CN106636441B

CN106636441B - 一种检测aldh2基因突变的探针及其应用和试剂盒

Info

Publication number: CN106636441B
Application number: CN201710092259.7A
Authority: CN
Inventors: 廖玮; 莫亚勤; 林晓燕; 张晨光
Original assignee: Guangzhou Easy Living Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou easy living Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2017-02-21
Filing date: 2017-02-21
Publication date: 2019-11-22
Anticipated expiration: 2037-02-21
Also published as: CN106636441A

Abstract

本发明公开了一种检测ALDH2基因突变的探针及其应用和试剂盒，属于基因检测技术领域。其包括SEQ ID NO.1所示的检测探针，以及SEQ ID NO.2‑3所示的捕获探针中的一种或两种。该探针可针对ALDH2基因的rs671位点的G→A突变进行检测，其具有检测灵敏度高、特异性强、假阳性率低等特点。

Description

一种检测ALDH2基因突变的探针及其应用和试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及一种检测ALDH2基因突变的探针及其应用和试剂盒。

背景技术

乙醛脱氢酶(Acetaldehyde Dehydrogenase，ALDH)由ALDH基因编码，可分为ALDH1A1、ALDH1B1和ALDH2。其中，ALDH2在人体内把乙醛催化成乙酸的能力最强。ALDH2基因位于第12号染色体(12q24)，由13个外显子构成，编码的酶蛋白肽链由500个氨基酸残基组成。研究表明，该基因的多态性在亚洲人群中很常见，并且可能影响人群的饮酒行为。ALDH2与亚洲人群最为密切的是ALDH2基因的rs671位点G→A突变，可导致其编码的多肽链谷氨酸(Glu)变为赖氨酸(Lys)。ALDH2基因与酒精在人体内的分解代谢有关，还参与硝酸甘油的代谢。

饮酒后吸收进入体内的乙醇，主要在肝脏进行代谢。乙醇被氧化成乙醛后，95％在肝脏变成乙酸，余下5％在其他组织及血液被代谢掉。乙醇在体内代谢产物是乙醛，是导致酒精性肝病的主要原因。由于ALDH2G(ALDH2*1)的基因序列发生突变形成ALDH2L(ALDH2*2)等位基因，二者随机组合可编码形成ALDH2GG、ALDH2GL或ALDH2LL，3种基因型。ALDH2*1/ALDH2*1基因型(野生型)的饮酒者，体内把乙醛氧化成乙酸能力很强，对乙醇耐受性高，可以过量饮酒，但应适当节制。ALDH2*1/ALDH2*2基因型(突变型杂合型)的饮酒者，血液中乙醛的浓度是前者的6倍，对酒有一定的耐受性，可以适量饮酒。ALDH2*2/ALDH2*2基因型(突变型纯合型)的饮酒者血液中乙醛的浓度是前者的19倍，对酒敏感，没有耐受性，饮酒后很快出现严重不适现象。大量乙醛滞留在体内，除了损伤肝脏导致脂肪肝、肝硬化，甚至肝癌，还与增加食道癌、口咽癌和胃癌、冠心病、心肌梗死等风险相关。

硝酸甘油作为抗心绞痛的经典药物，已有多位学者对其生物转化机制进行了广泛研究，2002年Chen等发现在巯基化合物参与下，ALDH2能够催化硝酸甘油生成1，2-二硝酸甘油和亚硝基硫醇，之后ALDH2在硝酸甘油代谢中的重要作用引起越来越多学者的关注。研究发现，ALDH2*1/ALDH2*1基因型(野生型)具有ALDH2的正常活力，ALDH2*1/ALDH2*2基因型(突变型杂合型)存在6％的酶活力，而ALDH2*2/ALDH2*2基因型(突变型纯合型)则完全丧失酶的活力，使硝酸甘油无法产生一氧化氮，难以发挥药效。

ALDH2除了与酒精性肝病等消化道疾病息息相关外，还与其他一些疾病相关，如消化道肿瘤、白血病、帕金森病(PD)等。

ALDH2位点的多态性为先天遗传，与任何疾病的发生无关，与年龄无关。研究表明，ALDH2*2在人类各族群中的分布是不同的，亚洲人种出现频率较高。中国汉族ALDH2*2的频率为15.5％，墨西哥1.0％，日本人23.8％，欧洲人0％，南非人0％。中国人群中广东汉族最高，达31％，武汉汉族12％，洛阳人15％，上海人25％，台湾人30％。此外，ALDH2各基因型的发生率在男女性别上差异无统计学意义。

综上所述，ALDH2基因多态性检测将为硝酸甘油的用药、饮酒指导及相关高风险疾病的提示提供有效的参考依据，具有重要的临床应用意义。目前，用于ALDH2基因分型的方法有以下几种，各有其特点。

1.限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术(PCR-RFLP)

