CN111778282A - Mdm2和p53蛋白相互作用检测体系 - Google Patents
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Abstract
Mdm2蛋白功能检测组合物或试剂盒,其特征在于,所述组合物或试剂盒包括dCas9‑Mdm2融合蛋白的编码基因、p53‑转录激活因子(例如p53‑VP64‑P65‑Rta(VPR))融合蛋白的编码基因、sgRNA的转录基因和报告基因,所述sgRNA用于引导dCas9‑Mdm2蛋白靶向所述报告基因,任选地所述基因构建在一个或多个(例如1、2、3、4个)表达载体上。本发明能够检测Mdm2的功能,尤其是在哺乳细胞动物中,以及利用改变nutlin‑3a的浓度调控Mdm2和p53蛋白相互作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及Mdm2和p53蛋白相互作用检测体系。
背景技术
一、基因转录调控
基因调控是指对从基因到蛋白质表达过程的调节,实现基因调控的途径可以分为三个方面:转录水平的调控、转录后水平的调控以及翻译水平的调控。其中,转录水平调控是基因表达调控的重要环节。
真核生物的转录是通过RNA聚合酶和相关转录因子以及一些调控元件共同作用实现的。而只有当染色质处于一定状态(即具有可及性)时才能够被转录因子结合,进行调控转录。因染色质的可及性受DNA修饰和组蛋白的影响,通过可编程的DNA靶向结合技术,加上转录效应元件,能够干扰DNA和组蛋白修饰,从而改变染色质可及性,实现转录调控。
研究中常用的DNA结合蛋白域(DBD)包括锌指蛋白(ZFPs)、TALEs和CRISPR/Cas9系统。ZFPs和TALEs是模块化的DNA结合蛋白,通过设计,能够使其氨基酸侧链特异性结合DNA序列,结合效应元件可以靶向结合DNA序列并调控其转录。
CRISPR/Cas9是一种具有核酸内切酶活性的复合体,它能够在sgRNA的引导下定点切割与sgRNA碱基互补配对的DNA序列。通过对Cas9的突变分析发现,突变体(dCas9)丢失了核酸内切酶活性,但仍保留sgRNA引导的DNA结合能力。利用dCas9的这一特性,结合一些转录效应元件,可以构建一个靶向结合DNA并调控下游基因转录的体系,从而实现转录水平上的基因调控。
在细胞中多种的效应元件中,比较有效的有VP64,P65,p300,KRAB,Rta等。VP64是病毒转录激活域VP16的四聚体,它能够募集重塑因子,提高染色质可及性。P65是人NF-κB复合物的亚基,它能够募集转录激活因子,和ZFPs,TALEs或dCas9结合可以激活靶标基因的转录。Rta是来自Epstein-Bar病毒的反式激活因子。另外,还有一些具有酶催化活性的结构域,如乙酰转移酶p300催化域,DNA去甲基酶TET1催化域和TDG去甲基酶,它们通过对DNA和组蛋白的作用,改变染色质的可及性,结合DBDs,可以实现转录激活。相反地,box(KRAB)作用于DNA能够诱导异染色质重塑复合物形成,同时抑制邻近及远端的基因调控元件,如增强子,进而抑制转录。
研究表明,将这些效应元件与CRISPR体系结合,可以实现内源和外源基因在转录水平上的定向调控。此外,将多个调控因子串联形成融合蛋白,如VP64-P65-Rta,可以大大提高转录调控的能力。
为了实现对基因表达的精确控制,设计能够响应外界环境变化的调控体系。如doxycycline控制的表达系统,被广泛用于转录的瞬时调控。在dCas9-VP64转录激活体系中加入可化学诱导结构域,就能够实现响应小分子化合物的转录调控。在CRISPR/dCas9转录调控体系中引入可响应远红光的c-di-GMP合酶,可促进c-di-GMP的合成,从而激活效应元件的转录,进一步实现CRISPR/dCas9对靶标下游基因的调控。Gao等人通过脱落酸或赤霉素在细胞内诱导形成相应的蛋白-小分子-蛋白复合体,结合CRISPR/dCas9,能够实现转录激活或抑制,进一步的,构建复杂的逻辑运算体系(Gao,Y.et al.Complex transcriptionalmodulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators.Nature methods13,1043-1049(2016))。
