CN115807066A - 一种通过数字pcr检测基因编辑的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种通过数字PCR检测基因编辑的方法及其应用，属于基因检测分析和分子生物学技术领域。本发明在通过基因编辑技术进行基因功能研究和基因治疗过程中通常需要进行基因编辑检测，然而现有的基因编辑检测方法面临着检测灵敏度低，以及检测结果准确度差的问题。本发明通过基因编辑敏感引物，借助高特异性Taq酶对引物/模板错配的敏感性，来区分发生编辑的基因序列和未发生编辑的基因序列，进而利用数字PCR技术，在微滴为单元的体系中对每个DNA分子进行扩增、检测和计数，通过计数的方式实现基因编辑的绝对准确定量，因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于基因检测分析和分子生物学技术领域，具体涉及一种通过数字PCR检测基因编辑的方法及其应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
CRISPR/Cas9基因编辑技术在科学研究、临床治疗和作物育种等多个领域得到了迅猛的发展和应用。在实际使用中通常需要对发生基因编辑产生indel变异的效率进行定量，目前，indel频率检测的方法中，基因编辑频率数字PCR(GEF-dPCR)和基因组编辑检测PCR(getPCR)是两种基于PCR技术的拥有较大潜力的新型检测方法，具有简便、快速的优点。
数字PCR即Digital PCR(dPCR)，基本原理是将PCR反应体系分散成数以万计的小微滴进行PCR扩增，每个小微滴中包含一个拷贝的核酸分子模板，PCR完成后对每个液滴进行荧光信号检测和分析，即可实现对DNA分子个数的绝对定量。GEF-dPCR方法就是基于数字PCR技术，在反应体系中包含一个indel敏感性探针和一个indel非敏感性探针，其中indel敏感性探针与野生型序列完全匹配，负责区分野生型序列与发生indel的序列，理想情况下只有野生型序列模板的扩增会产生荧光信号，indel序列模板因为和探针之间存在错配所以不产生荧光信号。而indel非敏感性探针不受indel影响，野生型序列与indel序列均可产生荧光扩增信号。根据单荧光信号阳性事件数与双荧光信号阳性事件数，就可以定量出野生型序列以及indel序列的比例，确定indel发生频率。然而，该技术对indel的检测大大受限于indel敏感探针区分indel序列与野生序列的能力，实际应用中大量indel序列即使不能与indel敏感探针完全匹配，在扩增过程中也会产生荧光信号，在结果中产生大量的“雨点”信号，大大影响阴性扩增微滴的判定，严重影响基因编辑分析结果的准确性。
而getPCR技术则通过实时定量PCR的方法，使用野生型序列特异性的引物来区分indel序列和野生序列，选择性扩增和定量未发生基因编辑的野生型序列的比例，确定发生indel的频率。它利用了Taq DNA聚合酶在启动DNA复制时对引物3’端核苷酸错配的敏感性，发生indel的模板由于不能和引物完全匹配，导致不能进行PCR扩增，无法产生扩增信号。而未发生编辑的野生型序列则可以正常扩增，并产生扩增荧光信号，藉此准确且快速地定量野生型序列在样本中的比例，进而确定发生indel的频率。但该方法区分indel序列与野生型序列的能力高度依赖也受限于TaqDNA聚合酶的特异性。并且，该方法无法直接定量发生编辑的基因序列，只能通过确定未发生编辑基因的比例，进而间接定量基因编辑效率。一方面，该方法检测结果的准确性会受到引物扩增效率的影响，另一方面，在基因编辑效率较低的时候，比如低于10％，检测结果的准确性大大降低。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种通过数字PCR检测基因编辑的方法及其应用。本发明通过基因编辑敏感引物，借助高特异性Taq酶对引物/模板错配的敏感性，来区分发生编辑的基因序列和未发生编辑的基因序列，进而利用数字PCR技术，在微滴为单元的体系中对每个DNA分子进行扩增、检测和计数，通过计数的方式实现基因编辑的绝对准确定量。基于上述研究成果，从而完成本发明。
为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种通过数字PCR检测基因编辑的方法，所述方法包括：采用getPCR技术，基于数字PCR系统，向系统中加入包括高特异性Taq DNA聚合酶在内的PCR反应成分进行PCR反应，并基于PCR反应结果对基因编辑产生indel变异的效率进行定量分析。
