CN114507689B - 一种提高真核生物基因编辑效率的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高真核生物基因编辑效率的方法及其应用，属于生物技术领域。本发明系统地研究了染色质可及性如何影响哺乳动物细胞中CRISPR/Cas9的基因组编辑效率，通过将Cas9与转录激活域融合来提高Cas9的基因组编辑效率。此外，本发明使用YF‑2增加染色质的可及性，YF‑2是一种高度选择性的HAT激活剂，具有针对CBP、PCAF和GCN5的活性。通过研究证明，使用HAT激活剂可以在不增加相对脱靶效应的情况下进一步提高Cas9‑VP64的基因组编辑活性。本发明为提高CRISPR/Cas9基因组编辑活性提供了一种新的策略，并使在真核生物中选择更广泛的gRNA靶标成为可能。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高真核生物基因编辑效率的方法及其应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
RNA引导的CRISPR/Cas9核酸酶系统已成为基因组编辑研究的首选，在生物技术和临床应用方面具有广阔前景。然而当CRISPR/Cas9在真核生物中使用时，在不同的靶点甚至在不同细胞类型的相同靶点上表现出差异很大的编辑效率。由于在所有用途中研究人员总是期待效率更高的gRNA靶点，因此揭示参与定义gRNA活性的因素将有助于研究人员挑选出高活性的gRNA靶点，并有助于研究人员开发提高基因组编辑效率的策略。
最初在一系列gRNA靶点上进行CRISPR/Cas9活性的大规模筛选以确定决定编辑效率的因素，揭示了优化靶点活性的几个关键作用，主要和gRNA序列及周围位置的核苷酸偏好有关。鸟嘌呤排在PAM序列5’段上游，鸟嘌呤富集，腺嘌呤耗尽，避免polyT也值得注意。然而大多数基于核苷酸偏好的模型在独立数据集上预测gRNA靶点活性的准确性并不一致。
在真核生物中，基因组DNA紧密包裹着组蛋白形成一个称为核小体的结构。核小体通过进一步组织和压缩形成染色质的高级结构。最新的证据表明染色质结构可能会通过阻碍核酸酶的可及性而影响CRISPR/Cas系统的基因组编辑作用。ChIP-seq分析显示dCas9脱靶结合的全基因组图谱在开放染色质区段中富集。此外对gRNA活性的高通量评估显示基因组编辑效率通常与染色质的可及性相关，将染色质可及性信息结合起来可以得到更准确的gRNA活性预测算法。越来越多的研究进一步证实染色质可及性是一个决定gRNA活性的关键因素。核小体结构可以在体外和体内抑制RGN结合和切割DNA，核小体的呼吸和染色质重塑酶的应用如ISWI-家族SNF2h，酵母染色质重塑酶RSC和Chd1允许Cas9更有效地作用于染色质。最近CHANGE-seq揭示了Cas9在开放的染色质或活跃的启动子、增强子或转录区域具有更高的基因组编辑活性。然而仍然需要更多的证据来阐明染色质可及性在哺乳动物细胞中对Cas9基因组编辑效率的影响。
已经报道了一些策略通过调节染色质的可及性来提高基因组编辑效率。proxy-CRISPR方法通过将催化失活的dCas9定位到靶点近端位置，恢复了FnCas9、CjCas9、NcCas9和FnCpf1在异染色质区域靶点的编辑活性。但这种策略不适用于Cas9难以结合的靶点，并且需要两种CRISPR/Cas系统共同表达，这为体内递送基因带来了很大的挑战。CRISPR-chrom方法将Cas9及衍生物与一系列染色质调节肽(CMP)融合在一起，成功地提高了Cas9的编辑效率特别是在异染色质区域。值得注意的是CMP是内源性蛋白质，它与染色质普遍相互作用并且没有序列特异性，应充分评估该策略的负面影响以及脱靶效应。最近一种策略是Cas9-TV与dsgRNA结合的方式在水稻中促进了Cas9的活性。该策略几乎提高了所有测试的位于开放染色质的gRNA的活性，然而对位于异染色质区域的gRNA，测试的三分之一的gRNA没有促进效果。但这些异染色质区域的gRNA通常是需要解决的问题。另一种提高染色质可及性的方法是提高组蛋白乙酰化水平。染色质结构的开启或关闭通常由组蛋白乙酰基转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)控制。HDAC抑制剂(Panobinostat或Entinostat)通过减弱HDAC1和HDAC2的活性，诱导CRISPR/Cas9靶点区域染色质状态的打开从而促进基因编辑。