CN108179192A - 一种基因多态性变异位点早期诊断子宫内膜癌的试剂盒 - Google Patents

一种基因多态性变异位点早期诊断子宫内膜癌的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基因多态性变异位点早期诊断子宫内膜癌的试剂盒，包括使用两个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物、一个DNA测序引物和一个内切酶，针对的检测基因为两个雌激素代谢相关基因：分别为UGT1A8基因和UGT2B7基因；特异性引物是指针UGT1A8rs1042597、UGT2B7rs7439366，两个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这两个SNPs位点的DNA片段的引物对。与现有技术对子宫内膜癌进行发病风险多用单个SNP位点进行分析，存在实用性、敏感性和特异性较差的情况相比本发明所用的检测位点都与子宫内膜癌易感性相关，选择的位点具有代表性，通过检测，能够有效预测子宫内膜癌的发病风险，能够较好的用于实际的检测和应用。

Description

一种基因多态性变异位点早期诊断子宫内膜癌的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种基因多态性变异位点早期诊断子宫内膜癌的试剂盒。
背景技术
子宫内膜癌是中老年女性生殖道常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身生殖道恶性肿瘤的20-30%，近年随着环境和人口老龄化的影响，子宫内膜癌癌的发病率有明显增高的趋势。 发病率已经接近宫颈癌的发生率。
基因多态性（single nucleotide polymorphism, SNP） 普遍存在于机体 DNA 序列中，是第三代遗传标记。SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤，可以用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。通过病例对照研究不仅对于发现癌症相关基因及阐明其作用机制起着重要作用，而且对于癌症易感性早期风险诊断和个体化医疗具有重要意义。
与子宫内膜癌的发病相关的基因众多，其多态性位点变异可影响子宫内膜癌的发病风险，因此建立迅速快捷的子宫内膜癌遗传易感性的无创检测方法，能够检测出子宫内膜癌发生相关的基因单核苷酸位点基因型，早期筛查出子宫内膜癌易感高危人群，从而根据检测结果尽早采取预防措施，这对于提高子宫内膜癌的早期诊断具有重要的意义。
发明内容
本发明提供一种基因多态性变异位点早期诊断子宫内膜癌的试剂盒，用以解决上述现有技术存在的问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：包括使用两个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物、一个DNA测序引物和一个内切酶，针对的检测基因为两个雌激素代谢相关基因：分别为UGT1A8基因和UGT2B7基因。
进一步的，所述的特异性引物是指针UGT1A8rs1042597、UGT2B7rs7439366，两个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这两个SNPs位点的DNA片段的引物对。
进一步的，所述的DNA测序引物是针对UGT1A8rs1042597这一个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述一个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
进一步的，所述的内切酶是针对UGT2B7rs7439366这一个单核苷酸多态性位点而设计，能通过琼脂糖凝胶电泳检测出上述一个SNPs位点基因型的 DNA 测序引物。
进一步的，所述的两对特异性引物序列如下 ：
（1）UGT1A8rs1042597正向引物：5'-CAGTTCTCTCATGGCTCGCA-3；
反向引物5'-GTGTGGCTGTAGAGATCATATGCT-3'；
（2）UGT2B7rs7439366正向引物：5'-ACCTTTTTTTTTTCTATTCCTGT-3'；
反向引物5'-CAAAATAAAACCAACAAAAGTATG-3'。
进一步的，所述的UGT1A8rs1014597的一对DNA测序引物序列为：
正向引物：5'-CAGTTCTCTCATGGCTCGCA-3；
反向引物：5'-GTGTGGCTGTAGAGATCATATGCT-3'。
进一步的，所述的UGT2B7rs7439366的内切酶为FoKI 内切酶。
进一步的，所述的试剂盒每一人份包括：
10×Buffer（含MgCl2）2ul，dNTP1ul，DNA模板2ul，Easy Taq DNA聚合酶0.25ul，灭菌双蒸水18.75ul特异性引物对，每条引物各0.5ul；
PCR 扩增产物酶切体系NEB Buffer 2ul，PCR产物10ul，FoKI 内切酶0.5ul，灭菌双蒸水7.5ul；
测序反应体系 ：25% BigDye mix 1ul；3.2uM DNA测序引物1ul；125MmEDTA溶液1ul；无水乙醇15ul；70%乙醇溶液30ul；HIDI溶液8ul；ddH2O2ul。
与现有技术对子宫内膜癌进行发病风险多用单个SNP 位点进行分析，存在实用性、敏感性和特异性较差的情况相比本发明所用的检测位点都与子宫内膜癌易感性相关，选择的位点具有代表性，通过检测，能够有效预测子宫内膜癌的发病风险，能够较好的用于实际的检测和应用。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明。
下面将结合本发明实施例及表格，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
通过对100例子宫内膜癌患者和 100例正常对照进行基因分型，分析由两个SNP位点在病例组和正常组的频率。结果发现UGT1A8突变纯合子GG型显著降低子宫内膜癌发病风险，与子宫内膜癌组相比，正常对照组GG型比例明显增高，P<0.05，具有显著性差异（具体结果见表1）。UGT2B7突变纯合子TT型显著提高子宫内膜癌发病风险，与子宫内膜癌组相比，正常对照组TT型比例明显降低，P<0.05，具有显著性差异（具体结果见表2）。
表1：UGT1A8rs1042597多态性在子宫内膜癌患者和健康对照中的分布表
等位基因频率以绝对值（百分比）表示；通过皮尔逊卡方检验确定bP值。
表2：UGT2B7rs7439366多态性在子宫内膜癌患者和健康对照中的分布表