PCR-RFLP为最为经典的SNP分型方法，它先利用PCR扩增跨越多态位点的靶DNA，然后用相应的限制性核酸内切酶切割PCR产物，最后根据酶切产物的电泳条带判断基因型。例如Hayashida等曾用该法对ALDH2进行分型，PCR扩增目的片段长度为430bp，野生型等位基因(ALDH2*1)会被AcuⅠ酶切成296bp和134bp2个片段，反之，突变型等位基因(ALDH2*2)则不能被AcuⅠ酶切。这样野生型纯合子ALDH2*1/*1的条带为296bp、134bp，杂合子ALDH2*1/*2的条带为430bp、296bp、134bp，突变型纯合子ALDH2*2/*2的条带为430bp。PCR-RFLP分型法操作简单，所需模板DNA量少，无需使用大型贵重仪器，实验中不涉及危险试剂，安全性高。但该法的一个最大缺点在于，会因为内切酶的活性、酶切时间、酶切体系的不恰当等原因造成假阴性或假阳性而出现基因型的误判。

2.等位基因特异性PCR(allele specific PCR，AS-PCR)

AS-PCR的基本原理是根据SNP位点的碱基特点设计2条等位基因特异引物(针对于野生型等位基因的P1、针对突变型等位基因的P2)，它们的3’末端与SNP位点的碱基互补(或相同)，另需一条按常规方法设计的公共用引物P3。用P1、P3作引物，在野生型等位基因中有扩增产物，在突变型等位基因中没有扩增产物，用P2、P3作引物，情况则刚好相反。PCR结束后，用凝胶电泳检测扩增产物的有无，从而确定基因型。AS-PCR方法避免采取酶切方法，步骤更简洁，但是等位基因特异性PCR扩增方法的假阳性率较高，其对实验要求较严格。

3.Taqman探针技术

Taqman探针技术在普通PCR的基础上增加荧光标记的探针，随着PCR产物的不断增加，荧光的强度不断增强，则可以检测到一个荧光增长曲线。该法的主要不足是采用荧光淬灭及双末端标记技术，其定量检测受酶活性的影响；本底较强，有时无法鉴别高度相关序列；探针标记以及实验仪器成本较高，不便普及应用。

4.高分辨率熔解曲线法

高分辨率熔解曲线分析技术(high resolution melting，HRM)是在实时荧光PCR基础上发展起来的一种新技术，它在PCR体系中加入饱和双链DNA结合染料，在PCR结束后制作高分辨率熔解曲线，根据熔解曲线的不同来对样品进行分型。该方法因其快速、通量大、使用成本低、结果准确，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。但HRM技术对仪器温度的均一性要求非常高，需Light CycleryTM480PCR仪或Light Scanner等价格高昂的专用仪器及精密的分析软件。另外，该法要求扩增片段的大小在400bp以下，引物设计受到局限，PCR条件的优化比较复杂。

5.直接测序法。

测序法是检测SNP的金标准，准确度高。包括直接测序(双脱氧链终止法)、焦磷酸测序及微测序等。测序需要一些特殊的仪器设备，需要专业人员操作，费用高，周期长；对PCR产物的量、纯度及特异性要求高，PCR后操作步骤繁琐。测序法目前在临床检测方面的应用还是有一定的困难，多作为其他分析方法的确认。

6.变性高效液相色谱法。

该方法的原理基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异，利用色谱方法进行分离。由于杂合双链在突变位点处出现错配，易于形成“Y”型结构，与色谱柱的固定相结合能力降低，因此杂合双链DNA比纯合双链DNA优先洗脱出来，通过洗脱峰的改变可以判断是否存在突变。但它只可判断有无突变，不能确定SNP的位置和类型，需用标准样品或结合测序验证，且需要昂贵特殊仪器及专业分析软件，这也是DHPLC未能得以广泛推行的原因之一。此外，检测过程需要打开反应管，容易造成污染。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种检测ALDH2基因突变的探针，该探针可针对ALDH2基因的rs671位点的G→A突变进行检测，其具有检测灵敏度高、特异性强、假阳性率低等特点。

本发明的第二目的在于提供上述的检测ALDH2基因突变的探针在制备用于检测ALDH2基因突变的试剂盒中的应用。

本发明的第三目的在于提供一种试剂盒，该试剂盒含有上述的探针，可用于ALDH2基因的rs671位点的G→A突变进行检测，其具有检测灵敏度高、特异性强、假阳性率低、操作简便、耗时短、成本低等特点。

本发明的第四目的在于提供上述的检测ALDH2基因突变的探针在检测ALDH2基因突变中的应用。

本发明是这样实现的：

一种检测ALDH2基因突变的探针，其包括SEQ ID NO.1所示的检测探针，以及SEQID NO.2-3所示的捕获探针中的一种或两种，检测探针的5’端或3’端标记有用于结合催化酶的亲和物。

上述的检测ALDH2基因突变的探针在制备用于检测ALDH2基因突变的试剂盒中的应用。

一种试剂盒，其包括上述的检测ALDH2基因突变的探针。

上述的检测ALDH2基因突变的探针在检测ALDH2基因突变中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的一种检测ALDH2基因突变的探针及其应用和试剂盒的有益效果是：