然而值得注意的是泛HDAC抑制剂Panobinostat和HDAC1/2/3选择性抑制剂Entinostat在原代细胞和细胞系中均表现出细胞毒性，并在多个细胞系上诱导细胞凋亡。此外只有特定的HDAC负调控的染色质区域可能受益于这些HDAC抑制剂。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种提高真核生物基因编辑效率的方法及其应用。本发明系统地研究了染色质可及性如何影响哺乳动物细胞中CRISPR/Cas9的基因组编辑效率，通过将Cas9与转录激活域融合来提高Cas9的基因组编辑效率。此外，本发明使用YF-2增加染色质的可及性，YF-2是一种高度选择性的HAT激活剂，具有针对CBP、PCAF和GCN5的活性。通过研究证明，使用HAT激活剂可以在不增加相对脱靶效应的情况下进一步提高Cas9-VP64的基因组编辑活性。基于上述研究成果，从而完成本发明。
本发明的第一个方面，提供调节染色质可及性在生物基因编辑效率中的应用。
具体的，经研究证明，通过提高染色质可及性可提高生物基因编辑效率；
所述提高染色质可及性的具体方法可以包括提高染色质开放状态，本发明通过研究证实，染色质开放状态是真核生物编辑效率的关键决定性因素。
本发明的第二个方面，提供一种提高生物基因编辑效率的方法，所述方法包括使用CRISPR/Cas9进行对生物细胞进行基因编辑时，使用Cas9-AD融合蛋白和/或使用组蛋白乙酰转移酶(HAT)激活剂，从而提高生物基因编辑效率。
本发明的第三个方面，提供一种提高生物基因编辑效率的产品，所述产品至少包括如下任意一种或多种组分：
(a)Cas9-AD融合蛋白，其中所述Cas9-AD融合蛋白为Cas9蛋白与VP64激活域融合获得；
(b)组蛋白乙酰转移酶激活剂。
所述产品可以为试剂盒。
本发明的第四个方面，提供一种辅助设计CRISPR gRNA的方法，所述方法包括：分析待设计gRNA区域的染色质开放状态。这是由于高染色质开放状态的gRNA编辑效率高于低染色质开放状态，从而可以为辅助高效gRNA的设计提供参考。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案揭示了染色质开放状态是决定哺乳动物细胞中gRNA活性的关键因素，并报告了一种提高Cas9基因组编辑活性的策略。gRNA区域的染色质开放状态越高，往往意味着Cas9的基因组编辑效率越高。因此靶点区域的染色质开放状态有助于设计高效的gRNA靶点。DHT处理增加AR响应元件的染色质可及性，提高此处gRNA靶点上Cas9的基因组编辑活性。然而已知最强大的转录激活域VP64与Cas9的融合仅适度提高了部分gRNA位点的基因组编辑效率。
同时，本发明研究发现，多个VP64结构域的引入极大地阻碍了Cas9融合蛋白的表达，进而导致基因编辑效能的降低。考虑到VP64结构域可招募组蛋白乙酰转移酶，而组蛋白乙酰转移酶又可调节染色质可及性，因此可应用组蛋白乙酰转移酶激活剂YF-2进一步促进CRISPR/Cas9的基因组编辑。
综上，上述技术方案为提高CRISPR/Cas9基因组编辑活性提供了一种新的策略，并使在真核生物中选择更广泛的gRNA靶标成为可能，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中染色质开放状态对基因组编辑效率的影响：
(a)rs339331位点邻近gRNA靶点序列示意图。(b)VCaP细胞FAIRE DNA的Sanger测序图。rs339331位点在测序峰中突出显示。(c)利用等位基因特异性引物，通过FAIRE qPCR检测VCaP细胞中T和C等位基因的染色质开放状态。(d)在VCaP细胞中，通过NGS分别测定Cas9在rs339331位点为T和C等位基因时邻近gRNA靶点上诱导的indel频率。(e)通过FAIREqPCR分析用或不用DHT处理的VCaP细胞中rs339331区域的染色质开放状态。(f)通过NGS分析用或不用DHT处理的VCaP细胞中rs339331位点邻近gRNA靶点的indel频率。(g)用getPCR方法检测Lenti-X 293T细胞HOXB13、DYRK1A、EMX1基因中9个gRNA靶点的indel频率。(h)通过FAIRE qPCR分析确定Lenti-X 293T细胞中这9个gRNA靶点区域的染色质开放状态。(i)HOXB13、DYRK1A、EMX1基因的9个gRNA中indel频率与染色质开放状态的相关性分析。(j)体内比较质粒和染色质DNA的编辑效率示意图。(k-l)用getPCR方法评估在Lenti-X 293T细胞中质粒DNA(k)和染色质DNA(l)上9个gRNA靶点的编辑效率。
