一种检测ALDH2基因突变的核酸组合及其应用和试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,具体而言,涉及一种检测ALDH2基因突变的核酸组合及其应用和试剂盒。
背景技术
乙醛脱氢酶(Acetaldehyde Dehydrogenase,ALDH)由ALDH基因编码,可分为ALDH1A1、ALDH1B1和ALDH2。其中,ALDH2在人体内把乙醛催化成乙酸的能力最强。ALDH2基因位于第12号染色体(12q24),由13个外显子构成,编码的酶蛋白肽链由500个氨基酸残基组成。研究表明,该基因的多态性在亚洲人群中很常见,并且可能影响人群的饮酒行为。ALDH2与亚洲人群最为密切的是ALDH2基因的rs671位点G→A突变(G671A突变位点),可导致其编码的多肽链谷氨酸(Glu)变为赖氨酸(Lys)。ALDH2基因与酒精在人体内的分解代谢有关,还参与硝酸甘油的代谢。
饮酒后吸收进入体内的乙醇,主要在肝脏进行代谢。乙醇被氧化成乙醛后,95%在肝脏变成乙酸,余下5%在其他组织及血液被代谢掉。乙醇在体内代谢产物是乙醛,是导致酒精性肝病的主要原因。由于ALDH2G(ALDH2*1)的基因序列发生突变形成ALDH2L(ALDH2*2)等位基因,二者随机组合可编码形成ALDH2GG、ALDH2GL或ALDH2LL,3种基因型。ALDH2*1/ALDH2*1基因型(野生型)的饮酒者,体内把乙醛氧化成乙酸能力很强,对乙醇耐受性高,可以过量饮酒,但应适当节制。ALDH2*1/ALDH2*2基因型(突变型杂合型)的饮酒者,血液中乙醛的浓度是前者的6倍,对酒有一定的耐受性,可以适量饮酒。ALDH2*2/ALDH2*2基因型(突变型纯合型)的饮酒者血液中乙醛的浓度是前者的19倍,对酒敏感,没有耐受性,饮酒后很快出现严重不适现象。大量乙醛滞留在体内,除了损伤肝脏导致脂肪肝、肝硬化,甚至肝癌,还与增加食道癌、口咽癌和胃癌、冠心病、心肌梗死等风险相关。
硝酸甘油作为抗心绞痛的经典药物,已有多位学者对其生物转化机制进行了广泛研究,2002年Chen等发现在巯基化合物参与下,ALDH2能够催化硝酸甘油生成1,2-二硝酸甘油和亚硝基硫醇,之后ALDH2在硝酸甘油代谢中的重要作用引起越来越多学者的关注。研究发现,ALDH2*1/ALDH2*1基因型(野生型)具有ALDH2的正常活力,ALDH2*1/ALDH2*2基因型(突变型杂合型)存在6%的酶活力,而ALDH2*2/ALDH2*2基因型(突变型纯合型)则完全丧失酶的活力,使硝酸甘油无法产生一氧化氮,难以发挥药效。
ALDH2除了与酒精性肝病等消化道疾病息息相关外,还与其他一些疾病相关,如消化道肿瘤、白血病、帕金森病(PD)等。
ALDH2位点的多态性为先天遗传,与任何疾病的发生无关,与年龄无关。研究表明,ALDH2*2在人类各族群中的分布是不同的,亚洲人种出现频率较高。中国汉族ALDH2*2的频率为15.5%,墨西哥1.0%,日本人23.8%,欧洲人0%,南非人0%。中国人群中广东汉族最高,达31%,武汉汉族12%,洛阳人15%,上海人25%,台湾人30%。此外,ALDH2各基因型的发生率在男女性别上差异无统计学意义。
综上所述,ALDH2基因多态性检测将为硝酸甘油的用药、饮酒指导及相关高风险疾病的提示提供有效的参考依据,具有重要的临床应用意义。目前,用于ALDH2基因分型的方法有以下几种,各有其特点。
1.限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术(PCR-RFLP)
PCR-RFLP为最为经典的SNP分型方法,它先利用PCR扩增跨越多态位点的靶DNA,然后用相应的限制性核酸内切酶切割PCR产物,最后根据酶切产物的电泳条带判断基因型。例如Hayashida等曾用该法对ALDH2进行分型,PCR扩增目的片段长度为430bp,野生型等位基因(ALDH2*1)会被AcuⅠ酶切成296bp和134bp2个片段,反之,突变型等位基因(ALDH2*2)则不能被AcuⅠ酶切。这样野生型纯合子ALDH2*1/*1的条带为296bp、134bp,杂合子ALDH2*1/*2的条带为430bp、296bp、134bp,突变型纯合子ALDH2*2/*2的条带为430bp。PCR-RFLP分型法操作简单,所需模板DNA量少,无需使用大型贵重仪器,实验中不涉及危险试剂,安全性高。但该法的一个最大缺点在于,会因为内切酶的活性、酶切时间、酶切体系的不恰当等原因造成假阴性或假阳性而出现基因型的误判。
2.等位基因特异性PCR(allele specific PCR,AS-PCR)
AS-PCR的基本原理是根据SNP位点的碱基特点设计2条等位基因特异引物(针对于野生型等位基因的P1、针对突变型等位基因的P2),它们的3’末端与SNP位点的碱基互补(或相同),另需一条按常规方法设计的公共用引物P3。用P1、P3作引物,在野生型等位基因中有扩增产物,在突变型等位基因中没有扩增产物,用P2、P3作引物,情况则刚好相反。PCR结束后,用凝胶电泳检测扩增产物的有无,从而确定基因型。AS-PCR方法避免采取酶切方法,步骤更简洁,但是等位基因特异性PCR扩增方法的假阳性率较高,其对实验要求较严格。
3.Taqman探针技术
Taqman探针技术在普通PCR的基础上增加荧光标记的探针,随着PCR产物的不断增加,荧光的强度不断增强,则可以检测到一个荧光增长曲线。该法的主要不足是采用荧光淬灭及双末端标记技术,其定量检测受酶活性的影响;本底较强,有时无法鉴别高度相关序列;探针标记以及实验仪器成本较高,不便普及应用。