本发明提供的检测ALDH2基因突变的探针，其包括SEQ ID NO.1所示的检测探针，以及SEQ ID NO.2-3所示的捕获探针中的一种或两种。其中，SEQ ID NO.2所示的捕获探针为野生型捕获探针，可对野生型ALDH2基因检测，SEQ ID NO.3所示的捕获探针为突变型捕获探针，可对突变型ALDH2基因检测。任意一种捕获探针与检测探针配合，在EFIRM技术平台上均能够实现对ALDH2基因的rs671位点是否发生了G→A突变检测，具有检测结果准确、假阳性率低、特异性高、灵敏度高，成本低、操作简单方便等特点，为ALDH2基因突变的检测提供了一种全新的检测策略。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明采用实施例1提供的检测ALDH2基因突变的探针检测不同浓度的待测样本的检测结果；

图2为本发明采用实施例2提供的检测ALDH2基因突变的探针检测不同浓度的待测样本的检测结果；

图3为本发明采用实施例3提供的检测ALDH2基因突变的探针检测三份样本的检测结果；

图4为本发明实施例8中对三份样本的ALDH2基因rs671位点区域的测序结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的检测ALDH2基因突变的探针及其应用和试剂盒进行具体说明。

一方面，本发明提供了检测ALDH2基因突变的探针，该探针其包括SEQ ID NO.1所示的检测探针，以及SEQ ID NO.2-3所示的捕获探针中的一种或两种，所述检测探针的5’端或3’端标记有用于结合催化酶的亲和物。

该探针基于人的ALDH2基因的rs671位点G→A突变进行设计，可用于在电场诱导释放和测量(EFIRM)技术平台上进行检测。该探针由本发明的发明人经过长期的探索研究后得到，具有特异性好、灵敏度高等特点。

其中，SEQ ID NO.2所示的捕获探针为野生型捕获探针，可将野生型ALDH2基因(rs671位点为G)片段捕获固定。SEQ ID NO.3所示的捕获探针为突变型捕获探针，可用于将突变型ALDH2基因(rs671位点为A)片段捕获固定。各捕获探针与检测探针配合，在EFIRM技术平台上实现对ALDH2基因的rs671位点是否发生了突变的检测。

相较于现有的检测技术，通过本发明提供的探针和EFIRM技术的结合，其具有操作简便快速(待测样本处理方法简便)、检测时间短(整个检测过程耗时约30min，半个小时即可输出结果)、特异性强(需要捕获探针和检测探针的双特异性识别结合后，才具有检出信号)、灵敏度高(在电场诱导作用下，即微量的目标序列能够被捕获，并通过电信号的放大作用，而输出检测信号)、成本低(检测过程中所用的试剂简单、设备要求低)等特点。

两种捕获探针以及检测探针的序列长度和碱基序列均是本发明的发明人经过长期的探索优化筛选后得到，具有较强的特异性和灵敏度，能够有效地将相应目标序列捕获固定，具有非常好的特异性。

检测探针的5’端或3’端标记有用于结合催化酶的生物素，生物素的作用在于与链霉亲和素标记的催化酶结合，通过催化酶催化底物产生的电流释放检测信号。

容易理解，生物素可以采用其他类型的物质替代，例如地高辛或者异硫氰酸荧光素等。只要检测探针的5’端或3’端标记有用于结合催化酶的亲和物即属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明还提供了上述的探针在制备用于检测ALDH2基因突变的试剂盒中的应用。目前来说，基于EFIRM技术平台用于检测ALDH2基因突变中尤其是检测ALDH2基因的rs671位点G→A突变的试剂盒基本没有。本发明的试剂盒填补了这一检测领域的空白，提供了更加便捷、快速、成本低、特异性好、灵敏度高的用于检测ALDH2基因的rs671位点G→A突变的试剂盒，有效地克服了现有检测技术中存在的问题。为检测ALDH2基因的s671位点的G→A突变提供了一种全新的检测策略。

优选地，上述探针以溶液的形式独立存在，例如捕获探针以含有捕获探针的捕获探针溶液的形式存在，检测探针以含有检测探针的检测探针溶液的形式存在。各探针溶液含有的探针浓度为可以根据实际情况设置。优选地，各探针溶液含有的探针终浓度为0.5～1.5μM。

进一步地，本发明提供的试剂盒还可包括将探针的捕获探针固定至检测孔板的固定物。固定物包括导电聚合物和离子化合物。导电聚合物选自吡咯、苯胺和噻吩中的一种，当然，导电聚合物也可以是其他的导电聚合物材料。离子化合物选自氯化钠和氯化钾中的任意一种。导电聚合物带正电，其在电场的作用下形成网状交联结构，被沉积在反应孔的底部，网状交联结构能够稳定地将捕获探针固定在底部，有助于提高捕获探针的稳定性和捕获能力。

进一步地，本发明提供的试剂盒还可包括催化酶，催化酶是带有标记物的辣根过氧化物酶，优选地，催化酶是带有链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶。当然，催化酶也可以是带有标记物的碱性磷酸酶，标记物为地高辛抗体、异硫氰酸荧光素抗体或链霉亲和素中的任意一种，标记物与亲和物相对应，其可根据检测探针上的亲和物的类别进行选择。

当亲和物是生物素时，标记物为链霉亲和素；当亲和物是地高辛时，标记物为地高辛抗体；当亲和物是异硫氰酸荧光素时，标记物为异硫氰酸荧光素抗体。只要亲和物与标记物相对应，可相互结合即可。