图2为本发明实施例中不同细胞系编辑效率与染色质开放状态之间的相关性：
(a-c)用getPCR方法测定22Rv1、BT-474、HeLa细胞中9个gRNA靶点的indel频率。(d-f)FAIRE qPCR分析22Rv1、BT-474和HeLa细胞中9个gRNA靶点区域的染色质开放状态。(g)用getPCR方法测定4种细胞系中9个gRNA靶点的indel频率的箱型图。箱型图中间带显示四分位数，晶须表示1.5IQR，异常值单独显示。(h-j)对22Rv1(h)、BT-474(i)和HeLa(j)细胞中9个gRNA靶点的indel频率与染色质开放状态的相关性分析。(k-n)22Rv1 vs.BT-474(k)、HeLa vs.Lenti-X 293T(l)、22Rv1 vs.HeLa(m)、HeLa vs BT-474(n)四种细胞系的基因组编辑效率两两相关分析及散点图。(平均值±s.e.m.，n＝3个独立的生物重复)。
图3为本发明实施例中染色质开放状态信息在高活性CRISPR靶点设计中的应用：
(a)在HOXB13、EMX1、DYRK1A和B3GALT2基因上设计了30个gRNA靶点，通过FAIREqPCR评估了它们在Lenti-X 293T细胞中的染色质开放状态。条形图中每个靶点的富集倍数值按顺序显示。(b)通过getPCR方法确定Lenti-X 293T细胞中这30个gRNA靶点的indel频率，并以与(a)相同的顺序显示。(c)30个gRNA靶点上indel频率和FAIRE富集倍数的相关性。(d)根据FAIRE qPCR结果，将30个gRNA靶点的indel频率平均分为三组的箱型图。箱型图中间带显示四分位数，晶须表示1.5IQR，异常值单独显示。(平均值±s.e.m.，n＝3个独立的生物重复)。
图4为本发明实施例中Cas9-AD融合蛋白通过调节染色质结构影响基因组编辑效率：
(a)Cas9或dCas9融合蛋白在其氨基或羧基末端融合不同数量VP64的图示。(b)在Lenti-X 293T细胞中转染24小时或48小时后评估dCas9-1V和dCas9-2V对提高HOXB13-T3靶点基因组编辑效率的促进作用。(c)在Lenti-X 293T细胞中转染24小时、48小时和72小时后评估dCas9-2V对提高DYRK1A-T1靶点基因组编辑效率的促进作用。(d)在Lenti-X 293T细胞中针对DYRK1A-T1靶点比较八种dCas9-AD对Cas9基因组编辑效率的促进作用。(e)在Lenti-X 293T细胞中针对DYRK1A-T1靶点比较八种Cas9-AD对Cas9基因组编辑效率的促进作用。(f)在Lenti-X 293T细胞中针对DYRK1A-T1靶点比较八种Cas9-AD的基因组编辑效率。(g)FAIRE qPCR分析确定8个Cas9-AD在增强DYRK1A-T1靶点区域染色质开放状态中的作用。。
图5为本发明实施例中Cas9-AD在15个sgRNA靶点上的基因组编辑效率：
(a)在Lenti-X 293T细胞中通过getPCR方法确定Cas9-1V和Cas9-3V在15个sgRNA靶点上indel频率的箱型图。箱型图中间带显示四分位数，晶须表示1.5IQR，异常值单独显示。配对样本T检验(双尾)使用IBM SPSS统计数据版本21进行。(b)在Lenti-X 293T细胞中比较Cas9-1V和Cas9在15个sgRNA靶点上基因组编辑效率的折线图。(c)在Lenti-X 293T细胞中比较Cas9-3V在提高15个sgRNA靶点基因组编辑效率的折线图。(平均值±s.e.m，n＝3个独立的生物重复)。
图6为本发明实施例中YF-2在改善基因组编辑中的作用：
(a)在Lenti-X 293T细胞中针对EMX1-T6靶点使用getPCR方法评估不同浓度的YF-2对Cas9和Cas9-1V indel频率的影响。(b)在Lenti-X 293T细胞中针对4个低活性的靶点使用getPCR方法评估50μM YF-2处理对Cas9和Cas9-1V的indel频率的影响。(c)有无YF-2处理时Cas9和Cas9-1V的在靶和脱靶效应。采用getPCR方法评估在靶编辑效率。通过Sanger测序，使用TIDE在线工具评估脱靶indel频率。(平均值±s.e.m，n＝3个独立的生物重复)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如前所述，目前报道的通过调节染色质的可及性来提高基因组编辑效率的策略往往存在适用范围受限，实施难度大，提高基因编辑脱靶率以及存在细胞毒性等问题。
