세포, 인간 A-431 세포, 및 인간 K562 세포; 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포; 생쥐 골수종 NS0 세포, 생쥐 배아 섬유모세포 3T3 세포 (NIH3T3), 생쥐 B 림프종 A20 세포; 생쥐 흑색종 B16 세포; 생쥐 근육모세포 C2C12 세포; 생쥐 골수종 SP2/0 세포; 생쥐 배아 중간엽 C3H-10T1/2 세포; 생쥐 암종 CT26 세포, 생쥐 전립선 DuCuP 세포; 생쥐 유방 EMT6 세포; 생쥐 간암 Hepa1c1c7 세포; 생쥐 골수종 J5582 세포; 생쥐 상피 MTD-1A 세포; 생쥐 심근 MyEnd 세포; 생쥐 신장 RenCa 세포; 생쥐 이자 RIN-5F 세포; 생쥐 흑색종 X64 세포; 생쥐 림프종 YAC-1 세포; 쥐 교모세포종 9L 세포; 쥐 B 림프종 RBL 세포; 쥐 신경모세포종 B35 세포; 쥐 간암 세포 (HTC); 버팔로 쥐 간 BRL 3A 세포; 개 신장 세포 (MDCK); 개 유선 (CMT) 세포; 쥐 골육종 D17 세포; 쥐 단핵구/대식세포 DH82 세포; 원숭이 신장 SV-40 형질전환된 섬유모세포 (COS7) 세포; 원숭이 신장 CVI-76 세포; 아프리카 녹색 원숭이 신장 (VERO-76) 세포가 포함된다. 포유동물 세포주의 보다 많은 목록은 미국 표준 균주 카탈로그 (ATCC, Manassas, VA)에서 찾을 수 있다.
(VII) 구체적 게놈 좌위 탐지 방법
융합 단백질이 비-뉴클레아제 활성을 가지는 프로그램가능한 DNA 변형을 포함하는 또는 CRISPR 복합체가 비-뉴클레아제 활성을 가지는 촉매적 비활성 CRISPR 단백질을 포함하는 구체예들에서, 상기 융합 단백질 또는 CRISPR 복합체는 진핵 세포에서 구체적인 게놈 좌위를 탐지 또는 가시화하는 방법들에서 사용될 수 있다. 이러한 구체예들에서, 상기 복합체의 융합 단백질 또는 CRISPR 단백질은 최소한 하나의 탐지가능한 표지, 가령, 형광단 (예컨대, FAM, TMR, Cy3, Cy5, Texas Red, Oregon Green, Alexa Fluors, Halo tags, 또는 적합한 형광 염료), 탐지 태그 (예컨대, 비오틴, 디곡시제닌, 등), 양자 점, 또는 금 입자들을 추가로 포함한다. 대안적으로, CRISPR 복합체의 가이드 RNA는 인 시튜 (in situ) 탐지를 위한 탐지가능한 표지 (예컨대, FISH 또는 CISH)를 추가로 포함할 수 있다. 융합 단백질 또는 CRISPR 복합체의 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 표적 염색체 서열에 대한 비-뉴클레아제 활성을 가지는 프로그램가능한 DNA 변형 단백질 또는 CRISPR 단백질의 접근을 증가시킴으로써, 구체적인 게놈 좌위 또는 표적되는 염색체 서열들의 탐지를 개선시킨다.
상기 방법은 탐지가능하게 표지된 융합 단백질, 탐지가능하게 표지된 CRISPR 복합체, 또는 인코딩 핵산을 진핵 세포에 도입시키는 단계, 및 표적 염색체 서열에 결합된 표지된 프로그램가능한 DNA 변형 단백질 또는 표지된 CRISPR 단백질을 탐지하는 단계를 포함한다. 탐지 단계는 동역학적 살아있는 세포 이미징, 형광 현미경검사법, 공초점 현미경검사법, 면역형광법, 면역탐지법, RNA-단백질 결합, 단백질-단백질 결합, 등에 의할 수 있다. 탐지 단계는 살아있는 세포 또는 고정된 세포에서 수행될 수 있다.
살아있는 세포에서의 염색질 구조 동역학을 탐지하는 단계를 포함하는 방법의 구체예들에서, 탐지가능하게 표지된 융합 단백질 또는 탐지가능하게 표지된 CRISPR 복합체는 단백질 또는 핵산처럼 세포에 도입될 수 있다. 고정된 세포에서 표적되는 염색체 서열을 탐지하는 단계를 포함하는 방법의 구체예들에서, 탐지가능하게 표지된 융합 단백질 또는 탐지가능하게 표지된 CRISPR 복합체는 단백질 (또는 단백질-RNA 복합체들)처럼 세포에 도입될 수 있다. 세포를 고정 및 투과가능하게 하는 수단들은 해당 분야에 널리 공지이다. 일부 구체예들에서, 고정된 세포는 이중-가닥 염색체 DNA를 단일-가닥 DNA로 전환시키기 위한 화학적 및/또는 역절 변성 과정을 거칠 수 있다. 다른 구체예들에서, 고정된 세포들은 화학적 및/또는 열적 변성 과정을 거치지 않는다.
(VIII) 응용분야
본 명세서에 개시된 조성물 및 방법들은 다양한 치료, 진단, 산업 및 연구 분야에서 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명은 유전자 기능을 모형화 및/또는 연구하기 위해, 관심의 유전적 또는 후성 조건들을 연구하기 위해, 또는 다양한 질병 또는 장애들에 관여하는 생화학적 경로들을 연구하기 위해 세포, 동물, 또는 식물에서 임의의 관심 염색체 서열을 변형하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 질병 또는 장애들을 모형화하는 유전자삽입 유기체가 생성될 수 있으며, 여기서 질병 또는 장애와 연관된 하나 이상의 핵산 서열들의 발현은 변화되어 있다. 질병 모델은 유기체에 대한 돌연변이들의 효과를 연구하기 위해, 질병의 발병 및/또는 진행을 연구하기 위해, 질병에 대한 제약학적 활성 화합물의 효과를 연구하기 위해, 및/또는 잠재적인 유전자 치료 전략의 효능을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
다른 구체예들에서, 상기 조성물 및 방법들은 효율적인 그리고 비용 효과적인 기능적 게놈 선별을 실시하기 위해 사용될 수 있으며, 특정 생물학적 과정에 관여하는 유전자들의 기능 그리고 유전자 발현에서 임의의 변형이 생물학적 과정에 어떻게 영향을 줄 수 있는지를 연구하기 위해, 또는 세포 표현형과 관련된 게놈 좌위의 포화 또는 딥 스캐닝 돌연변이생성을 실시하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 유전자 발현, 약물 내성, 및 질병의 역전에 필요한 기능적 요소들에 관한 중요한 최소 특징들 및 별개의 취약성들을 결정하기 위하여 포화 또는 딥 스캐닝 돌연변이생성이 사용될 수 있다.
추가 구체예들에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법들은 질병 또는 장애의 존재를 확인하기 위한 진단 테스트에 및/또는 치료 옵션 결정에 사용하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 진단 테스트들의 예는 암 세포에서 특정 돌연변이들 (예컨대, EGFR, HER2, 등에서 특정 돌연변이)의 탐지, 특정 질병들과 관련된 특정 돌연변이들의 탐지 (예컨대, 트라이뉴클레오티드 반복, 낫 적혈구병과 연관된 β-글로빈의 돌연변이들, 특정 SNP, 등), 간염의 탐지, 바이러스 (예컨대, Zika)의 탐지, 등을 포함한다.
추가 구체예들에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법들은 특정 질병 또는 장애와 연관된 유전자 돌연변이들을 교정, 가령, 예컨대, 낫 적혈구병 또는 지중해빈혈과 연관된 글로빈 유전자 돌연변이들을 교정, 중증 복합성 면역 결핍증 (SCID)과 연관된 아데노신 탈아미노효소 유전자에서 돌연변이들을 교정, 헌팅턴 병의 질병-유발 유전자인 HTT의 발현을 감소, 또는 망막 색소변성의 치료를 위해 로돕신 유전자에서의 돌연변이들을 교정함에 사용될 수 있다. 이러한 변형들은 생체외 세포에서 이루어질 수 있다.
또 다른 구체예들에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법들은 환경적 스트레스에 대한 내성이 증가된 또는 개선된 형질들을 가지는 작물들을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 개선된 형질을 가진 농장 동물 또는 생산 동물을 생성하기 위해 사용될 수도 있다. 예를 들면, 돼지는 생의학 모델, 특히, 재생 의학 또는 이종이식에서의 모델로서 매력적이게 하는 많은 특징들을 가진다.
(IX) 다수 구체예
하기 다수 구체예들은 본 발명의 특정 양상들을 설명하기 위하여 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
1. 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 연결된 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질.
2. 구체예 1에 있어서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 HMGB1, HMGB2, 또는 HMGB3에서 선택된 고 이동성 그룹 (HMG) 박스 (HMGB) 단백질; HMGN1, HMGN2, HMGN3a, HMGN3b, HMGN4, 또는 HMGN5에서 선택된 HMG 뉴클레오솜-결합 (HMGN) 단백질로부터의 DNA 결합 도메인; 히스톤 H1 변이체로부터의 중심 구형 도메인; 스위치/수크로스 비-발효성 (SWI/SNF) 복합체, 모방 스위치 (ISWI) 복합체, 크로모도메인-헬리케이스-DNA 결합 (CHD) 복합체, 뉴클레오솜 재형성 및 탈아세틸화효소 (NuRD) 복합체, INO80 복합체, SWR1 복합체, RSC 복합체, 또는 이의 조합에서 선택된 염색질 재형성 복합체 단백질로부터의 DNA 결합 도메인인 융합 단백질.
