CN103436631B - 一种检测cyp3a5基因多态性的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测CYP3A5基因多态性的试剂盒及方法，属于荧光定量PCR领域。所述试剂盒包括检测用引物以及检测用荧光探针，所述检测用引物和检测用荧光探针包括：CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性上下游引物及Taqman荧光探针、CYP3A5基因CYP2C19*4多态性的特异性上下游引物及Taqman荧光探针、CYP3A5基因CYP2C19*6多态性的特异性上下游引物及Taqman荧光探针、和CYP3A5基因CYP3A5*7多态性的特异性上下游引物及Taqman荧光探针中的至少一组。所述试剂盒检测敏感度及特异性均显著提高，检测时间短，有利于预测药物剂量及疗效。
Description
技术领域
本发明涉及荧光定量PCR领域，具体涉及一种检测CYP3A5基因多态性的试剂盒及方法。
背景技术
CYP3A5基因位于人类第7号染色体，全长31.8kb，有13个外显子，编码502个氨基酸。它是CYP3A亚家族主要的肝外表达形式，在肺、肾、乳腺、前列腺以及多形核白细胞中显现出比CYP3A4基因更高的表达水平，却与CYP3A4基因拥有相似的编码氨基酸序列、相似的作用底物及相同的调控途径。CYP3A5野生型定义为CYP3A5*1，携带至少一个CYP3A5*1等位基因的个体才可正常表达CYP3A5蛋白，CYP3A5基因多态性具体详见CYP等位基因数据库(http://www.cypalleles.ki.se)。CYP3A5的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)最早于1996年由Jounaidi等发现。随后更多SNP位点被陆续发现，这些位点包括：位于编码区，特别是位于第7和11号外显子上的位点CYP3A5*2、*4、*6、*7、*8、*9和*10以及位于非编码区的位点，如CYP3A5*3和*5等。其中，CYP3A5*3是导致个体间CYP3A5蛋白差异表达的主要原因而成为研究的焦点。Busi等研究发，突变型CYP3A5*3等位基因的6986位点存在A＞G的变化，从而在第3内含子中创造了一个隐含的受体剪接位点。该位点促使基因内类外显子序列(假外显子)插入成熟mRNA并包括随后外显子的缺失和/或其他基因内序列的插入。这些异常的剪接导致若干框内提前终止密码子的出现。突变型CYP3A5的mRNA比野生型降解更迅速、更不稳定，这种机制称为无义密码子介导的mRNA降解(nonsense-mediatedmRNAdecay，NMD)，促使含PTC(prematuretranslationterminationcondon，翻译提前终止密码子)的mRNA降解，是机体细胞的一种保护性措施。因此，突变纯合型携带者的总mRNA水平比另两种携带者显著减少，最终导致CYP3A5蛋白的不表达，使CYP3A5酶活性明显降低甚至消失。CYP3A5*3等位基因在各种族中的发生频率均为最高，频率差异也很大。黑种人和白种人中发生频率分别为27％～50％和85％～95％。西班牙人、南亚人、韩国人、亚洲美国人、高加索人中的发生频率分别为62％～83％、59％～61％、70％、55％和90％。Liu等对1382名汉族健康人的CYP3A5*3基因型进行分析，结果中国汉族人群的野生、杂合和纯合突变基因型频率分别为8.4％，34.3％和57.3％。CYP3A5的表达亦呈高度多态性，不同种族人群中CYP3A5酶活性可相差10～40倍。Kueh等认为，基因突变是CYP3A5表达的主要调控方式，也是导致CYP3A的药物清除及用药过程中出现个人、种族间差异最重要的原因。基因突变可引起酶的活性和数量的变异，表现为代谢相应底物的能力和速率减慢或减弱。因此，导致个体反应性差异最重要的因素是CYP3A5，而不是CYP3A4。
现有技术中，一般采用直接测序或定性PCR技术检测CYP3A5基因CYP3A5*3多态性、CYP3A5*4多态性、CYP3A5*6和CYP3A5*7多态性。
经研究发现，采用直接测序或定性PCR技术检测CYP3A5基因CYP3A5*3多态性、CYP3A5*4多态性、CYP3A5*6和CYP3A5*7多态性，其检测的灵敏度和特异性均不高，且耗时耗力，所以，不能准确的检测出CYP3A5基因CYP3A5*3多态性、CYP3A5*4多态性、CYP3A5*6和CYP3A5*7多态性。
发明内容
针对现有技术中检测CYP3A5基因CYP3A5*3、CYP3A5*4、CYP3A5*6和CYP3A5*7多态性的灵敏度和特异性均不高、而且耗时耗力等问题，本发明的目的在于提供一种检测CYP3A5基因多态性的试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种检测CYP3A5基因多态性的方法。
为了解决现有技术检测CYP3A5基因CYP3A5*3多态性、CYP3A5*4多态性、CYP3A5*6和CYP3A5*7多态性多态性的灵敏度和特异性均不高且耗时耗力等问题，本发明采用了以下技术方案：
一种检测CYP3A5基因多态性的试剂盒，包括检测用引物以及检测用荧光探针，所述检测用引物和检测用荧光探针包括：CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性Taqman荧光探针、CYP3A5基因CYP3A5*4多态性的特异性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*4多态性的特异性Taqman荧光探针、CYP3A5基因CYP3A5*6多态性的特异性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*6多态性的特异性Taqman荧光探针、和CYP3A5基因CYP3A5*7多态性的特异性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*7多态性的特异性Taqman荧光探针中的至少一组，其中：