等位基因频率以绝对值（百分比）表示；通过皮尔逊卡方检验确定bP值。
试剂盒的应用：
1、DNA 抽提：抽取静脉血，使用DNA提取试剂盒抽提基因组 DNA。
2、PCR 反应：PCR 反应组件，其中含下列引物对 ：
（1）UGT1A8rs1042597 正向引物：5'-CAGTTCTCTCATGGCTCGCA-3；
反向引物5'-GTGTGGCTGTAGAGATCATATGCT-3'；
（2）UGT2B7rs7439366正向引物：5'-ACCTTTTTTTTTTCTATTCCTGT-3'；
反向引物5'-CAAAATAAAACCAACAAAAGTATG-3'；
UGT1A8 PCR扩增的反应体系为：10×Buffer（含MgCl2）2ul，dNTP1ul，DNA模板2ul，EasyTaq DNA聚合酶0.25ul，灭菌双蒸水18.75ul 特异性引物对，每条引物各0.5ul；反应条件为：95℃ 4min 变性酶激活，95℃ 30sec 变性，58℃ 1min 退火，72℃ 1min延伸，35 个循环，最后 72℃延长7分钟。
UGT2B7 PCR扩增的反应体系为：10×Buffer（含MgCl2）2ul，dNTP1ul， DNA模板2ul，Easy Taq DNA聚合酶0.25ul，灭菌双蒸水18.75ul 特异性引物对，每条引物各0.5ul。反应条件为 ：95℃ 5min 变性酶激活，95℃ 30sec 变性，49.8℃ 1min 退火，72℃ 1min延伸，40个循环，最后 72℃延长 7分钟。
3、基因型分析
（1）UGT1A8rs1042597基因检测DNA测序反应：测序反应组件含有下列DNA测序引物 ：
（1）UGT1A8rs1042597 正向引物 ：5'-CAGTTCTCTCATGGCTCGCA-3；
反向引物5'-GTGTGGCTGTAGAGATCATATGCT-3'；
在 ABI3500型 PCR扩增仪上进行反应，反应条件为 98℃ 2min，后 25个循环的 96℃30s，55℃ 30s， 60℃ 4min。反应的总体系为5ul，包括 PCR纯化产物1ul，25% Big Dye mix1ul ；3.2uM DNA测序引物 1ul ；ddH2O 2ul。
结束后加入 125mM EDTA 溶液 1ul 和无水乙醇 15ul，室温下沉淀 15min，4℃，3500rpm/min 离心 30min，去除上清液，加入 70% 乙醇溶液 30ul，3500rpm/min 离心15min，去除上清液，室温放置 20min 后加入HIDI溶液 8ul，放入测序仪。
（2）UGT2B7rs7439366基因检测
琼脂糖凝胶电泳：PCR 扩增产物酶切体系NEB Buffer 2ul，PCR产物10ul，FoKI 内切酶0.5ul，灭菌双蒸水7.5ul。 混匀后置37°C消化2h，酶切产物用 2.0%的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其它的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同替换和改进，均应包含在本发明技术方案的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基因多态性变异位点早期诊断子宫内膜癌的试剂盒，其特征在于，包括使用两个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物、一个DNA测序引物和一个内切酶，针对的检测基因为两个雌激素代谢相关基因：分别为UGT1A8基因和UGT2B7基因。
2.根据权利要求1所述的一种基因多态性变异位点早期诊断子宫内膜癌的试剂盒，其特征在于，所述的特异性引物是指针UGT1A8rs1042597、UGT2B7rs7439366，两个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这两个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的一种基因多态性变异位点早期诊断子宫内膜癌的试剂盒，其特征在于，所述的DNA测序引物是针对UGT1A8rs1042597这一个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述一个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4. 根据权利要求1所述的一种基因多态性变异位点早期诊断子宫内膜癌的试剂盒，其特征在于，所述的内切酶是针对UGT2B7rs7439366这一个单核苷酸多态性位点而设计，能通过琼脂糖凝胶电泳检测出上述一个SNPs位点基因型的 DNA 测序引物。
5. 根据权利要求2所述的一种基因多态性变异位点早期诊断子宫内膜癌的试剂盒，其特征在于，所述的两对特异性引物序列如下 ：
（1）UGT1A8rs1042597正向引物：5'-CAGTTCTCTCATGGCTCGCA-3；
反向引物5'-GTGTGGCTGTAGAGATCATATGCT-3'；
UGT2B7rs7439366正向引物：5'-ACCTTTTTTTTTTCTATTCCTGT-3'；
反向引物5'-CAAAATAAAACCAACAAAAGTATG-3'。
6.根据权利要求3所述的一种基因多态性变异位点早期诊断子宫内膜癌的试剂盒，其特征在于，所述的UGT1A8rs1014597的一对DNA测序引物序列为：
正向引物：5'-CAGTTCTCTCATGGCTCGCA-3；
反向引物：5'-GTGTGGCTGTAGAGATCATATGCT-3'。
7. 根据权利要求1所述的一种基因多态性变异位点早期诊断子宫内膜癌的试剂盒，其特征在于，所述的UGT2B7rs7439366的内切酶为FoKI 内切酶。
8.根据权利要求1所述的一种基因多态性变异位点早期诊断子宫内膜癌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒每一人份包括：
10×Buffer（含MgCl2）2ul，dNTP1ul，DNA模板2ul，Easy Taq DNA聚合酶0.25ul，灭菌双蒸水18.75ul特异性引物对，每条引物各0.5ul；
PCR 扩增产物酶切体系NEB Buffer 2ul，PCR产物10ul，FoKI 内切酶0.5ul，灭菌双蒸水7.5ul；
测序反应体系 ：25% BigDye mix 1ul；3.2uM DNA测序引物1ul；125MmEDTA溶液1ul；无水乙醇15ul；70%乙醇溶液30ul；HIDI溶液8ul；ddH2O2ul。
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