所述高特异性Taq DNA聚合酶至少表现出对引物-模板错配(特别是由indel引起的)选择性(敏感性)的提高，上述高特异性Taq DNA聚合酶在CN 112921015A中已有部分展示，但并不必然为上述专利中所记载的高特异性Taq DNA聚合酶，事实上，现有已知的任意具有优于野生型Taq DNA聚合酶对indel造成的引物-模板错配选择性(敏感性)的Taq DNA聚合酶均可适用于本申请的检测方法，因此均在在本申请保护范围之内。
所述数字PCR系统是基于数字PCR技术获得的相关装置设备，如前所述，数字PCR技术的基本原理是将PCR反应体系分散成数以万计的小微滴进行PCR扩增，每个小微滴中包含一个拷贝的核酸分子模板，PCR完成后对每个液滴进行荧光信号检测和分析，即可实现对DNA分子个数的绝对定量。
本发明的第二个方面，提供一种通过数字PCR检测基因编辑的产品，所述产品至少包括高特异性Taq DNA聚合酶，以及上述数字PCR系统。
当然，所述产品还可以包括基于数字PCR系统进行PCR扩增和分析的任意试剂、装置和设备，如PCR扩增反应体系成分、样品处理系统、数字PCR芯片、PCR扩增仪、生物芯片阅读仪等，在此不做具体限定。
本发明的第三个方面，提供上述方法和/或产品在如下任意一种或多种中的应用：
(a)准确区分和定量indel序列；
(b)准确定量基因突变。
其中，所述(b)中，所述基因突变为单碱基变异。
经试验证明，基于高特异性Taq388酶的数字PCR技术能够准确检测并定量单碱基基因突变，在突变位点的基因分型分析，循环肿瘤DNA的检测等领域应用前景广泛。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案利用高特异性Taq酶对引物/模板错配的敏感性来提高PCR识别和区分基因编辑序列的能力，通过数字PCR技术实现了基因编辑序列的灵敏、准确、直接的绝对定量方法。该方法可以精准的定量发生基因编辑的频率，即使在编辑频率较低的情况下，比如低于10％的时候，依然表现出非常理想的准确性和灵敏度。更进一步的，该方法在基因突变检测中也有同样优秀的表现，用突变核苷酸位于3’末端的引物可完全区分野生型和突变型DNA，在突变位点的基因分型分析，循环肿瘤DNA的检测等领域有非常大的应用价值和广阔的应用前景。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中基因编辑效率的GEF-dPCR分析结果。其中，a为基因不同比例indel质粒模板的数字PCR扩增微滴的FAM荧光和HEX荧光一维散点图，b为不同indel比例模板数字PCR扩增微滴FAM荧光和HEX荧光的二维展示图，HEX荧光代表indel敏感探针的扩增信号，FAM代表非indel敏感探针的扩增信号；
图2为本发明实施例中基因编辑效率的get-dPCR分析结果，为不同indel比例质粒模板get-dPCR扩增微滴的FAM和HEX荧光一维散点图，FAM荧光代表indel敏感PCR扩增的荧光信号，HEX荧光代表indel非敏感PCR扩增信号，dPCR表示作为对照的普通Taq酶产品；
图3为本发明实施例中基因编辑效率的get-dPCR分析结果，为不同indel比例质粒模板get-dPCR扩增微滴的FAM和HEX荧光二维散点图，FAM荧光代表indel敏感PCR扩增的荧光信号，HEX荧光代表indel非敏感PCR扩增信号，dPCR表示作为对照的普通Taq酶产品；
图4为本发明实施例中基因编辑效率的get-dPCR分析定量结果图，为get-dPCR定量的indel频率和实际indel频率之间的相关性分析图，dPCR表示作为对照的普通Taq酶产品；
图5为本发明实施例中通过get-dPCR技术检测基因突变的微滴荧光一维散点图，CY5，FAM，ROX和HEX荧光分别代表Kras-35G>T，BRAF-1799T>A，BRAF-1391G>T和非突变对照扩增信号dPCR表示作为对照的普通Taq酶产品；
图6为本发明实施例中通过get-dPCR技术检测基因突变的微滴荧光二维散点图，CY5，FAM，ROX和HEX荧光分别代表Kras-35G>T，BRAF-1799T>A，BRAF-1391G>T和非突变对照扩增信号，dPCR表示作为对照的普通Taq酶产品。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如前所述，现有的基因编辑检测方法面临着检测灵敏度低，以及检测结果准确度差的问题。有鉴于此，本发明通过基因编辑敏感引物，借助高特异性Taq酶对引物/模板错配的敏感性，来区分发生编辑的基因序列和未发生编辑的基因序列，进而利用数字PCR技术，在微滴为单元的体系中对每个DNA分子进行扩增、检测和计数，通过计数的方式实现基因编辑的绝对准确定量。
