CN105177116A - 人类cyp2c9和vkorc1基因多态性检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人类CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，dNTP，MgCl₂，2组特异性引物，2组特异性探针，内标系统，HotStart？Taq酶、UNG酶。本发明用于检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒具有特异性强、敏感度高、操作简单快速、高通量、安全、结果判读客观等优势。

Description

人类CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种人类CYP2C9和VKORC1基因多态性检测的试剂盒，尤其涉及一种快速有效地检测少量样本的CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒。

背景技术

华法林是目前临床上使用最早、最多、最广的口服抗凝药，已被应用于多种疾病的抗凝治疗,如静脉血栓栓塞性疾病(VTE)的一级和二级预防、心房颤动血栓栓塞的预防、瓣膜病、人工瓣膜置换术和心腔内血栓形成等，但临床疗效和不良反应个体差异很大，剂量很难掌握，尤其是在使用华法林抗凝治疗初期，极易导致严重的出血并发症。据估计，服用华法林的患者中，每年有15.2％的人发生出血副作用，其中致命性的大出血占3.5％，不同个体间华法林稳定剂量的差异可达20倍以上。

华法林有两种构象：R和S。其中S-华法林的作用占60～70％，而R-华法林只有30～40％。S-华法林主要由CYP2C9代谢成无活性的代谢产物。CYP2C9的基因多态性决定了华法林的使用剂量。有荟萃分析显示,患者携带CYP2C9*2或CYP2C9*3变异需要一个较低的华法林维持剂量,尤其携带有CYP2C9*3突变的患者表现更为明显,大约减少30％的剂量。

突变导致CYP2C9酶活性降低，其活性仅为野生型的5％，这种突变降低了酶活性，使其底物的清除率降低，血药浓度升高，因此，需降低临床用药剂量，防止不良反应的发生。VKORC1基因是华法林作用靶点，目前已经有了一系列VKORC1基因多态与华法林剂量的报道。在亚洲人群中研究结果显示，VKORC1的基因多态对华法林剂量差异的影响达到了49.5％，其中VKORC1基因-1639G>A位点，G和A等位基因的发生频率分别为80.5％和19.5％。与A等位基因相比，G等位基因增加了近40％的酶活性，从而可能引起华法林剂量的差异。

人工机械瓣膜置换术患者必须进行抗凝以预防血栓栓塞的形成，而华法林是常用抗凝药。华法林治疗窗窄，临床中华法林每日维持剂量在不同个体间可以相差20倍，引起致命性和严重出血发生率分别为1.3％和7.2％，对患者生命健康构成极大威胁。CYP2C9和VKORC1基因突变可解释约50％的华法林用药剂量个体差异，对指导华法林合理应用具有巨大的指导意义。

近年来随着分子生物学的快速发展，大量研究表明，在中国，华法林代谢酶基因CYP2C9基因*3等位基因型和华法林靶点基因VKORC1基因-1639G/A基因型与其抗凝疗效密切相关，不同基因型患者所需华法林剂量差异明显。美国FDA于2007年对华法林的说明书进行了更新，强调医护工作者要使用基因检测来调整不同个体病人的合理初始药剂量，从而达到辅助优化华法林使用的目的，并降低出血风险。

本发明试剂盒对人类CYP2C9基因CYP2C9*3位点和VKORC1基因VKORC1-1639G>A位点的多态性进行定性检测，可辅助医生对华法林药物使用剂量及毒性反应进行预测。

表1：CYP2C9和VKORC1基因多态性

目前针对基因多态性的检测方法很多，如直接测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶解曲线检测法(HighResolutionMeltingAnalysis，HRM)，荧光定量PCR法等。其中最常见方法为测序法，该方法费用较低，但操作耗时长且灵敏度低；高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，在临床推广存在一定的困难；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法检测基因多态性一般采用Genotyping方法进行检测，该方法对样本数量以及多态性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确检测。因此，需要建立一种快速有效的检测少量样本的CYP2C9和VKORC1基因多态性的方法。