4.高分辨率熔解曲线法
高分辨率熔解曲线分析技术(high resolution melting,HRM)是在实时荧光PCR基础上发展起来的一种新技术,它在PCR体系中加入饱和双链DNA结合染料,在PCR结束后制作高分辨率熔解曲线,根据熔解曲线的不同来对样品进行分型。该方法因其快速、通量大、使用成本低、结果准确,并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。但HRM技术对仪器温度的均一性要求非常高,需Light CycleryTM480PCR仪或Light Scanner等价格高昂的专用仪器及精密的分析软件。另外,该法要求扩增片段的大小在400bp以下,引物设计受到局限,PCR条件的优化比较复杂。
5.直接测序法。
测序法是检测SNP的金标准,准确度高。包括直接测序(双脱氧链终止法)、焦磷酸测序及微测序等。测序需要一些特殊的仪器设备,需要专业人员操作,费用高,周期长;对PCR产物的量、纯度及特异性要求高,PCR后操作步骤繁琐。测序法目前在临床检测方面的应用还是有一定的困难,多作为其他分析方法的确认。
6.变性高效液相色谱法。
该方法的原理基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异,利用色谱方法进行分离。由于杂合双链在突变位点处出现错配,易于形成“Y”型结构,与色谱柱的固定相结合能力降低,因此杂合双链DNA比纯合双链DNA优先洗脱出来,通过洗脱峰的改变可以判断是否存在突变。但它只可判断有无突变,不能确定SNP的位置和类型,需用标准样品或结合测序验证,且需要昂贵特殊仪器及专业分析软件,这也是DHPLC未能得以广泛推行的原因之一。此外,检测过程需要打开反应管,容易造成污染。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种检测ALDH2基因突变的核酸组合,该核酸组合可针对ALDH2基因的rs671位点的G→A突变进行检测,其具有检测灵敏度高、特异性强、假阳性率低等特点。
本发明的第二目的在于提供上述的检测ALDH2基因突变的核酸组合在制备用于检测ALDH2基因突变的试剂盒中的应用。
本发明的第三目的在于提供一种试剂盒,该试剂盒含有上述的核酸组合,可用于ALDH2基因的rs671位点的G→A突变进行检测,其具有检测灵敏度高、特异性强、假阳性率低、操作简便、耗时短、成本低等特点。
本发明的第四目的在于提供上述的检测ALDH2基因突变的核酸组合在检测ALDH2基因突变中的应用。
本发明是这样实现的:
一种检测ALDH2基因突变的核酸组合,其包括SEQ ID NO.1-2所示的上游引物中的一种或两种、SEQ ID NO.3所示的下游引物以及SEQ ID NO.4所示的捕获探针,下游引物的5’端或上游引物的5’端标记有用于结合催化酶的亲和物。
上述的检测ALDH2基因突变的核酸组合在制备用于检测ALDH2基因突变的试剂盒中的应用。
一种试剂盒,其包括上述的检测ALDH2基因突变的核酸组合。
上述的检测ALDH2基因突变的核酸组合在检测ALDH2基因突变中的应用。
与现有技术相比,本发明提供的检测ALDH2基因突变的核酸组合及其应用和试剂盒的有益效果是:
本发明的提供的检测ALDH2基因突变的核酸组合,其包括SEQ ID NO.1-2所示的上游引物中的一种或两种、SEQ ID NO.3所示的下游引物以及SEQ ID NO.4所示的捕获探针。SEQ ID NO.1的上游引物和SEQ ID NO.3下游引物组成的引物对可以用于对野生型ALDH2基因(rs671位点为G)特异性地PCR扩增,得到的扩增产物再在EFIRM技术平台上,被SEQ IDNO.4所示的捕获探针特异性结合捕获,然后得到检出信号,实现检测野生型ALDH2基因的目的;SEQ ID NO.2的上游引物和SEQ ID NO.3下游引物组成的引物对可以用于对突变型ALDH2基因(rs671位点为A)特异性地PCR扩增,得到的扩增产物再通过EFIRM技术可SEQ IDNO.4所示的捕获探针特异性结合捕获,然后得到检出信号,实现检测突变型ALDH2基因的目的。
本发明通过针对ALDH2基因rs671突变位点的两对特异性引物独立地进行PCR,将样本中的微量的靶核酸片段在数量上呈指数增加,从而在短时间内获得大量的靶核酸片段,大大地增加了在后续EFIRM技术平台上的待测模板的数量,进而大大地提高了检测灵敏度。再将PCR扩增得到的PCR产物(含靶核酸片段)用到EFIRM技术平台上,通过捕获探针与靶核酸片段的杂交、进行特异性结合。
由于杂交效率受错配碱基的影响明显,只有靶核酸片段与两条引物、捕获探针同时准确配对后才能有检测信号,即需要两次特异性识别结合(而现有的检测技术通常只有一次特异性识别),这大大提高了检测的特异性。
所以,本发明的提供的检测ALDH2基因突变的核酸组合通过特异性的引物和捕获探针的设计,结合PCR技术的扩增优势和EFIRM技术的特异性捕获特点,提高了检测的灵敏度和特异性,且具有操作便捷、耗时短等特点,其为检测ALDH2基因的rs671位点G→A突变提供了一种新的思路和策略。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的检测ALDH2基因突变的核酸组合及其应用和试剂盒进行具体说明。
一方面,本发明提供的检测ALDH2基因突变的核酸组合,其包括:SEQ ID NO.1-2所示的上游引物中的一种或两种、SEQ ID NO.3所示的下游引物以及SEQ ID NO.4所示的捕获探针,所述下游引物的5’端或所述上游引物的5’端标记有用于结合催化酶的亲和物。