二、蛋白质相互作用及检测
蛋白质作为生命物质的基础,几乎控制和调节着细胞的一切生命活动,而其中超过80%的蛋白质是以复合物的形式参与生命活动的。细胞内的生长代谢等多方面都涉及到蛋白质分子相互作用,其中包括蛋白酶复合体的组装、抗原-抗体反应、核糖体等超分子结构的组装以及细胞表面受体与生长因子和激素的相互作用;此外,蛋白质分子间的相互作用也会参与到肿瘤形成中。因此,研究蛋白质的功能一个主要的途径就是研究蛋白质分子间相互作用和作用网络。
研究蛋白质-蛋白质相互作用不仅能够从分子水平揭示蛋白质的功能,更有助于了解细胞生长、发育、分化和凋亡等生命活动,进而为探讨重大疾病机制、疾病治疗和预防以及新药开发提供重要的理论基础。
现有的蛋白质-蛋白质相互作用检测方法可分为三种:体外检测、体内检测和生物信息学研究方法。其中体内方法提供了唯一的一种途径,能够还原被检测蛋白产生相互作用的细胞环境,原位检测蛋白质相互作用变化,其主要包括酵母双杂交技术(Y2H)及由此衍生的哺乳动物细胞双杂交技术(M2H)、荧光共振能量转移(FRET)、信号蛋白邻近成像法(PRIM)等。
Y2H是一种基于转录激活的检测系统。整个体系包括两类蛋白,一类是目的蛋白‘X’与DNA结合结构域的融合蛋白(DBD-X),一类是目的蛋白‘Y’与转录激活结构域的融合蛋白(AD-Y),当两个目的蛋白相互作用时,AD-Y融合蛋白被DBD-X融合蛋白招募到报告基因的转录激活区域附近,从而能够进行筛选和鉴定。Y2H的优势在于灵敏度高,而且过程较为简捷;此外,使用Y2H还可以从蛋白质库中筛选与已知蛋白相互作用的新蛋白。但同时,Y2H也存在着缺陷:对于某些存在于非酵母细胞中的蛋白对相互作用而言,在酵母细胞中可能会由于受到异于正常生理状态的刺激而产生假阴性结果,且实验不能完全模拟目标蛋白所在的细胞类型、细胞空间和生长发育的不同时期,所以不能用于研究在特定细胞条件下发生的蛋白相互作用。由此发展出M2H,其作用原理与Y2H相同,但效应元件与酵母细胞中所用不同,可用于哺乳动物细胞中原位检测蛋白质间的相互作用。
荧光共振能量转移(FRET)检测蛋白质之间相互作用是依靠供体和受体荧光分子之间的偶极-偶极耦合过程。当两种蛋白(A和B)由于相互作用而靠近时,B所连接的受体荧光分子受激发射荧光,同时A所连接的供体荧光分子荧光消失或减弱,由此可以推断蛋白质间的相互作用。FRET的优势在于能够用于原位检测活细胞中的蛋白质相互作用,但对供体和受体荧光物质的要求较严格:供体的发射光谱需和受体的激发光谱有明显的重叠,且两者的发射光谱要完全分开。此外,由于该方法的关键就在于供体和受体荧光分子的距离关系,所以需要设计合适的linker连接荧光分子和待检测蛋白,而这一步需要大量的实验验证优化,所以该体系较难构建。
信号蛋白邻近成像法(PRIM)的原理是,当蛋白质间存在相互作用时,两种蛋白所连接的信号蛋白会发生重组并产生信号,通过检测重组蛋白的信号变化就可以推测蛋白质间相互作用的变化。所用的信号蛋白有荧光蛋白及荧光素酶等。这种检测方式存在一些问题:只有当荧光蛋白以正确的方式组装时才能够产生荧光信号,所以导致荧光信号较弱,对于一些弱的相互作用较难检测到。
三、Mdm2和p53蛋白
p53是一种肿瘤抑制因子,它参与调控细胞中最重要的过程,其活性和稳定性主要体现在转录后的共价修饰来应对各种形式的应激。在绝大多数人类癌症中,p53的活性不是丧失了,就是减弱了。它对很多靶基因都有转录激活作用。对细胞最典型的作用是使细胞周期阻滞、凋亡以及分化和衰老。许多应激诱导因素会激活p53下游基因如Bcl-2凋亡基因的转录从而导致细胞凋亡。在正常细胞的生长过程中,蛋白质经历快速代谢和生理转换,细胞内p53蛋白含量较低。在细胞暴露于各种生理应激状态后,p53开始积累。
