CN116949143A

CN116949143A - 一种用于检测mthfr和mtrr基因的序列组合物、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN116949143A
Application number: CN202210420659.7A
Authority: CN
Inventors: 霍笑笑; 宋立洁; 乔志宏; 范林林; 孙隽; 张俊青; 石超男
Original assignee: Tianjin Medical Laboratory Bgi
Current assignee: Tianjin Medical Laboratory Bgi
Priority date: 2022-04-20
Filing date: 2022-04-20
Publication date: 2023-10-27

Abstract

本发明公开了一种用于检测MTHFR基因和MTRR基因的序列组合物、试剂盒及相关应用。具体的，本发明提供了一种用于检测MTHFR和MTRR基因的序列组合物，该序列组合物包括分别针对MTHFR基因677C>T、1298A>C、MTRR基因66A>G的三组特异性引物对以及对应的三条探针。上述序列组合物在实际检测中具有极佳的特异性、灵敏度和可重复性，可实现在样品DNA免提取的条件下完成检测。同时，本发明还提供了一种全预混MTHFR和MTRR基因检测试剂盒，在该全预混检测试剂盒中包括PCR预混试剂和阳性质控品。该试剂盒可适用于免提取样本、煮沸法粗提样本、磁珠纯化的样本，可批量操作，样本需求量低，数据处理简便，具有广泛的推广价值。

Description

一种用于检测MTHFR和MTRR基因的序列组合物、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种用于检测MTHFR基因和MTRR基因的序列组合物、试剂盒及相关应用。

背景技术

叶酸对蛋白质、核酸合成及氨基酸代谢有重要作用。孕妇叶酸缺乏与多种自身及新生儿并发症发生有关，如孕妇贫血、妊高症、早产，以及胎儿神经管缺陷、先天性心脏病、唐氏综合征等。

目前研究发现，遗传(基因)突变导致机体对叶酸的利用能力下降。5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)是叶酸-甲硫氨酸代谢途径中的关键酶，分别由MTHFR基因和MTRR基因合成。人的MTHFR基因和MTRR基因具有遗传多态性，MTHFR基因677C>T(rs1801133)位点、1298A>C(rs1801131)位点和MTRR基因66A>G(rs1801394)位点是目前研究最多也是跟叶酸代谢关系最为密切的突变位点，在人群中发生的比例为30.85％、28.58％、46.54％(gnomAD Genome,2022.03)。MTHFR基因的677C>T(rs1801133)位点、1298A>C(rs1801131)位点的多态性可以引起5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶活性降低，导致体内同型半胱氨酸浓度升高，引起新生儿神经管缺陷。MTRR基因编码的相应酶可以使丧失活性的甲硫氨酸合酶(methioninesynthetase，MTR)重新生成具有功能活性的MTR，进而催化甲硫氨酸的合成过程。MTRR基因66A>G(rs1801394)位点突变也会影响相应酶活性，从而使血清中同型半胱氨酸的水平升高，进一步引起相关疾病发生。叶酸相关基因的多态性差异，决定了叶酸利用能力的不同。因此，在临床应用上，叶酸相关基因的单核苷酸多态性检测可作为叶酸个性化补充的给药依据。

目前常见的基因位点多态性的检测方法主要有：DNA直接测序法、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测技术、Taqman探针实时荧光定量PCR法等。其中，DNA直接测序法为DNA碱基突变检测的金标准，但是测序耗时长且价格昂贵，不适合临床推广，无法满足大量样本快速筛查的需求。PCR-限制性片段长度多态性技术需要限制性内切酶识别特异的DNA序列，且需要电泳分析，容易出现结果误判的现象，且通量低，应用局限较大。Taqman探针实时荧光定量PCR法实现了快速检测等需求，但是仍需两孔甚至多孔结合判定结果，容易出现误判，加大数据分析的难度。且目前大部分检测技术都需要纯化的DNA模板，无法满足免提取的要求。

发明内容

本发明的目的在于设计一种可实现样品DNA免提取且单管反应实现MTHFR基因和MTRR基因的三个位点的同时检测的方案，进而提供一种更便于使用且高效简单的检测试剂盒，适用于临床样品的常规检测及筛查。