有鉴于此，本发明系统地研究了染色质可及性如何影响哺乳动物细胞中CRISPR/Cas9的基因组编辑效率，通过将Cas9与转录激活域融合来提高Cas9的基因组编辑效率。此外本发明使用YF-2增加染色质的可及性，YF-2是一种高度选择性的HAT激活剂，具有针对CBP、PCAF和GCN5的活性。使用HAT激活剂可以在不增加相对脱靶效应的情况下进一步提高Cas9-VP64的基因组编辑活性。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供调节染色质可及性在生物基因编辑效率中的应用。
具体的，经研究证明，通过提高染色质可及性可提高生物基因编辑效率；
所述提高染色质可及性的具体方法可以包括提高染色质开放状态，本发明通过研究证实，染色质开放状态是真核生物编辑效率的关键决定性因素；
其中，所述生物可以是原核生物或真核生物，优选为真核生物，进一步优选为哺乳动物；显而易见的，在进行具体操作时，所针对对象具体为生物的细胞，在本发明的具体实施方式中，所述细胞包括但不限于22Rv1、BT-474、HeLa和Lenti-X 293T。
所述基因编辑可以采用CRISPR/Cas9进行。而且，使用CRISPR/Cas9进行基因编辑时，既可以采用单一CRISPR/Cas9系统进行基因编辑处理，同时也可以使用双CRISPR/Cas9共表达系统进行基因编辑处理。
所述生物基因编辑效率可以包括在靶编辑效率。
本发明的又一具体实施方式中，所述提高染色质开放状态的方法包括如下任意一种或多种：
(a)使用Cas9-AD融合蛋白，所述Cas9-AD融合蛋白为Cas9蛋白与转录激活域融合获得；
(b)使用组蛋白乙酰转移酶(HAT)激活剂。
其中，在本发明中，所述转录激活域优选为VP64激活域，即VP16激活域的四拷贝版本；
所述Cas9蛋白可以为Cas9和/或dCas9；更具体的，所述Cas9-AD融合蛋白可以是Cas9或dCas9在其氨基或羧基末端融合1个或多个VP64获得；
所述多个可以为不多于10个，进一步优选为不多于5个，如2个，3个，4个，5个。
所述组蛋白乙酰转移酶激活剂可以为任意针对组蛋白乙酰转移酶具有激活作用的化合物等，在此不做具体限定，在本发明的一个具体实施方式中，所述组蛋白乙酰转移酶激活剂可以为YF-2(CAS No.:1311423-89-8)，其是一种高度选择性的组蛋白乙酰转移酶激动剂，具有针对CBP、PCAF和GCN5的活性。使用HAT激活剂可以在不增加相对脱靶效应的情况下进一步提高Cas9-VP64的基因组编辑活性。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种提高生物基因编辑效率的方法，所述方法包括使用CRISPR/Cas9进行对生物细胞进行基因编辑时，使用Cas9-AD融合蛋白和/或使用组蛋白乙酰转移酶(HAT)激活剂，从而提高生物基因编辑效率。
其中，所述生物可以是原核生物或真核生物，优选为真核生物，进一步优选为哺乳动物；所述生物细胞包括但不限于22Rv1、BT-474、HeLa和Lenti-X 293T。
使用CRISPR/Cas9进行基因编辑时，既可以采用单一CRISPR/Cas9系统进行基因编辑处理，同时也可以使用双CRISPR/Cas9共表达系统进行基因编辑处理。
所述生物基因编辑效率可以包括在靶编辑效率。
其中，所述Cas9-AD融合蛋白是通过Cas9蛋白与转录激活域融合获得；
所述转录激活域优选为VP64激活域，即VP16激活域的四拷贝版本；
所述Cas9蛋白可以为Cas9和/或dCas9；更具体的，所述Cas9-AD融合蛋白可以是Cas9或dCas9在其氨基或羧基末端融合1个或多个VP64获得；
所述多个可以为不多于10个，进一步优选为不多于5个，如2个，3个，4个，5个；
在本发明的一个具体实施方式中，根据VP64激活域的数目和N-或C-端的位置设计并构建了16种不同的融合蛋白，其中8种用于dCas9,8种用于Cas9(如图4a所示)。经试验证明，8种dCas9-AD融合后大多数都明显增加了Cas9的编辑效率，其中dCas9-3V的促进作用最强，需要说明的是，在一定范围内，随着VP64结构域的增加，Cas9-AD融合蛋白的表达水平下降，从而导致编辑效率降低；然而，Cas9-AD蛋白水平标准化的基因组编辑效率随着VP64激活域数目的增加而提高。