进一步地，本发明提供的试剂盒还可包括底物，底物的类别根据催化酶的类别选择。

当催化酶为辣根过氧化物酶时，底物是TMB(Tetramethylbenzidine、四甲基联苯胺)、ABTS(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)和OPD(o-Phenylenediamine、邻苯二胺)中的任意一种。TMB、ABTS和OPD均是辣根过氧化物酶的底物，在辣根过氧化物酶的催化作用下发生显色反应并伴随电流产生，有助于提高检测信号的释放。

当催化酶为碱性磷酸酶时，底物是对BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3-IndolylPhosphate、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐)和NBT(Nitrotetrazolium Blue chloride、四唑硝基蓝)的组合物、硝基苯磷酸盐、4-硝基苯磷酸二钠、萘酚AS-BI磷酸盐、萘酚-AS-MX-磷酸盐中的任意一种。

进一步地，本发明提供的试剂盒还可包括清洗液，清洗液包括洗液A和洗液B，洗液A是含SDS的SSC缓冲液，洗液B是含Tween20的PBS缓冲液。

进一步地，本发明提供的试剂盒还可包括稀释液，稀释液是含酪蛋白的PBS缓冲液。

进一步地，本发明提供的试剂盒还可包括杂交buffer。用于提高探针和目标序列的结合效率。

进一步地，本发明提供的试剂盒还可包括检测孔板，检测孔板的反应孔内固定有上述捕获探针。需要说明的是，在其他的实施例中，捕获探针也可不用固定在检测孔板的反应孔内，在使用时采用相应方法将捕获探针固定至检测孔板也是可以的。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的检测ALDH2基因突变的探针包括野生型捕获探针和检测探针，检测探针的5’端标记有生物素(Biotin)。

野生型捕获探针的碱基序列如下：

5’-ATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTTTTT TTTATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTCACTTCAGTGTA-3’(SEQ ID NO.2)，其中，下划线部分用于与野生型ALDH2基因的覆盖了rs671位点(G)的目标序列(SEQ ID NO.4)的靶区域(5’-TACACTGAAGTGA-3’)反向互补结合，进而将野生型目标序列捕获固定。

另外，该野生型捕获探针5’端的第1-77位富含胸腺嘧啶(T)的区域为延长臂，用于提高其与野生型目标序列的捕获结合概率，进而提高检测的灵敏度。

从野生型ALDH2基因上的选取的覆盖rs671位点的野生型目标序列(SEQ ID NO.4)的碱基序列如下：

5’-GCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGC TGGGGGCTCAGGGC-3’，其中，下划线部分为rs671位点(G)。

检测探针的碱基序列如下：

5’-CTTATGGAGCCCCCAGCAGGTCCCACACTCACA-3’(SEQ ID NO.1)，其中，下划线部分用于与野生型目标序列(SEQ ID NO.4)上的靶区域(5’-TGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTC-3’)互补结合，实现对目标序列的特异性结合和检测。

本实施例提供的探针可用于对野生型ALDH2基因(rs671位点为G)的检测，具有特异性好、灵敏度高等特点。

实施例2

本实施例提供的检测ALDH2基因突变的探针包括突变型捕获探针(SEQ ID NO.3)和检测探针(SEQ ID NO.1)，检测探针的碱基序列和结构同实施例1。

突变型捕获探针的碱基序列如下：

5’-ATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTTTTT TTTATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTCACTTTAGTGTA-3’(SEQ ID NO.3)，其中，下划线部分用于与突变型ALDH2基因的覆盖了rs671位点(A)的突变型目标序列(SEQ ID NO.5)的靶区域(5’-TACACTAAAGTGA-3’，下划线为rs671位点(A))反向互补结合，进而将突变型目标序列捕获固定。

另外，该突变型捕获探针5’端的第1-77位富含胸腺嘧啶(T)的区域为延长臂，通过延长臂的修饰，可用于提高突变型捕获探针与突变型目标序列(SEQ ID NO.5)的捕获结合概率，提高检测的灵敏度。

从突变型ALDH2基因上的选取的突变型目标序列(SEQ ID NO.5)的碱基序列如下：

5’-GCTGCAGGCATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGC TGGGGGCTCAGGGC-3’，其中，下划线部分为rs671位点(A)。

本实施例提供的探针可用于对突变型ALDH2基因(rs671位点为A)的检测，具有特异性好、灵敏度高等特点。

实施例3

本实施例提供的检测ALDH2基因突变的探针包括：野生型捕获探针、突变型捕获探针以及检测探针。

野生型捕获探针的碱基序列同实施例1，突变型捕获探针的碱基序列同实施例2，检测探针的碱基序列和结构同实施例1。

本实施例提供的探针不仅能够实现对待测样品的ALDH2基因rs671位点的突变情况进行检测，还能够区别出待测样品是野生型纯合子、还是突变型杂合子或者是突变型纯合子，同样具有特异性好、灵敏度高、假阳性率低等特点。