所述CYP3A5基因CYP2C19*3多态性的特异性上游引物序列如序列表中SEQIDNO:1所示；
所述CYP3A5基因CYP2C19*3多态性的特异性下游引物序列如序列表中SEQIDNO:2所示；
所述CYP3A5基因CYP2C19*3多态性的特异性Taqman荧光探针的碱基序列如序列表中SEQIDNO:3所示；
所述CYP3A5基因CYP2C19*4多态性的特异性上游引物序列如序列表中SEQIDNO:4所示；
所述CYP3A5基因CYP2C19*4多态性的特异性下游引物序列如序列表中SEQIDNO:5所示；
所述CYP3A5基因CYP2C19*4多态性的特异性Taqman荧光探针的碱基序列如序列表中SEQIDNO:6所示；
所述CYP3A5基因CYP2C19*6多态性的特异性上游引物序列如序列表中SEQIDNO:7所示；
所述CYP3A5基因CYP2C19*6多态性的特异性下游引物序列如序列表中SEQIDNO:8所示；
所述CYP3A5基因CYP2C19*6多态性的特异性Taqman荧光探针的碱基序列如序列表中SEQIDNO:9所示；
所述CYP3A5基因CYP2C19*7多态性的特异性上游引物序列如序列表中SEQIDNO:10所示；
所述CYP3A5基因CYP2C19*7多态性的特异性下游引物序列如序列表中SEQIDNO:11所示；
所述CYP3A5基因CYP2C19*7多态性的特异性Taqman荧光探针的碱基序列如序列表中SEQIDNO:12所示。
在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括内参基因GPADH、所述内参基因GAPDH的上下游引物及所述内参基因GAPDH的Taqman荧光探针，其中，
所述内参基因GAPDH的上游引物序列如序列表中SEQIDNO:13所示；
所述内参基因GAPDH的下游引物序列如序列表中SEQIDNO:14所示；
所述内参基因GAPDH的Taqman荧光探针的碱基序列如序列表中SEQIDNO:15所示；
所述内参基因GAPDH的序列如序列表中SEQIDNO:16所示。
在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性Taqman荧光探针、所述CYP3A5基因CYP3A5*4多态性的特异性Taqman荧光探针、所述CYP3A5基因CYP3A5*6多态性的特异性Taqman荧光探针、所述CYP3A5基因CYP3A5*7多态性的特异性Taqman荧光探针和所述内参基GAPDH的Taqman荧光探针的5’端均连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA-MGB。
在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括各种荧光定量PCR反应试剂或者各种荧光定量PCR反应试剂的混合物，优选地，所述各种荧光定量PCR反应试剂包括PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和无RNase去离子水。
在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的上下游引物和Taqman荧光探针，其中：
所述内部阳性控制序列如序列表中SEQIDNO:17所示；
所述内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQIDNO:18所示；
所述内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQIDNO:19所示；
所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的碱基序列如序列表中SEQIDNO:20所示。更优选地，所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，其中，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有CYP3A5基因CYP3A5*3多态性、所述CYP3A5基因CYP3A5*4多态性、所述CYP3A5基因CYP3A5*6多态性和所述CYP3A5基因CYP3A5*7多态性的基因组DNA样品。
一种检测CYP3A5基因多态性的方法，采用荧光定量PCR法，包括如下步骤：
步骤一，提取受检者基因组DNA；
步骤二，以稀释成不同浓度的如序列表中SEQIDNO:16所示的内参基因GAPDH标准品为模板，采用如序列表中SEQIDNO:13所示的上游引物、如序列表中SEQIDNO:14所示的下游引物和如序列表中SEQIDNO:15所示的Taqman荧光探针进行荧光定量PCR反应以制作内参基因GAPDH标准品的标准曲线；