根据第一方面，本发明提供了一种用于检测MTHFR和MTRR基因的序列组合物，该序列组合物包括分别针对MTHFR基因677C>T(rs1801133位点)、1298A>C(rs1801131位点)、MTRR基因66A>G(rs1801394位点)的三组特异性引物对以及对应的三条探针。具体的，上述三组特异性引物对和三条探针分别为：

MTHFR677引物对：上游引物1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；下游引物2，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

MTHFR1298引物对：上游引物3，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；下游引物4，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

MTRR66引物对：上游引物5，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；下游引物6，其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

MTHFR677探针(探针1)，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，且SEQ ID No.3的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

MTHFR1298探针(探针2)，其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，且SEQ ID No.6的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

MTRR66探针(探针3)，其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，且SEQ ID No.9的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

上述荧光报告基团可选自FAM、VIC、ROX、CY5中的任一种，但需确保上述三条探针的荧光报告基团彼此不相同，荧光淬灭基团则优选MGB。

同时，本发明序列组合物中还进一步包括了内参基因引物对及其探针，在本申请中的一个具体实施方式中，采用ACTB基因作为内参基因，其中，内参基因ACTB引物对包括：上游引物7，其核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；下游引物8，其核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。内参基因ACTB探针(探针4)，其核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，且SEQ ID No.12的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。上述内参基因探针的荧光报告基团可选自FAM、VIC、ROX、CY5中的任一种，荧光淬灭基团则优选MGB。

根据第二方面，本发明提供了一种用于检测MTHFR和MTRR基因的试剂盒，该试剂盒包括上述序列组合物，进一步的该试剂盒还包括其他反应液组分及阳性对照品。特别的，在制备成品试剂盒时，可根据实际应用的样本类型及需求，选择样品免提取或者适配的DNA提取/纯化试剂盒，从而使该试剂盒更方便、快捷地得到应用。在本申请的一种具体实施方式中，提供了一种全预混MTHFR和MTRR基因检测试剂盒，在该全预混检测试剂盒中包括PCR预混试剂和阳性质控品，其中，本发明上述第一方面中的序列组合物与TaqDNA聚合酶、dNTPs和PCR反应缓冲液等一起组成PCR预混试剂。序列组合物包括：MTHFR677引物对及其探针、MTHFR1298引物对及其探针、MTRR66引物对及其探针、内参基因引物对及其探针，上述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，上述荧光报告基团可选自FAM、VIC、ROX、CY5中的任一种，但需确保上述待测位点(MTHFR和MTRR基因)的探针的荧光报告基团彼此不相同，荧光淬灭基团则为MGB。在上述全预混试剂盒中，上游引物的终浓度为0.05-0.15μM，下游引物的终浓度为0.5-1.5μM，待测位点的探针的终浓度为0.1-0.3μM，内参探针的浓度为0.05-0.15μM。阳性质控品采用了基因型为MTHFR C677T(CT型)、MTHFR A1298C(AC型)和MTRR A66G(AG型)的人类基因组DNA。

同时，本发明还进一步提供了上述序列组合物、阳性质控品和试剂盒在MTHFR基因和MTRR基因多态性检测中的应用。

本发明的有益效果在于：一方面，采用本发明的上述序列组合物对样品进行检测时，可根据熔解曲线峰图对应的Tm报告结果，实现单个反应孔/反应管完成MTHFR基因677C>T位点、1298A>C位点，MTRR基因66A>G位点型别的检测。同时，上述序列组合物在实际检测中具有极佳的特异性、灵敏度和可重复性，可实现在样品DNA免提取的条件下完成检测。进一步的，本发明的序列组合物还进一步提供了内参基因引物对及其探针，实现了一个孔检测内参基因的同时，分别对MTHFR基因和MTRR基因3个位点型别进行检测。