实施例4

本实施例提供了试剂盒，该试剂盒包括上述实施例中任一项所述的检测ALDH2基因突变的探针。该试剂盒可用于对ALDH2基因rs671位点的G→A突变进行检测，其具有检测灵敏度高、特异性强、假阳性率低等特点。

实施例5

本实施例提供了试剂盒，该试剂盒不仅包括上述实施例1-3中任一项所述的检测检测ALDH2基因突变的探针。还包括带有链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶、TMB、含SDS的2×SSC缓冲液以及含Tween20的PBS缓冲液、吡咯溶液、氯化钾溶液、杂交buffer。

容易理解，在其他的实施例中，试剂盒可包括链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶、TMB、含SDS的2×SSC缓冲液以及含Tween20的PBS缓冲液、吡咯溶液、氯化钾溶液、杂交buffer中的一种或多种。

本实施例提供的试剂盒的效果同实施例4。

实施例6

实施例1提供的检测ALDH2基因突变的探针的灵敏度验证。

以实施例1提供的检测ALDH2基因突变的探针的野生型捕获探针(命名为ALDH2-WLSCP13，SEQ ID NO.2)为实验组、以SEQ ID NO.6所示的捕获探针(命名为ALDH2-WCP13，碱基序列为：5’-TCACTTCAGTGTAGCATGGCCTTAG-3’，其第1-13位用于与野生型目标序列(SEQID NO.4)的靶区域结合，捕获目标序列；第14-25位为延长臂，但该序列和长度与野生型捕获探针的延长臂不同)为对照组、以不同浓度(1nM、100pM、10pM、1pM)的SEQ ID NO.4所示的目标序列(寡核苷酸片段)为待测样本，验证实施例1提供的检测ALDH2基因突变的探针的灵敏度，检测方法如下。

1捕获探针(以下简称CP)固定

1.1配制吡咯(pyrrole)与CP的混合液

取1个1.5mL离心管，依次加入超纯水885μl，离子化合物100μl 3M KCl，涡旋震荡混匀，离心；加入导电聚合物5μl pyrrole(≥98.0％，购自Sigma，货号W338605)，涡旋震荡混匀，离心；加入10μl 100μM的CP(实验组加入SEQ ID NO.2所示的野生型捕获探针(ALDH2-WLSCP13)、对照组加入SEQ ID NO.6所示的野生型捕获探针(ALDH2-WCP13)；涡旋震荡混匀后离心，备用。

1.2固定捕获探针

在96孔的检测孔板(E-plate)(其结构和工作原理可见参考文献201620769829.2)上，按其操作说明书，往反应孔加入30μl的已配制好的pyrrole与CP的混合液(实验组和对照组各自都设置5个反应孔，均加入各自对应的混合液，其中四个孔用于后续步骤加入不同浓度的待测样本，作为检测孔，剩下的一个孔用于做空白对照孔)，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打E-plate使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM仪器上(其工作原理和结构可参考申请日为2016年8月11日、申请号为201610658321.X、名称为保持结构及包括保持结构的检测仪的专利文献)，按其操作说明书，进行电场操作。

1.3 EFIRM电场处理

在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：350mV，1s；电压B:950mV，1s；进行9个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗E-plate板。

1.4 E-plate板清洗：

在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，清洗液选择洗液A。清洗完毕，立刻进行下一步，样本上样操作。其中，洗液A为含0.05％(质量百分比)SDS的2×SSC缓冲液。

2样本杂交

2.1杂交buffer预处理

取杂交buffer(购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号:B548207)平衡至室温。

2.2配制待测样本

将待测样本与杂交buffer按体积比1:2混合，涡旋振荡后离心，即可上样进行检测。

2.3加待测样本

在E-plate上，在对应的反应孔里加入上述待测样本与杂交buffer混合后的混合液30μl，且控制待测样本在各组的三个检测孔中的终浓度依次为1nM、100pM、10pM、5pM。各组的空白对照孔仅加入相同体积的杂交buffer。

需要注意的是:加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打E-plate使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM上进行电场操作。

2.4 EFIRM电场处理

在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：300mV，1s；电压B:500mV，1s；进行150个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗E-plate板。

2.5室温孵育

盖上E-plate盖子，实验台上室温孵育15min。

2.6 E-plate板清洗

在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，清洗液选择洗液A。清洗完毕，立刻进行DP加样操作。

3检测探针(DP)结合

3.1 DP溶液配制

从4℃冰箱取出稀释液，取1个1.5mL离心管，加入990μl的稀释液，往各组的反应孔中加入对应的10μl 100μM DP(SEQ ID NO.1，即实施例1中的检测探针)，涡旋震荡混匀，离心，备用。

其中，稀释液为含0.1％(质量体积比)酪蛋白的PBS缓冲液(pH7.4)。酪蛋白的作用是封闭非特异性位点，以提高检测的灵敏性和准确度。

3.2加样

根据实验设计在对应的孔加入对应DP溶液30μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打E-plate使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM上进行电场操作。

3.3室温孵育

盖上E-plate盖子，实验台上室温孵育15min。

3.4 E-plate板清洗

在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(2bottom，2top)，清洗液选择洗液A。清洗完毕，立刻进行加样操作。