所述组蛋白乙酰转移酶激活剂可以为任意针对组蛋白乙酰转移酶具有激活作用的化合物等，在此不做具体限定，在本发明的一个具体实施方式中，所述组蛋白乙酰转移酶激活剂可以为YF-2(CAS No.:1311423-89-8)，其是一种高度选择性的组蛋白乙酰转移酶激动剂。
组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的动态平衡调节细胞中组蛋白的乙酰化和去乙酰化。有报道称HDAC抑制剂可以增加染色质可及性，促进基因组编辑。然而，组蛋白乙酰转移酶激活剂对基因组编辑的促进作用尚不清楚。鉴于VP64结构域在转录起始阶段可以招募组蛋白乙酰转移酶，因此应用组蛋白乙酰转移酶激活剂YF-2可能会提高Cas9-AD的基因组编辑活性。在Lenti-X 293T细胞中EMX1-T6靶点的基因组编辑显示，50μMYF-2处理显著增加了Cas9-1V和Cas9的基因组编辑，前者促进效果更为显著(图6a)。此外YF-2处理还增加了Cas9-1V和Cas9在四个基因编辑活性低的靶点的基因组编辑(图6b)。值得注意的是，YF-2处理对不同gRNA靶点基因组编辑的促进作用差异很大。这些结果表明YF-2在改善Cas9和Cas9-1V基因组编辑方面具有很大的潜力。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种提高生物基因编辑效率的产品，所述产品至少包括如下任意一种或多种组分：
(a)Cas9-AD融合蛋白，其中所述Cas9-AD融合蛋白为Cas9蛋白与VP64激活域融合获得；
(b)组蛋白乙酰转移酶激活剂。
其中，所述Cas9蛋白可以为Cas9和/或dCas9；更具体的，所述Cas9-AD融合蛋白可以是Cas9或dCas9在其氨基或羧基末端融合1个或多个VP64获得；
所述多个可以为不多于10个，进一步优选为不多于5个，如2个，3个，4个，5个；
所述组蛋白乙酰转移酶激活剂可以为任意针对组蛋白乙酰转移酶具有激活作用的化合物等；优选的，所述组蛋白乙酰转移酶激活剂可以为YF-2(CAS No.:1311423-89-8)。
所述产品可以为试剂盒，因此，所述试剂盒还可以包含其它可用于CRISPR/Cas9的酶、缓冲液等，在此不做具体限定。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种辅助设计CRISPR gRNA的方法，所述方法包括：分析待设计gRNA区域的染色质开放状态。这是由于高染色质开放状态的gRNA编辑效率高于低染色质开放状态，从而可以为辅助高效gRNA的设计提供参考。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
实施例
1.1基因组编辑效率与染色质开放状态相关
rs339331位点在两种前列腺癌细胞系VCaP和22Rv1中均为T/C杂合，之前的研究揭示了这两种等位基因具有不同的染色质开放状态。直接比较rs339331位点临近靶点在两个不同等位基因时的基因组编辑效率(图1a)，可以让本发明在研究基因组编辑效率与染色质开放状态的相关性时剥离sgRNA靶点序列差异所产生的潜在影响。VCaP细胞中FAIRE DNA的Sanger测序结果(图1b)和22Rv1细胞中FAIRE DNA的Sanger测序结果均显示T等位基因富集。利用等位基因特异性引物对这两种细胞系进行FAIRE qPCR分析，证实T等位基因比C等位基因具有更开放的染色质状态(图1c)。当在rs339331邻近的gRNA靶点进行CRISPR/Cas9基因组编辑时，在VCaP(图1d)和22Rv1细胞中T等位基因的indel频率明显高于C等位基因。此外rs339331位点是响应AR信号通路的重要转录调控双氢睾酮(DHT)处理显著增加了VCaP(图1e)和22Rv1细胞中rs339331位点的染色质开放状态。有趣的是DHT处理VCaP(图1f)和22Rv1细胞后，Cas9在rs339331位点邻近gRNA靶点的编辑效率也显著提高。