另一方面，本发明提供的试剂盒采用多组分PCR预混试剂，该预混试剂包括序列组合物、Taq DNA聚合酶、dNTPs和PCR反应缓冲液，预混后的酶活性和反应液稳定性不受影响，预混的PCR反应液可直接分装于检测孔/反应管中，操作方便，缩短检测时间；该试剂盒可适用于免提取样本、煮沸法粗提样本、磁珠纯化的样本等多种样本类型，可批量操作，同时采用本申请的试剂盒，样本需求量低，数据处理简便，具有广泛的推广价值。

附图说明

图1为阳性质控品的qPCR结果图；

图2为实施例1中待测样品口腔拭子1在两种终浓度条件下于MTHFR 677位点的qPCR结果图；

图3为实施例1中待测样品口腔拭子1在两种终浓度条件下于MTHFR 1298位点的qPCR结果图；

图4为实施例1中待测样品口腔拭子1在两种终浓度条件下于MTRR 66位点的qPCR结果；

图5为实施例2中待测者S1的两种样本类型——免提取和粗提取(煮沸法)在MTHFR677位点的qPCR结果图；

图6为实施例2中待测者S1的两种样本类型免提取和粗提取(煮沸法)在MTHFR1298位点的qPCR结果图；

图7为实施例2中待测者S1的两种样本类型免提取和粗提取(煮沸法)在MTRR 66位点的qPCR结果；

图8实施例2中待测者S1关于MTHFR 677位点的sanger测序结果图；

图9实施例2中待测者S1关于MTHFR 1298位点的sanger测序结果图；

图10实施例2中待测者S1关于MTRR 66位点的sanger测序结果图。

具体实施方式

现有技术检测MTHFR和MTRR基因多态性时，存在操作流程复杂、样本纯化处理过程繁杂、适用样本类型有限、数据分析繁琐等多方面不足，因此，有必要对现有的检测技术进行进一步的改进。本发明分别针对MTHFR基因677C>T位点、MTHFR基因1298A>C位点、MTRR基因66A>G位点设计特异性引物，对目标位点区域进行扩增，并通过标记不同荧光的特异性探针，实现了分别对目标位点进行扩增信号和熔解信号标记。本发明的一种实施方式中，各待测位点的引物及探针的具体序列及其相关荧光基团如表1所示。此时，仅需对基因的每个突变位点设计一条探针即可，大大降低成本。而由于3条探针采用不同的荧光标记，单个反应孔/反应管即可实现多通道多靶点的定性检测，样本需求量低，数据处理简便。实际检测时，通过不同荧光标记探针的信号，识别判断待检测样本是否存在MTHFR基因677C>T、1298A>C，MTRR基因66A>G突变，并通过熔解峰图及对应的Tm判断突变的杂合性(未突变/杂合突变/纯合突变)。

表1各待测位点的引物及探针的具体序列及相关荧光基团

序号	名称	序列	5’-荧光基团
				Seq No.1	上游引物1：MTHFR 677_F	GGAAGAATGTGTCAGCCTCAAA	-
Seq No.2	下游引物2：MTHFR 677_R	CAAAGGCCACCCCGAA	-
				Seq No.3	探针1：MTHFR 677_P	TGAAATCGACTCCCGCA	FAM
Seq No.4	上游引物3：MTHFR 1298_F	GTTTGGTTCTCCCGAGAGGT	-
				Seq No.5	下游引物4：MTHFR 1298_R	ACTACCTCTTCTACCTGAAGAGCAA	-
Seq No.6	探针2：MTHFR 1298_P	ACTTCAAAGACACTTTCTT	CY5
				Seq No.7	上游引物5：MTRR 66_F	CAGCAGGGACAGGCAAA	-
Seq No.8	下游引物6：MTRR 66_R	ACGGCTCTAACCTTATCGGATT	-
				Seq No.9	探针3：MTRR 66_P	CATCGCAGAAGAAATATGT	ROX