p53有众多靶基因,Mdm2癌基因是其中最具特征性的。Mdm2蛋白作为p53蛋白泛素化过程中的E3泛素连接酶使p53蛋白被泛素小分子标记,然后被蛋白酶降解。Mdm2基因内有两个相邻的应答元件,p53能与其特异性结合并促进Mdm2的转录。Mdm2含量增加后反过来抑制p53的活性。因此,p53和Mdm2能在人体内形成一个负反馈循环回路。在人体内的含量保持在一个相对稳定的水平。Mdm2蛋白并不作用于p53的下游基因而是直接调控p53基因的生物学效应。因此,它实际上与p53自身相互作用,并以多种方式抑制其功能。Mdm2现在被认为是p53的主要生理拮抗剂,Mdm2与p53的复合体使p53的转录激活功能域无法发挥正常功能。Mdm2过表达时会通过泛素化-蛋白酶降解途径导致p53含量降低。
p53-Mdm2相互作用的细节能够通过x射线晶体学和核磁共振波谱显示。p53蛋白的反式激活域有三个关键的氨基酸残基Phe19,Trp23,and Leu26。这些p53残基分别与Mdm2分子中的三个疏水空腔相互作用称为Phe19、Trp23和Leu26口袋。Mdm2的共晶结构不仅能与p53蛋白的α螺旋结合,还能与很多Mdm2抑制剂结合,例如顺式咪唑啉和螺-羟吲哚类化合物,它们被设计成模拟p53蛋白的α螺旋并以同样的模式与Mdm2蛋白结合
在癌细胞中,Mdm2蛋白通常过量表达,过量的Mdm2可能会导致p53基因沉默使其失去转录活性无法激活下游凋亡基因的表达,导致癌细胞不可控增值。因此,破坏p53-Mdm2蛋白相互作用使Mdm2无法抑制p53的活性发挥p53正常功能成为治疗癌症的一个靶点。于是人们根据p53-Mdm2蛋白结合位点筛选了很多Mdm2蛋白小分子抑制剂。nutlin-3a是一种很有发展前景的特异性Mdm2抑制剂。nutlin-3a能与Mdm2蛋白N端的疏水性裂口有效结合,从而阻止p53-Mdm2蛋白相互作用。它在体内和体外均能有效杀死野生型p53癌细胞。Mdm2的p53结合位点因与nutlin-3a结合而受到空间抑制,诱导p53积累进而导致癌细胞凋亡。
因此,研究哺乳动物细胞内的p53-Mdm2蛋白相互作用和nutlin-3a对蛋白相互作用的影响对癌症治疗具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明提出一种基于CRISPR/dCas9的Mdm2和p53蛋白相互作用检测体系。
具体涉及如下各项:
1、用于Mdm2蛋白功能检测的组合物或试剂盒,其特征在于,所述组合物或试剂盒包括dCas9-Mdm2融合蛋白的编码基因、p53-转录激活因子(例如p53-VP64-P65-Rta(VPR))融合蛋白的编码基因、sgRNA的转录基因和报告基因,所述sgRNA用于引导dCas9-Mdm2蛋白靶向所述报告基因,任选地所述基因构建在一个或多个(例如1、2、3、4个)表达载体上。
2、根据项1所述的组合物或试剂盒,其中dCas9与Mdm2蛋白的编码基因之间,以及p53与VPR蛋白的编码基因之间均通过连接链的编码基因连接,形成两种融合蛋白的表达基因。
3、根据项1或2所述的组合物或试剂盒,其中所述Mdm2蛋白的编码基因的序列如SEQ ID NO.1所示,所述p53蛋白的编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示,和/或所述连接链的编码基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
4、根据项1-3中任一项所述的组合物或试剂盒,所述报告基因是编码荧光蛋白的基因,如dtomato基因,所述dtomato基因的序列如SEQ ID NO.4所示。
5、根据项4所述的组合物或试剂盒,所述sgRNA的转录基因的序列是SEQ ID NO.5。
6、根据项1-5中任一项所述的组合物或试剂盒,其还包括小分子抑制剂nutlin-3a。
7、项1-6中任一项所述的组合物或试剂盒在检测Mdm2功能中的用途或在筛选Mdm2抑制剂中的用途。
8、根据项7所述的用途,其中,所述用途用于哺乳动物细胞。
9、检测Mdm2的功能的方法,其包括将项1-6中任一项所述的组合物或试剂盒中的基因或载体转染进哺乳动物细胞中,并检测报告基因的表达情况,任选地,所述方法还包括利用改变nutlin-3a的浓度调控Mdm2和p53蛋白相互作用。
10、组合物或试剂盒,其包括项1-6中任一项中定义的基因或载体。