为了进一步研究基因组编辑效率与染色质开放状态的相关性，选择之前已经评估过的位于HOXB13、DYRK1A和EMX1基因中的9个gRNA靶点。在lenti-X 293T细胞中进行的基因组编辑显示，这9个gRNA靶点表现出不同的编辑效率(图1g)，从EMX1-T4靶点不到0.1％到HOXB13-T273.9％的编辑效率不等。FAIRE qPCR分析显示9个gRNA靶点区域的染色质开放状态也有很大差异(图1h)。Pearson相关分析表明indel频率与FAIRE富集倍数两者的高度相关，相关系数r＝0.877(图1i)。
此外，将9个gRNA靶点序列串联插入pGEN-MCS-Renilla质粒中，并与CRISPR/Cas9系统共转染Lenti-X 293T细胞(图1j)。通过getPCR方法分别测定每个gRNA靶点在基因组DNA和质粒DNA上的编辑效率。除了EMX1-T2只有28.3％，其余8个gRNA靶点在质粒DNA上的编辑效率均达到了50-70％(图1k)。相比之下，共转染实验(图1l)中相应的染色质DNA编辑效率表现出与图1g相同的多样性。综上所述染色质开放状态是真核生物编辑效率的关键决定因素。
1.2不同细胞中编辑效率与染色质开放状态的相关性
为了解决在Lenti-X 293T细胞中观察到的基因组编辑效率与染色质开放状态之间的相关性是否在真核生物中普遍存在的问题，继续选择这9个gRNA靶点在另外3种细胞系22Rv1(图2a)、BT-474(图2b)和HeLa(图2c)中进行Cas9基因组编辑实验。通过FAIRE qPCR分析分别测定了3种细胞系中9个gRNA的染色质开放状态(图2d-f)。尽管9个gRNA靶点的indel频率在不同细胞系中存在显著差异(图2g)，但它们仍然与各细胞系的染色质开放状态密切相关。22Rv1(图2h)、BT-474(图2i)和HeLa细胞(图2j)的相关系数分别为0.84、0.64和0.64。有趣的是9个gRNA的indel频率在细胞系之间也表现出相关性。22Rv1和BT-474细胞的相关性最强，r＝0.95(图2k)，其次是HeLa和Lenti-X 293T细胞，r＝0.90(图2l)。如果两个细胞的平均indel频率差异太大，例如22Rv1和HeLa细胞(图2m)，HeLa和BT-474细胞(图2n)，相关水平相对较低。此外通过FAIRE qPCR分析，染色质开放状态与细胞系之间也有很强的相关性。这表明一个细胞系的gRNA效率可能对另一个细胞系的gRNA效率有一定的参考价值，可能存在微小的差异。
1.3染色质开放状态辅助设计高效的CRISPR gRNA
为了确定染色质开放状态和基因组编辑效率之间的相关性在多大程度上可以用于设计高效的gRNA。使用FAIRE-seq分析了Lenti-X293T细胞染色质开放状态的全基因组景观。然后分别针对EMX1、HOXB13、DYRK1A、B3GALNT2 4个基因不同开放状态的染色质区域共设计30个gRNA，按顺序命名为target11～target 40。进一步用FAIRE qPCR分析这些gRNA区域的染色质开放状态(图3a)，结果显示与FAIRE-seq结果高度一致，Pearson相关系数r＝0.96。通过getPCR方法确定了Lenti-X 293T细胞中每个gRNA靶点的编辑效率(图3b)。indel频率与FAIRE富集倍数高度相关，Pearson相关系数r＝0.572(图3c)。将30个gRNA按FAIRE富集倍数平均分为3组，每组10个gRNA，高染色质开放状态组的gRNA编辑效率明显高于低染色质开放状态组，P＝0.00089(图3d)。这表明染色质开放状态信息在辅助高效gRNA的设计方面具有很大的潜力。
1.4 Cas9-AD通过打开染色质提高基因组编辑效率
基于基因组编辑效率与染色质开放状态之间的强相关性，通过打开染色质结构来提高基因组编辑效率应该是一个有价值的策略。如图1e-f所示，DHT处理增加了rs339331区域的染色质开放状态，显著提高了相邻gRNA靶点的基因组编辑效率。在实践中需要一个工具可以用来打开任何想要的gRNA靶点区域的染色质结构。