3. 구체예 2에 있어서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 HMGB1 박스 A 도메인, HMGN1 단백질, HMGN2 단백질, HMGN3a 단백질, HMGN3b 단백질, 히스톤 H1 중심 구형 도메인, ISWI 단백질 DNA 결합 도메인, CHD1 단백질 DNA 결합 도메인, 또는 이의 조합인 융합 단백질.
4. 구체예 1 내지 3 중 어느 한 구체예에 있어서, 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 뉴클레아제 활성을 가지는, 융합 단백질.
5. 구체예 4에 있어서, 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 클러스터된 규칙적으로 산재된 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 뉴클레아제 또는 니카아제, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 메가뉴클레아제, 또는 뉴클레아제 도메인에 연결된 프로그램가능한 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질인, 융합 단백질.
6. 구체예 1 내지 3 중 어느 한 구체예에 있어서, 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 비-뉴클레아제 활성을 가지는, 융합 단백질.
7. 구체예 6에 있어서, 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 비-뉴클레아제 도메인에 연결된 프로그램가능한 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질인, 융합 단백질.
8. 구체예 7에 있어서, 프로그램가능한 DNA 결합 도메인은 모든 뉴클레아제 활성이 없도록 변형된 CRISPR 단백질, 징크 핑거 단백질, 또는 전사 활성화제-유사 이펙터인, 융합 단백질.
9. 구체예 7에 있어서, 비-뉴클레아제 도메인은 아세틸전이효소 활성, 탈아세틸화효소 활성, 메틸전이효소 활성, 탈메틸화효소 활성, 키나아제 활성, 인산분해효소 활성, 유비퀴틴 연결효소 활성, 탈유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, 수모화 활성, 탈수모화 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성, 탈미리스토일화 활성, 시트룰린화 활성, 헬리케이스 활성, 아미노화 활성, 탈아미노화 활성, 알킬화 활성, 탈알킬화 활성, 산화 활성, 전사 활성화 활성, 또는 전사 억제인자 활성을 가지는, 융합 단백질.
10. 구체예 9에 있어서, 비-뉴클레아제 도메인은 시토신 탈아미노효소 활성, 히스톤 아세틸전이효소 활성, 전사 활성화 활성, 또는 전사 억제인자 활성을 가지는, 융합 단백질.
11. 구체예 1 내지 10 중 어느 한 구체예에 있어서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 화학적 결합에 의해 직접적으로, 링커에 의해 간접적으로, 또는 이의 조합에 의해 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 연결되는, 융합 단백질.
12. 구체예 1 내지 11 중 어느 한 구체예에 있어서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 그 N-말단, C-말단, 내부 위치, 또는 이의 조합에서 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 연결되는, 융합 단백질.
13. 구체예 1 내지 12 중 어느 한 구체예에 있어서, 최소한 하나의 핵 위치화 신호, 최소한 하나의 세포-침투 도메인, 최소한 하나의 마커 도메인, 또는 이의 조합을 추가로 포함하는, 융합 단백질.
14. 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인에 연결된 클러스터된 규칙적으로 산재된 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 단백질을 포함하는 융합 단백질.
15. 구체예 14에 있어서, CRISPR 단백질은 유형 II CRISPR/Cas9 뉴클레아제 또는 니카아제이거나, 또는 CRISPR 단백질은 유형 V CRISPR/Cpf1 뉴클레아제 또는 니카아제인 융합 단백질.
16. 구체예 14에 있어서, CRISPR 단백질은 모든 뉴클레아제 활성이 없도록 변형되고 비-뉴클레아제 도메인에 연결된 유형 II CRISPR/Cas9 단백질이거나, 또는 모든 뉴클레아제 활성이 없도록 변형되고 비-뉴클레아제 도메인에 연결된 유형 V CRISPR/Cpf1 단백질인, 융합 단백질.
17. 구체예 16에 있어서, 비-뉴클레아제 도메인은 시토신 탈아미노효소 활성, 히스톤 아세틸전이효소 활성, 전사 활성화 활성, 또는 전사 억제인자 활성을 가지는, 융합 단백질.
18. 구체예 14 내지 17 중 어느 한 구체예에 있어서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 고 이동성 그룹 (HMG) 박스 (HMGB) DNA 결합 도메인, HMG 뉴클레오솜-결합 (HMGN) 단백질, 히스톤 H1 변이체로부터의 중심 구형 도메인, 염색질 재형성 복합체 단백질로부터의 DNA 결합 도메인, 또는 이의 조합인, 융합 단백질.
19. 구체예 18에 있어서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 HMGB1 박스 A 도메인, HMGN1 단백질, HMGN2 단백질, HMGN3a 단백질, HMGN3b 단백질, 히스톤 H1 중심 구형 도메인, 모방 스위치 (ISWI) 단백질 DNA 결합 도메인, 크로모도메인-헬리케이스-DNA 단백질 1 (CHD1) DNA 결합 도메인, 또는 이의 조합인, 융합 단백질.
20. 구체예 14 내지 19 중 어느 한 구체예에 있어서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 화학적 결합에 의해 직접적으로, 링커에 의해 간접적으로, 또는 이의 조합에 의해 CRISPR 단백질에 연결되는, 융합 단백질.
21. 구체예 14 내지 20 중 어느 한 구체예에 있어서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 그 N-말단, C-말단, 내부 위치, 또는 이의 조합에서 CRISPR 단백질에 연결되는, 융합 단백질.
22. 구체예 14 내지 21 중 어느 한 구체예에 있어서, 최소한 하나의 핵 위치화 신호, 최소한 하나의 세포-침투 도메인, 최소한 하나의 마커 도메인, 또는 이의 조합을 추가로 포함하는, 융합 단백질.
23. 구체예 14 내지 22 중 어느 한 구체예에 있어서, CRISPR 단백질은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (SpCas9), 스트렙토코쿠스 써모필루스 Cas9 (StCas9), 스트렙토코쿠스 파스테우리아누스 (SpaCas9), 캄필로박터 제주니 Cas9 (CjCas9), 스타필로코쿠스 아우레우스 (SaCas9), 프란시셀라 노비시다 Cas9 (FnCas9), 나이세리아 시네레아 Cas9 (NcCas9), 나이세리아 메닌지티스 Cas9 (NmCas9), 프란시셀라 노비시다 Cpf1 (FnCpf1), 아시다미노코쿠스 속 Cpf1 (AsCpf1), 또는 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006 Cpf1 (LbCpf1)인, 융합 단백질.
24. 구체예 14 내지 23 중 어느 한 구체예에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열 번호:61, 서열 번호:62, 서열 번호:63, 서열 번호:64, 서열 번호:65, 서열 번호:66, 서열 번호:67, 서열 번호:68, 서열 번호:69, 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:72, 서열 번호:73, 서열 번호:74, 서열 번호:75, 서열 번호:76, 서열 번호:77, 서열 번호:78, 또는 서열 번호:79와 최소한 약 90% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는, 융합 단백질.
25. 구체예 14 내지 24 중 어느 한 구체예에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열 번호:61, 서열 번호:62, 서열 번호:63, 서열 번호:64, 서열 번호:65, 서열 번호:66, 서열 번호:67, 서열 번호:68, 서열 번호:69, 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:72, 서열 번호:73, 서열 번호:74, 서열 번호:75, 서열 번호:76, 서열 번호:77, 서열 번호:78, 또는 서열 번호:79에 제시된 아미노산 서열을 가지는, 융합 단백질.
26. 구체예 14 내지 25 중 어느 한 구체예의 최소한 하나의 융합 단백질 및 최소한 하나의 가이드 RNA를 포함하는 복합체.
27. 구체예 1 내지 25 중 어느 한 구체예의 융합 단백질을 인코드하는 핵산.
28. 구체예 27에 있어서, 진핵 세포에서의 번역을 위해 코돈 최적화된, 융합 단백질.
29. 구체예 27 또는 28에 있어서, 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 또는 자가-복제 RNA의 일부인, 융합 단백질.
30. 구체예 1 내지 25 중 어느 한 구체예에 제시된 최소한 하나의 융합 단백질, 또는 구체예 27 내지 29 중 어느 한 구체예에 제시된 최소한 하나의 융합 단백질을 인코드하는 핵산을 진핵 세포에 도입시키는 단계를 포함하는, 진핵 세포에서 표적된 게놈 또는 후성 변형 효율성의 증가 방법으로서, 최소한 하나의 융합 단백질의 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 표적 염색체 서열에 대해 표적되고 최소한 하나의 융합 단백질의 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 최소한 하나의 융합 단백질의 표적 염색체 서열에 대한 접근이 증가되도록 뉴클레오솜 또는 염색질 구조를 변형시킴으로써, 표적된 게놈 또는 후성 변형 효율성을 증가시키는, 방법.
31. 구체예 30에 있어서, 최소한 하나의 융합 단백질의 DNA 변형 단백질은 CRISPR 단백질을 포함하고 상기 방법은 최소한 하나의 가이드 RNA 또는 최소한 하나의 가이드 RNA를 인코드하는 핵산을 진핵 세포에 도입시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
32. 구체예 30 또는 31에 있어서, 상기 방법은 진핵 세포에 최소한 하나의 공여체 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 추가로 포함하고, 공여체 폴리뉴클레오티드는 최소한 하나의 공여체 서열을 포함하는, 방법.