步骤三，以步骤一得到的基因组DNA为模板，采用如序列表中SEQIDNO:1所示的上游引物、如序列表中SEQIDNO:2所示的下游引物和如序列表中SEQIDNO:3所示的Taqman荧光探针，对CYP3A5基因CYP3A5*3多态性进行荧光定量PCR扩增；以步骤一得到的基因组DNA为模板，采用如序列表中SEQIDNO:4所示的上游引物、如序列表中SEQIDNO:5所示的下游引物和如序列表中SEQIDNO:6所示的Taqman荧光探针，对CYP3A5基因CYP3A5*4多态性进行荧光定量PCR扩增；以步骤一得到的基因组DNA为模板，采用如序列表中SEQIDNO:7所示的上游引物、如序列表中SEQIDNO:8所示的下游引物和如序列表中SEQIDNO:9所示的Taqman荧光探针，对CYP3A5基因CYP3A5*6多态性进行荧光定量PCR扩增；以步骤一得到的基因组DNA为模板，采用如序列表中SEQIDNO:10所示的上游引物、如序列表中SEQIDNO:11所示的下游引物和如序列表中SEQIDNO:12所示的Taqman荧光探针，对CYP3A5基因CYP3A5*7多态性进行荧光定量PCR扩增；其中所述步骤三中的荧光定量PCR扩增的反应条件与步骤二的荧光定量PCR反应条件相同；
步骤四，数据收集处理和分析。
在上述方法中，作为一种优选实施方式，在所述步骤二和所述步骤三中，所述荧光定量PCR反应中均加入了如序列表中SEQIDNO:17所示的内部阳性控制序列、如序列表中SEQIDNO:18所示的内部阳性控制序列的上游引物、如序列表中SEQIDNO:19所示的内部阳性控制序列的下游引物以及如序列表中SEQIDNO:20所示的内部阳性控制序列的Taqman荧光探针。
在上述方法中，作为一种优选实施方式，在所述步骤二和所述步骤三中，所述荧光定量PCR反应的条件为：先经过50℃10s，95℃10min预变性，然后95℃15s，60℃1min，扩增40个循环。更优选地，荧光定量PCR的反应液中部分组分及终浓度为：1×的PCR预混合液、2.5-4.0mM的Mg2+、0.2-0.4mM的dNTPs、0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶、0.01-0.05U/μL的UNG酶。
本发明试剂盒及检测方法的优点和效果如下：
(1)敏感性高：可重复敏感度为0.01％，即10000个细胞中有一个含CYP3A5基因CYP3A5*3多态性、CYP3A5基因CYP3A5*4多态性、CYP3A5基因CYP3A5*6多态性或CYP3A5基因CYP3A5*7多态性就可以被检测出。
(2)特异性强：使用特异性探针对定量分子进行识别，准确性高。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。
(3)简便安全：操作简单、安全、自动化程度高而且防止污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易被污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，无需要担心放射性污染。
(4)全程监控：本发明实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制体系，对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性。
(5)快速：速度快、高通量，可在3-4小时完成。
本发明的试剂盒及检测方法能快速、准确、定量检测CYP3A5基因CYP3A5*3多态性、CYP3A5基因CYP3A5*4多态性、CYP3A5基因CYP3A5*6多态性或CYP3A5基因CYP3A5*7多态性，有效杜绝了假阳性和假阴性的发生，用于经CYP3A5代谢的药物使用剂量的预测并为药物的选择提供了重要的技术手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例2提供的采用实施例1试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增CYP3A5基因CYP3A5*3多态性阳性的受检者外周血的荧光曲线图，及内参基因GAPDH标准品扩增的荧光曲线图和内部阳性控制序列标准品扩增的荧光曲线图，其横坐标为CycleNumber(循环数，个)，其纵坐标为FLUORESCENCE(荧光强度，a.u.)；
图2是本发明实施例2提供的采用实施例1试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增CYP3A5基因CYP3A5*4多态性阳性的受检者外周血的荧光曲线图，及内参基因GAPDH标准品扩增的荧光曲线图和内部阳性控制序列标准品扩增的荧光曲线图，其横坐标为CycleNumber(循环数，个)，其纵坐标为FLUORESCENCE(荧光强度，a.u.)；
图3是本发明实施例2提供的采用实施例1试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增CYP3A5基因CYP3A5*6多态性阳性的受检者外周血的荧光曲线图，及内参基因GAPDH标准品扩增的荧光曲线图和内部阳性控制序列标准品扩增的荧光曲线图，其横坐标为CycleNumber(循环数，个)，其纵坐标为FLUORESCENCE(荧光强度，a.u.)；
图4是本发明实施例2提供的采用实施例1试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增CYP3A5基因CYP3A5*7多态性阳性的受检者外周血的荧光曲线图，及内参基因GAPDH标准品扩增的荧光曲线图和内部阳性控制序列标准品扩增的荧光曲线图，其横坐标为CycleNumber(循环数，个)，其纵坐标为FLUORESCENCE(荧光强度，a.u.)。