注：上述探针的3’端标记荧光淬灭基团均为MGB

进一步说明的是，在本发明中，结合上述引物/探针的序列特点，在检测反应体系中采用了非对称扩增的方式，即通过调整各引物对上下游引物的浓度或配比，实现在有效熔解过程的前提下进一步调节相应的阈值参数，利用目标片段的野生型和突变型DNA模板与各探针匹配的碱基数不同，获得不同的熔解温度Tm值，从而实现型别判定和排除非特异性信号干扰的目的。在本申请的一种实施方式下，经过优化筛选，各待测位点的引物和探针在单管检测(单次反应)的反应体系的终浓度(μM，μmol/L)如下表2所示，即上游引物的终浓度为0.05-0.15μM；下游引物的终浓度为0.5-1.5μM，探针的终浓度均为0.1-0.3μM。

表2反应体系

需要特别说明的是，适用于本发明的待测样本包括但不限于血液和唾液，可直接采用外周血、口腔拭子或唾液样本等作为检测对象(即免提取DNA)，也可通过煮沸法、磁珠法等DNA提取方式对上述样本中的外周血gDNA、口腔拭子gDNA或唾液gDNA进行提取后再行检测。检测的反应体系可参考上述表2，其反应程序可参考以下表3。本发明的上机检测流程较为简单，无需专业人员操作即可，具体的，进行MTHFR和MTRR基因检测时，PCR反应过程的反应条件为：95℃，预变性2-5分钟；95℃变性15-30秒，55℃-65℃退火20-50秒，72℃延伸20-30秒，50个循环，收集荧光信号；熔解曲线过程的反应条件为：95℃，预变性1-2分钟，35℃探针退火杂交2-5分钟；接着熔解温度从35℃开始升温熔解至95℃，升温方式Continuous，升温速率0.04℃/s，收集荧光信号。

表3反应程序

在上述反应体系熔解完成后，则可根据熔解曲线呈平滑的曲线及最高峰对应的Tm值判断待检测样本MTHFR C677T位点、A1298C位点和MTRR A66G位点检测结果，结合本发明的一种具体实施方式，其具体判断标准如下表4所示。具体的，探针1所在荧光通道内的熔解曲线为单峰且Tm值为51±2℃，判断为MTHFR 677位点为野生型，熔解曲线为单峰且Tm值为61±3℃，判断为MTHFR 677位点为突变型，熔解曲线为双峰且Tm值为51±2℃和61±3℃，判断为MTHFR 677位点为杂合型。探针2所在荧光通道内的熔解曲线为单峰且Tm值为67±2℃，判断为MTHFR 1298位点为野生型，熔解曲线为单峰且Tm值为57±2℃，判断为MTHFR 1298位点为突变型，熔解曲线为双峰且Tm值为67±2℃和57±2℃，判断为MTHFR1298位点为杂合型。探针3所在荧光通道内的熔解曲线为单峰且Tm值为68±2℃，判断为MTRR 66位点为野生型，熔解曲线为单峰且Tm值为62±2℃，判断为MTRR 66位点为突变型，熔解曲线为双峰且Tm值为68±2℃和62±2℃，判断为MTRR 66位点为杂合型。

表4检测结果判断

进一步的，在本发明中增加了对内参基因的检测，其目的在于质控样本的质量，如果检测中内参基因未被检出，则可能该样品未被有效加入或样本质量差。考虑到实际检测过程中，造成检测结果不准确或无法完成检测的原因是多方面的，而通过增加对内参基因的检测(设置内参)可快速直接有效的排除模板相关因素。需要说明的是，内参基因的具体选择通常要求该内参基因的引物对及其探针与待测目的基因位点没有关联，除本发明的一种具体实施方式中公开的ACTB基因以外，也可使用其他管家基因进行替代。而在实际设计过程中，该内参基因的探针的荧光标记可以与其中任一个待测目标基因位点的荧光标记关联(即采用相同的荧光报告基团进行标记)，此时，两者将在同一个荧光通道中被检出，因此设计时需注意不要影响待测目标分型。该内参基因的探针的荧光标记也可与其他待测位点的荧光标记不关联，此时，内参基因可在单独荧光通道中被检出。具体可根据实际选择的内参基因选择合适的标记方式及检测方式。此外，关于内参基因的引物对及其探针在反应体系中的终浓度,在本申请的一种具体实施方式中，采用ACTB基因作为内参基因，在单管检测(单次反应)时，其上游引物7的终浓度为0.05-0.15μM，下游引物8的终浓度为0.5-1.5μM的，探针4的浓度为0.05-0.15μM。同时，在结果判定时，该内参基因的Tm阈值为53±3℃，即在探针4所在的荧光通道内存在Tm值为53±3℃的单峰。