33. 구체예 30 내지 32 중 어느 한 구체예에 있어서, 진핵 세포는 시험관내 존재하는, 방법.
34. 구체예 30 내지 32 중 어느 한 구체예에 있어서, 진핵 세포는 생체내 존재하는, 방법.
35. 구체예 30 내지 34 중 어느 한 구체예에 있어서, 진핵 세포는 포유동물 세포인, 방법.
36. 구체예 30 내지 35 중 어느 한 구체예에 있어서, 진핵 세포는 인간 세포인, 방법.
37. 진핵 세포에 다음을 도입시키는 단계를 포함하는, 진핵 세포에서 표적된 게놈 또는 후성 변형 효율성의 증가 방법으로서: (a) 최소한 하나의 융합 단백질 또는 최소한 하나의 융합 단백질을 인코드하는 핵산, 각 융합 단백질은 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인에 연결된 CRISPR 단백질을 포함하고, 이 때 CRISPR 단백질은 (i) 뉴클레아제 또는 니카아제 활성을 가지거나 (ii) 모든 뉴클레아제 활성이 없도록 변형되어 비-뉴클레아제 도메인에 연결되고; 그리고 (b) 최소한 하나의 가이드 RNA 또는 최소한 하나의 가이드 RNA를 인코드하는 핵산; 이 때 최소한 하나의 융합 단백질의 CRISPR 단백질은 표적 염색체 서열에 대해 표적되고 최소한 하나의 융합 단백질의 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 최소한 하나의 융합 단백질의 표적 염색체 서열에 대한 접근이 증가되도록 뉴클레오솜 또는 염색질 구조를 변형시킴으로써, 표적된 게놈 또는 후성 변형의 효율성을 증가시키는, 방법.
38. 구체예 37에 있어서, CRISPR 단백질은 유형 II CRISPR/Cas9 단백질 또는 유형 V CRISPR/Cpf1 단백질인, 방법.
39. 구체예 37 또는 38에 있어서, 비-뉴클레아제 도메인은 시토신 탈아미노효소 활성, 히스톤 아세틸전이효소 활성, 전사 활성화 활성, 또는 전사 억제인자 활성을 가지는, 방법.
40. 구체예 37 내지 39 중 어느 한 구체예에 있어서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 고 이동성 그룹 (HMG) 박스 (HMGB) DNA 결합 도메인, HMG 뉴클레오솜-결합 (HMGN) 단백질, 히스톤 H1 변이체로부터의 중심 구형 도메인, 염색질 재형성 복합체 단백질로부터의 DNA 결합 도메인, 또는 이의 조합인, 방법.
41. 구체예 37 내지 40 중 어느 한 구체예에 있어서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 화학적 결합에 의해 직접적으로, 링커에 의해 간접적으로, 또는 이의 조합에 의해 CRISPR 단백질에 연결되는, 방법.
42. 구체예 37 내지 41 중 어느 한 구체예에 있어서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 CRISPR 단백질의 N-말단, C-말단, 및/또는 내부 위치에 연결되는, 방법.
43. 구체예 37 내지 42 중 어느 한 구체예에 있어서, 최소한 하나의 융합 단백질은 최소한 하나의 핵 위치화 신호, 최소한 하나의 세포-침투 도메인, 최소한 하나의 마커 도메인, 또는 이의 조합을 추가로 포함하는, 방법.
44. 구체예 37 내지 43 중 어느 한 구체예에 있어서, 최소한 하나의 융합 단백질을 인코드하는 핵산은 진핵 세포에서 번역을 위해 코돈 최적화되는, 방법.
45. 구체예 37 내지 44 중 어느 한 구체예에 있어서, 최소한 하나의 융합 단백질을 인코드하는 핵산은 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 또는 자가-복제 RNA의 일부인, 방법.
46. 구체예 37 내지 45 중 어느 한 구체예에 있어서, 상기 방법은 진핵 세포에 최소한 하나의 공여체 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 추가로 포함하고, 공여체 폴리뉴클레오티드는 최소한 하나의 공여체 서열을 포함하는, 방법.
47. 구체예 37 내지 46 중 어느 한 구체예에 있어서, 진핵 세포는 시험관내 존재하는, 방법.
48. 구체예 37 내지 46 중 어느 한 구체예에 있어서, 진핵 세포는 생체내 존재하는, 방법.
49. 구체예 37 내지 48 중 어느 한 구체예에 있어서, 진핵 세포는 포유동물 세포인, 방법.
50. 구체예 37 내지 48 중 어느 한 구체예에 있어서, 진핵 세포는 인간 세포인, 방법.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 해당 분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가진다. 다음 참고문헌들은 본 발명에서 사용되는 많은 용어들의 일반적인 정의를 숙련된 기술자에게 제공한다: Singleton 외., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd Ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger 외. (eds.), Springer Verlag (1991); 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). 본 출원에서 사용되는, 하기 용어들은 달리 특정한 언급이 없는 한 하기 의미들을 가진다.
본 발명 또는 바람직한 구체예(들)의 구성요소들을 소개할 때, 관사 "하나 (a, an)", "그것" 및 "상기"는 하나 이상의 구성요소들이 존재함을 의미하는 것이다. 용어 "포함하는", "비롯한" 및 "가지는"은 포함적인 의미이며 나열된 구성요소들 이외에 추가 구성요소들이 존재할 수 있음을 의미한다.
수치값과 관련하여 사용될 때 용어 "약" x는, 예를 들면 x ± 5%를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상보적인" 또는 "상보성"은 특정 수소 결합을 통한 염기 페어링에 의한 이중-가닥 핵산들의 결합을 지칭한다. 염기 페어링은 표준 왓슨-크릭 염기 페어링일 수 있다 (예컨대, 5'-A G T C-3'은 상보적 서열 3'-T C A G-5'과 쌍을 이룬다). 염기 페어링은 또한 후그스틴 또는 역 후그스틴 수소 결합 일 수 있다. 상보성은 일반적으로 이중나선 영역에 대해 측정되므로, 예를 들면, 오버행은 제외된다. 이중나선 영역의 두 개 가닥들 간의 상보성은 부분적일 수 있으며 염기들 중 일부만 (예컨대, 70%) 상보적인 경우 백분율로 표현된다 (예컨대, 70%). 상보적이지 않은 염기들은 "미스매치"된다. 상보성은 또한 이중나선 영역의 모든 염기들이 상보적인 경우 완전할 수도 있다 (즉, 100%).
본 명세서에서 사용되는 용어 "CRISPR 시스템"은 CRISPR 단백질 (즉, 뉴클레아제, 니카아제, 또는 촉매적 사멸 단백질 단백질) 및 가이드 RNA를 포함하는 복합체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "내인성 서열"은 세포에 대해 고유한 염색체 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "외인성"은 세포에 대해 고유하지 않은 서열 또는 세포의 게놈에서 그 고유 위치가 상이한 염색체 위치에 존재하는 염색체 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "유전자"는 유전자 생성물을 인코드하는 DNA 영역 (엑손과 인트론 포함), 뿐만 아니라 조절 서열들이 코딩 및/또는 전사된 서열들에 인접하는지와 관계없이 유전자 생성물의 생성을 조절하는 모든 DNA 영역을 지칭한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 터미네이터, 번역 조절 서열, 가령, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위, 인핸서, 슬라이서, 절연체, 경계 요소, 복제 원점, 기질 부착 부위 및 좌위 제어 영역을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "이종"은 관심 세포에 대해 내인성이 아닌 또는 고유하지 않은 엔터티를 지칭한다. 예를 들면, 이종 단백질은 외인성 출처, 가령, 외인적으로 도입된 핵산 서열로부터 유래한 또는 본래 유래하였던 단백질을 지칭한다. 일부 사례들에서, 이종 단백질은 관심 세포에 의하여 일반적으로 생성되지 않는다.
용어 "니카아제"는 이중-가닥 핵산 서열 중 한 가닥을 절단하는 (즉, 이중-가닥 서열을 파열시키는) 효소를 지칭한다. 예를 들면, 이중 가닥 절단 활성을 가지는 뉴클레아제는 니카아제로서 기능하여 이중-가닥 서열 중 한 가닥만을 절단하도록 하기 위한 돌연변이 및/또는 결실에 의해 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "뉴클레아제"는 이중-가닥 핵산 서열 두 가닥 모두를 절단하는 효소를 지칭한다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 선형 또는 원형 입체형태의, 그리고 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 폴리머를 지칭한다. 본 출원의 목적에서, 이들 용어들은 폴리머의 길이에 대한 제한으로 해석되어서는 안된다. 이 용어들은 자연 뉴클레오티드, 뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티 (예컨대, 포스포로티오에이트 골격)에서 변형되어 있는 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기-쌍 특이성을 가진다; 즉, A의 유사체는 T와 염기-쌍을 이루게 될 것이다.