在上述应用中,只需与对照组的基因表达情况进行比较,即可分析蛋白质分子间的相互作用。
与现有技术相比,本发明具有以下技术效果:
本发明能够利用Mdm2和p53蛋白的相互作用调控报告基因的表达,也能够利用报告基因的表达信号检测Mdm2和p53的相互作用情况;
本发明提供了用于Mdm2蛋白功能检测的组合物或试剂盒,尤其是在哺乳动物细胞中检测Mdm2和p53的相互作用的方法,且能够通过改变nutlin-3a的浓度进一步研究其对Mdm2和p53的相互作用的影响,为今后研发抗肿瘤药物奠定良好的基础。且利用转录翻译的过程可以在一定程度上放大信号,从而提高检测敏感度。将本发明的构建好的体系转染细胞就可以进行检测,过程简捷可操作性强,是一个高效、准确检测蛋白质相互作用的方法。
附图说明
图1是本发明实施例中p53-Mdm2蛋白相互作用检测体系的结构示意图;
图2是本发明实施例中表达dCas9-Mdm2的质粒(p_dCas9-Mdm2)图谱;
图3是本发明实施例中表达p53-VPR的质粒(p_p53-VPR)图谱;
图4为本发明实施例中0,20,40μM nutlin-3a作用下293T细胞荧光显微镜检测结果图;
图5为本发明实施例中0-40μM nutlin-3a作用下293T细胞流式细胞仪检测结果图;
图6为本发明实施例中0-40μM nutlin-3a作用下报告基因mRNA荧光定量PCR检测结果图;
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本发明作进一步的详细说明。
本发明构建了一个CRISPR/dCas9基因转录激活体系,并利用该体系实现p53-Mdm2蛋白相互作用的检测。
为了实现上述目的,本发明提供一种利用CRISPR/dCas9的转录激活功能实现检测p53-Mdm2蛋白间相互作用的体系。其中包括dCas9-Mdm2载体和p53-VPR载体,能够引导dCas9-Mdm2融合蛋白靶向报告基因的sgRNA表达载体、以及报告基因dtomato表达载体。其中p53和Mdm2是一对可相互作用的蛋白,该体系基本原理如图1所示。
p_dCas9-Mdm2和p_p53-VPR的质粒图谱如图2和图3所示。
本发明提供一种利用CRISPR/dCas9在293T细胞内检测外源p53和Mdm2蛋白相互作用的体系,该体系通过检测易表征的红色荧光蛋白来反映p53-Mdm2蛋白相互作用情况。另外,在一个具体的实施方案中,本发明也提供了一种通过小分子抑制剂nutlin-3a调控p53-Mdm2蛋白相互作用的方法。通过将dCas9-Mdm2和p53-VPR两种融合蛋白表达载体与sgRNA表达载体以及报告基因dtomato表达载体转染进293T细胞,转染后用含不同浓度nutlin-3a的细胞培养基培养一段时间后检测红色荧光蛋白的表达情况来反映小分子抑制剂nutlin-3a对p53-Mdm2蛋白相互作用的影响。
下面通过具体实施例进一步说明利用本发明的检测体系检测p53-Mdm2蛋白相互作用的技术方案,以及小分子抑制剂nutlin-3a对p53-Mdm2蛋白相互作用的影响。
实施例1:p53-Mdm2蛋白相互作用检测体系的建立
1、dCas9-Mdm2和p53-VPR两种融合蛋白表达载体的构建
首先用Prime STAR max mix(Takara,Japan)预混液通过PCR反应得到p53(SEQ IDNO.2)和Mdm2(SEQ ID NO.1)基因片段。然后用引物VPR F(SEQ ID NO.6)和VPR R(SEQ IDNO.7)对VPR载体(购自addgene)PCR扩增以在VPR载体片段两端添加同源重组序列使其线性化。接下来用Bsu36I和EcoRV双酶切dCas9载体(购自addgene)得到线性片段1(包含dCas9基因的2837bp片段)和线性片段2(包含dCas9基因的1267bp片段),然后用引物Bsu36I F(SEQID NO.8)和EcoRV R(SEQ ID NO.9)PCR扩增线性片段1,用引物EcoRV F(SEQ ID NO.10)和Bsu36I R(SEQ ID NO.11)PCR扩增线性片段2,在两个线性片段两端分别添加同源重组序列。最后用10μlGibson预混液(NEB)将VPR载体片段与p53基因片段,dCas9载体片段1和2与Mdm2基因片段分别按摩尔比1∶1,总质量100ng混合,于50℃孵育1h,得到dCas9-Mdm2和p53-VPR两种融合蛋白表达载体。