图中：1-CYP3A5*3多态性的阳性扩增曲线、2-内参基因GAPDH标准品的扩增曲线、3-内部阳性控制品扩增曲线、4-CYP3A5*4多态性的阳性扩增曲线、5-CYP3A5*6多态性的阳性扩增曲线、6-CYP3A5*7多态性的阳性扩增曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规实验条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中所述的条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。
实施例1.试剂盒的制备
1、内参基因GAPDH以及检测用引物和荧光探针的设计
根据基因序列分别设计对上述各基因序列特异的引物和荧光探针，其中，GAPDH基因序列和CYP3A5基因序列来源于美国国家生物技术信息中心核酸数据库(NCBI)，GAPDH基因ID分别为2597，参考序列号为NG_007073.2，也可参见本发明序列表中SEQIDNO:16；CYP3A5基因ID分别为1577，参考序列号为NC_000007.13。采用Primer5.0引物设计软件分别设计如下引物：CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性Taqman荧光探针、CYP3A5基因CYP3A5*4多态性的特异性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*4多态性的特异性Taqman荧光探针、CYP3A5基因CYP3A5*6多态性的特异性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*6多态性的特异性Taqman荧光探针、CYP3A5基因CYP3A5*7多态性的特异性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*7多态性的特异性Taqman荧光探针、内参基因GAPDH的上下游引物及内参基因GAPDH的Taqman荧光探针。
CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性上游引物序列：5’-AAGAGCTCTTTTGTCTTTCGA-3’(序列表中SEQIDNO:1所示)。
CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性下游引物序列：5’-GACACACAGCAACCTTAGGT-3’(序列表中SEQIDNO:2所示)。
CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性Taqman荧光探针：FAM5’-TATCTCTTCCCTGTTT-3’TAMRA-MGB(序列表中SEQIDNO:3所示)。
CYP3A5基因CYP3A5*4多态性的特异性上游引物序列：5’-TGCTCTCCACAAAGGGGTCGC-3’(序列表中SEQIDNO:4所示)。
CYP3A5基因CYP3A5*4多态性的特异性下游引物序列：5’-TGATTTTAATTTTCCATATC-3’(序列表中SEQIDNO:5所示)。
CYP3A5基因CYP3A5*4多态性的特异性Taqman荧光探针：FAM5’-TGTTGAGAGAGTCG-3’TAMRA-MGB(序列表中SEQIDNO:6所示)。
CYP3A5基因CYP3A5*6多态性的特异性上游引物序列：5’-AGATCCATTATTTCTCTCAATAGA-3’(序列表中SEQIDNO:7)。
CYP3A5基因CYP3A5*6多态性的特异性下游引物序列：5’-ATGGAATTGTACCTTTTAAGTG-3’(序列表中SEQIDNO:8)。
CYP3A5基因CYP3A5*6多态性的特异性Taqman荧光探针：FAM5’-TATGTGGGCTATTATT-3’TAMRA-MGB(序列表中SEQIDNO:9)。
CYP3A5基因CYP3A5*7多态性的特异性上游引物序列：5’-GTTTCTTTCCTTCCAGGCACCACGTT-3’(序列表中SEQIDNO:10)。
CYP3A5基因CYP3A5*7多态性的特异性下游引物序列：5’-TCAACATCTTTCTTGCAAGT-3’(序列表中SEQIDNO:11)。
CYP3A5基因CYP3A5*7多态性的特异性Taqman荧光探针：FAM5’-CTATGATGCCGTG-3’TAMRA-MGB(序列表中SEQIDNO:12)。
内参基因GAPDH的上游引物序列：5’-CCTTTTGCAGACCACAGTCCAT-3’(序列表中SEQIDNO:13所示)。
内参基因GAPDH的下游引物序列：5’-GGCCATGCCAGTGAGCTT-3’(序列表中SEQIDNO:14所示)。
内参基因GAPDH的Taqman荧光探针：FAM5’-CCATCACTGCCACCC-3’TAMRA-MGB(序列表中SEQIDNO:15所示)。
对于上述5个Taqman荧光探针，均采用添加荧光染料的方法在5’端标记了FAM，3’端标记了TAMRA-MGB。对于上述四个Taqman荧光探针，均采用添加荧光染料的方法分别在5’端标记了FAM，3’端标记了TAMRA-MGB。
2、内部阳性控制序列及其引物和探针的设计
该内部阳性控制序列为人工合成序列，包含CYP3A5基因部分序列和一部分人工合成序列，如序列表中SEQIDNO:17所示。