4链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(Poly-HRP)与生物素结合

4.1 Poly-HRP溶液配制

从4℃冰箱取出稀释液，取1个1.5mL离心管，加入999μl的稀释液，加入1μl的酶液(含Poly-HRP，浓度为0.5mg/ml，购自thermo fisher,产品名称为Pierce^TM StreptavidinPoly-HRP，货号为21140，单位规格为0.5mL)，涡旋震荡混匀，离心，备用。

4.2加酶液

在对应的各孔加入上述稀释液和酶液混合后的混合液30μl，Poly-HRP通过其标记的链霉亲和素与检测探针上的生物素识别并结合。

4.3室温孵育

盖上E-plate盖子，实验台上室温孵育15min。

4.4 E-plate板清洗

在洗板机程序上选择对应的实验列，清洗程序选择(3bottom，3top)，清洗液选择洗液B。清洗完毕，立刻进行TMB加样操作。其中，洗液B为含0.1％(质量百分比)Tween20的PBS缓冲液。

5数据读取

5.1加底物

在反应孔中加入底物60μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极。加完立刻到EFIRM上进行电场操作。其中，底物为含TMB的溶液(购自thermo fisher，产品货号为34028，名称为1-Step^TM Ultra TMB-ELISA)。加入酶的底物，发生氧化还原反应，产生电流，检测各孔内电流值即完成整个检测过程。

5.2 EFIRM电场读数

在EFIRM软件上选择进行实验的对应列，电场参数设置为：电压A：-200mV，60s；电压B:0mV，0s；进行1个循环。电场处理完毕，立刻取出，清洗E-plate板。

仪器将自动完成检测工作，检测数据自动上传到云计算平台。根据检测数据绘制柱状图，横坐标为检测组的类别，纵坐标为各检测组中各反应孔中的电流值(Current)，单位为纳安(nA)，本实施例的检测结果如表1和图1所示。

表1.采用实施例1提供的检测ALDH2基因突变的探针检测不同浓度的待测样本的检测结果

由表1和图1的结果显示，相较于对照组的ALDH2-WCP13，实施例1提供的检测ALDH2基因突变的探针的野生型捕获探针ALDH2-WLSCP13的灵敏度更高，其在待测样本的浓度低至1pM的情况下也能够将待测样本检出，其检出电流信号达到234.7nA，比对照组的电流信号值(107.32nA)高。由此表明，通过延长臂的设置，SEQ ID NO.2所示的野生型捕获探针的捕获能力较好，能够将低浓度的目标序列捕获固定，使得实施例1提供的检测ALDH2基因突变的探针具有较高的灵敏度。

实施例7

实施例2提供的检测ALDH2基因突变的探针的灵敏度验证。

以实施例2提供的检测ALDH2基因突变的探针的野生型捕获探针(SEQ ID NO.3，命名为ALDH2-MLSCP13)为实验组、以SEQ ID NO.7所示的捕获探针(命名为ALDH2-MCP13，碱基序列为：5’-TCACTTTAGTGTAGCATGGCCTTAG-3’，其中，第1-13位与突变型目标序列的靶区域互补结合)为对照组、以不同浓度(1nM、100pM、10pM、1pM)的SEQ ID NO.5所示的突变型目标序列(寡核苷酸片段)为待测样本，检测实施例2提供的检测ALDH2基因突变的探针的灵敏度，检测方法与实施例6基本相同。检测结果如表2和图2所示。

表1.采用实施例2提供的检测ALDH2基因突变的探针检测不同浓度的待测样本的检测结果

由表2和图2的结果显示，相较于对照组的ALDH2-MCP13，实施例2提供的检测ALDH2基因突变的探针的突变型捕获探针ALDH2-MLSCP13的检出限更低，其在待测样本的各浓度下均有较强的检出电流信号值。由此，进一步表明，通过在突变型探针的5’端加入的延长臂，提高了突变型捕获探针(SEQ ID NO.3)的捕获能力，能够将低浓度的目标序列(SEQ IDNO.5)捕获固定，使得实施例2提供的检测ALDH2基因突变的探针也具有较高的灵敏度。

实施例8

本实施例提供了采用实施例3提供的检测ALDH2基因突变的探针检测ALDH2基因rs671位点突变情况的方法，步骤如下。

1捕获探针(以下简称CP)固定

1.1配制吡咯(pyrrole)与CP的混合液

取1个1.5mL离心管，依次加入超纯水885μl，离子化合物100μl 3M KCl，涡旋震荡混匀，离心；加入导电聚合物5μl pyrrole，涡旋震荡混匀，离心；加入10μl 100μM的CP；涡旋震荡混匀后离心，备用。

1.2固定捕获探针

在96孔的检测孔板(E-plate)上，按其操作说明书，往反应孔加入30μl的已配制好的pyrrole与CP的混合液，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打E-plate使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM仪器上，按其操作说明书，进行电场操作。

设置2个检测组，分别为野生型检测组和突变型检测组。每个检测组设置一个阳性对照孔，一个阴性对照孔，一个样本1的检测孔、一个样本2的检测孔和一个样本3的检测孔(样本的检测孔根据需要检测的样本数量确定，可以是一个，或者多个)。

