CN104561336A - 利用高分辨熔解曲线分析技术检测ugt2b7基因多态性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测UGT2B7的基因多态性的方法，所述方法为：提取DNA后经PCR扩增，再用高分辨熔解仪检测UGT2B7C.802T>C(RS7439366)基因分型。本方法无需昂贵的设备和试剂，操作不需要进行酶切、纯化等步骤，避免人工接触有毒有害试剂和紫外照射等，安全性较好，并且真正实现了闭管操作，降低样本污染，分析不需要探针，仅在PCR反应体系中增加微量饱和荧光染料，成本较低。具有操作简便、快速、高灵敏度、重复性好、成本低等优点，适合常规基因多态性监测。

Description

利用高分辨熔解曲线分析技术检测UGT2B7基因多态性的方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术和医学检验领域，尤其涉及一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测药物代谢酶UGT基因多态性的方法。

背景技术

药物进入人体经过吸收、分布、代谢和消除后排除体外，药物与其相关的药物代谢酶、转运蛋白及作用靶点相互作用，编码代谢酶和靶点蛋白的基因和药物效应密切相关。如果这些基因发生突变，就可以引起药物反应的遗传差异。通过药物相关基因检测来预测患者是否对治疗药物敏感，从而筛选出最适合的药物，提高药物的疗效，降低药物的毒副反应。基因检测指导个体化用药对提高临床疗效和保证用药安全有重要意义，基因多态性可作为不同患者个体用药的参考指标。

葡萄糖醛酸基转移酶(UDP-glucuronosyhransferase，UGT)存在于许多脊椎动物的肝微粒体中，是最重要的II相生物转化酶之一，UGT催化多种内源性物质和许多临床应用的药物(如非甾体抗炎药、吗啡、化疗药物表柔比星、抗癫痫药物卡马西平和丙戊酸盐、免疫抑制药物麦考酚酸、抗病毒药物齐多夫定等)。UGT存在明显的个体差异和种族差异，通过检测其基因多态性可以预测药物的反应，如FDA伊立替康说明书中注释需要检测UGT 1A1*28的多态性，UGT 1A1*28纯合子患者需要调整给药剂量以预防嗜中性白血球减少症的发生。UGT2B7基因是UGT家族中的重要成员之一，主要定位于4q13，全长16kb，包含6个外显子和5个内含子，可编码529个氨基酸残基。研究表明UGT2B7基因的编码区和启动子区域存在着高度的遗传多态性，如-327A>G，-161T>C，-138G>A和-125T>C。研究表明，UGT2B7是卡马西平和丙戊酸葡萄糖醛酸化的主要同工酶，UGT2B7C.802T>C(rs7439366)多态性可能通过影响UGT酶的活性影响药物的代谢，其基因多态性影响药物浓度，从而影响药物的疗效。因此，检测UGT2B7C.802T>C多态性对个体化给药有重要的临床意义。

目前现有的基因多态性的检测方法主要有Taqman探针法和DNA直接测序法。Taqman是高度特异的定量PCR技术，其优点是步骤少，不易污染，便于对大样本进行分型；但对引物设计有一定的限制，对于SNP附近的序列有一定要求，受突变碱基位点与类型局限。DNA直接测序法是突变检测的金标准，但存在费时费力，成本较昂贵，不适用于对大量样本进行检测。除以上两种常用方法外，市场上已经出现一些基因产品，罗氏公司的基因芯片产品——NimbleGen AccuSNP CYP基因分型芯片，利用芯片技术对于已知位点的突变进行快速分型，是目前基因芯片的热点应用之一，基因芯片快速、准确、简便，实验报告为定性，缺点是价格昂贵，高达几百美元，且无法同时处理大量样本。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题提出的。

本发明的目的是提供一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法—高分辨熔解曲线分析(high-resolution melting analysis,HRM)技术测定UGT2B7基因多态性的方法，该方法具有高通量、高灵敏度、重复性好、操作简便和低成本的特点，对协助个体化给药、保证用药安全和有效具有重要意义。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测UGT2B7基因多态性的方法，其特征在于，提取DNA后经PCR扩增，再用高分辨熔解仪检测UGT2B7C.802T>C(RS7439366)基因分型。