其中,SEQ ID NO.1所示的上游引物为针对野生型ALDH2基因(rs671位点为G)进行扩增设计的野生型上游引物,与下游引物(SEQ ID NO.3)配合,可对野生型ALDH2基因进行特异性扩增,得到含野生型靶核酸片段的PCR产物。相应地,由于引物的末端标记有亲和物,野生型靶核酸片段的末端也就标记有亲和物,在后续的EFIRM技术(电场诱导释放和测量技术)平台上,可结合相应的催化酶,催化底物产生电流,进而被相应仪器(EFIRM精准基因检测仪)检测出。SEQ ID NO.4所示的捕获探针与野生型靶核酸片段的靶区域反向互补结合,通过EFIRM技术可检出野生型靶核酸片段,实现对野生型ALDH2基因的检测。
SEQ ID NO.2所示的上游引物为针对突变型ALDH2基因(rs671位点为A)进行扩增设计的突变型上游引物,与下游引物(SEQ ID NO.3)配合,可对突变型ALDH2基因进行特异性扩增,得到含突变型靶核酸片段的PCR产物。SEQ ID NO.4所示的捕获探针与突变型靶核酸片段的靶区域反向互补结合,通过EFIRM技术可检出突变型靶核酸片段,实现对突变型ALDH2基因的检测。
需要说明的是,本发明提供的检测ALDH2基因突变的核酸组合可以是包括SEQ IDNO.1所示的上游引物、SEQ ID NO.3所示的下游引物以及SEQ ID NO.4所示的捕获探针的这种组合情况,针对野生型ALDH2基因检测;
也可以是包括SEQ ID NO.2所示的上游引物、SEQ ID NO.3所示的下游引物以及SEQ ID NO.4所示的捕获探针的这种组合情况情况,针对突变型ALDH2基因检测;
还可以是SEQ ID NO.1-2所示的两种上游引物、SEQ ID NO.3所示的下游引物以及SEQ ID NO.4所示的捕获探针的这种情况,可同时针对野生型ALDH2基因和突变型ALDH2基因检测。
进一步地,亲和物为地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种。
再一方面,本发明提供了上述的检测ALDH2基因突变的的核酸组合在制备用于检测ALDH2基因突变的的试剂盒中的应用。该试剂盒包括上述的检测ALDH2基因突变的的核酸组合。需要说明的是,核酸组合中的上游引物、下游引物、捕获探针可独立地以粉状形式存在,也可是以溶液的形式存在,或者其它形式存在,均可根据实际情况选择。
另一方面,本发明提供的一种试剂盒,其包括上述的检测ALDH2基因突变的核酸组合。需要说明的是,核酸组合中的上游引物、下游引物、捕获探针可独立地以粉状形式存在,也可是以溶液的形式存在,或者其它形式存在,均可根据实际情况选择。
进一步地,本发明提供的试剂盒还包括将核酸组合的捕获探针固定至检测孔板的固定物。固定物包括导电聚合物和离子化合物。导电聚合物选自吡咯、苯胺和噻吩中的一种,当然,导电聚合物也可以是其他的导电聚合物材料。离子化合物选自氯化钠和氯化钾中的任意一种。导电聚合物带正电,其在电场的作用下形成网状交联结构,被沉积在反应孔的底部,网状交联结构能够稳定地将捕获探针固定在底部,有助于提高捕获探针的稳定性和捕获能力。
进一步地,本发明提供的试剂盒还包括催化酶,催化酶是带有标记物的辣根过氧化物酶,优选地,催化酶是带有链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶。标记物用于与亲和物结合。
当然,催化酶也可以是带有标记物的碱性磷酸酶,标记物为地高辛抗体、异硫氰酸荧光素抗体或链霉亲和素中的任意一种,标记物与亲和物相对应,其可根据引物上的亲和物的类别进行选择。
当亲和物是生物素时,标记物为链霉亲和素;当亲和物是地高辛时,标记物为地高辛抗体;当亲和物是异硫氰酸荧光素时,标记物为异硫氰酸荧光素抗体。只要亲和物与标记物相对应,可相互结合即可。
进一步地,本发明提供的试剂盒还包括底物,底物的类别根据催化酶的类别选择。
当催化酶为辣根过氧化物酶时,底物是TMB(Tetramethylbenzidine、四甲基联苯胺)、ABTS(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)和OPD(o-Phenylenediamine、邻苯二胺)中的任意一种。TMB、ABTS和OPD均是辣根过氧化物酶的底物,在辣根过氧化物酶的催化作用下发生显色反应并伴随电流产生,有助于提高检测信号的释放。
当催化酶为碱性磷酸酶时,底物是对BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3-IndolylPhosphate、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐)和NBT(Nitrotetrazolium Blue chloride、四唑硝基蓝)的组合物、硝基苯磷酸盐、4-硝基苯磷酸二钠、萘酚AS-BI磷酸盐、萘酚-AS-MX-磷酸盐中的任意一种。
进一步地,本发明提供的试剂盒还包括清洗液,清洗液包括洗液A和洗液B,洗液A是含SDS的SSC缓冲液,洗液B是含Tween20的PBS缓冲液。
进一步地,本发明提供的试剂盒还包括PCR反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。
进一步地,本发明提供的试剂盒还可包括检测孔板,检测孔板的反应孔内固定有上述捕获探针。需要说明的是,在其他的实施例中,捕获探针也可不用固定在检测孔板的反应孔内,在使用时采用相应方法将捕获探针固定至检测孔板也是可以的。