具体的，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种通过数字PCR检测基因编辑的方法，所述方法包括：采用getPCR技术，基于数字PCR系统，向系统中加入包括高特异性Taq DNA聚合酶在内的PCR反应成分进行PCR反应，并基于PCR反应结果对基因编辑产生indel变异的效率进行定量分析。
所述高特异性Taq DNA聚合酶至少表现出对引物-模板错配(特别是由indel引起的)选择性(敏感性)的提高，上述高特异性Taq DNA聚合酶在CN 112921015A中已有部分展示，但并不必然为上述专利中所记载的高特异性Taq DNA聚合酶，事实上，现有已知的任意具有优于野生型Taq DNA聚合酶对indel造成的引物-模板错配选择性(敏感性)的Taq DNA聚合酶均可适用于本申请的检测方法，因此均在在本申请保护范围之内。具体的，在本发明的一个具体实施方式中，所述高特异性Taq DNA聚合酶选用的是Taq388 DNA聚合酶，经试验证明，基于高特异性Taq388酶的数字PCR方法能准确定量indel效率，从而真正意义上实现了indel变异序列的绝对和准确定量。
所述数字PCR系统是基于数字PCR技术获得的相关装置设备，如前所述，数字PCR技术的基本原理是将PCR反应体系分散成数以万计的小微滴进行PCR扩增，每个小微滴中包含一个拷贝的核酸分子模板，PCR完成后对每个液滴进行荧光信号检测和分析，即可实现对DNA分子个数的绝对定量。因此，只要是基于上述原理制备得到的数字PCR系统均可适用于本申请的技术方案。在本发明的一个具体实施方式中，使用的是小海龟科技BioDigital·青数字PCR系统进行扩增反应和信号分析。
所述方法中，其他PCR反应成分均为现有基于getPCR技术进行PCR扩增的反应成分，如基因编辑敏感引物(包括上、下游引物)、TaqMan荧光探针等，当然，还包括待测DNA样品，所述PCR反应成分还包括PCR反应缓冲液等。
在本发明的一个具体实施方式中，反应过程中所涉及的引物和探针如下所示：
HB13-indelf:GTGCCTTATGGTTACTTTGGAGGC(SEQ ID NO.5)；
HB13-r:CTCCGCGGGGTACGCGGCCA(SEQ ID NO.6)；
HB13-Ctrl-FAM:FAM-ccctgtgcccaggcagccacc-BHQ1(SEQ ID NO.7)。
在本发明的一个具体实施方式中，上述方法包括：在反应体系中含有5×TaqManprobe mix，质粒DNA，上、下游引物和探针以及Taq388聚合酶；配置好反应体系后使用数字PCR系统进行反应和分析；具体的，将反应体系加载到数字PCR芯片中，然后在PCR扩增仪上进行PCR扩增，PCR反应结束之后读取芯片上PCR扩增产生的荧光信号，并进行indel频率定量分析。
在本发明的一个具体实施方式中，PCR扩增的程序具体为：50℃孵育10min，95℃初始变性10min，然后是45个循环的扩增(95℃变性30s，65℃退火延申30s)，最后25℃保温。
在本发明的一个具体实施方式中，提供一种通过数字PCR检测基因编辑的产品，所述产品至少包括高特异性Taq DNA聚合酶，以及上述数字PCR系统。
当然，所述产品还可以包括基于数字PCR系统进行PCR扩增和分析的任意试剂、装置和设备，如PCR扩增反应体系成分、样品处理系统、数字PCR芯片、PCR扩增仪、生物芯片阅读仪等，在此不做具体限定。
在本发明的一个具体实施方式中，提供上述方法和/或产品在如下任意一种或多种中的应用：
(a)准确区分和定量indel序列；
(b)准确定量基因突变。
其中，所述(b)中，所述基因突变为单碱基变异。当基因突变位点为Kras35G>T、BRAF1391G>T和BRAF1799T>A时，所使用的引物包括SEQ ID NO.11-22。
经试验证明，基于高特异性Taq388酶的数字PCR技术能够准确检测并定量单碱基基因突变，在突变位点的基因分型分析，循环肿瘤DNA的检测等领域应用前景广泛。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
实施例
1.实验材料和方法
质粒模板
将26种在HOXB13基因序列上模拟不同类型indel变异序列的质粒等比例混合，作为indel频率为100％质粒模板。然后将其与含有HOXB13野生型序列的质粒按照一定比例混合，即可得到indel频率为1％，10％，50％的质粒，作为测试DNA模板进行检测。使用到的26种模拟不同类型indel突变的质粒序列及编号如下：
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agctcccgtgccttatggttactttaggcgggtactactcctgccgagtgtcccggag-OE67,d2L