在上述方法中，优选地，所述方法包括以下步骤：

步骤1：查找目的基因UGT2B7C.802T>C(RS7439366)的DNA序列，对该目的基因的突变位点设计筛选合适的引物对；

步骤2：提取外周血细胞样本的基因组DNA，利用步骤1筛选的引物进行基因PCR扩增；

步骤3：利用高分辨熔解曲线分析技术对扩增后的目的基因的突变位点进行检测。

在上述方法中，优选地，所述引物对含有目的基因靶序列中18-27bp连续核苷酸构成的序列，PCR产物长度为80-150bp；其中，UGT2B7C.802T>C(RS7439366)引物序列为：

RS7439366-F：ATGGGGAAAGCTGACGTATG；

RS7439366-R：TTACCTTAGGCAGGGGTTTG。

在上述方法中，优选地，所述步骤2的PCR扩增反应的条件为92-97℃预变性3-15min，92-97℃变性10-30s，50-65℃退火10-30s，72℃延伸10-30s，70-75℃继续延伸3-10min，进行30-50个循环。

在上述方法中，优选地，所述步骤3的检测选用SYTO-9饱和荧光染料，以已知UGT2B7C.802T>C(RS7439366)位点三种基因型的样本DNA为对照，参照对照样本高分辨熔解曲线，以判断样本的基因多态性。

在上述方法中，优选地，所述步骤3的检测条件为92-97℃变性2-4min，40℃复性1-2min；然后初始熔解温度60-65℃开始程序升温熔解至95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，25-45次每秒；然后40℃进行冷却5-15s；其中，UGT2B7C.802T>C熔解曲线温度设定范围为78-84℃。

在上述方法中，优选地，所述方法在PCR反应体系中进行，所述PCR反应体系包括引物、DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、模板DNA、PCR缓冲液和荧光染料。

其中，所述dNTPs优选地为包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP的混合液；所述荧光染料优选为SYTO-9饱和性染料。

本发明的第二个方面是提供一种预测药物反应的方法，采用如上所述方法检测UGT2B7的基因多态性。

在上述方法中，优选地，所述药物包括但不限于非甾体抗炎药、吗啡、化疗药物表柔比星、抗癫痫药物卡马西平和丙戊酸盐、免疫抑制药物麦考酚酸、抗病毒药物齐多夫定。

本发明应用一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法——高分辨熔解曲线分析(high-resolution melting analysis，HRM)技术，该技术是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。因此，该方法可以应用于样品突变、单核苷酸多态性、甲基化、HLA配型等分析。HRM方法具有高通量(1次检测可完成384个样本测定)、高灵敏度(试验中无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限)、特异性高(闭管操作，避免污染造成的假阳性)、操作快速简便(在60-90分钟内完成检测，检测速度快、操作简便、适合临床常规监测)和低成本的特点，随着高精度PCR仪(480和Rotor-Gene 6000)和饱和染料(LC Green、Eva Green等)的出现，使HRM技术的广泛应用。

目前，应用HRM测定UGT2B7基因多态性的方法未见报道。因此开发出高效、灵敏、准确的检测上述单核苷酸多态性的方法，对协助个体化给药、保证用药安全和有效有重要意义。

本方法无需昂贵的设备和试剂，操作不需要进行酶切、纯化等步骤，避免人工接触有毒有害试剂和紫外照射等，安全性较好，并且真正实现了闭管操作，降低样本污染，分析不需要探针，仅在PCR反应体系中增加微量饱和荧光染料，成本较低。具有操作简便、快速、高灵敏度、重复性好、成本低等优点，适合常规基因多态性监测。

附图说明

图1为本发明实施例UGT2B7C.802T>C位点PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为本发明实施例大样本UGT2B7C.802T>C位点的高分辨熔解标准曲线图；

图3为本发明实施例大样本UGT2B7C.802T>C位点的高分辨溶解差异曲线图。

具体实施方式

本发明提供了一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测UGT2B7基因多态性的方法。

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例：以UGT2B7C.802T>C基因为例

1.设计引物：

从美国国立生物技术信息中心核酸数据库中检索人UGT2B7C.802T>C(RS7439366)基因的序列信息，用Primer Premier 5(Premier,Canada)软件设计筛选合适的引物对。引物片段的大小会影响PCR扩增的特异性，所述引物对含有目的基因靶序列中18-27bp连续核苷酸构成的序列，PCR产物长度80-150bp。引物由上海生工生物技术有限公司(Sangon Biotech(Shanghai))Co.Ltd.负责合成。