VP16酸性激活域是真核生物中强大的转录激活域。它可以与多种转录成分相互作用并招募多种转录成分，包括组蛋白乙酰基转移酶复合物，染色质重塑酶SWI/SNF复合物和许多共激活因子，从而激活转录机制并启动基因转录。VP16结构域通过与dCas9蛋白融合已被广泛用于激活内源性基因表达。另一方面，染色质重塑酶(如ISWI家族SNF2h、酵母染色质重塑酶RSC24和Chd125)的应用可以增加Cas9对体外染色质DNA的切割。在这里本发明提出一种策略，将Cas9蛋白融合VP64激活域(VP16激活域的四拷贝版本)，从而提高染色质的可及性来提高Cas9的基因组编辑效率。根据VP64激活域的数目和N-或C-端的位置设计并构建了16种不同的融合，其中8种用于dCas9,8种用于Cas9(图4a)。在HOXB13-T3上，dCas9-1V在转染48小时后将Cas9的编辑效率提高到1.42倍，而dCas9-2V在转染24小时后将编辑效率提高到1.45倍，在转染48小时后提高到1.77倍(图4b)。在DYRK1A-T1上，dCas9-2V在转染后24、48和72小时显著提高了Cas9的编辑效率，在48小时达到峰值(图4c)。进一步评估16种(d)Cas9融合VP64。8种dCas9-AD融合后大多数都明显增加了Cas9的编辑效率，其中dCas9-3V的促进作用最强(图4d)。当与Cas9共转染时，所有8个Cas9-AD的编辑效率均明显提高(图4e)。但单转染Cas9-AD时只有Cas9-1V的编辑效率提高(图4f)。
为了研究为什么Cas9-AD的基因组编辑活性没有随着VP64结构域数目的增加而提高，进行Western blotting分析以确定Cas9融合蛋白的水平。发现随着VP64结构域的增加，Cas9融合蛋白的表达水平显著下降。说明Cas9-AD融合蛋白表达水平下降是导致编辑效率降低的原因。然而，所有8个Cas9-AD都不同程度地增加了DYRK1A-T1靶点区域的染色质开放状态(图4g)。值得注意的是，Cas9-AD蛋白水平标准化的基因组编辑效率随着VP64激活域数目的增加而提高。
1.5 Cas9-AD在15个靶点上适度提高编辑效率
基于Cas9-1V和Cas9-3V对DYRK1A-T1靶点的活性，选择Cas9-1V和Cas9-3V进一步评估Lenti-X 293T细胞中更多的gRNA靶点。从30个目标中选择了15个不同编辑效率的gRNA靶点。在配对样本T检验中，单转Cas9-1V和Cas9/Cas9-3V共转染在15个gRNA靶标上的编辑效率均显著高于Cas9，P＝0.006和P＝0.008(图5a)。尽管如此，如果查看每一个靶点，Cas9-1V仅在四个gRNA目标(图5b)上产生比Cas9更高的编辑效率，而Cas9-3V则没有(图5c)。
1.6 YF-2提高了Cas9和Cas9-1V的基因组编辑能力
由于Cas9-AD促进基因组编辑的作用有限，应用另一种策略来提高染色质的开放程度可能有助于开发更强大的基因组编辑工具。已有的研究结果表明，提高组蛋白乙酰化水平可以通过减少组蛋白与DNA之间的相互作用来改善染色质开放状态。组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的动态平衡调节细胞中组蛋白的乙酰化和去乙酰化。有报道称HDAC抑制剂可以增加染色质可及性，促进基因组编辑。然而，组蛋白乙酰转移酶激活剂对基因组编辑的促进作用尚不清楚。鉴于VP64结构域在转录起始阶段可以招募组蛋白乙酰转移酶，因此应用组蛋白乙酰转移酶激活剂YF-2可能会提高Cas9-AD的基因组编辑活性。在Lenti-X 293T细胞中EMX1-T6靶点的基因组编辑显示，50μMYF-2处理显著增加了Cas9-1V和Cas9的基因组编辑，前者促进效果更为显著(图6a)。此外YF-2处理还增加了Cas9-1V和Cas9在四个基因编辑活性低的靶点的基因组编辑(图6b)。值得注意的是，YF-2处理对不同gRNA靶点基因组编辑的促进作用差异很大。这些结果表明YF-2在改善Cas9和Cas9-1V基因组编辑方面具有很大的潜力。
脱靶效应在促进基因组编辑时通常受到关注。然后使用EMX1-T6靶点测试YF-2处理对Cas9和Cas9-1V的脱靶效应，如前面描述，EMX1-T6靶点有两个潜在的脱靶位点OT1和OT2。发现Cas9-1V在OT1和OT2位点都表现出与Cas9相似的脱靶编辑。YF-2处理也没有增加Cas9和Cas9-1V的脱靶效应(图6c)。
综上，本发明中，揭示了染色质开放状态是决定哺乳动物细胞中gRNA活性的关键因素，并报告了一种提高Cas9基因组编辑活性的策略。gRNA区域的染色质开放状态越高，往往意味着Cas9的基因组编辑效率越高。因此靶点区域的染色质开放状态有助于设计高效的gRNA靶点。DHT处理增加AR响应元件的染色质可及性，提高此处gRNA靶点上Cas9的基因组编辑活性。然而已知最强大的转录激活域VP64与Cas9的融合仅适度提高了部分gRNA位点的基因组编辑效率。发现多个VP64结构域的引入极大地阻碍了Cas9融合蛋白的表达，进而导致基因编辑效能的降低。考虑到VP64结构域可招募组蛋白乙酰转移酶，而组蛋白乙酰转移酶又可调节染色质可及性，应用组蛋白乙酰转移酶激活剂YF-2进一步促进CRISPR/Cas9的基因组编辑。