野生型检测组的各反应孔里加入野生型捕获探针(SEQ ID NO.2)；突变型检测组的各反应孔里加入突变型捕获探针(SEQ ID NO.3)。

1.3 EFIRM电场处理

1.4 E-plate板清洗：

2样本杂交

2.1杂交buffer预处理

2.2配制待测样本

待测样本(样本采集方式：小心取出口腔拭子；握住手柄，将拭子分别伸进两侧口腔，使拭子头部充分接触左侧脸颊内部/左侧上下牙床处粘膜，用刷牙的力度上下擦动，同时，旋转拭子，让拭子头部充分接触口腔粘膜，将拭子头放置在采样管中，加PBS浸泡，并震荡重悬细胞，于-20℃保存。)从-20℃冰箱取出，放进4℃冰箱解冻。完全溶解后，使用煮沸法或0.4M NaOH预处理待测样本，然后将待测样本与杂交buffer按体积比1:2混合，涡旋振荡后离心，即可上样进行检测。

2.3加待测样本

在E-plate上，在对应的孔里加入上述待测样本(样本1、样本2或样本3)与杂交buffer混合后的混合液30μl。(需要注意的是:加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极，加完后倾斜或拍打E-plate使液体在孔里的电极表面均匀覆盖，然后立刻到EFIRM上进行电场操作。)

野生型检测组的阳性对照孔加入含ALDH2-WT(野生型寡核酸片段，SEQ ID NO.4)的阳性对照Buffer混合液，突变型检测组的阳性对照孔加入含ALDH2-MT(突变型寡核酸片段，SEQ ID NO.5)的阳性对照Buffer混合液，各检测组的阴性对照孔均仅加入Buffer。样本检测孔加入相应的待测样本(样本1、样本2或样本3)与杂交buffer混合后的混合液。

2.4 EFIRM电场处理

2.5室温孵育

盖上E-plate盖子，实验台上室温孵育15min。

2.6 E-plate板清洗

3 DP结合

3.1 DP溶液配制

从4℃冰箱取出稀释液，取1个1.5mL离心管，加入990μl的稀释液，往各检测组的反应孔中加入对应的10μl 100μM DP(SEQ ID NO.1)，涡旋震荡混匀，离心，备用。其中，稀释液为含0.1％(质量体积比)酪蛋白的PBS缓冲液(pH7.4)。酪蛋白的作用是封闭非特异性位点，以提高检测的灵敏性和准确度。

3.2加样

3.3室温孵育

盖上E-plate盖子，实验台上室温孵育15min。

3.4 E-plate板清洗

4链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(Poly-HRP)与生物素结合

4.1 Poly-HRP溶液配制

从4℃冰箱取出稀释液，取1个1.5mL离心管，加入999μl的稀释液，加入1μl的酶液(含Poly-HRP，浓度为0.5mg/ml)，涡旋震荡混匀，离心，备用。

4.2加酶液

4.3室温孵育

盖上E-plate盖子，实验台上室温孵育15min。

4.4 E-plate板清洗

5数据读取

5.1加底物

在对应的各孔加入底物60μl，加样时枪头贴近孔的底部，但是不接触到底部电极。加完立刻到EFIRM上进行电场操作。其中，底物为含TMB的溶液。加入酶的底物，发生氧化还原反应，产生电流，检测各孔内电流值即完成整个检测过程。

5.2 EFIRM电场读数

仪器将自动完成检测工作，检测数据自动上传到云计算平台。根据检测数据绘制柱状图，横坐标为检测组的类别，纵坐标为各检测组中各检测孔的电流值(Current)，单位为纳安(nA)。本实施例的检测结果如图3和表3所示。

5.3结果分析

质控结果说明：对于野生型和突变型检测组，阴性对照的值均需小于100nA，阳性对照值均需大于100nA，否则结果不成立。阈值设定即为100nA。

需要说明的是，采用其他实施例提供的探针的进行检测的方法与本实施例基本相同。

表3.采用实施例3提供的检测ALDH2基因突变的探针检测三份样本的检测结果

组别	阴性对照	阳性对照	样本1	样本2	样本3
						野生型检测组	24.47nA	213.56nA	206.77nA	38.23nA	196.99nA
突变型检测组	20.13nA	240.17nA	33.88nA	841.73nA	191.09nA

由表3和图3(图中：纵坐标为电流值nA)可知，在野生型检测组中，阴性对照值为24.47nA，小于100nA，阳性对照值为213.56nA，大于100nA，符合质控要求；

在突变型检测组中，阴性对照值为20.13nA，小于100nA，阳性对照值为240.17nA，大于100nA，符合质控要求。

样本1的野生型检测结果为206.77nA，大于100nA，野生型检测结果为阳性；样本1的突变型检测结果为33.88nA，小于100nA，突变型检测结果为阴性；说明样本1为ALDH2野生型纯合子，即基因型为ALDH2GG(ALDH2*1/ALDH2*1)。

样本2的野生型检测结果为38.23nA，小于100nA，野生型检测结果为阴性；样本2的突变型检测结果为841.73nA，大于100nA，突变型检测结果为阳性；说明样本2为突变型纯合子，即基因型为ALDH2LL(ALDH2*2/ALDH2*2)。