本发明通过针对ALDH2基因rs671突变位点的两对特异性引物(SEQ ID NO.1和SEQID NO.3,SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3)独立地进行PCR,将样本中的微量的靶核酸片段在数量上呈指数增加,从而在短时间内获得大量的靶核酸片段,大大地增加了在后续EFIRM技术平台上的待测模板的数量,进而大大地提高了检测灵敏度。再将PCR扩增得到的PCR产物(即野生型靶核酸片段或突变型靶核酸片段)用到EFIRM技术平台上,通过捕获探针与靶核酸片段的杂交、进行特异性结合,将靶核酸片段固定。
由于杂交效率受错配碱基的影响明显,只有靶核酸片段与两条引物、捕获探针同时准确配对后才能有检测信号,即需要两次特异性识别结合(而现有的检测技术通常只有一次特异性识别),这大大提高了检测的特异性。
所以,本发明的提供的检测ALDH2基因突变的核酸组合通过特异性的引物和捕获探针的设计,结合PCR技术的扩增优势和EFIRM技术的特异性捕获特点,提高了检测的灵敏度和特异性,且具有操作便捷、耗时短等特点,其为检测ALDH2基因的rs671位点G→A突变提供了一种新的思路和策略。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的检测ALDH2基因突变的核酸组合包括野生型上游引物、下游引物以及捕获探针,下游引物的5’端标记有生物素(Biotin)。
野生型上游引物的碱基序列如下:
5’-GCTGCAGGCATACACTG-3’(SEQ ID NO.1),其中,下划线部分可与野生型ALDH2基因的的rs671位点(G)对应,其与野生型靶序列完全互补。
野生型靶序列的碱基序列如下:
5’-GCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTCAGGGCCTGTTGGGGCTTGAGGGTCTGCTGGTGGCT-3’。
下游引物的碱基序列如下:
5’-AGCCACCAGCAGACCCTC-3’(SEQ ID NO.3)。
捕获探针的碱基序列如下:
5’-AAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACC-3’(SEQ ID NO.4)。
本实施例提供的探针可用于对野生型ALDH2基因(rs671位点为G)的检测,具有特异性好、灵敏度高等特点。
实施例2
本实施例提供的检测ALDH2基因突变的核酸组合包括:突变型上游引物、下游引物以及捕获探针,下游引物的5’端标记有生物素(Biotin)。
突变型上游引物的碱基序列如下:
5’-GCTGCAGGCATACACTA-3’(SEQ ID NO.2),其中,下划线部分可与突变型ALDH2基因的rs671位点(A)对应。其与突变型靶序列完全互补。
突变型靶序列的碱基序列如下:
5’-GCTGCAGGCATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTCAGGGCCTGTTGGGGCTTGAGGGTCTGCTGGTGGCT-3’。
下游引物的碱基序列如下:
5’-AGCCACCAGCAGACCCTC-3’(SEQ ID NO.3)。
捕获探针的碱基序列如下:
5’-AAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACC-3’(SEQ ID NO.4)。
本实施例提供的探针可用于对突变型ALDH2基因(rs671位点为A)的检测,具有特异性好、灵敏度高等特点。
实施例3
本实施例提供的检测ALDH2基因突变的核酸组合包括:野生型上游引物、突变型上游引物、下游引物以及捕获探针,下游引物的5’端标记有生物素(Biotin)。
野生型上游引物的碱基序列如下:
5’-GCTGCAGGCATACACTG-3’(SEQ ID NO.1),其中,下划线部分可与野生型ALDH2基因的的rs671位点(G)对应。
突变型上游引物的碱基序列如下:
5’-GCTGCAGGCATACACTA-3’(SEQ ID NO.2),其中,下划线部分可与突变型ALDH2基因的的rs671位点(A)对应。
下游引物的碱基序列如下:
5’-AGCCACCAGCAGACCCTC-3’(SEQ ID NO.3)。
捕获探针的碱基序列如下:
5’-AAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACC-3’(SEQ ID NO.4)。
本实施例提供的探针不仅能够实现对待测样本的ALDH2基因rs671位点的G→A突变进行检测,还能够区别出待测样本的ALDH2基因是野生型纯合子、还是突变型杂合子或者是突变型纯合子,同样具有特异性好、灵敏度高、假阳性率低等特点。
实施例4
本实施例提供了试剂盒,该试剂盒包括上述实施例中任一项所述的检测ALDH2基因突变的核酸组合。该试剂盒可用于对ALDH2基因rs671位点的G→A突变进行检测,其具有检测灵敏度高、特异性强、假阳性率低等特点。
实施例5
本实施例提供了试剂盒,该试剂盒不仅包括上述实施例1-3中任一项所述的检测ALDH2基因突变的组合;还包括:PCR反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶和Mg2+溶液、带有链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶、TMB、含SDS的2×SSC缓冲液以及含Tween20的PBS缓冲液、吡咯溶液、氯化钾溶液、杂交buffer。