采用Primer5.0引物设计软件并按照上述引物和探针设计原则设计出上述内部阳性控制序列的上下游引物分别为：5’-CGTATTGCACTCACTCAGAG-3’(序列表中序列18)、5’-ACAACAGCGTAAGATGATCACTATC-3’(序列表中序列19)，内部阳性控制序列的Taqman荧光探针为：TET5’-AATAAGTCCTCTACTATATTAGC-3’TAMRA(序列表中序列20)。对于该Taqman荧光探针，采用添加荧光染料的方法在5’端标记了TET，3’端标记了TAMRA。
3、试剂盒的组成及制备
本发明试剂盒组成如下：
①基因组DNA提取试剂：该提取试剂为本领域常用试剂，本实施例采用组织基因组DNA提取试剂盒(Qiagen公司，货号：69504)中的试剂。
②引物、探针：上述CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性上下游引物、上述CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性Taqman荧光探针、上述CYP3A5基因CYP3A5*4多态性的特异性上下游引物、上述CYP3A5基因CYP3A5*4多态性的特异性Taqman荧光探针、上述CYP3A5基因CYP3A5*6多态性的特异性上下游引物、上述CYP3A5基因CYP3A5*6多态性的特异性Taqman荧光探针、上述内部阳性控制序列的上下游引物、上述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针、上述内参基因GAPDH的上下游引物以及上述内参基因GAPDH的Taqman荧光探针。
③上述内参基因GAPDH和内部阳性控制序列标准品。
上述引物序列、控制序列、内参基因GAPDH序列和Taqman荧光探针序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
④阴性对照和阳性对照：以去离子水为阴性对照，以含有CYP3A5*3基因多态性、CYP3A5*4基因多态性、CYP3A5*6基因多态性和CYP3A5*7基因多态性的基因组DNA样品为阳性对照。
阳性对照的制备方法：采用组织基因组DNA提取试剂盒(Qiagen公司，货号：69504)快速提取已经确诊的含有CYP3A5*3基因多态性、CYP3A5*4基因多态性、CYP3A5*6基因多态性和CYP3A5*7基因多态性的0.5ml受检者外周血基因组DNA，作为阳性对照。
⑤各种荧光定量PCR反应试剂：PCR预混合液，本实施例中选用2×PCRPremix(Qiagen公司，产品货号：210212)；Mg2+(本实例为氯化镁)、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和无RNase去离子水。
实施例2.用实施例1的试剂盒检测CYP3A5基因多态性
以随机检测30例受检者外周血标本结果为例。
用本发明的试剂盒检测某一受检者的CYP3A5*3基因多态性、CYP3A5*4基因多态性、CYP3A5*6和CYP3A5*7基因多态性的检测流程为：首先获取临床受检者外周血样本，快速提取基因组DNA；其次，先配制内参基因GAPDH和内部阳性控制序列的荧光定量PCR反应液，将内部阳性控制序列标准品和内参基因GAPDH标准品分别稀释至拷贝数/mL为1.0x103、1.0x104、1.0x105和1.0x106，分别制作内部阳性控制序列标准品的标准曲线和内参基因GAPDH标准品的标准曲线；接下来再配制CYP3A5*3基因多态性、CYP3A5*4基因多态性、CYP3A5*6和CYP3A5*7基因多态性的荧光定量PCR反应液，进行荧光定量PCR检测样品，在荧光定量PCR仪数据分析系统中读出CT值结果。PCR扩增结束后，先分析各待检测样品的荧光定量PCR反应中内部阳性控制序列的扩增结果，如果其Ct值小于33；提示整个检测过程有效；如果其Ct值大于35，提示检测失败，则需要重新进行检测；如果其Ct值位于33～35之间，需要重复检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算即分别计算如图1所示的CYP3A5*3基因多态性、如图2所示的CYP3A5*4基因多态性、如图3所示的CYP3A5*6基因多态性、如图4所示的CYP3A5*7基因多态性及内参基因GAPDH的Ct值，两者之差即为ΔCt值。最后，荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。
各受检者的CYP3A5基因多态性的具体检测步骤如下：
①受检者外周血基因组DNA的抽提：采用实施例1试剂盒中的基因组DNA提取试剂按DNA抽提纯化的方法快速提取0.5ml受检者外周血基因组DNA。
②将①中提取的受检者外周血基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，通过紫外分光光度计测定260nm与280nm光密度值计算DNA的纯度与浓度，用无菌去离子水调节抽提的DNA至相同浓度，置冰箱-20℃保存。
③将实施例1试剂盒中的内部阳性控制序列标准品和内参基因GAPDH标准品分别稀释至拷贝数/mL为1.0x103、1.0x104、1.0x105和1.0x106，用本发明实施例1提供的内部阳性控制序列和内参基因GAPDH的荧光定量PCR反应液按以下荧光定量PCR反应体系进行反应以分别制作内部阳性控制序列标准品的标准曲线和内参基因GAPDH标准品的标准曲线。
稀释成不同梯度浓度的内参基因GAPDH的荧光定量PCR扩增：