agctcccgtgccttatggttacttaggcgggtactactcctgccgagtgtcccggag-OE68,d3L
agctcccgtgccttatggttacaggcgggtactactcctgccgagtgtcccggag-OE69,d5L
agctcccgtgccttatgaggcgggtactactcctgccgagtgtcccggag-OE70,d10L
ccaggggacgtccccagctcccgtgccaggcgggtactactcctgccgagtgtcccgga-OE71,d15L
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agctcccgtgccttatggttactttggactactcctgccgagtgtcccggag-OE74,d8R
agctcccgtgccttatggttactttggggtactactcctgccgagtgtcccggag-OE75,d5R
agctcccgtgccttatggttactttggtactcctgccgagtgtcccggag-OE76,d10R
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agctcccgtgccttatggttactttgggcgggtactactcctgccgagtgtcccggag-OE78,d1L1R
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agctcccgtgccttatggttactttcgggtactactcctgccgagtgtcccggag-OE80,d2L3R
agctcccgtgccttatggttactttggtactactcctgccgagtgtcccggag-OE81,d2L5R
agctcccgtgccttatggttacttttactcctgccgagtgtcccggag-OE82,d2L10R
agctcccgtgccttatggttactttggAaggcgggtactactcctgccgagtgtcccgga-OE84,iA
agctcccgtgccttatggttactttggTaggcgggtactactcctgccgagtgtcccggag-OE85,iT
agctcccgtgccttatggttactttggGaggcgggtactactcctgccgagtgtcccggag-OE86,iG
agctcccgtgccttatggttactttggCaggcgggtactactcctgccgagtgtcccggag-OE87,iC
agctcccgtgccttatggttactttggAAaggcgggtactactcctgccgagtgtcccggag-OE88,iAA
agctcccgtgccttatggttactttggATAggcgggtactactcctgccgagtgtcccggag-OE89,iAT
agctcccgtgccttatggttactttggAGAggcgggtactactcctgccgagtgtcccggag-OE90,iAG
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agctcccgtgccttatggttactttggAAAAggcgggtactactcctgccgagtgtcccggag-OE92,iAAA
GEF-dPCR分析实验
在30μL反应体系中含有6μL5×TaqMan probe mix，50fg质粒DNA，6pmol的上、下游引物和3pmol的indel敏感和对照探针，0.6μL的Taq388聚合酶。配置好反应体系后使用小海龟科技BioDigital·青数字PCR系统进行扩增反应和信号分析。首先使用全自动样品处理系统loaderS200将反应体系加载到数字PCR芯片中，然后在PCR扩增仪CyclerS200上使用如下程序进行PCR扩增：50℃孵育10min，95℃初始变性10min，然后是45个循环的扩增(95℃变性30s，65℃退火延申30s)，最后25℃保温。PCR反应结束之后使用生物芯片阅读仪ImagerT200读取芯片上的扩增荧光信号，并进行定量分析。
PCR扩增的上下游引物序列为：
HB13-f：CAGCTCCCGTGCCTTATGGTTAC(SEQ ID NO.1)；
HB13-r:CTCCGCGGGGTACGCGGCCA(SEQ ID NO.2)，
Indel敏感TaqMan探针：
HB13-Indel-HEX:HEX-TGGAGGCGGGTACTACTCCTGCCG-BHQ1(SEQ ID NO.3)，