容易理解,在其他的实施例中,试剂盒可包括PCR反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶和Mg2+溶液、带有链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶、TMB、含SDS的2×SSC缓冲液以及含Tween20的PBS缓冲液、吡咯溶液、氯化钾溶液、杂交buffer中的一种或多种。
本实施例提供的试剂盒的效果同实施例4。
实施例6
本实施例提供了对实施例1提供的检测ALDH2基因突变的组合的灵敏度和特异性验证实验。
实验设计:以实施例1提供的检测ALDH2基因突变的核酸组合的野生型上游引物(SEQ ID NO.1,命名为ALDH2-WPF-1s)为实验组、以命名为ALDH2-WPF-2s的上游引物为对照组,检测该核酸组合的特异性和灵敏度。
对照组的ALDH2-WPF-2s上游引物的碱基序列为:5’-GCTGCAGGCATAAACTG-3’,其仅有第13位的碱基(下划线部分)与野生型上游引物不同,其野生型靶序列不完全相同,进行了错配设计。分别以含有野生型靶序列的质粒(作为野生型样本、浓度为1000copies/μl)和突变型靶序列的质粒(作为突变型样本,浓度为1000copies/μl)作为模板,通过PCR技术和EFIRM技术检测两个组的电流信号。检测方法如下。
1 PCR扩增
1.1配制PCR反应体系,具体见表1。
表1.PCR反应体系
名称 |
使用量(μl) |
终浓度 |
10×Ex Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>free) |
2.5 |
1× |
dNTP Mixture(各2.5mM) |
2 |
各0.2mM |
MgCl<sub>2</sub>(25mM) |
2 |
2mM |
上游引物(10μM) |
0.75 |
0.3μM |
下游引物(10μM) |
0.75 |
0.3μM |
Ex Taq(5U/μl) |
0.125 |
0.025U/μl |
模板 |
2 |
|
水 |
补齐至总体积为25μl |
- |
1.2 PCR扩增程序,按表2中的程序进行扩增。
表2.PCR反应的扩增程序
得到的PCR产物立即进行后续实验或4℃暂存。
2基于EFRIM技术平台的杂交检测
2.1捕获探针(以下简称CP)固定
2.1.1配制吡咯(pyrrole)与CP的混合液
取1个1.5mL离心管,依次加入超纯水885μl,离子化合物100μl 3M KCl,涡旋震荡混匀,离心;加入导电聚合物5μl pyrrole(≥98.0%,购自Sigma,货号W338605),涡旋震荡混匀,离心;加入10μl 100μM的CP(SEQ ID NO.4);涡旋震荡混匀后离心,备用。
2.1.2固定捕获探针
在96孔的检测孔板(E-plate)(其结构和工作原理可见参考文献201620769829.2)上,按其操作说明书,往反应孔加入30μl的已配制好的pyrrole与CP的混合液(实验组和对照组各自都设置3个反应孔,各孔均需加入混合液;其中1个孔用于后续步骤加入由野生型样本为模板扩增的PCR产物,作为野生型检测孔;另1个孔用于后续步骤加入由突变型样本为模板扩增的PCR产物,突变型检测孔;剩下的1个孔用于做空白对照孔)。加样时枪头贴近孔的底部,但是不接触到底部电极,加完后倾斜或拍打E-plate使液体在孔里的电极表面均匀覆盖,然后立刻到EFIRM仪器上(其工作原理和结构可参考申请日为2016年8月11日、申请号为201610658321.X、名称为保持结构及包括保持结构的检测仪的专利文献),按其操作说明书,进行电场操作。
2.1.3 EFIRM电场处理
在EFIRM软件上选择进行实验的对应列,电场参数设置为:电压A:350mV,1s;电压B:950mV,1s;进行9个循环。电场处理完毕,立刻取出,清洗E-plate板。
2.1.4 E-plate板清洗:
在洗板机程序上选择对应的实验列,清洗程序选择(2bottom,2top),清洗液选择洗液A。清洗完毕,立刻进行下一步,样本上样操作。其中,洗液A为含0.05%(质量百分比)SDS的2×SSC缓冲液。
2.2 PCR产物杂交
2.2.1杂交buffer预处理
取杂交buffer(购自生工生物工程(上海)股份有限公司,货号:B548207),平衡至室温。
2.2.2 PCR产物预处理
将上述步骤1.2得到的各PCR产物与杂交buffer按体积比1:2混合,涡旋振荡后离心,得到PCR产物预处理混合液。
2.3加待测样本
在E-plate上,在对应的反应孔里加入上述待测样本与杂交buffer混合后的混合液30μl。具体如下。
实验组:检测孔中加入由野生型上游引物(即SEQ ID NO.1、ALDH2-WPF-1s)和下游引物扩增野生型样本或突变型样本得到的PCR产物预处理混合液(即野生型检测孔中加入由野生型上游引物(即SEQ ID NO.1、ALDH2-WPF-1s)和下游引物扩增野生型样本得到的PCR产物预处理混合液;突变型检测孔中加入由野生型上游引物和下游引物扩增突变型样本得到的PCR产物预处理混合液);空白对照孔中加入水作为阴性对照的PCR产物预处理混合液。
对照组:检测孔中加入由ALDH2-WPF-2s上游引物和下游引物扩增野生型样本或突变型样本得到的PCR产物预处理混合液(即野生型检测孔中加入由ALDH2-WPF-2s上游引物和下游引物扩增野生型样本得到的PCR产物预处理混合液;突变型检测孔中加入由ALDH2-WPF-2s上游引物和下游引物扩增突变型样本得到的PCR产物预处理混合液);空白对照孔中加入水作为阴性对照的PCR产物预处理混合液。