各PCR反应体系为20μL，该反应体系中各组分及其终浓度为：1×PCR混合液(Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCRPremix，10.0μL)，3mM的Mg2+、0.3mM的dNTPs、0.5mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶、0.04U/μL的UNG酶，内参基因GAPDH的上、下游引物的终浓度均为0.2μmol/L，内参基因GAPDH的Taqman荧光探针的终浓度为0.2μmol/L；另外，各稀释梯度浓度的内参基因GAPDH标准品用量为1.0μL，其余为无RNase去离子水。
稀释成不同浓度的内部阳性控制序列的荧光定量PCR扩增：
各PCR反应体系为20μL，该反应体系中各组分及其终浓度为：1×PCR混合液(Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCRPremix，10.0μL)，3mM的Mg2+、0.3mM的dNTPs、0.5mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶、0.04U/μL的UNG酶，内部阳性控制序列的上、下游引物的终浓度均为0.25pmol/μL，内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的终浓度为0.3pmol/μL；另外，各稀释梯度的内部阳性控制序列标准品用量为1.0μL，其余为无RNase去离子水。
将上述各PCR反应体系置于lightcycler荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR：先经过50℃10s、95℃10min预变性，然后95℃15s，60℃1min扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号，并读取Ct值。
④CYP3A5*3基因多态性荧光定量PCR扩增：
PCR反应体系为20μL，该反应体系中各组分及终浓度为：1×PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCRPremix，10.0μL)，3mM的Mg2+、0.3mM的dNTPs和0.5mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.04U/μL的UNG酶，CYP3A5*3基因多态性特异性上、下游引物终浓度均为0.2μmol/L，CYP3A5*3基因多态性特异性Taqman荧光探针终浓度为0.3μmol/L，同时加入内部阳性控制序列上、下游引物的终浓度均为0.2μmol/L，内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的终浓度为0.3μmol/L，内部阳性控制序列终浓度为0.2μmol/L；另外，被提取的受检者外周血基因组DNA用量为2.0μL，余量为无RNase去离子水。
将上述PCR反应体系置于lightcycler荧光定量PCR仪上反应，扩增条件：先经过50℃10s，95℃10min预变性，然后95℃15s，60℃1min扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。
⑤CYP3A5*4基因多态性荧光定量PCR扩增：
PCR反应体系为20μL，该反应体系中各组分及终浓度为：1×PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCRPremix，10.0μL)，3mM的Mg2+、0.3mM的dNTPs和0.5mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.04U/μL的UNG酶，CYP3A5*4基因多态性特异性上、下游引物终浓度均为0.2μmol/L，CYP3A5*4基因多态性特异性Taqman荧光探针终浓度为0.3μmol/L，同时加入内部阳性控制序列上、下游引物的终浓度均为0.2μmol/L，内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的终浓度为0.3μmol/L，内部阳性控制序列的终浓度为0.2μmol/L；另外，被提取的受检者外周血基因组DNA用量为2.0μL，余量为无RNase去离子水。
将上述PCR反应体系置于lightcycler荧光定量PCR仪上反应，扩增条件：先经过50℃10s，95℃10min预变性，然后95℃15s，60℃1min扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。
⑥CYP3A5*6基因多态性荧光定量PCR扩增：
PCR反应体系为20μL，该反应体系中各组分及终浓度为：1×PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCRPremix，10.0μL)，3mM的Mg2+、0.3mM的dNTPs和0.5mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和004U/μL的UNG酶，CYP3A5*6基因多态性特异性上、下游引物的终浓度均为0.2μmol/L，CYP3A5*6基因多态性的特异性Taqman荧光探针终浓度为0.3μmol/L，同时加入内部阳性控制序列上、下游引物的终浓度均为0.2μmol/L，内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的终浓度为0.3μmol/L，内部阳性控制序列终浓度为0.2μmol/L；另外，被提取的受检者外周血基因组DNA用量为2.0μL，余量为无RNase去离子水。