对照TaqMan探针
HB13-Ctrl-FAM:FAM-ccctgtgcccaggcagccacc-BHQ1(SEQ ID NO.4)。
数字PCR分析indel频率
在30μL反应体系中含有6μL5×TaqMan probe mix，50fg质粒DNA，6pmol的上、下游引物和3pmol的探针，0.6μL的Taq388聚合酶。配置好反应体系后使用小海龟科技BioDigital·青数字PCR系统进行反应和分析。首先使用全自动样品处理系统loaderS200将反应体系加载到数字PCR芯片中，然后在PCR扩增仪CyclerS200上使用如下程序进行PCR扩增：50℃孵育10min，95℃初始变性10min，然后是45个循环的扩增(95℃变性30s，65℃退火延申30s)，最后25℃保温。PCR反应结束之后使用生物芯片阅读仪ImagerT200读取芯片上PCR扩增产生的荧光信号，并进行indel频率定量分析。同时，作为比较分析的普通商品化Taq酶，我们按照商品说明书的建议在30μL反应体系中加入3μL10×dPCR buffer，50fg质粒DNA，6pmol的上、下游引物和3pmol的探针，1μL的dTaq聚合酶。其他反应条件同Taq388的扩增反应。
使用的indel检测扩增子的引物和探针序列分别为：
HB13-indelf:GTGCCTTATGGTTACTTTGGAGGC(SEQ ID NO.5)；
HB13-r:CTCCGCGGGGTACGCGGCCA(SEQ ID NO.6)；
HB13-Ctrl-FAM:FAM-ccctgtgcccaggcagccacc-BHQ1(SEQ ID NO.7)。
对照扩增子的上下游引物和探针分别为：
HB13-Ctrl-f:GTTCATCACCAAGGACAAGAGGCG(SEQ ID NO.8)
HB13-Ctrl-r:TGTTCTTCACCTTGGCGAGAACCT(SEQ ID NO.9)，
HB13-HEX:HEX-CTCGGCAGCCACCAGCCTCTCG-BHQ1(SEQ ID NO.10)。
dPCR检测基因突变
在设计单碱基基因突变检测引物时，突变核苷酸位于引物的3’末端，本研究以临床上肿瘤基因检测常用的三个基因突变位点Kras35G>T、BRAF1391G>T和BRAF1799T>A为例，进行了测试分析。引物序列如下：
Kras35G>T：
KrasMut-f:CACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTG(SEQ ID NO.11)
KrasMut-probe:CY5-AGCTCCAACTACCACAAGTT-MGB(SEQ ID NO.12)
KrasMut-r:AAGGCACTCTTGCCTACGCCAA(SEQ ID NO.13)
BRAF1799T>A:
BRAF1799-f:AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGA(SEQ ID NO.14)
BRAF1799-probe:FAM-TCTCGATGGAGTGGGTCCC-MGB(SEQ ID NO.15)
BRAF1799-r:CCATCCACAAAATGGATCCAGACAACTG(SEQ ID NO.16)，
BRAF1391G>T:
BRAF1391-r:TTGTAGACTGTTCCAAATGATCCAGATA(SEQ ID NO.17)
BRAF1391-probe:ROX-TGTCCCACTGTAATCTGCCC-MGB(SEQ ID NO.18)
BRAF1391-f:CGGGACTCGAGTGATGATTGGGAGA(SEQ ID NO.19)
对照扩增：
KrasCtrl-f:GCTCGGCCAGTACTCCCGGC(SEQ ID NO.20)
KrasCtrl-probe:HEX-CGCCATTTCGGACTGGGAG-3’MGB(SEQ ID NO.21)
KrasCtrl-r:CCGCCGCCTTCAGTGCCTGC(SEQ ID NO.22)
在30μL反应体系中含有6μL5×TaqMan probe mix，10ng细胞基因组DNA，三个突变位点以及对照扩增的上、下游引物各6pmol和探针各3pmol，0.6μL的Taq388聚合酶。配置好反应体系后使用小海龟科技BioDigital青数字PCR系统进行反应和分析。首先使用全自动样品处理系统loaderS200将反应体系加载到数字PCR芯片中，然后在PCR扩增仪CyclerS200上使用如下程序进行PCR扩增：50℃孵育10min，95℃初始变性10min，然后是45个循环的扩增(95℃变性30s，65℃退火延申30s)，最后25℃保温。PCR反应结束之后使用生物芯片阅读仪ImagerT200读取芯片上的扩增荧光信号，并进行基因突变分析。同时，作为比较分析的普通商品化Taq酶，按照商品说明书的建议，在30μL反应体系中含有3μL10×dPCR buffer，10ng基因组DNA，6pmol的上、下游引物和3pmol的探针，1μL的dTaq聚合酶。其他反应条件同Taq388的扩增反应。