样本3的野生型检测结果为196.99nA，大于100nA，野生型检测结果为阳性，样本3的突变型检测结果为191.09nA，大于100nA，突变型检测结果为阳性。两种基因型信号均成阳性，说明样本3为突变型杂合子，即基因型为ALDH2GL(ALDH2*1/ALDH2*2)。

此外，通过对上述三份样本的检测结果也表明实施例3提供的探针的野生型捕获探针(SEQ ID NO.2)和突变型捕获探针(SEQ ID NO.3)的特异性较好。因为二者的碱基序列只有一个碱基的差异，但各自都仅与其互补的目标序列特异性结合，例如样本1的突变型检测结果为阴性(33.88nA)，说明突变型捕获探针(SEQ ID NO.3)不与SEQ ID NO.4所示的目标序列结合，表明突变型捕获探针的特异性好，假阳性率低；又例如样本2的野生型检测结果为阴性(38.23nA)，说明野生型捕获探针(SEQ ID NO.2)不与SEQ ID NO.5所示的目标序列结合，这也表明野生型捕获探针的特异性好，假阳性率低。

另外，本实施例中，还利用引物5’-TGGAGCCCAGTCACCCTT-3’和5’-CGCCCAGCAGACCCTAAAT-3’，通过测序的方式检测样本1、样本2和样本3的ALDH2基因的rs671位点的突变情况，以验证上述检测结果的准确性，针对rs671位点区域的测序结果如图4所示。

图4的结果显示(图中：a代表样本1、b代表样本2、c代表样本3，箭头处为待测突变位点)，样本1为野生型纯合子，样本2为突变型纯合子，样本3为突变型杂合子，该结果与上述的检测结果一致，表明采用实施例3提供的ALDH2基因突变的探针检测ALDH2基因rs671位点G→A突变的结果是准确可靠的。

综上所述，本发明提供的检测ALDH2基因突变的探针基于人的ALDH2基因rs671位点G→A突变进行设计，并通过在捕获探针的5’端引入特殊序列的延长臂修饰，提高了捕获探针的捕获能力，进而提高其检测的灵敏度，再然后根据rs671位点位点的附件序列选取一段互补结合区(靶区域)作为捕获探针的结合区域，提高其检测的特异性，降低其假阳性率。此外，本发明提供的检测ALDH2基因突变的探针不仅能够检测出ALDH2基因在rs671位点是否发生突变，还能够检测出突变基因型是杂合还是纯合。且采用本发明提供的探针在EFIRM技术平台进行检测时，具有操作简便快速、耗时短、成本低等特点。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京易活生物科技有限公司

<120> 一种检测ALDH2基因突变的探针及其应用和试剂盒

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cttatggagc ccccagcagg tcccacactc aca 33

<210> 2

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

attttttttt ttttttttat tttttttttt ttttttattt tttttttttt ttttattttt 60

tttttttttt ttatttttca cttcagtgta 90

<210> 3

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

attttttttt ttttttttat tttttttttt ttttttattt tttttttttt ttttattttt 60

tttttttttt ttatttttca ctttagtgta 90

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

gctgcaggca tacactgaag tgaaaactgt gagtgtggga cctgctgggg gctcagggc 59

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 5

gctgcaggca tacactaaag tgaaaactgt gagtgtggga cctgctgggg gctcagggc 59

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcacttcagt gtagcatggc cttag 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcactttagt gtagcatggc cttag 25

Claims

1.一种检测ALDH2基因突变的探针，其特征在于，其包括SEQ ID NO.1所示的检测探针，以及SEQ ID NO.2-3所示的捕获探针中的一种或两种，所述检测探针的5’端或3’端标记有用于结合催化酶的亲和物。

2.根据权利要求1所述的检测ALDH2基因突变的探针，其特征在于，所述亲和物为地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种。

3.权利要求1或2所述的检测ALDH2基因突变的探针在制备用于检测ALDH2基因突变的试剂盒中的应用。

4.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1或2所述的检测ALDH2基因突变的探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于将所述探针的所述捕获探针固定至检测孔板的固定物，所述固定物包括导电聚合物和离子化合物；

所述导电聚合物为选自吡咯、苯胺和噻吩中的任意一种；

所述离子化合物为选自氯化钠和氯化钾中的任意一种。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括所述催化酶，所述催化酶是带有标记物的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，所述标记物用于与所述亲和物结合，所述标记物为地高辛抗体、异硫氰酸荧光素抗体以及链霉亲和素中的一种。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括所述催化酶的底物；

当所述催化酶为所述辣根过氧化物酶时，所述底物是TMB、ABTS和OPD中的任意一种；

当所述催化酶为所述碱性磷酸酶时，所述底物是BCIP和NBT的组合物、对硝基苯磷酸盐、4-硝基苯磷酸二钠、萘酚AS-BI磷酸盐以及萘酚-AS-MX-磷酸盐中的任意一种。

8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括清洗液，所述清洗液包括洗液A和洗液B，所述洗液A是含SDS的SSC缓冲液，所述洗液B是含Tween20的PBS缓冲液。

9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测孔板，所述检测孔板的反应孔内固定有所述捕获探针。