将上述PCR反应体系置于lightcycler荧光定量PCR仪上反应，扩增条件：先经过50℃10s，95℃10min预变性，然后95℃15s，60℃1min扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。
⑦CYP3A5*7基因多态性荧光定量PCR扩增：
PCR反应体系为20μL，该反应体系中各组分及终浓度为：1×PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCRPremix，10.0μL)，3mM的Mg2+、0.3mM的dNTPs和0.5mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.04U/μL的UNG酶，CYP3A5*7基因多态性特异性上、下游引物的终浓度均为0.2μmol/L，CYP3A5*7基因多态性的特异性Taqman荧光探针终浓度为0.3μmol/L，同时加入内部阳性控制序列上、下游引物的终浓度均为0.2μmol/L，内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的终浓度为0.3μmol/L，内部阳性控制序列终浓度为0.2μmol/L；另外，被提取的受检者外周血基因组DNA用量为2.0μL，余量为无RNase去离子水。
将上述PCR反应体系置于lightcycler荧光定量PCR仪上反应。扩增条件：先经过50℃10s，95℃10min预变性，然后95℃15s，60℃1min扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。在CYP3A5*3、CYP3A5*4、CYP3A5*6和CYP3A5*7基因多态性的荧光定量PCR扩增的同时设置阴性对照和阳性对照，阳性对照、阴性对照荧光定量PCR扩增的PCR反应体系为20μL，该反应体系中各组分及终浓度为：1×PCR混合液(Qiagen公司，产品货号：210212，2×PCRPremix，10.0μL)，,3M的Mg2+、0.3mM的dNTPs和0.5mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.04U/μL的UNG酶，CYP3A5*3基因多态性、CYP3A5*4基因多态性、CYP3A5*6和CYP3A5*7基因多态性的特异性上、下游引物的终浓度均为0.2μmol/L，CYP3A5*3基因多态性、CYP3A5*4基因多态性、CYP3A5*6和CYP3A5*7基因多态性的特异性Taqman荧光探针的终浓度均为0.3μmol/L；另外，阳性对照的基因组DNA样品的用量为1.0μL或者阴性对照去离子水的用量为1.0μL，余量为无RNase去离子水。
将该阴性对照和阳性对照也置于lightcycler荧光定量PCR仪上反应，扩增条件为：先经过50℃10s，95℃10min预变性，然后95℃15s，60℃1min扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。
⑨数据收集处理和分析：PCR扩增结束后，首先分析各反应体系中的内部阳性控制序列扩增结果，如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，则需要重新进行检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，得出，CYP3A5*3基因多态性、CYP3A5*4基因多态性、CYP3A5*6和CYP3A5*7基因多态性相对于内参基因GAPDH的相对表达量后再进行统计分析，以比值大于或等于0.0001为阳性表达，小于0.0001为阴性表达，具体参见表1。
表1为荧光定量PCR分析CYP3A5*3基因多态性、CYP3A5*4基因多态性、C
YP3A5*6和CYP3A5*7基因多态性在受检者外周血标本中的表达数据
表1中CYP3A5基因多态性模板和内参基因GAPDH模板中的数值均表示荧光累计值。
本发明试剂盒检测能力评价：
以定性PCR作为本发明的比较检测方法，同时对上述30例受检者外周血标本进行检测，比较结果显示，本发明试剂盒采用定量PCR检测的敏感性、特异性及灵敏度较定性PCR法更为精确，完全符合目前临床实用要求(具体参见表2)：
表2为两种不同方法检测受检者外周血中CYP3A5基因多态性的比较
由上表可知，通过定性PCR法检验本发明提供的荧光定量PCR法，定性PCR法作为参照，本发明的荧光定量PCR法和定性PCR法同时检测到16例阳性，均未检测检测出阴性，由此得出，采用本发明的试剂盒检测的阳性预测值为100％；采用本发明的荧光定量PCR法和定性PCR法同时检测到14例阴性，均未检测检测出阳性，由此得出，采用本发明的试剂盒检测的阴性预测值为100％。
其中：
①特异性：100％；
②阳性预测值：阳性预测值达到100％；
③阴性预测值：阴性预测值达到100％；
④重复性：多次重复实验结果一致；
⑤耗时：本发明检测一份临床标本的检测时间约为4h，而采用定性PCR法一份临床标本的检测时间约为72h。