2、sgRNA表达载体的构建
选择报告基因dtomato启动子上游的5’-gtcccctccaccccacagtg-3’作为sgRNA靶标报告基因的碱基序列,用引物sgRNA F(SEQ ID NO.12)和sgRNA R(SEQ ID NO.13)PCR扩增sgRNA载体(购自addgene)使其线性化,然后用10μlGibson预混液(NEB)混合100ngPCR产物,并于50℃孵育1h使线性载体变成环状得到sgRNA表达载体。
3、dCas9-Mdm2和p53-VPR两种融合蛋白表达载体以及sgRNA表达载体转化大肠杆菌感受态细胞
将本实施例中1-2中得到的dCas9-Mdm2和p53-VPR两种融合蛋白表达载体以及sgRNA表达载体分别缓慢加入到DH5α感受态细胞(购自NEB)中,冰上放置30min,42℃热激2min,放回冰上2min,加入800μl的LB培养基,37℃,250rpm摇床培养1h;菌液离心,留下100μl沉淀及培养基,混匀,均匀涂抹于含有卡纳抗生素的固体LB板上,37℃培养过夜;挑单克隆,接种到4mL LB液体培养基中(含氨苄抗生素50μg/mL),37℃摇床培养过夜。使用TIANGEN无内毒素质粒小提中量试剂盒抽提质粒,得到质粒dCas9-Mdm2,p53-VPR,sgRNA,dtomato。
4、293T细胞转染
实验选用易转染的HEK293T细胞。24孔板每孔加600μl含10%FBS的DMEM培养基和含有7万293T细胞的细胞悬液。放入细胞培养箱中培养约24小时,待细胞密度达到70%-80%时准备转染。将质粒dCas9-Mdm2450ng,p53-VPR300ng,sgRNA 15ng,dtomato 180ng共945ng与Opti-MEM混合至总体积100μl。1.89μl转染试剂2000加Opti-MEM补足到100μl孵育5min。将质粒和转染试剂的Opti-MEM溶液混合均匀,补加100μl Opti-MEM,室温孵育20min。取出24孔细胞培养板,吸去培养基,并用PBS轻轻冲洗细胞,吸去PBS,加入孵育好的质粒转染混合液,在37℃,5%CO2培养箱中转染4h,吸去转染混合液,加入600μl含DMEM+10%FBS培养基,培养48h。
实施例2:检测小分子抑制剂nutlin-3a对p53-Mdm2蛋白相互作用的影响
上述实施例1中所述的Mdm2不仅能与p53发生蛋白相互作用,同时也是咪唑啉类小分子抑制剂nutlin-3a的结合蛋白。nutlin-3a是一种特异性Mdm2抑制剂,它能与Mdm2蛋白N端的疏水性裂口有效结合,从而阻止其与p53结合。上述系统转染293T细胞后用nutlin-3a处理,可以检测nutlin-3a对p53和Mdm2相互作用的影响。
具体方法是在实施例1所述的细胞转染4h后,吸去转染混合液,换成1ml含0、10、20、30、40μM小分子抑制剂nutlin-3a的DMEM+10%FBS培养基培养48h。
细胞转染48h后,用荧光显微镜和流式细胞仪检测红色荧光蛋白dtomato表达情况。荧光显微镜拍摄结果如图4所示,293T细胞在0,20,40μM nutlin-3a作用下,随着nutlin-3a浓度的增加,表达红色荧光蛋白的细胞数量逐渐减少。流式细胞仪检测结果也是类似的趋势。如图5所示,nutlin-3a的浓度为40μM时,293T细胞表达的红色荧光蛋白平均强度下降到不添加nutlin-3a时的41.6%。该结果表明nutlin-3a在293T细胞中可模拟p53的分子结构与Mdm2结合,抑制p53和Mdm2之间蛋白相互作用,使转录激活因子VPR无法靶向激活报告基因红色荧光蛋白的转录和表达,导致红色荧光蛋白表达量下降。说明在293T细胞内能够发生p53-Mdm2蛋白相互作用且该相互作用受Mdm2抑制剂nutlin-3a的调控。