2.实验结果
现有GEF-dPCR方法识别indel的能力不足
以indel序列占比分别为0％，50％和100％的质粒DNA作为测试模板，使用FAM标记的indel非敏感性探针和HEX标记的indel-敏感性探针进行GEF-dPCR分析来检测模板DNA中indel序列的比例，考察该检测方法的准确性。如图1所示，作为对照扩增的FAM信号，阳性微滴显示了几乎五倍于阴性微滴的荧光信号强度，对应于indel敏感探针的HEX荧光扩增信号，野生型序列阳性微滴的HEX荧光信号强度更是达到了阴性微滴的14倍，表明PCR扩增是成功的和有效的。
然而，对于带有indel序列的模板，indel敏感探针扩增产生的HEX荧光信号并没有如期望的那样完全消失，而是仅仅显示出了一定程度的下降趋势，在结果图中表现出来就是散在分布于阴性微滴和阳性微滴之间区域的“雨点”，因此，就像文献报道的那样只能参考野生型样本的荧光值划定阈值线，来判定是否为带有indel序列的模板。一方面，阈值线的划定具有比较大的主观性，在某种程度上会影响分析结果的客观性和可靠性。另一方面，分析软件在确定微滴荧光信号的时候，是基于芯片背景荧光值和阳性微滴荧光值来确定信号的倍增系数，在不同芯之间背景荧光信号强度往往存在明显差异，这种差异会严重干扰荧光阈值的确定，以及indel模板微滴的判断。如图1所示，理想情况下对照扩增HEX荧光信号在不同芯片之间应该保持一致的荧光强度，然而，实际检测结果中不同芯片之间却呈现出了很大的差异。这些因素都会严重影响indel频率检测的准确性。
基于高特异性Taq388的dPCR可准确区分和定量indel序列
以indel序列占比1％，10％和50％的质粒混合物作为模板，使用indel敏感的值守引物选择性扩增未发生indel的野生型序列，通过数字PCR分析样本中indel序列的比例。Indel敏感的值守引物落在发生indel的区域，具体来说，引物3‘末端距离发生基因编辑的切点3-6个碱基。本反应中，indel敏感的PCR扩增对应于FAM标记的探针，而非indel敏感的对照扩增则对应于HEX标记的探针。结果如图2所示，不管是indel敏感的FAM荧光信号还是对照扩增的HEX荧光信号，阳性微滴的荧光信号都超过了阴性微滴的十倍，表明PCR扩增具有很高的效率，并且两种信号都仅有极少数量的类似GEF-dPCR中的“雨点”。值得注意的是，与普通商品化Taq酶(dPCR)产品相比，我们Taq388 DNA聚合酶的扩增反应还表现出来更好的芯片间荧光一致性。
在FAM荧光和HEX荧光的二维图结果中可见(图3)，无论是对照扩增和indel敏感性扩增，都仅有极个别的“雨点”微滴，indel序列DNA和野生序列DNA的微滴的FAM荧光扩增信号能够截然区分开来，无需人为根据野生型对照样品的扩增荧光值划定阈值线来判定模板DNA是否发生了indel变异。无论是50％，10％还是1％indel比例的模板，基于高特异性Taq388酶的数字PCR方法都能准确的定量indel效率，检测出的结果分别为(49.15％，48.90％)，(11.84％，10.14％)和(1.02％，1.13％)，与理论值高度吻合(图4)。而普通商品化Taq酶(dPCR)产品检测的indel频率结果则严重偏离预期的理论值。这是因为由于普通Taq酶区分indel序列的能力较低，有将近一半的indel序列会被当成野生型序列。因此，我们的基于高特异性Taq388酶的数字PCR方法在检测indel时具有多种优点，一方面让检测结果的分析更加客观，检测结果更加可信、可靠。另一方面也完全摆脱了不同芯片上微滴扩增荧光信号差异带来的影响，真正意义上实现了indel变异序列的绝对和准确定量。
基于高特异性Taq388酶的数字PCR分析可准确定量基因突变
在临床上，包括肿瘤在内的多种疾病都和基因突变有密切关系，基因突变的检测和定量对于疾病的风险评估，疾病的诊断和治疗，以及疾病的复发监测均有举足轻重的意义。鉴于上述基于高特异性Taq388酶的数字PCR方法展现了强大的区分indel基因变异的能力，我们接下来评估了该方法在单碱基变异检测中的性能。