용어 "뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드는 표준 뉴클레오티드 (즉, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 티미딘, 및 우리딘), 뉴클레오티드 이성질체, 또는 뉴클레오티드 유사체일 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 변형된 리보오스 모이어티를 가지는 뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드 유사체는 자연 발생 뉴클레오티드 (예컨대, 이노신, 수도우리딘, 등) 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드 일 수 있다. 뉴클레오티드의 당 또는 염기 모이어티에 대한 변형의 비-제한적 예들에는 아세틸 그룹, 아미노 그룹, 카르복실 그룹, 카르복시메틸 그룹, 하이드록실 그룹, 메틸 그룹, 포스포릴 그룹, 및 싸이올 그룹의 부가 (또는 제거), 뿐만 아니라 염기의 탄소 및 질소 원자들의 다른 원자들로의 치환 (예컨대, 7-데아자 퓨린)이 포함된다. 뉴클레오티드 유사체에는 또한 다이데옥시 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 잠금 핵산 (LNA), 펩티드 핵산 (PNA), 및 모르포린이 포함된다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 호환적으로 사용되어 아미노산 잔기들의 폴리머를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로그램가능한 DNA 변형 단백질"은 염색체 DNA에서 특정 표적 서열에 결합하도록 조작되고 DNA 또는 표적 서열에서 또는 표적 서열 근방에서 DNA와 결합된 단백질(들)을 변형시키는 단백질을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "서열 동일성"은, 실질적으로 동일한 길이의 두 개 서열들 간의 동일성 정도에 관한 정량적 측정치를 나타낸다. 두 개 서열들, 핵산 또는 아미노산 서열들의 동일성 퍼센트는, 두 개의 정렬된 서열들 사이의 정확한 매치수(exact matches)를 더 짧은 서열들의 길이로 나누고 100을 곱한 것이다. 핵산 서열들에 대한 대략적인 정렬은 Smith 및 Waterman의 국소적 상동성 알고리즘, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)에 의해 제공된다. 이 알고리즘은 미국 Washington, D.C.의 National Biomedical Research Foundation이 펴낸 Dayhoff, Atlas of Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358에 의해 개발되고, Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)에 의해 정규화된 점수 행렬을 사용함으로써 아미노산 서열들에 적용될 수 있다. 서열의 동일성 백분율을 결정하기 위한 이러한 알고리즘의 예시적인 실행은 "BestFit" 실용신안 출원에서 Genetics Computer Group (Madison, Wis.)에 의해 제공된다. 서열들 간의 동일성 또는 유사성 백분율을 계산하는 그 외 적합한 프로그램들은 일반적으로 해당 기술분야에 공지이며, 예를 들어, 또다른 정렬 프로그램은 기본 매개변수와 함께 사용되는 BLAST가 있다. 예를 들어, BLASTN 및 BLASTP는 다음 기본 매개변수를 사용하여 이용될 수 있다: 유전 부호=표준; 필터=없음; 가닥=모두; 컷오프=60; 기대값=10; 매트릭스=BLOSUM62; 디스크립션=50 서열들; 분류=HIGH SCORE; 데이터베이스=비다중(non-redundant), GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+ GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. 이들 프로그램들의 상세내용은 GenBank 웹사이트에서 찾을 수 있다. 일반적으로, 치환은 보존적 아미노산 치환이다: 그룹 1: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 아이소류신; 그룹 2: 세린, 시스테인, 트레오닌, 및 메티오닌; 그룹 3: 프롤린; 그룹 4: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; 그룹 5: 아스파테이트, 글루타메이트, 아스파라긴, 및 글루타민의 구성원들 내에서의 교환에 제한된다.
용어 "표적 서열", "표적 염색체 서열" 및 "표적 부위"는 호환적으로 사용되어 프로그램가능한 DNA 변형 단백질이 표적되는 염색체 DNA 내 특정 서열, 및 프로그램가능한 DNA 변형 단백질이 DNA 또는 DNA와 관련된 단백질(들)을 변형시키는 부위를 지칭한다.
핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하는 기술들은 해당 분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 기술들은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계 및/또는 이에 의해 인코드되는 아미노산 서열을 결정하는 단계, 및 이들 서열들을 제 2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 단계를 포함한다. 또한 게놈 서열들을 결정하고 이러한 방식으로 비교할 수 있다.
일반적으로, 동일성은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 상응성을 지칭한다. 둘 이상의 서열들 (폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)은 그 퍼센트 동일성을 결정함으로써 비교될 수 있다.
본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 상기 세포 및 방법들에서 다양한 변화가 이루어질 수 있으므로, 상기 상세한 설명 및 하기 제공되는 실시예에 포함된 모든 주제들은 설명적으로 해석되어야 하며 제한적 의미로 해석되어서는 안된다.
실시예
다음 실시예들은 본 발명의 특정 양상들을 설명한다. 표 1은 뉴클레오솜 상호작용 도메인의 펩티드 서열들을 나열하며 표 2는 하기 제시된 실시예 1-8에서 사용된 표적 염색체 서열들을 제시한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 1. 인간 HMGB1 박스 A 도메인을 사용한 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (SpCas9) 활성의 개선
인간 HMGB1 박스 A 도메인 (서열 번호:40)은 Cas9와 HMGB1 박스 A 도메인 사이에서 링커 LEGGGS (서열 번호:1)을 사용하여 뉴클레아제 카르복실 말단에서 SpCas9 (+NLS)와 융합되었다. 인간 K562 세포 (1 x 106)는 인간 사이토크롬 p450 산화환원효소 (POR) 좌위 내 게놈 부위 (#1)를 표적하기 위해 3 μg의 sgRNA 플라스미드와 조합된 몰 당량 (융합 단백질 및 야생형 Cas9 단백질 각각에 대해 5.2 및 5.0 μg)의 융합 단백질 또는 야생형 SpCas9 단백질을 인코드하는 플라스미드 DNA로 형질감염되었다. Amaxi 뉴클레오펙터 상에서 뉴클레오펙션을 사용하여 형질감염을 실시하였다. 형질감염 3일 후, 세포들을 DNA 추출 용액 (QuickExtract™)으로 용해시키고 표적 게놈 영역을 PCR 증폭시켰다. Cas9 뉴클레아제 표적 절단 활성 (% 삽입-결실)을 Cel-I 분석법을 사용하여 측정하였다. 표 3에서 보는 바와 같이, 뉴클레아제와 인간 HMGB1 박스 A 도메인의 융합은 표적 부위에서 SpCas9 절단 효율성을 증가시켰다.
Figure pct00006
실시예 2. 인간 HMGN1, HMGN2, HMGN3a, 및 HMGN3b를 사용한 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (SpCas9) 활성의 개선
인간 HMGN1, HMGN2, HMGN3a, 및 HMGN3b (각각 서열 번호:41-44)는 각각 Cas9와 각각의 HMGN 펩티드 사이에서 링커 LEGGGS (서열 번호:1)를 이용하여 뉴클레아제 카르복실 말단에서 SpCas9 (+NLS)와 융합되었다. 인간 K562 세포 (1 x 106)는 인간 사이토크롬 p450 산화환원효소 (POR) 좌위 내 게놈 부위 (#1)를 표적하기 위해 3 μg의 sgRNA 플라스미드와 조합된 몰 당량 (융합 단백질 및 야생형 Cas9 단백질 각각에 대해 5.2 및 5.0 μg)의 융합 단백질 또는 야생형 SpCas9 단백질 각각을 인코드하는 플라스미드 DNA로 형질감염되었다. Amaxi 뉴클레오펙터 상에서 뉴클레오펙션을 사용하여 형질감염을 실시하였다. 형질감염 3일 후, 세포들을 DNA 추출 용액 (QuickExtract™)으로 용해시키고 표적 게놈 영역을 PCR 증폭시켰다. Cas9 표적 절단 활성 (% 삽입-결실)을 Cel-I 분석법을 사용하여 측정하였다. 표 4에 요약된 결과는 각각의 인간 HMGN 펩티드와 뉴클레아제의 융합이 표적 부위에서 SpCas9 절단 효율성을 증가시켰음을 보여준다.
Figure pct00007
실시예 3. 인간 히스톤 H1 중심 구형 도메인을 사용한 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (SpCas9) 활성의 개선
인간 히스톤 H1 중심 구형 도메인 (서열 번호:45)은 Cas9와 상기 구형 도메인 사이에서 링커 LEGGGS (서열 번호:1)을 사용하여 뉴클레아제 카르복실 말단에서 SpCas9 (+NLS)와 융합되었다. 인간 K562 세포 (1 x 106)는 인간 사이토크롬 p450 산화환원효소 (POR) 좌위 내 게놈 부위 (#1)를 표적하기 위해 3 μg의 sgRNA 플라스미드와 조합된 몰 당량 (융합 단백질 및 야생형 Cas9 단백질 각각에 대해 5.2 및 5.0 μg)의 융합 단백질 또는 야생형 SpCas9 단백질을 인코드하는 플라스미드 DNA로 형질감염되었다. Amaxi 뉴클레오펙터 상에서 뉴클레오펙션을 사용하여 형질감염을 실시하였다. 형질감염 3일 후, 세포들을 DNA 추출 용액 (QuickExtract™)으로 용해시키고 표적 게놈 영역을 PCR 증폭시켰다. Cas9 표적 절단 활성 (% 삽입-결실)을 Cel-I 분석법을 사용하여 측정하였다. 결과는 표 5에 제공된다. 인간 히스톤 H1 중심 구형 도메인과 뉴클레아제의 융합은 표적 부위에서 SpCas9 절단 효율성을 증가시켰다.