需要注意的是:加样时枪头贴近孔的底部,但是不接触到底部电极,加完后倾斜或拍打E-plate使液体在孔里的电极表面均匀覆盖,然后立刻到EFIRM上进行电场操作。
2.4 EFIRM电场处理
在EFIRM软件上选择进行实验的对应列,电场参数设置为:电压A:300mV,1s;电压B:500mV,1s;进行150个循环。电场处理完毕,立刻取出,清洗E-plate板。
2.5室温孵育
盖上E-plate盖子,实验台上室温孵育15min。
2.6 E-plate板清洗
在洗板机程序上选择对应的实验列,清洗程序选择(2bottom,2top),清洗液选择洗液A。
2.7链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(Poly-HRP)与生物素结合
2.7.1 Poly-HRP溶液配制
从4℃冰箱取出稀释液(含酪蛋白的PBS缓冲液),取1个1.5mL离心管,加入999μl的稀释液,加入1μl的酶液(含Poly-HRP,浓度为0.5mg/ml,购自thermo fisher,产品名称为PierceTMStreptavidin Poly-HRP,货号为21140,单位规格为0.5mL),涡旋震荡混匀,离心,备用。
2.7.2加酶液
在对应的各孔加入上述稀释液和酶液混合后的混合液30μl,Poly-HRP通过其标记的链霉亲和素与PCR产物上的生物素识别并结合。
2.7.3室温孵育
盖上E-plate盖子,实验台上室温孵育15min。
2.7.4 E-plate板清洗
在洗板机程序上选择对应的实验列,清洗程序选择(3bottom,3top),清洗液选择洗液B。清洗完毕,立刻进行TMB加样操作。其中,洗液B为含0.1%(质量百分比)Tween20的PBS缓冲液。
2.8数据读取
2.8.1加底物
在反应孔中加入底物60μl,加样时枪头贴近孔的底部,但是不接触到底部电极。加完立刻到EFIRM上进行电场操作。其中,底物为含TMB的溶液(购自thermo fisher,产品货号为34028,名称为1-StepTMUltra TMB-ELISA)。加入酶的底物,发生氧化还原反应,产生电流,检测各孔内电流值即完成整个检测过程。
2.8.2 EFIRM电场读数
在EFIRM软件上选择进行实验的对应列,电场参数设置为:电压A:-200mV,60s;电压B:0mV,0s;进行1个循环。电场处理完毕,立刻取出,清洗E-plate板。
仪器将自动完成检测工作,结果以检出的电流值(Current)表示,单位为纳安(nA),本实施例的检测结果如表3所示。
表3.采用实施例1提供的检测ALDH2基因突变的核酸组合检测不同样本的检测结果
由表3的结果可知,针对突变型样本的检测,实验组的电流信号值与对照组的电流信号值差异不大;但是,针对野生型样本的检测,实验组的电流信号值(3629.29nA)明显大于对照组的电流信号值(403.97nA),由此说明野生型上游引物(SEQ ID NO.1)与下游引物组合,进行PCR扩增的灵敏度和特异性均好于ALDH2-WPF-2s上游引物与下游引物的组合。也就表明,实施例1提供的检测ALDH2基因突变的核酸组合用于检测ALDH2基因的rs671位点的G→A突变具有较好的灵敏度和特异性。
实施例7
本实施例提供了对实施例2提供的检测ALDH2基因突变的组合的灵敏度和特异性验证实验。
实验设计:以实施例2提供的检测ALDH2基因突变的核酸组合的突变型上游引物(SEQ ID NO.2,命名为ALDH2-MPF-1s)为实验组、以命名为ALDH2-MPF-2s的上游引物为对照组,检测ALDH2基因突变的核酸组合的特异性和灵敏度。
ALDH2-MPF-2s上游引物的碱基序列为:5’-GCTGCAGGCATAAACTA-3’,其仅有第13位的碱基(下划线部分)与突变型上游引物不同,其与突变型靶序列不完全相同,进行了错配设计。分别以含有野生型靶序列的质粒(野生型样本)和突变型靶序列的质粒(突变型样本)作为模板,通过PCR技术和EFIRM技术检测两个组的电流信号。检测方法基本与实施例6相同。检测结果见表4。
表4.采用实施例2提供的检测ALDH2基因突变的核酸组合检测不同样本的检测结果
由表4的结果可知,针对野生型样本的检测,实验组的电流信号值与对照组的电流信号值差异不大;但是,针对突变型样本的检测,实验组的电流信号值(3286.18nA)明显大于对照组的电流信号值(241.78nA),由此说明突变型上游引物(SEQ ID NO.2)与下游引物组合,进行PCR扩增的灵敏度和特异性均好于ALDH2-WPF-2s上游引物与下游引物的组合。也就表明,实施例2提供的检测ALDH2基因突变的核酸组合用于检测ALDH2基因的rs671位点的G→A突变具有较好的灵敏度和特异性。
实施例8
本实施例提供了采用实施例3提供的检测ALDH2基因突变的核酸组合分别检测三份样本的ALDH2基因rs671位点G→A突变的检测方法,步骤如下。
1核酸提取:使用市售的血液基因组DNA提取试剂盒按说明书的步骤进行血液样本的核酸提取,分别提取三个不同个人的基因组DNA,得到样本1、样本2和样本3的核酸模板,用于后续检测。
2 PCR扩增