我们选择了在临床上癌症基因突变检测常用的三个基因变异位点进行了分析，包括Kras-35G>T、BRAF-1799T>A和BRAF-1391G>T。PCR反应中负责识别单碱基突变的引物3’末端恰好落在突变碱基处，使用Lenti-X 293T细胞系的基因组DNA作为野生型序列，并将SW620(Kras35T/T)、MDA-MB-231(BRAF1391G/T)和HT-29(BRAF1799T/A)三种癌细胞系的基因组DNA的等比例混合物作为带有三种基因突变的测试样品。PCR反应时在同一个反应体系中同时进行四个扩增子的反应，分别是对应HEX标记探针的对照扩增，以及分别对应CY5、FAM和ROX标记探针的Kras-35G>T、BRAF-1799T>A和BRAF-1391G>T扩增反应。微滴的PCR扩增荧光信号图(图5)显示，HEX荧光信号代表的对照扩增在普通商品化Taq酶(dPCR)产品和Taq388酶中均表现出了良好的信噪比，阳性微滴的信号都超过阴性微滴的十倍。值得关注的是，商品化的dPCR酶产品在扩增lenti-X 293T细胞基因组DNA时，尽管其不携带Kras-35G>T、BRAF-1799T>A和BRAF-1391G>T基因突变，但是代表这三种基因突变扩增的CY5、FAM和ROX荧光信号却与带有这些基因突变的癌细胞基因组达到了相同的强度，表明商品化dPCR酶产品区分单碱基的基因突变的能力严重不足。相反的，高特异性Taq388酶在三个基因突变位点上的扩增均展现出了完美区分突变DNA和野生型DNA的能力，在lenti-X 293T细胞基因组DNA上，针对三种基因突变的扩增都几乎未产生阳性扩增微滴(图5)。并且与普通商品化Taq酶(dPCR)相比，扩增癌细胞基因组DNA微滴的荧光信号与阴性微滴之间拥有更好的分离度。二维荧光散点图(图6)则进一步展示了这个结果。因此，基于高特异性Taq388酶的数字PCR技术能够准确检测并定量单碱基基因突变，在突变位点的基因分型分析，循环肿瘤DNA的检测等领域有非常大的应用价值和广阔的应用前景。
本发明未尽事宜为公知技术。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种通过数字PCR检测基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括：采用getPCR技术，基于数字PCR系统，向系统中加入包括高特异性Taq DNA聚合酶在内的PCR反应成分进行PCR反应，并基于PCR反应结果对基因编辑产生indel变异的效率进行定量分析。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高特异性Taq DNA聚合酶至少表现出对引物-模板错配选择性的提高，优选的，所述高特异性Taq DNA聚合酶为Taq388 DNA聚合酶。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述数字PCR系统是基于数字PCR技术获得的相关装置设备。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其他PCR反应成分均为现有基于getPCR技术进行PCR扩增的反应成分，包括基因编辑敏感引物、TaqMan荧光探针、待测DNA样品以及PCR反应缓冲液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，上述方法包括：在反应体系中含有5×TaqManprobe mix，质粒DNA，基因编辑敏感引物和探针以及Taq388聚合酶；配置好反应体系后使用数字PCR系统进行反应和分析；具体的，将反应体系加载到数字PCR芯片中，然后在PCR扩增仪上进行PCR扩增，PCR反应结束之后读取芯片上PCR扩增产生的荧光信号，并进行indel频率定量分析。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR扩增的程序具体为：50℃孵育10min，95℃初始变性10min，然后是45个循环的扩增(95℃变性30s，65℃退火延申30s)，最后25℃保温。
7.一种通过数字PCR检测基因编辑的产品，其特征在于，所述产品至少包括高特异性Taq DNA聚合酶，以及数字PCR系统。
8.如权利要求7所述的产品，其特征在于，所述产品包括基于数字PCR系统进行PCR扩增和分析的任意试剂、装置和设备。
9.权利要求1-6任一项所述方法和/或权利要求7或8所述产品在如下任意一种或多种中的应用：
(a)准确区分和定量indel序列；
(b)准确定量基因突变。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述应用(b)中，所述基因突变为单碱基变异。
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