Figure pct00008
실시예 4. 염색질 재형성 단백질 DNA 결합 도메인을 사용한 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (SpCas9) 활성의 개선
SpCas9 (+NLS)는 Cas9와 DNA 결합 도메인 사이에서 링커 TGSG (서열 번호:2)를 사용하여 뉴클레아제 아미노 말단에서 효모 ISWI 염색질-재형성 복합체 ATPase ISW1 (서열 번호:46)의 DNA 결합 도메인과 융합되었다. 독립적으로, 야생형 SpCas9는 Cas9와 DNA 결합 도메인 사이에서 링커 LEGGGS (서열 번호:1)를 사용하여 뉴클레아제 카르복실 말단에서 효모 크로모 도메인-내포 단백질 1 (CHD1) (서열 번호:47)의 DNA 결합 도메인과 융합되었다. 인간 K562 세포 (1 x 106)는 인간 사이토크롬 p450 산화환원효소 (POR) 좌위 내 게놈 부위 (#1)를 표적하기 위해 3 μg의 sgRNA 플라스미드와 조합된 몰 당량 (융합 단백질 및 야생형 Cas9 단백질 각각에 대해 6.0 및 5.0 μg)의 융합 단백질 또는 야생형 SpCas9 단백질 각각을 인코드하는 플라스미드 DNA로 형질감염되었다. Amaxi 뉴클레오펙터 상에서 뉴클레오펙션을 사용하여 형질감염을 실시하였다. 형질감염 3일 후, 세포들을 DNA 추출 용액 (QuickExtract™)으로 용해시키고 표적 게놈 영역을 PCR 증폭시켰다. Cas9 표적 절단 활성 (% 삽입-결실)을 Cel-I 분석법을 사용하여 측정하였다. 표 6에 요약된 결과는 각각의 DNA 결합 도메인과 뉴클레아제의 융합이 표적 부위에서 SpCas9 절단 효율성을 증가시켰음을 보여준다.
Figure pct00009
실시예 5. 뉴클레오솜 상호작용 도메인의 조합을 사용한 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (SpCas9) 활성의 개선
SpCas9 (+NLS)는 Cas9와 HMGN1 사이에서 링커 TGSG (서열 번호:2)를 이용하여 뉴클레아제 아미노 말단에서 인간 HMGN1 (서열 번호:41)과 그리고 Cas9와 각각의 단백질 도메인 사이에서 링커 LEGGGS (서열 번호:1)를 이용하여 뉴클레아제 카르복실 말단에서 인간 HMGB1 박스 A 도메인 (서열 번호:40) 또는 인간 히스톤 H1 중심 구형 도메인 (서열 번호: 45) 또는 효모 크로모 도메인-내포 단백질 1 (CHD1) DNA 결합 도메인 (서열 번호:47)과 융합되었다. 인간 K562 세포 (1 x 106)는 인간 사이토크롬 p450 산화환원효소 (POR) 좌위 내 게놈 부위 (#1, #2, #3), 또는 인간 핵 수용체 서브패밀리 1 그룹 I 구성원 3 (CAR) 좌위 내 게놈 부위 (#1), 또는 인간 엠프티 스피라클 호메오박스 1 (the human empty spiracles homeobox 1, EMX1) 좌위 내 게놈 부위 (#1, #2)를 표적하기 위하여 융합 단백질 또는 야생형 SpCas9 단백질 각각을 인코드하는 플라스미드 DNA 몰 당량 (HMGB1 박스 A 및 H1 중심 구형 도메인 융합 단백질에 대해 5.4 μg, CHD1 DNA 결합 도메인 융합 단백질에 대해 6.0 μg, 및 야생형 Cas9 단백질에 대해 5.0 μg)으로 3 μg의 sgRNA 플라스미드와 조합하여 형질감염되었다. Amaxi 뉴클레오펙터 상에서 뉴클레오펙션을 사용하여 형질감염을 실시하였다. 형질감염 5일 후, 세포들을 DNA 추출 용액 (QuickExtract™)으로 용해시키고 각 표적 게놈 영역을 PCR 증폭시켰다. Cas9 표적 절단 활성 (% 삽입-결실)을 Cel-I 분석법을 사용하여 측정하였다. 표 7에 요약된 결과는 이들 단백질 도메인과 뉴클레아제의 조합 융합이 표적 부위에서 SpCas9 절단 효율성을 증가시켰음을 보여준다.
Figure pct00010
Figure pct00011
실시예 6. 뉴클레오솜 상호작용 도메인의 조합을 사용한 스트렙토코쿠스 파스테우리아누스 Cas9 (SpaCas9) 활성의 개선
스트렙토코쿠스 파스테우리아누스 Cas9 (SpaCas9) (+NLS)는 Cas9와 HMGN1 사이에서 링커 TGSG (서열 번호:2)를 이용하여 뉴클레아제 아미노 말단에서 인간 HMGN1 (서열 번호:41)과 그리고 Cas9와 각각의 단백질 도메인 사이에서 링커 LEGGGS (서열 번호:1)를 이용하여 뉴클레아제 카르복실 말단에서 인간 HMGB1 박스 A 도메인 (서열 번호:41) 또는 인간 히스톤 H1 중심 구형 도메인 (서열 번호: 45) 또는 효모 크로모 도메인-내포 단백질 1 (CHD1) DNA 결합 도메인 (서열 번호:47)과 융합되었다. 인간 K562 세포 (1 x 106)는 인간 사이토크롬 p450 산화환원효소 (POR) 좌위 내 게놈 부위 (#1, #2)를 표적하기 위해 융합 단백질 또는 야생형 SpaCas9 단백질 각각을 인코드하는 플라스미드 DNA 몰 당량 (융합 단백질 및 야생형 Cas9 단백질 각각에 대해 5.4 및 5.0 μg)으로 3 μg의 sgRNA 플라스미드와 조합하여 형질감염되었다. Amaxi 뉴클레오펙터 상에서 뉴클레오펙션을 사용하여 형질감염을 실시하였다. 형질감염 3일 후, 세포들을 DNA 추출 용액 (QuickExtract?)으로 용해시키고 표적 게놈 영역을 PCR 증폭시켰다. Cas9 표적 절단 활성 (% 삽입-결실)을 Cel-I 분석법을 사용하여 측정하였다. 표 8에 요약한 바와 같이, 이들 단백질 도메인과 뉴클레아제의 조합 융합은 표적 부위에서 SpaCas9 절단 효율성을 증가시켰다.
Figure pct00012
실시예 7. 뉴클레오솜 상호작용 도메인의 조합을 사용한 프란시셀라 노비시다 Cpf1 (FnCpf1) 활성의 개선
프란시셀라 노비시다 Cpf1 (FnCpf1) (+NLS)는 Cpf1과 HMGN1 사이에서 링커 TGSG (서열 번호:2)를 이용하여 뉴클레아제 아미노 말단에서 인간 HMGN1 (서열 번호:41)과 그리고 Cpf1과 각각의 단백질 도메인 사이에서 링커 LEGGGS (서열 번호:1)를 이용하여 뉴클레아제 카르복실 말단에서 인간 HMGB1 박스 A 도메인 (서열 번호:40) 또는 인간 히스톤 H1 중심 구형 도메인 (서열 번호: 45) 또는 효모 크로모 도메인-내포 단백질 1 (CHD1) DNA 결합 도메인 (서열 번호:47)과 융합되었다. 인간 K562 세포 (1 x 106)는 인간 사이토크롬 p450 산화환원효소 (POR) 좌위 내 게놈 부위 (#1, #2)를 표적하기 위해 융합 단백질 또는 야생형 FnCpf1 단백질 각각을 인코드하는 플라스미드 DNA 몰 당량 (융합 단백질 및 야생형 Cas9 단백질 각각에 대해 5.4 및 5.0 μg)으로 3 μg의 sgRNA 플라스미드와 조합하여 형질감염되었다. Amaxi 뉴클레오펙터 상에서 뉴클레오펙션을 사용하여 형질감염을 실시하였다. 형질감염 3일 후, 세포들을 DNA 추출 용액 (QuickExtract?)으로 용해시키고 표적 게놈 영역을 PCR 증폭시켰다. Cas9 표적 절단 활성 (% 삽입-결실)을 Cel-I 분석법을 사용하여 측정하였다. 표 9 요약된 결과는 이들 단백질 도메인과 뉴클레아제의 조합 융합이 표적 부위에 대한 FnCpf1 절단 효율성을 증가시켰음을 보여준다.
Figure pct00013
실시예 8. 캄필로박터 제주니 Cas9 (CjCas9) 유전자 편집 효율성의 개선
캄필로박터 제주니 Cas9 (CjCas9) (+NLS)는 Cas9와 HMGN1 사이에서 링커 TGSG (서열 번호:2)를 이용하여 뉴클레아제 아미노 말단에서 인간 HMGN1 (서열 번호:41)과 그리고 Cas9와 각각의 단백질 도메인 사이에서 링커 LEGGGS (서열 번호:1)를 이용하여 뉴클레아제 카르복실 말단에서 인간 HMGB1 박스 A 도메인 (서열 번호:40) 또는 인간 히스톤 H1 중심 구형 도메인 (서열 번호: 45)과 융합되었다. 야생형 CjCas9 gRNA는 crRNA 불변 반복 영역에 U->C 돌연변이를 그리고 tracrRNA 서열의 5' 영역에 상응하는 A->G 돌연변이를 도입시킴으로써 변형되었다. 변형된 sgRNA 서열은 다음과 같으며: 5'- NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUCUAGUCCCUGAAAAGGGACUAGAAUAAAGAGUUUGCGGGACUCUGCGGGGUUACAAUCCCCUAAAACCGCUUUU-3', 이 때 crRNA 및 tracrRNA 모이어티에서 돌연변이된 뉴클레오티드들은 밑줄표시된다. 인간 사이토크롬 p450 산화환원효소 유전자 (POR) 내 두 개의 상이한 부위들 (#1, #2)을 표적하는 가이드 서열들을 각각 야생형 및 변형된 CjCas9 sgRNA 스캐폴드에 클로닝하였다. sgRNAs의 발현은 U6 프로모터의 제어하에 있었다. 인간 K562 세포 (1x 106)들을 4 μg의 CjCas9 플라스미드 DNA 및 3 μg의 sgRNA 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. Amaxi 뉴클레오펙터 상에서 뉴클레오펙션을 사용하여 형질감염을 실시하였다. 형질감염 3일 후, 세포들을 QuickExtract으로 용해시키고 표적된 게놈 영역들을 PCR 증폭시켰다. CjCas9 표적 DNA 절단 활성 (% 삽입-결실)을 Cel-I 분석법을 사용하여 측정하였다. 결과가 도 1에 제시되며 융합 단백질은 표적 부위들에 대한 절단 효율성을 증가시켰고, 변형된 CjCas9 sgRNA 스캐폴드는 표적 부위들에 대한 CjCas9 절단 효율성을 효과적으로 증가시켰음을 보여준다.