进一步的，本发明通过将上述序列组合物与其他试剂进行进一步的组合优化，组成了标准化的试剂盒。在本申请的一种实施方式中，公开了一种全预混试剂盒，其以宝生物技术(北京)有限公司的TaKaRa ExHot Start Version(RR006B)为例，对PCR预混试剂的反应体系进行了详细说明，并给出了该条件下的PCR预混试剂中各组分的优化浓度。需要说明的是，当选择不同品牌或来源的TaqDNA聚合酶、dNTPs和PCR反应缓冲液时，可根据实际情况，基于本发明公开的范围(例如表1所示的反应体系)对上述引物对和探针的具体浓度进行具体调试以获得最佳的使用效果。需要特别说明的是，本发明可采用全预混的方式制备PCR预混试剂并将其以液体形式保存在棕色瓶中，且该PCR预混试剂可以保证在不加其他保护剂的条件下长期稳定保存至少12个月。由于采用了全预混的方式，因此使用方便，操作简单。

而在本申请的试剂盒中，其阳性对照品选择了基因型为MTHFR C677T(CT型)、MTHFR A1298C(AC型)和MTRR A66G(AG型)的人类基因组DNA。在本申请的一种具体实施方式中，该试剂盒的阳性对照品为GM12878人类细胞系的人类基因组DNA，购自Coriell“DNA”(货号NA12878)。该人类基因组DNA也从培养的细胞系“细胞”中提取。需要说明的是，质粒DNA拷贝数高，易污染；使用过程需稀释；低浓度的质粒DNA不稳定，易降解。而由于细胞系DNA是天然的，因此与真实样本的检测结果更为接近。故，采用本发明的人基因组DNA则能有效避免上述采用质粒DNA所带来的问题。阳性质控品的qPCR结果如图1所示。

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。

实施例一：

1、制备引物对及探针，其具体为：

MTHFR 677上游引物1(SEQ ID No.1)；

MTHFR 677下游引物2(SEQ ID No.2)；

MTHFR 677探针1(SEQ ID No.3)：FAM-TGAAATCGACTCCCGCA-MGB；

MTHFR1298上游引物3(SEQ ID No.4)；

MTHFR1298下游引物4(SEQ ID No.5)；

MTHFR1298探针2(SEQ ID No.6)：CY5-ACTTCAAAGACACTTTCTT-MGB；

MTRR66上游引物5(SEQ ID No.7)；

MTRR66下游引物6(SEQ ID No.8)；

MTRR66探针3(SEQ ID No.9)：ROX-CATCGCAGAAGAAATATGT–MGB。

2、检测

1)待测样品

待测样品直接采用口腔拭子(本例中包括三个待测样本——口腔拭子1-3)，无需进行DNA提取。口腔拭子无创，且操作简单，待测者接受度高。

2)配制qPCR反应液

按表5所示的反应体系配置两种不同终浓度的反应液。

表5反应体系

3)设置反应程序并进行检测

将1)待测样品分别加入到上述2)的反应液中。按表6所示设置上机程序，进行PCR反应和熔解曲线检测。本例中采用的荧光定量PCR仪为宏石SLAN-96S。

表6反应程序

4)结果判读

反应体系熔解完成后，将实验结果导出，附图以口腔拭子1为例，具体的，图2-4为待测样品口腔拭子1在两种终浓度条件下(终浓度1和终浓度2)在不同位点的qRCR结果图，图2-4中各自有两组曲线分别表示终浓度1和终浓度2。