用实施例3提供的检测ALDH2基因突变的核酸组合中的野生型上游引物和下游引物组合形成野生型引物对,分别扩增待测样本(样本1、样本2、样本3)、野生型样本(作为野生型对照)、突变型样本(作为突变型对照)和水(作为空白对照),作为野生型检测组,检测样本的ALDH2基因是否为野生型(rs671位点为G);用突变型上游引物对和下游引物组合形成突变型引物对,用突变型引物对分别扩增待测样本(样本1、样本2、样本3)、野生型样本(作为野生型对照)、突变型样本(作为突变型对照)和水(作为空白对照),作为突变型检测组,检测样本的ALDH2基因是否为突变型(rs671位点为A)。PCR反应系统和扩增程序同实施例6。得到各检测组各样本的PCR产物。
3基于EFRIM平台的杂交检测,方法与实施例6基本相同,具体如下。
3.1捕获探针固定
3.1.1配制吡咯(pyrrole)与CP的混合液
取1个1.5mL离心管,依次加入超纯水885μl,离子化合物100μl 3M KCl,涡旋震荡混匀,离心;加入导电聚合物5μl pyrrole,涡旋震荡混匀,离心;加入10μl 100μM的CP(SEQID NO.4);涡旋震荡混匀后离心,备用。
3.1.2固定捕获探针
在96孔的检测孔板(E-plate)上,按其操作说明书,往反应孔加入30μl的已配制好的pyrrole与CP的混合液(野生型检测组和突变型检测组各设置5个反应孔;每个组的其中3个孔用于分别加入样本1、样本2、样本3的PCR产物,作为检测孔,1个用于加入野生型样本的PCR产物,作为野生型对照;1个用于加入突变型样本的PCR产物,作为突变型对照;剩下的1个孔用于做空白对照孔)。
3.1.3 EFIRM电场处理
在EFIRM软件上选择进行实验的对应列,电场参数设置为:电压A:350mV,1s;电压B:950mV,1s;进行9个循环。电场处理完毕,立刻取出,清洗E-plate板。
3.1.4 E-plate板清洗:
在洗板机程序上选择对应的实验列,清洗程序选择(2bottom,2top),清洗液选择洗液A。清洗完毕,立刻进行下一步,样本上样操作。其中,洗液A为含0.05%(质量百分比)SDS的2×SSC缓冲液。
3.2 PCR产物杂交
3.2.1杂交buffer预处理
杂交buffer从-20℃取出,平衡至室温待用。
3.2.2 PCR产物预处理
将本实施例步骤2中得到的各PCR产物与杂交buffer按体积比1:2混合,涡旋振荡后离心,得到PCR产物预处理混合液。
3.3加待测样本
在E-plate上,在对应的反应孔里加入上述PCR产物与杂交buffer混合后的混合液30μl。具体如下。
野生型检测组:3个检测孔分别加入由野生型引物对扩增样本1、样本2、样本3的PCR产物预处理混合液;野生型对照孔中加入由野生型引物对扩增野生型样本的PCR产物预处理混合液;突变型对照孔中加入由野生型引物对扩增突变型样本的PCR产物预处理混合液。空白对照孔中加入由野生型引物对水的PCR产物预处理混合液。
突变型检测组:3个检测孔分别加入由突变型引物对扩增样本1、样本2、样本3的PCR产物预处理混合液;野生型对照孔中加入由突变型引物对扩增野生型样本的PCR产物预处理混合液;突变型对照孔中加入由突变型引物对扩增突变型样本的PCR产物预处理混合液。空白对照孔中加入由突变型引物对水的PCR产物预处理混合液。
需要注意的是:加样时枪头贴近孔的底部,但是不接触到底部电极,加完后倾斜或拍打E-plate使液体在孔里的电极表面均匀覆盖,然后立刻到EFIRM上进行电场操作。
3.4 EFIRM电场处理
在EFIRM软件上选择进行实验的对应列,电场参数设置为:电压A:300mV,1s;电压B:500mV,1s;进行150个循环。电场处理完毕,立刻取出,清洗E-plate板。
3.5室温孵育
盖上E-plate盖子,实验台上室温孵育15min。
3.6 E-plate板清洗
在洗板机程序上选择对应的实验列,清洗程序选择(2bottom,2top),清洗液选择洗液A。
3.7链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(Poly-HRP)与生物素结合
3.7.1 Poly-HRP溶液配制
从4℃冰箱取出稀释液(含酪蛋白的PBS缓冲液),取1个1.5mL离心管,加入999μl的稀释液,加入1μl的酶液,涡旋震荡混匀,离心,备用。
3.7.2加酶液
在对应的各孔加入上述稀释液和酶液混合后的混合液30μl,Poly-HRP通过其标记的链霉亲和素与PCR产物上的生物素识别并结合。
3.7.3室温孵育
盖上E-plate盖子,实验台上室温孵育15min。
3.7.4 E-plate板清洗
在洗板机程序上选择对应的实验列,清洗程序选择(3bottom,3top),清洗液选择洗液B。清洗完毕,立刻进行TMB加样操作。其中,洗液B为含0.1%(质量百分比)Tween20的PBS缓冲液。
3.8数据读取
3.8.1加底物
在反应孔中加入底物60μl,加样时枪头贴近孔的底部,但是不接触到底部电极。加完立刻到EFIRM上进行电场操作。其中,底物为含TMB的溶液。加入酶的底物,发生氧化还原反应,产生电流,检测各孔内电流值即完成整个检测过程。
3.8.2 EFIRM电场读数
在EFIRM软件上选择进行实验的对应列,电场参数设置为:电压A:-200mV,60s;电压B:0mV,0s;进行1个循环。电场处理完毕,立刻取出,清洗E-plate板。
仪器将自动完成检测工作,结果以检出的电流值(Current)表示,单位为纳安(nA),本实施例的检测结果如表5所示。结果说明,电流值大于或等于100nA,则相应结果为阳性,若小于100nA,则相应的结果为阴性。质控要求,野生型对照的野生型检测的电流值要大于或等于100nA,突变型检测的电流值要小于100nA;突变对照的野生型检测的电流值要小于100nA,突变型检测的电流值要大于或等于100nA。