표 10은 특정 융합 단백질들에 대한 아미노산 서열들을 제시한다. 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 볼드체로 나타내며, 링커는 이탤릭체로 나타내고, NLS는 밑줄표시된다.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
SEQUENCE LISTING <110> SIGMA-ALDRICH CO. LLC <120> USING NUCLEOSOME INTERACTING PROTEIN DOMAINS TO ENHANCE TARGETED GENOME MODIFICATION <130> 047497-599979 <150> US 62/531,222 <151> 2017-07-11 <160> 79 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 1 Leu Glu Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 2 Thr Gly Ser Gly 1 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 3 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(20) <223> can be either absent or present <400> 4 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(8) <223> can be either absent or present) <400> 5 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 6 <211> 20 <212> 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Gly Phe 305 310 315 320 Ser Phe Ser Lys Lys Phe Glu Glu Glu Val Leu Ser Val Ala Phe Tyr 325 330 335 Lys Arg Ala Leu Lys Asp Phe Ser His Leu Val Gly Asn Cys Ser Phe 340 345 350 Phe Thr Asp Glu Lys Arg Ala Pro Lys Asn Ser Pro Leu Ala Phe Met 355 360 365 Phe Val Ala Leu Thr Arg Ile Ile Asn Leu Leu Asn Asn Leu Lys Asn 370 375 380 Thr Glu Gly Ile Leu Tyr Thr Lys Asp Asp Leu Asn Ala Leu Leu Asn 385 390 395 400 Glu Val Leu Lys Asn Gly Thr Leu Thr Tyr Lys Gln Thr Lys Lys Leu 405 410 415 Leu Gly Leu Ser Asp Asp Tyr Glu Phe Lys Gly Glu Lys Gly Thr Tyr 420 425 430 Phe Ile Glu Phe Lys Lys Tyr Lys Glu Phe Ile Lys Ala Leu Gly Glu 435 440 445 His Asn Leu Ser Gln Asp Asp Leu Asn Glu Ile Ala Lys Asp Ile Thr 450 455 460 Leu Ile Lys Asp Glu Ile Lys Leu Lys Lys Ala Leu Ala Lys Tyr Asp 465 470 475 480 Leu Asn Gln Asn Gln Ile Asp Ser Leu Ser Lys Leu Glu Phe Lys Asp 485 490 495 His Leu Asn Ile Ser Phe Lys Ala Leu Lys Leu Val Thr Pro Leu Met 500 505 510 Leu Glu Gly Lys Lys Tyr Asp Glu Ala Cys Asn Glu Leu Asn Leu Lys 515 520 525 Val Ala Ile Asn Glu Asp Lys Lys Asp Phe Leu Pro Ala Phe Asn Glu 530 535 540 Thr Tyr Tyr Lys Asp Glu Val Thr Asn Pro Val Val Leu Arg Ala Ile 545 550 555 560 Lys Glu Tyr Arg Lys Val Leu Asn Ala Leu Leu Lys Lys Tyr Gly Lys 565 570 575 Val His Lys Ile Asn Ile Glu Leu Ala Arg Glu Val Gly Lys Asn His 580 585 590 Ser Gln Arg Ala Lys Ile Glu Lys Glu Gln Asn Glu Asn Tyr Lys Ala 595 600 605 Lys Lys Asp Ala Glu Leu Glu Cys Glu Lys Leu Gly Leu Lys Ile Asn 610 615 620 Ser Lys Asn Ile Leu Lys Leu Arg Leu Phe Lys Glu Gln Lys Glu Phe 625 630 635 640 Cys Ala Tyr Ser Gly Glu Lys Ile Lys Ile Ser Asp Leu Gln Asp Glu 645 650 655 Lys Met Leu Glu Ile Asp His Ile Tyr Pro Tyr Ser Arg Ser Phe Asp 660 665 670 Asp Ser Tyr Met Asn Lys Val Leu Val Phe Thr Lys Gln Asn Gln Glu 675 680 685 Lys Leu Asn Gln Thr Pro Phe Glu Ala Phe Gly Asn Asp Ser Ala Lys 690 695 700 Trp Gln Lys Ile Glu Val Leu Ala Lys Asn Leu Pro Thr Lys Lys Gln 705 710 715 720 Lys Arg Ile Leu Asp Lys Asn Tyr Lys Asp Lys Glu Gln Lys Asn Phe 725 730 735 Lys Asp Arg Asn Leu Asn Asp Thr Arg Tyr Ile Ala Arg Leu Val Leu 740 745 750 Asn Tyr Thr Lys Asp Tyr Leu Asp Phe Leu Pro Leu Ser Asp Asp Glu 755 760 765 Asn Thr Lys Leu Asn Asp Thr Gln Lys Gly Ser Lys Val His Val Glu 770 775 780 Ala Lys Ser Gly Met Leu Thr Ser Ala Leu Arg His Thr Trp Gly Phe 785 790 795 800 Ser Ala Lys Asp Arg Asn Asn His Leu His His Ala Ile Asp Ala Val 805 810 815 Ile Ile Ala Tyr Ala Asn Asn Ser Ile Val Lys Ala Phe Ser Asp Phe 820 825 830 Lys Lys Glu Gln Glu Ser Asn Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Lys Lys Ile 835 840 845 Ser Glu Leu Asp Tyr Lys Asn Lys Arg Lys Phe Phe Glu Pro Phe Ser 850 855 860 Gly Phe Arg Gln Lys Val Leu Asp Lys Ile Asp Glu Ile Phe Val Ser 865 870 875 880 Lys Pro Glu Arg Lys Lys Pro Ser Gly Ala Leu His Glu Glu Thr Phe 885 890 895 Arg Lys Glu Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Tyr Gly Gly Lys Glu Gly Val 900 905 910 Leu Lys Ala Leu Glu Leu Gly Lys Ile Arg Lys Val Asn Gly Lys Ile 915 920 925 Val Lys Asn Gly Asp Met Phe Arg Val Asp Ile Phe Lys His Lys Lys 930 935 940 Thr Asn Lys Phe Tyr Ala Val Pro Ile Tyr Thr Met Asp Phe Ala Leu 945 950 955 960 Lys Val Leu Pro Asn Lys Ala Val Ala Arg Ser Lys Lys Gly Glu Ile 965 970 975 Lys Asp Trp Ile Leu Met Asp Glu Asn Tyr Glu Phe Cys Phe Ser Leu 980 985 990 Tyr Lys Asp Ser Leu Ile Leu Ile Gln Thr Lys Asp Met Gln Glu Pro 995 1000 1005 Glu Phe Val Tyr Tyr Asn Ala Phe Thr Ser Ser Thr Val Ser Leu 1010 1015 1020 Ile Val Ser Lys His Asp Asn Lys Phe Glu Thr Leu Ser Lys Asn 1025 1030 1035 Gln Lys Ile Leu Phe Lys Asn Ala Asn Glu Lys Glu Val Ile Ala 1040 1045 1050 Lys Ser Ile Gly Ile Gln Asn Leu Lys Val Phe Glu Lys Tyr Ile 1055 1060 1065 Val Ser Ala Leu Gly Glu Val Thr Lys Ala Glu Phe Arg Gln Arg 1070 1075 1080 Glu Asp Phe Lys Lys Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Leu Glu Gly 1085 1090 1095 Gly Gly Gly Ser Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys 1100 1105 1110 Met Ser Ser Tyr Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His 1115 1120 1125 Lys Lys Lys His Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser 1130 1135 1140 Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys 1145 1150 1155 Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu 1160 1165 1170 Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro Pro Lys Gly Glu 1175 1180 1185 <210> 79 <211> 1182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 79 Met Pro Lys Arg Lys Val Ser Ser Ala Glu Gly Ala Ala Lys Glu Glu 1 5 10 15 Pro Lys Arg Arg Ser Ala Arg Leu Ser Ala Lys Pro Pro Ala Lys Val 20 25 30 Glu Ala Lys Pro Lys Lys Ala Ala Ala Lys Asp Lys Ser Ser Asp Lys 35 40 45 Lys Val Gln Thr Lys Gly Lys Arg Gly Ala Lys Gly Lys Gln Ala Glu 50 55 60 Val Ala Asn Gln Glu Thr Lys Glu Asp Leu Pro Ala Glu Asn Gly Glu 65 70 75 80 Thr Lys Thr Glu Glu Ser Pro Ala Ser Asp Glu Ala Gly Glu Lys Glu 85 90 95 Ala Lys Ser Asp Thr Gly Ser Gly Met Ala Arg Ile Leu Ala Phe Asp 