上述三个待测样品(口腔拭子1-3)根据相应的Tm值判断检测结果如下表7所示：

表7实施例1检测结果

以口腔拭子1为例说明如下：结合图2-4以及表7可知，该口腔拭子1的3个位点的型别分别为：图2表示口腔拭子1该位点为MTHFR C677T(CT型,杂合型)，图3表示口腔拭子1该位点为MTHFR A1298C(AA型，野生型)，图4表示口腔拭子1该位点为MTRR A66G(AG型，杂合型)。

同时，为验证上述检测结果的正确性，本例中分别对上述3例待测样本分别进行了DNA提取且进行了PCR-Sanger测序，测序结果显示与其口腔拭子检测结果一致，即本例中提供的序列组合物可在对样本DNA进行免提取的条件下对待测样品3个位点的型别进行准确检测。

实施例二：

1、制备引物对及探针，具体为：

MTHFR 677上游引物1(SEQ ID No.1)；

MTHFR 677下游引物2(SEQ ID No.2)；

MTHFR 677探针1(SEQ ID No.3)：FAM-TGAAATCGACTCCCGCA-MGB；

MTHFR1298上游引物3(SEQ ID No.4)；

MTHFR1298下游引物4(SEQ ID No.5)；

MTHFR1298探针2(SEQ ID No.6)：CY5-ACTTCAAAGACACTTTCTT-MGB；

MTRR66上游引物5(SEQ ID No.7)；

MTRR66下游引物6(SEQ ID No.8)；

MTRR66探针3(SEQ ID No.9)：ROX-CATCGCAGAAGAAATATGT–MGB。

内参基因ACTB上游引物7(SEQ ID No.10)，

SEQ ID No.10：TTCCCTCCAGACTACCTCCTTA；

内参基因ACTB下游引物8(SEQ ID No.11)，

SEQ ID No.11：GCCGACCAACACCTAATAATG；

内参基因ACTB探针4(SEQ ID No.12)：ROX-TCAGAGTGTTCCT-MGB。

2、制备检测试剂盒

1)PCR预混试剂的制备

按照表8制备PCR预混试剂，并将其以液体形式分装在棕色瓶中，冷冻保存。全预混的PCR预混试剂操作简单，融化后即可直接分装使用。

表8反应体系

2)阳性对照品：本例中阳性对照品采用GM12878人类细胞系的人类基因组DNA，购自Coriell“DNA”(货号NA12878)，浓度为5ng/ul。该阳性对照品为三个目标位点都为杂合型的标准品DNA。

3)本例中的试剂盒由上述PCR预混试剂和阳性对照品组成。为了验证本例中的PCR预混试剂和阳性对照品的稳定性、有效性、准确性、特异性和可重复性，本例中取9个质检合格的上述用于检测MTHFR基因和MTRR基因的试剂盒，置于-18℃以下，分别于储存1个月、2个月、3个月、5个月、7个月、9个月、12个月、13个月、14个月时，使用阳性对照品和企业参考品进行检测。通过对外观、性状的观察，以及对阳性对照品有效性、企业参考品准确性(阴阳性符合率)、重复性的评估，对各实验条件下的试剂盒进行相关评价。

测试结果显示：

外观、性状：9次待检的试剂盒外包装盒均无明显损坏，各待检试剂盒内各组分包装完整，字迹清晰，无污渍。目测待检试剂盒均未发现试剂泄露和试剂盒组分损坏现象。试剂盒内各组分为透明溶液，无沉淀及絮状物，无肉眼可见颗粒。