表5采用实施例3提供的检测ALDH2基因突变的核酸组合检测三份样本的检测结果
ALDH2 |
样本1 |
样本2 |
样本3 |
野生型对照 |
突变型对照 |
空白对照 |
野生型检测组 |
4286.46nA |
27.08nA |
3815.69nA |
3323.38nA |
28.37nA |
24.51nA |
突变型检测组 |
28.74nA |
3310.72nA |
4237.96nA |
25.47nA |
3815.28nA |
24.22nA |
由表5的结果显示,野生型对照和突变型对照的检测结果均符合质控要求。样本1的野生型检测组结果为4286.46nA,大于100nA,判定为阳性,突变型检测结果为28.74nA,小于100nA,判定为阴性,综合后样本1为ALDH2野生型纯合子,即基因型为ALDH2GG(ALDH2*1/ALDH2*1);样本2的野生型检测组结果为27.08nA,小于100nA,判定为阴性,突变型检测结果为3310.72nA,大于100nA,判定为阳性,综合后样本2为突变型纯合子,即基因型为ALDH2LL(ALDH2*2/ALDH2*2);样本3的野生型检测组结果为3815.69nA,大于100nA,判定为阳性,突变型检测结果为4237.96nA,大于100nA,判定为阳性,综合后样本3为突变型杂合子,即基因型为ALDH2GL(ALDH2*1/ALDH2*2)。由此表明,本发明提供的的检测ALDH2基因突变的核酸组合能够准确地检测出ALDH2基因rs671位点G→A突变情况,且具有良好的灵敏度和特异性,且采用本发明提供的核酸组合检测ALDH2基因rs671位点G→A突变还具有操作便捷、耗时短等特点。
综上,与现有技术相比,本发明提供的检测ALDH2基因突变的核酸组合及其应用和试剂盒具有的优势如下:
(1)检测灵敏度高
PCR是一种体外DNA扩增技术,将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性—低温退火—延伸”三步反应的多次循环,使DNA片段在数量上呈指数增加,从而在短时间内获得大量的特定目的基因片段。大大增加了EFIRM待测模板的数量,提高了检测灵敏度。
传统的探针固定方法是把探针的一端固定在平面支持物上,此方法由于探针表面的疏水性等原因会降低探针与待测靶标DNA的杂交效率,本发明通过电荷吸附作用将捕获探针固定在聚吡咯孔内,可保证捕获探针具有超高活性;传统的核酸杂交过程通过控制杂交温度、盐离子、反应时间等提高杂交效率,本发明增加电场作为第四个控制条件,在电场的作用下提高了捕获探针对靶标DNA的捕获效率;本方法中通过测定HRP催化TMB氧化过程中产生的电子信号作为检测结果,由于酶的催化效率很高,间接地放大了杂交反应的结果,增加了测定方法的敏感度。瞬间靶标分子捕获、超高活性分子探针固定、捕获分子信号特异放大这三大核心技术保证了EFIRM方法具有超高的灵敏性。
(2)高灵敏度与准确率
PCR反应的特异性决定因素为上下游引物与模板DNA特异正确的结合,而EFIRM技术则需要捕获探针与PCR扩增产物特异性结合,捕获探针长度在25bp左右,杂交效率受错配碱基的影响明显,只有待检测DNA与上、下游引物、捕获探针同时准确配对后才能有检测信号,大大提高了检测的特异性。
(3)操作简便、反应快速
PCR扩增过程仅需要普通的PCR仪即可完成,EFIRM技术中电场的引入降低了杂交过程中对反应时间的要求,加快了反应速率。
(4)成本低
首先,在检测设备方面,较常用的检测技术是基于荧光定量,荧光定量技术采用荧光信号检测,检测设备需配备昂贵的荧光检测系统,荧光定量PCR仪市场售价都在数十万元左右。与之相比,PCR扩增过程仅需要普通的PCR仪即可完成,EFIRM平台采用独创的电场引导的释放与测量技术,检测过程利用电场作用,反应快速,最终结果以电信号的形式检测,因而设备的成本大幅降低。
其次,在检测试剂方面EFIRM技术基于核酸杂交的原理,采用独特设计的电化学技术。本发明中使用的核酸探针采用人工合成寡核苷酸探针,引物中的一条采用较常见的Biotin修饰方法,另一条引物和捕获探针无需修饰,探针的制备委托商业化的DNA化学合成公司完成,技术难度低,稳定性较好,成本低。与之相比,以PCR为基础的荧光定量需要对探针进行两端修饰,且一端为荧光集团,合成成本较高,因此检测试剂成本与其它技术相比大幅降低。
总之,本发明提供的检测ALDH2基因突变的核酸组合及其应用和试剂盒兼具精准可靠、快速便捷、经济的明显优势,能满足临床对ALDH2基因检测的需求,是值得临床推广的一项新兴基因检测技术。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京易活生物科技有限公司
<120> 一种检测ALDH2基因突变的核酸组合及其应用和试剂盒
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctgcaggca tacactg 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctgcaggca tacacta 17
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agccaccagc agaccctc 18
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aagtgaaaac tgtgagtgtg ggacc 25