本发明的策略是使用Cas9-AD结合组蛋白乙酰转移酶激活剂来促进基因组编辑。一方面，Cas9融合的VP64结构域招募组蛋白乙酰转移酶，包括p300、CBP和PCAF等。另一方面，YF-2可以进一步激活组蛋白乙酰转移酶，协同提高染色质可及性。因此，该方法不仅局限于对特定组蛋白乙酰转移酶调控的基因组区域进行基因组编辑，而且有望在广泛的gRNA靶点上发挥作用。此外由于不需要额外的gRNA或dsgRNA，实验设计更加简单。
尽管YF-2在增强CRISPR/Cas9基因组编辑方面有效，但需要注意使用YF-2的潜在副作用，尤其是在研究基因表达调控时。此外测试的YF-2工作浓度对Lenti-X 293T细胞的毒性作用是可以接受的，但对其他细胞系的作用和毒性目前仍不清楚。
多个VP64结构域与Cas9的融合阻碍了蛋白的表达，这可能是由于多个VP16结构域对细胞的毒性作用。现在有一种可供选择的策略，让Cas9和VP64片段分别表达，然后自组装成功能复合物。此外在原核细胞中表达和纯化Cas9-AD融合蛋白，并在基因组编辑实验中直接使用Cas9-AD蛋白，有望促进基因组编辑。
本发明未尽事宜为公知技术。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.提高染色质可及性在生物基因编辑效率中的应用，其特征在于，所述提高染色质可及性的方法包括使用Cas9-AD融合蛋白和组蛋白乙酰转移酶激活剂；
所述Cas9-AD融合蛋白为Cas9蛋白与转录激活域融合获得；所述转录激活域为VP64激活域，即VP16激活域的四拷贝版本；
所述Cas9蛋白为Cas9和/或dCas9；
所述Cas9-AD融合蛋白是Cas9或dCas9在其氨基或羧基末端融合1个或多个VP64获得；
所述多个为不多于10个；
所述组蛋白乙酰转移酶激活剂为YF-2。
2.如权利要求1中所述应用，其特征在于，提高染色质可及性的具体方法包括提高染色质开放状态；
所述生物是原核生物或真核生物；
所述基因编辑采用CRISPR/Cas9进行。
3.如权利要求2中所述应用，其特征在于，所述生物为真核生物。
4.如权利要求3中所述应用，其特征在于，所述生物为哺乳动物。
5.如权利要求1中所述应用，其特征在于，所述多个为不多于5个，包括2个，3个，4个，5个。
6.一种提高生物基因编辑效率的方法，其特征在于，所述方法包括使用CRISPR/Cas9进行对生物细胞进行基因编辑时，使用Cas9-AD融合蛋白和使用组蛋白乙酰转移酶激活剂；
所述生物是原核生物或真核生物；
所述Cas9-AD融合蛋白是通过Cas9蛋白与转录激活域融合获得；
所述转录激活域为VP64激活域，即VP16激活域的四拷贝版本；
所述Cas9蛋白为Cas9和/或dCas9；所述Cas9-AD融合蛋白是Cas9或dCas9在其氨基或羧基末端融合1个或多个VP64获得；
所述多个为不多于10个；
所述组蛋白乙酰转移酶激活剂为YF-2。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述生物为真核生物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述生物为哺乳动物。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述多个为不多于5个，包括2个，3个，4个，5个。
10.一种提高生物基因编辑效率的产品，其特征在于，所述产品至少包括：Cas9-AD融合蛋白和组蛋白乙酰转移酶激活剂；
所述Cas9-AD融合蛋白为Cas9蛋白与VP64激活域融合获得；
所述Cas9蛋白为Cas9和/或dCas9；所述Cas9-AD融合蛋白是Cas9或dCas9在其氨基或羧基末端融合1个或多个VP64获得；
所述多个为不多于10个；
所述组蛋白乙酰转移酶激活剂为YF-2。
11.如权利要求10所述的产品，其特征在于，所述多个为不多于5个，包括2个，3个，4个，5个。
12.如权利要求10所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂盒。
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