阳性对照品有效性：在9次取样检测中，阳性对照品的检测结果均为MTHFR C677T(CT型)、MTHFR A1298C(AC型)和MTRR A66G(AG型)。

准确性与特异性(阴阳性符合率)：在9次取样检测中，试剂盒对P1～P4共4份企业参考品的检测均与表9中已知结果一致。阴阳性符合率为100％。

重复性：9次取样检测时，试剂盒对J1～J8共8份企业参考品各10次的检测结果与表9中已知变异信息一致，且10次重复检测结果各目标Tm值CV≤5％。

表9企业参考品信息

因此，通过上述实验证明，本例中的试剂盒具有良好的稳定性、有效性、准确性、特异性和可重复性。

3、检测

1)待测样品

本例中采用了两种样品类型：口腔拭子(免提取)和外周血(提取DNA)。

(1)对待测者(本例中涉及4位待测者S1-S4)直接采用口腔拭子的方式进行取样，无需进行DNA提取。口腔拭子无创，且操作简单，待测者接受度高。

(2)对应的，对上述(1)的待测者(S1-S4)同时采集外周血，并采用煮沸粗提法进行DNA提取。

2)上机检测

将各个待检测样本、阳性质控品分别加入分装好的PCR预混试剂中，按照表10反应程序进行扩增、熔解检测。本例中采用的荧光定量PCR仪为宏石SLAN-96S。

表10反应程序

3)结果判读：

将4位待测者的8组(口腔拭子和外周血)以及阳性对照品的检测数据导出，附图以待测者S1为例，具体的，图5-7为待测者S1的两种样本类型——免提取和粗提取(煮沸法)在3个不同位点的qPCR结果图，图5-7中各自有两组曲线分别表示免提取和粗提取(煮沸法)。

上述4个待测者的8组检测数据，在满足内参阈值53±3℃的情况下，根据相应的Tm值判断检测结果，具体检测结果如表11所示(包括阳性质控品)：

表11实施例2检测结果

以待测者S1为例说明如下，结合图5-7以及表11可知，该待测者S1的3个位点的型别分别为：图5表示待测者S1该位点为MTHFR C677T(CT型,杂合型)，图6表示待测者S1该位点为MTHFR A1298C(AA型，野生型)，图7表示待测者S1该位点为MTRR A66G(AG型，杂合型)。同时，口腔拭子(免提取)和外周血(提取DNA)的结果均相同。

作为对照，除按照上述方式对待测者S1-S4中提取的DNA进行上述试剂盒检测外，同时将其通过PCR-Sanger法对待检目标位点进行测序，其中，以待测者S1为例，其3个待测位点的测序结果分别如图8-10所示，分别为：图8表示待测者S1该位点为MTHFR C677T(CT型,杂合型)，图9表示待测者S1该位点为MTHFR A1298C(AA型，野生型)，图10表示待测者S1该位点为MTRR A66G(AG型，杂合型)。

4)结论：通过上述实验结果证明，该试剂盒在免提取和提取DNA的条件下均可以准确检测MTHFR基因上C677T位点、A1298C位点和MTRR基因A66G位点的单核苷酸突变情况，其检出性能良好。

由本例可知，本发明通过测试筛选和优化，得到了引物/探针序列的设计和优化，并确定了较优的反应体系和反应程序，建立了标准化可执行的质控体系和结果判读标准，并且对试剂盒适配机型进行了测试和确认，具有模板质量需求低、样本类型广、特异性好、灵敏度高、重复性好、操作简单、成本低、周期短等优点。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津华大医学检验所有限公司

<120> 一种用于检测MTHFR和MTRR基因的序列组合物、试剂盒及应用

<130> 22I33544

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggaagaatgt gtcagcctca aa 22

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caaaggccac cccgaa 16

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgaaatcgac tcccgca 17

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtttggttct cccgagaggt 20

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

actacctctt ctacctgaag agcaa 25

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acttcaaaga cactttctt 19

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cagcagggac aggcaaa 17

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acggctctaa ccttatcgga tt 22

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

catcgcagaa gaaatatgt 19

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttccctccag actacctcct ta 22

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gccgaccaac acctaataat g 21

<210> 12

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcagagtgtt cct 13

Claims

1.一种用于检测MTHFR和MTRR基因的序列组合物，其特征在于，所述序列组合物包括以下引物对和探针：

上游引物1：SEQ ID No.1，下游引物2：SEQ ID No.2；

上游引物3：SEQ ID No.4，下游引物4：SEQ ID No.5；

上游引物5：SEQ ID No.7，下游引物6：SEQ ID No.8；

探针1：SEQ ID No.3；

探针2：SEQ ID No.6；

探针3：SEQ ID No.9；

所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，且探针1、2、3的荧光报告基团彼此不相同。

2.一种如权利要求1所述的序列组合物，其特征在于，进行MTHFR和MTRR基因检测时，所述上游引物1、3、5的浓度为0.05-0.15μM，所述下游引物2、4、6的浓度为0.5-1.5μM，所述探针1、2、3的浓度为0.1-0.3μM。