100 105 110 Ile Gly Ile Ser Ser Ile Gly Trp Ala Phe Ser Glu Asn Asp Glu Leu 115 120 125 Lys Asp Cys Gly Val Arg Ile Phe Thr Lys Val Glu Asn Pro Lys Thr 130 135 140 Gly Glu Ser Leu Ala Leu Pro Arg Arg Leu Ala Arg Ser Ala Arg Lys 145 150 155 160 Arg Leu Ala Arg Arg Lys Ala Arg Leu Asn His Leu Lys His Leu Ile 165 170 175 Ala Asn Glu Phe Lys Leu Asn Tyr Glu Asp Tyr Gln Ser Phe Asp Glu 180 185 190 Ser Leu Ala Lys Ala Tyr Lys Gly Ser Leu Ile Ser Pro Tyr Glu Leu 195 200 205 Arg Phe Arg Ala Leu Asn Glu Leu Leu Ser Lys Gln Asp Phe Ala Arg 210 215 220 Val Ile Leu His Ile Ala Lys Arg Arg Gly Tyr Asp Asp Ile Lys Asn 225 230 235 240 Ser Asp Asp Lys Glu Lys Gly Ala Ile Leu Lys Ala Ile Lys Gln Asn 245 250 255 Glu Glu Lys Leu Ala Asn Tyr Gln Ser Val Gly Glu Tyr Leu Tyr Lys 260 265 270 Glu Tyr Phe Gln Lys Phe Lys Glu Asn Ser Lys Glu Phe Thr Asn Val 275 280 285 Arg Asn Lys Lys Glu Ser Tyr Glu Arg Cys Ile Ala Gln Ser Phe Leu 290 295 300 Lys Asp Glu Leu Lys Leu Ile Phe Lys Lys Gln Arg Glu Phe Gly Phe 305 310 315 320 Ser Phe Ser Lys Lys Phe Glu Glu Glu Val Leu Ser Val Ala Phe Tyr 325 330 335 Lys Arg Ala Leu Lys Asp Phe Ser His Leu Val Gly Asn Cys Ser Phe 340 345 350 Phe Thr Asp Glu Lys Arg Ala Pro Lys Asn Ser Pro Leu Ala Phe Met 355 360 365 Phe Val Ala Leu Thr Arg Ile Ile Asn Leu Leu Asn Asn Leu Lys Asn 370 375 380 Thr Glu Gly Ile Leu Tyr Thr Lys Asp Asp Leu Asn Ala Leu Leu Asn 385 390 395 400 Glu Val Leu Lys Asn Gly Thr Leu Thr Tyr Lys Gln Thr Lys Lys Leu 405 410 415 Leu Gly Leu Ser Asp Asp Tyr Glu Phe Lys Gly Glu Lys Gly Thr Tyr 420 425 430 Phe Ile Glu Phe Lys Lys Tyr Lys Glu Phe Ile Lys Ala Leu Gly Glu 435 440 445 His Asn Leu Ser Gln Asp Asp Leu Asn Glu Ile Ala Lys Asp Ile Thr 450 455 460 Leu Ile Lys Asp Glu Ile Lys Leu Lys Lys Ala Leu Ala Lys Tyr Asp 465 470 475 480 Leu Asn Gln Asn Gln Ile Asp Ser Leu Ser Lys Leu Glu Phe Lys Asp 485 490 495 His Leu Asn Ile Ser Phe Lys Ala Leu Lys Leu Val Thr Pro Leu Met 500 505 510 Leu Glu Gly Lys Lys Tyr Asp Glu Ala Cys Asn Glu Leu Asn Leu Lys 515 520 525 Val Ala Ile Asn Glu Asp Lys Lys Asp Phe Leu Pro Ala Phe Asn Glu 530 535 540 Thr Tyr Tyr Lys Asp Glu Val Thr Asn Pro Val Val Leu Arg Ala Ile 545 550 555 560 Lys Glu Tyr Arg Lys Val Leu Asn Ala Leu Leu Lys Lys Tyr Gly Lys 565 570 575 Val His Lys Ile Asn Ile Glu Leu Ala Arg Glu Val Gly Lys Asn His 580 585 590 Ser Gln Arg Ala Lys Ile Glu Lys Glu Gln Asn Glu Asn Tyr Lys Ala 595 600 605 Lys Lys Asp Ala Glu Leu Glu Cys Glu Lys Leu Gly Leu Lys Ile Asn 610 615 620 Ser Lys Asn Ile Leu Lys Leu Arg Leu Phe Lys Glu Gln Lys Glu Phe 625 630 635 640 Cys Ala Tyr Ser Gly Glu Lys Ile Lys Ile Ser Asp Leu Gln Asp Glu 645 650 655 Lys Met Leu Glu Ile Asp His Ile Tyr Pro Tyr Ser Arg Ser Phe Asp 660 665 670 Asp Ser Tyr Met Asn Lys Val Leu Val Phe Thr Lys Gln Asn Gln Glu 675 680 685 Lys Leu Asn Gln Thr Pro Phe Glu Ala Phe Gly Asn Asp Ser Ala Lys 690 695 700 Trp Gln Lys Ile Glu Val Leu Ala Lys Asn Leu Pro Thr Lys Lys Gln 705 710 715 720 Lys Arg Ile Leu Asp Lys Asn Tyr Lys Asp Lys Glu Gln Lys Asn Phe 725 730 735 Lys Asp Arg Asn Leu Asn Asp Thr Arg Tyr Ile Ala Arg Leu Val Leu 740 745 750 Asn Tyr Thr Lys Asp Tyr Leu Asp Phe Leu Pro Leu Ser Asp Asp Glu 755 760 765 Asn Thr Lys Leu Asn Asp Thr Gln Lys Gly Ser Lys Val His Val Glu 770 775 780 Ala Lys Ser Gly Met Leu Thr Ser Ala Leu Arg His Thr Trp Gly Phe 785 790 795 800 Ser Ala Lys Asp Arg Asn Asn His Leu His His Ala Ile Asp Ala Val 805 810 815 Ile Ile Ala Tyr Ala Asn Asn Ser Ile Val Lys Ala Phe Ser Asp Phe 820 825 830 Lys Lys Glu Gln Glu Ser Asn Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Lys Lys Ile 835 840 845 Ser Glu Leu Asp Tyr Lys Asn Lys Arg Lys Phe Phe Glu Pro Phe Ser 850 855 860 Gly Phe Arg Gln Lys Val Leu Asp Lys Ile Asp Glu Ile Phe Val Ser 865 870 875 880 Lys Pro Glu Arg Lys Lys Pro Ser Gly Ala Leu His Glu Glu Thr Phe 885 890 895 Arg Lys Glu Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Tyr Gly Gly Lys Glu Gly Val 900 905 910 Leu Lys Ala Leu Glu Leu Gly Lys Ile Arg Lys Val Asn Gly Lys Ile 915 920 925 Val Lys Asn Gly Asp Met Phe Arg Val Asp Ile Phe Lys His Lys Lys 930 935 940 Thr Asn Lys Phe Tyr Ala Val Pro Ile Tyr Thr Met Asp Phe Ala Leu 945 950 955 960 Lys Val Leu Pro Asn Lys Ala Val Ala Arg Ser Lys Lys Gly Glu Ile 965 970 975 Lys Asp Trp Ile Leu Met Asp Glu Asn Tyr Glu Phe Cys Phe Ser Leu 980 985 990 Tyr Lys Asp Ser Leu Ile Leu Ile Gln Thr Lys Asp Met Gln Glu Pro 995 1000 1005 Glu Phe Val Tyr Tyr Asn Ala Phe Thr Ser Ser Thr Val Ser Leu 1010 1015 1020 Ile Val Ser Lys His Asp Asn Lys Phe Glu Thr Leu Ser Lys Asn 1025 1030 1035 Gln Lys Ile Leu Phe Lys Asn Ala Asn Glu Lys Glu Val Ile Ala 1040 1045 1050 Lys Ser Ile Gly Ile Gln Asn Leu Lys Val Phe Glu Lys Tyr Ile 1055 1060 1065 Val Ser Ala Leu Gly Glu Val Thr Lys Ala Glu Phe Arg Gln Arg 1070 1075 1080 Glu Asp Phe Lys Lys Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Leu Glu Gly 1085 1090 1095 Gly Gly Gly Ser Ser Thr Asp His Pro Lys Tyr Ser Asp Met Ile 1100 1105 1110 Val Ala Ala Ile Gln Ala Glu Lys Asn Arg Ala Gly Ser Ser Arg 1115 1120 1125 Gln Ser Ile Gln Lys Tyr Ile Lys Ser His Tyr Lys Val Gly Glu 1130 1135 1140 Asn Ala Asp Ser Gln Ile Lys Leu Ser Ile Lys Arg Leu Val Thr 1145 1150 1155 Thr Gly Val Leu Lys Gln Thr Lys Gly Val Gly Ala Ser Gly Ser 1160 1165 1170 Phe Arg Leu Ala Lys Ser Asp Glu Pro 1175 1180

Claims (36)

  1. 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 연결된 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질.
  2. 청구항 1에 있어서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 HMGB1, HMGB2, 또는 HMGB3에서 선택된 고 이동성 그룹 (HMG) 박스 (HMGB) 단백질; HMGN1, HMGN2, HMGN3a, HMGN3b, HMGN4, 또는 HMGN5에서 선택된 HMG 뉴클레오솜-결합 (HMGN) 단백질로부터의 DNA 결합 도메인; 히스톤 H1 변이체로부터의 중심 구형 도메인; 스위치/수크로스 비-발효성 (SWI/SNF) 복합체, 모방 스위치 (ISWI) 복합체, 크로모도메인-헬리케이스-DNA 결합 (CHD) 복합체, 뉴클레오솜 재형성 및 탈아세틸화효소 (NuRD) 복합체, INO80 복합체, SWR1 복합체, RSC 복합체, 또는 이의 조합에서 선택된 염색질 재형성 복합체 단백질로부터의 DNA 결합 도메인인 융합 단백질.