上述实验可以说明，本发明提供的试剂盒的敏感性及特异性均较高，本发明提供的试剂盒采用人工设计与合成的内部阳性控制序列，监测受检者外周血CYP3A5*3基因多态性、CYP3A5*4基因多态性、CYP3A5*6和CYP3A5*7基因多态性实时荧光定量PCR检测的整个过程，能有效地解决目前受检者外周血中CYP3A5*3基因多态性、CYP3A5*4基因多态性、CYP3A5*6和CYP3A5*7基因多态性实时荧光定量PCR检测过程中的假阳性、假阴性问题，使得检测结果更可靠，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种检测CYP3A5基因多态性的试剂盒，包括检测用引物以及检测用荧光探针，其特征在于，所述检测用引物和检测用荧光探针包括：CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性Taqman荧光探针、CYP3A5基因CYP3A5*4多态性的特异性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*4多态性的特异性Taqman荧光探针、CYP3A5基因CYP3A5*6多态性的特异性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*6多态性的特异性Taqman荧光探针、和CYP3A5基因CYP3A5*7多态性的特异性上下游引物及所述CYP3A5基因CYP3A5*7多态性的特异性Taqman荧光探针中，其中：
所述CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性上游引物序列如序列表中SEQIDNO:1所示；
所述CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性下游引物序列如序列表中SEQIDNO:2所示；
所述CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性Taqman荧光探针的碱基序列如序列表中SEQIDNO:3所示；
所述CYP3A5基因CYP3A5*4多态性的特异性上游引物序列如序列表中SEQIDNO:4所示；
所述CYP3A5基因CYP3A5*4多态性的特异性下游引物序列如序列表中SEQIDNO:5所示；
所述CYP3A5基因CYP3A5*4多态性的特异性Taqman荧光探针的碱基序列如序列表中SEQIDNO:6所示；
所述CYP3A5基因CYP3A5*6多态性的特异性上游引物序列如序列表中SEQIDNO:7所示；
所述CYP3A5基因CYP3A5*6多态性的特异性下游引物序列如序列表中SEQIDNO:8所示；
所述CYP3A5基因CYP3A5*6多态性的特异性Taqman荧光探针的碱基序列如序列表中SEQIDNO:9所示；
所述CYP3A5基因CYP3A5*7多态性的特异性上游引物序列如序列表中SEQIDNO:10所示；
所述CYP3A5基因CYP3A5*7多态性的特异性下游引物序列如序列表中SEQIDNO:11所示；
所述CYP3A5基因CYP3A5*7多态性的特异性Taqman荧光探针的碱基序列如序列表中SEQIDNO:12所示；
所述试剂盒还包括内参基因GPADH、所述内参基因GAPDH的上下游引物及所述内参基因GAPDH的Taqman荧光探针，其中，
所述内参基因GAPDH的上游引物序列如序列表中SEQIDNO:13所示；
所述内参基因GAPDH的下游引物序列如序列表中SEQIDNO:14所示；
所述内参基因GAPDH的Taqman荧光探针的碱基序列如序列表中SEQIDNO:15所示；
所述内参基因GAPDH的序列如序列表中SEQIDNO:16所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述CYP3A5基因CYP3A5*3多态性的特异性Taqman荧光探针、所述CYP3A5基因CYP3A5*4多态性的特异性Taqman荧光探针、所述CYP3A5基因CYP3A5*6多态性的特异性Taqman荧光探针、所述CYP3A5基因CYP3A5*7多态性的特异性Taqman荧光探针和所述内参基GAPDH的Taqman荧光探针的5’端均连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA-MGB。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括各种荧光定量PCR反应试剂或者各种荧光定量PCR反应试剂的混合物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述各种荧光定量PCR反应试剂包括PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和无RNase去离子水。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的上下游引物和Taqman荧光探针，其中：
所述内部阳性控制序列如序列表中SEQIDNO:17所示；
所述内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQIDNO:18所示；
所述内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQIDNO:19所示；
所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的碱基序列如序列表中SEQIDNO:20所示。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，其中，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有所述CYP3A5基因CYP3A5*3多态性、所述CYP3A5基因CYP3A5*4多态性、所述CYP3A5基因CYP3A5*6多态性和所述CYP3A5基因CYP3A5*7多态性的基因组DNA样品。
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