UGT2B7C.802T>C(rs7439366)基因的序列为：

RS7439366-F：ATGGGGAAAGCTGACGTATG；

RS7439366-R：TTACCTTAGGCAGGGGTTTG。

2.提取外周血细胞样本的基因组DNA，进行基因扩增：

试验选用TaKaRa Premix溶液，溶液中加入DNA模板和两个引物，加纯水补足PCR反应体系进行反应。在反应体系中同时加入微量SYTO-9染料，减少后续操作中开管，避免样本间的污染。

20μL PCR反应体系如下：

多样本操作时，可将各种成分乘以相应倍数，分别加入，涡旋30秒，混匀后分装，然后加入模板DNA，涡旋混匀后进行PCR反应。

经琼脂糖凝胶电泳法分析PCR产物是否为特异性扩增。图1为本实施例UGT2B7C.802T>C位点DNA在不同退火温度下进行PCR扩增得到的电泳图。PCR扩增反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性20s，61℃退火20s，72℃延伸20s，72℃继续延伸5min，40个循环。

3.根据高分辨率溶解曲线法对扩增后的目的基因突变位点进行检测：

HRM条件的优化主要在熔解温度的起始温度、每秒钟监测荧光的次数两方面进行优化调整。为了确保结果判读的准确性，每次实验均设突变纯合子对照管、突变杂合子对照管及野生纯合子对照管。图2本实施例的UGT2B7C.802T>C对照基因型的高分辨熔解曲线图。产物熔解条件如表1所示。图2、图3为实施例大样本UGT2B7C.802T>C位点的高分辨熔解标准和差异曲线图。结果显示，在10例外周血提取的DNA检测中，有5例UGT2B7C.802T>C位点基因型为CC型，4例基因型为CT型，1例基因型为TT型。该方法适用于UGT2B7C.802T>C基因型检测，具有灵敏度高、特异性好、分辨率高的特点。

表1.UGT2B7C.802T>C PCR产物熔解条件设置程序

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测UGT2B7基因多态性的方法，其特征在于，提取DNA后经PCR扩增，再用高分辨熔解仪检测UGT2B7C.802T>C(RS7439366)基因分型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：查找目的基因UGT2B7C.802T>C(RS7439366)的DNA序列，对该目的基因的突变位点设计筛选合适的引物对；

步骤2：提取外周血细胞样本的基因组DNA，利用步骤1筛选的引物进行基因PCR扩增；

步骤3：利用高分辨熔解曲线分析技术对扩增后的目的基因的突变位点进行检测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述引物对含有目的基因靶序列中18-27bp连续核苷酸构成的序列，PCR产物长度为80-150bp；其中，UGT2B7C.802T>C(RS7439366)引物序列为：

RS7439366-F：ATGGGGAAAGCTGACGTATG；

RS7439366-R：TTACCTTAGGCAGGGGTTTG。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2的PCR扩增反应的条件为92-97℃预变性3-15min，92-97℃变性10-30s，50-65℃退火10-30s，72℃延伸10-30s，70-75℃继续延伸3-10min，进行30-50个循环。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3的检测选用SYTO-9饱和荧光染料，以已知UGT2B7C.802T>C(RS7439366)位点三种基因型的样本DNA为对照，参照对照样本高分辨熔解曲线，以判断样本的基因多态性。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3的检测条件为92-97℃变性2-4min，40℃复性1-2min；然后初始熔解温度60-65℃开始程序升温熔解至95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，25-45次每秒；然后40℃进行冷却5-15s；其中，UGT2B7C.802T>C熔解曲线温度设定范围为78-84℃。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法在PCR反应体系中进行，所述PCR反应体系包括引物、DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、模板DNA、PCR缓冲液和荧光染料。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述dNTPs为包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP的混合液；所述荧光染料为SYTO-9饱和性染料。

9.一种预测药物反应的方法，其特征在于，采用如权利要求1-8任意一项所述方法检测UGT2B7的基因多态性。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述药物包括非甾体抗炎药、吗啡、化疗药物表柔比星、抗癫痫药物卡马西平和丙戊酸盐、免疫抑制药物麦考酚酸、抗病毒药物齐多夫定。