  3. 청구항 2에 있어서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 HMGB1 박스 A 도메인, HMGN1 단백질, HMGN2 단백질, HMGN3a 단백질, HMGN3b 단백질, 히스톤 H1 중심 구형 도메인, ISWI 단백질 DNA 결합 도메인, CHD1 단백질 DNA 결합 도메인, 또는 이의 조합인 융합 단백질.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 뉴클레아제 활성을 가지는, 융합 단백질.
  5. 청구항 4에 있어서, 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 클러스터된 규칙적으로 산재된 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 뉴클레아제 또는 니카아제, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 메가뉴클레아제, 또는 뉴클레아제 도메인에 연결된 프로그램가능한 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질인, 융합 단백질.
  6. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 청구항에 있어서, 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 비-뉴클레아제 활성을 가지는, 융합 단백질.
  7. 청구항 6에 있어서, 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 비-뉴클레아제 도메인에 연결된 프로그램가능한 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질인, 융합 단백질.
  8. 청구항 7에 있어서, 프로그램가능한 DNA 결합 도메인은 모든 뉴클레아제 활성이 없도록 변형된 CRISPR 단백질, 징크 핑거 단백질, 또는 전사 활성화제-유사 이펙터인, 융합 단백질.
  9. 청구항 7에 있어서, 비-뉴클레아제 도메인은 아세틸전이효소 활성, 탈아세틸화효소 활성, 메틸전이효소 활성, 탈메틸화효소 활성, 키나아제 활성, 인산분해효소 활성, 유비퀴틴 연결효소 활성, 탈유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, 수모화 활성, 탈수모화 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성, 탈미리스토일화 활성, 시트룰린화 활성, 헬리케이스 활성, 아미노화 활성, 탈아미노화 활성, 알킬화 활성, 탈알킬화 활성, 산화 활성, 전사 활성화 활성, 또는 전사 억제인자 활성을 가지는, 융합 단백질.
  10. 청구항 9에 있어서, 비-뉴클레아제 도메인은 시토신 탈아미노효소 활성, 히스톤 아세틸전이효소 활성, 전사 활성화 활성, 또는 전사 억제인자 활성을 가지는, 융합 단백질.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 화학적 결합에 의해 직접적으로, 링커에 의해 간접적으로, 또는 이의 조합에 의해 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 연결되는, 융합 단백질.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 그 N-말단, C-말단, 내부 위치, 또는 이의 조합에서 프로그램가능한 DNA 변형 단백질에 연결되는, 융합 단백질.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 최소한 하나의 핵 위치화 신호, 최소한 하나의 세포-침투 도메인, 최소한 하나의 마커 도메인, 또는 이의 조합을 추가로 포함하는, 융합 단백질.
  14. 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인에 연결된 클러스터된 규칙적으로 산재된 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 단백질을 포함하는 융합 단백질.
  15. 청구항 14에 있어서, CRISPR 단백질은 유형 II CRISPR/Cas9 뉴클레아제 또는 니카아제이거나, 또는 CRISPR 단백질은 유형 V CRISPR/Cpf1 뉴클레아제 또는 니카아제인 융합 단백질.
  16. 청구항 14 또는 15에 있어서, CRISPR 단백질은 모든 뉴클레아제 활성이 없도록 변형되고 비-뉴클레아제 도메인에 연결된 유형 II CRISPR/Cas9 단백질이거나, 또는 모든 뉴클레아제 활성이 없도록 변형되고 비-뉴클레아제 도메인에 연결된 유형 V CRISPR/Cpf1 단백질인, 융합 단백질.
  17. 청구항 16에 있어서, 비-뉴클레아제 도메인은 시토신 탈아미노효소 활성, 히스톤 아세틸전이효소 활성, 전사 활성화 활성, 또는 전사 억제인자 활성을 가지는, 융합 단백질.
  18. 청구항 14 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 고 이동성 그룹 (HMG) 박스 (HMGB) DNA 결합 도메인, HMG 뉴클레오솜-결합 (HMGN) 단백질, 히스톤 H1 변이체로부터의 중심 구형 도메인, 염색질 재형성 복합체 단백질로부터의 DNA 결합 도메인, 또는 이의 조합인, 융합 단백질.
  19. 청구항 18에 있어서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 HMGB1 박스 A 도메인, HMGN1 단백질, HMGN2 단백질, HMGN3a 단백질, HMGN3b 단백질, 히스톤 H1 중심 구형 도메인, 모방 스위치 (ISWI) 단백질 DNA 결합 도메인, 크로모도메인-헬리케이스-DNA 단백질 1 (CHD1) DNA 결합 도메인, 또는 이의 조합인, 융합 단백질.
  20. 청구항 14 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 화학적 결합에 의해 직접적으로, 링커에 의해 간접적으로, 또는 이의 조합에 의해 CRISPR 단백질에 연결되는, 융합 단백질.
  21. 청구항 14 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 그 N-말단, C-말단, 내부 위치, 또는 이의 조합에서 CRISPR 단백질에 연결되는, 융합 단백질.
  22. 청구항 14 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 최소한 하나의 핵 위치화 신호, 최소한 하나의 세포-침투 도메인, 최소한 하나의 마커 도메인, 또는 이의 조합을 추가로 포함하는, 융합 단백질.
  23. 청구항 14 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR 단백질은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 (SpCas9), 스트렙토코쿠스 써모필루스 Cas9 (StCas9), 스트렙토코쿠스 파스테우리아누스 (SpaCas9), 캄필로박터 제주니 Cas9 (CjCas9), 스타필로코쿠스 아우레우스 (SaCas9), 프란시셀라 노비시다 Cas9 (FnCas9), 나이세리아 시네레아 Cas9 (NcCas9), 나이세리아 메닌지티스 Cas9 (NmCas9), 프란시셀라 노비시다 Cpf1 (FnCpf1), 아시다미노코쿠스 속 Cpf1 (AsCpf1), 또는 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006 Cpf1 (LbCpf1)인, 융합 단백질.
  24. 청구항 14 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열 번호:61, 서열 번호:62, 서열 번호:63, 서열 번호:64, 서열 번호:65, 서열 번호:66, 서열 번호:67, 서열 번호:68, 서열 번호:69, 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:72, 서열 번호:73, 서열 번호:74, 서열 번호:75, 서열 번호:76, 서열 번호:77, 서열 번호:78, 또는 서열 번호:79와 최소한 약 90% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는, 융합 단백질.
  25. 청구항 14 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열 번호:61, 서열 번호:62, 서열 번호:63, 서열 번호:64, 서열 번호:65, 서열 번호:66, 서열 번호:67, 서열 번호:68, 서열 번호:69, 서열 번호:70, 서열 번호:71, 서열 번호:72, 서열 번호:73, 서열 번호:74, 서열 번호:75, 서열 번호:76, 서열 번호:77, 서열 번호:78, 또는 서열 번호:79에 제시된 아미노산 서열을 가지는, 융합 단백질.
  26. 청구항 14 내지 25 중 어느 한 항의 최소한 하나의 융합 단백질 및 최소한 하나의 가이드 RNA를 포함하는 복합체.
  27. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항의 융합 단백질을 인코드하는 핵산.
  28. 청구항 27에 있어서, 진핵 세포에서의 번역을 위해 코돈 최적화된, 융합 단백질.
  29. 청구항 27 또는 28에 있어서, 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 또는 자가-복제 RNA의 일부인, 융합 단백질.
  30. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 제시된 최소한 하나의 융합 단백질, 또는 청구항 27 내지 29 중 어느 한 항에 제시된 최소한 하나의 융합 단백질을 인코드하는 핵산을 진핵 세포에 도입시키는 단계를 포함하는, 진핵 세포에서 표적된 게놈 또는 후성 변형 효율성의 증가 방법으로서, 최소한 하나의 융합 단백질의 프로그램가능한 DNA 변형 단백질은 표적 염색체 서열에 대해 표적되고 최소한 하나의 융합 단백질의 최소한 하나의 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인은 최소한 하나의 융합 단백질의 표적 염색체 서열에 대한 접근이 증가되도록 뉴클레오솜 또는 염색질 구조를 변형시킴으로써, 표적된 게놈 또는 후성 변형 효율성을 증가시키는, 방법.
  31. 청구항 30에 있어서, 최소한 하나의 융합 단백질의 DNA 변형 단백질은 CRISPR 단백질을 포함하고 상기 방법은 최소한 하나의 가이드 RNA 또는 최소한 하나의 가이드 RNA를 인코드하는 핵산을 진핵 세포에 도입시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  32. 청구항 30 또는 31에 있어서, 상기 방법은 진핵 세포에 최소한 하나의 공여체 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 추가로 포함하고, 공여체 폴리뉴클레오티드는 최소한 하나의 공여체 서열을 포함하는, 방법.
  33. 청구항 30 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 진핵 세포는 시험관내 존재하는, 방법.
  34. 청구항 30 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 진핵 세포는 생체내 존재하는, 방법.
  35. 청구항 30 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 진핵 세포는 포유동물 세포인, 방법.
  36. 청구항 30 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 진핵 세포는 인간 세포인, 방법.
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