然后用荧光定量PCR技术检测报告基因mRNA的表达情况。收集24孔板内转染48h后的293T细胞,用TIANGEN RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒提取293T细胞的总RNA。提取的RNA OD260/OD280=1.9~2.1,说明RNA纯度较高,可进行后续实验。RNA逆转录成cDNA使用TIANGEN FastKing一步法去除基因组cDNA第一链合成预混试剂(购自TIANGEN)完成。然后进行荧光定量PCR,以上一步得到的dtomato的cDNA为目的基因,核糖体18sRNA为内参基因,分别对两种基因设计荧光定量PCR引物(如表1所示)。用qPCR检测报告基因mRNA的表达水平。使用靶向不相关基因的sgRNA和其他质粒共转染293T细胞得到的cDNA作为阴性对照。荧光定量PCR使用TIANGEN SuperReal荧光定量预混试剂完成。运用比较Ct值法计算不同浓度nutlin-3a处理下报告基因mRNA的变化倍数。设计dtomato和核糖体18sRNA的荧光定量PCR引物如表1所示。
表1 qPCR所需引物
检测结果如图6所示,可以看出,报告基因mRNA的变化趋势与流式细胞仪所测得的红色荧光强度结果一致。报告基因mRNA表达量随nutlin-3a浓度增加而降低,nutlin-3a浓度为40μM时,报告基因mRNA表达量降为不添加nutlin-3a时的11.0%,说明nutlin-3a破坏了p53-Mdm2蛋白相互作用并且呈现浓度依赖性。因此,该体系能够检测不同浓度nutlin-3a对293T细胞内p53-Mdm2蛋白相互作用的影响。另外,如果将nutlin-3a替换为其它Mdm2抑制剂,则该体系同样适用于检测其它Mdm2蛋白抑制剂对p53-Mdm2蛋白相互作用的影响。
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.用于Mdm2蛋白功能检测的组合物或试剂盒,其特征在于,所述组合物或试剂盒包括dCas9-Mdm2融合蛋白的编码基因、p53-转录激活因子(例如p53-VP64-P65-Rta(VPR))融合蛋白的编码基因、sgRNA的转录基因和报告基因,所述sgRNA用于引导dCas9-Mdm2蛋白靶向所述报告基因,任选地所述基因构建在一个或多个(例如1、2、3、4个)表达载体上。
2.根据权利要求1所述的组合物或试剂盒,其中dCas9与Mdm2蛋白的编码基因之间,以及p53与VPR蛋白的编码基因之间均通过连接链的编码基因连接,形成两种融合蛋白的表达基因。
3.根据权利要求1或2所述的组合物或试剂盒,其中所述Mdm2蛋白的编码基因的序列如SEQ ID NO.1所示,所述p53蛋白的编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示,和/或所述连接链的编码基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物或试剂盒,所述报告基因是编码荧光蛋白的基因,如dtomato基因,所述dtomato基因的序列如SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求4所述的组合物或试剂盒,所述sgRNA的转录基因的序列是SEQ IDNO.5。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物或试剂盒,其还包括小分子抑制剂nutlin-3a。
7.权利要求1-6中任一项所述的组合物或试剂盒在检测Mdm2功能中的用途或在筛选Mdm2抑制剂中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途,其中,所述用途用于哺乳动物细胞。
9.检测Mdm2的功能的方法,其包括将权利要求1-6中任一项所述的组合物或试剂盒中的基因或载体转染进哺乳动物细胞中,并检测报告基因的表达情况,任选地,所述方法还包括利用改变nutlin-3a的浓度调控Mdm2和p53蛋白相互作用。
10.组合物或试剂盒,其包括权利要求1-6中任一项中定义的基因或载体。
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