3.一种如权1或2所述的序列组合物，其特征在于，所述序列组合物还包括：

上游引物7：SEQ ID No.10，下游引物8：SEQ ID No.11；

探针4：SEQ ID No.12；

所述探针4的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；

优选的，进行MTHFR和MTRR基因检测时，所述上游引物7的浓度为0.05-0.15μM，所述下游引物8的浓度为0.5-1.5μM，探针4的浓度为0.05-0.15μM。

4.一种如权1-3中任一项所述的序列组合物，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX、CY5中的任一种，所述荧光淬灭基团为MGB。

5.一种用于检测MTHFR和MTRR基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如权1-4中任一项所述的序列组合物。

6.一种如权5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR预混试剂，所述PCR预混试剂包括序列组合物、TaqDNA聚合酶、dNTPs和PCR反应缓冲液；所述序列组合物由以下引物对和探针组成：

上游引物1：SEQ ID No.1，下游引物2：SEQ ID No.2；

上游引物3：SEQ ID No.4，下游引物4：SEQ ID No.5；

上游引物5：SEQ ID No.7，下游引物6：SEQ ID No.8；

上游引物7：SEQ ID No.10，下游引物8：SEQ ID No.11；

探针1：SEQ ID No.3；

探针2：SEQ ID No.6；

探针3：SEQ ID No.9；

探针4：SEQ ID No.12；

所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX、CY5中的任一种，且探针1、2、3的荧光报告基团彼此不相同，所述荧光淬灭基团为MGB；

所述PCR预混试剂中，所述上游引物1、3、5、7的浓度为0.05-0.15μM，所述下游引物2、4、6、8的浓度为0.5-1.5μM，所述探针1、2、3的浓度为0.1-0.3μM，所述探针4的浓度为0.05-0.15μM。

7.一种如权5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控品，所述阳性质控品为MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G的人类基因组DNA。

8.如权1-4中任一项所述的序列组合物或如权5-7中任一项所述的试剂盒在MTHFR和MTRR基因检测领域的应用。

9.如权8所述的应用，其特征在于，进行MTHFR和MTRR基因检测时，PCR反应过程的反应条件为：95℃，预变性2-5分钟；95℃变性15-30秒，55℃-65℃退火20-50秒，72℃延伸20-30秒，50个循环；熔解曲线过程的反应条件为：95℃，预变性1-2分钟，35℃探针退火杂交2-5分钟；接着熔解温度从35℃开始升温熔解至95℃，升温速率0.04℃/s。

10.如权8所述的应用，其特征在于，进行MTHFR和MTRR基因检测时，熔解曲线判断检测结果的标准是：

所述探针1所在荧光通道内的熔解曲线为单峰且Tm值为51±2℃，判断为MTHFR 677位点为野生型，熔解曲线为单峰且Tm值为61±3℃，判断为MTHFR 677位点为突变型，熔解曲线为双峰且Tm值为51±2℃和61±3℃，判断为MTHFR 677位点为杂合型；

所述探针2所在荧光通道内的熔解曲线为单峰且Tm值为67±2℃，判断为MTHFR 1298位点为野生型，熔解曲线为单峰且Tm值为57±2℃，判断为MTHFR 1298位点为突变型，熔解曲线为双峰且Tm值为67±2℃和57±2℃，判断为MTHFR1298位点为杂合型；

所述探针3所在荧光通道内的熔解曲线为单峰且Tm值为68±2℃，判断为MTRR 66位点为野生型，熔解曲线为单峰且Tm值为62±2℃，判断为MTRR 66位点为突变型，熔解曲线为双峰且Tm值为68±2℃和62±2℃，判断为MTRR 66位点为杂合型。