发明内容

本发明目的在于，克服现有技术中的不足，提供一种CYP2C9和VKORC1基因多态性的检测试剂盒，以此解决现有基因多态性检测技术中，样本量少时基因多态性检测效果不理想的问题。本试剂盒可用于高通量、低成本快速检测CYP2C9和VKORC1基因多态性，其灵敏度高，特异性强，可适用于用于EDTA、柠檬酸盐抗凝新鲜全血或血浆中提取的人类基因组DNA的检测。

本发明提供了一种CYP2C9和VKORC1基因多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，dNTP，HotStartTaq酶，UNG酶，2组特异性引物，2组特异性探针和内标系统。

在本发明的一些实施方案中，所述2组特异性引物序列分别为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2与SEQIDNO:3；SEQIDNO:4；SEQIDNO:5与SEQIDNO:6。

在本发明的一些实施方案中，所述2组特异性探针序列分别为SEQIDNO:7与SEQIDNO:8，SEQIDNO:9与SEQIDNO:10，且所述特异性探针5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。

在本发明的一些实施方案中，所述内标系统包含内标引物和内标探针。内标引物序列为SEQIDNO:11和SEQIDNO:12,所述内标探针序列为SEQIDNO:13。在一些实施方案中，所述内标探针5’端修饰有ROX，3’端修饰有BHQ2。

在本发明的一些实施方案中，所述检测试剂盒含有阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液含有4种质粒DNA混合液，所述4种质粒DNA分别含有2种不同的CYP2C9等位基因和2种不同的VKORC1等位基因，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。

本发明的CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒可以简单快速检测基因多态性，并且所述检测包括以下步骤：(1)设计并筛选含有CYP2C9和VKORC1的检测探针，ARMS引物，通用引物；(2)从非细胞体系或细胞体系中提取的基因组DNA作为模板DNA；(3)进行实时荧光定量PCR扩增：每个样本的CYP2C9基因多态性和VKORC1多态性检测分2管进行PCR反应。

本发明CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒采用Taqman探针法，建立了在同一反应管检测同一基因两种不同多态性的多重荧光定量PCR检测方法，本发明CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒采用ARMS引物特异性扩增目的模板与SNP探针特异性识别目的基因检测的方法，对检测同一基因两种多态性提供更高效的特异性双重保证，同时引入内标系统和UNG酶防污染系统，能更加准确、稳定地对样品进行分型检测。本发明的试剂盒具有以下优点：1.可以准确检测单个样品的基因型；2.可以准确检测1ng基因组DNA的基因型；3.针对CYP2C9和VKORC1的基因型设计ARMS特异性引物和SNP分型探针，可以特异性扩增识别对应的多态性；4.使用荧光定量PCR技术进行检测，检测过程均为闭管反应，显著降低污染，并且加入UNG酶防污染系统，确保结果真实可信；5..在同一反应管中检测同一基因两种多态性，操作简便，能在90分钟内完成检测结果判读方法简单客观，便于分析。

图1是CYP2C9*3A/*3A纯合野生样本23例中的一个检测结果；

图2是CYP2C9*3C/*3C纯合突变样本1例中的一个检测结果；

图3是CYP2C9*3A/*3C杂合突变样本16例中的一个检测结果；

图4是VKORC1-1639G/G纯合野生样本1例中的一个检测结果；

图5是VKORC1-1639A/A纯合突变样本30例中的一个检测结果；

图6是VKORC1-1639G/A杂合突变样本9例中的一个检测结果。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不限制本发明。

本发明的一个实施方案提供了一种CYP2C9和VKORC1基因多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，dNTP，HotStartTaq酶，UNG酶，2组特异性引物，2组特异性探针和内标系统。

在一些具体实施方案中，所述PCR缓冲液中含有1.0～5.0mM的MgCl₂，1.0～5.0mM的dNTP，即dATP、dUTP、dGTP和dCTP各1.0～5.0mM。

在一些具体实施方案中，所述2组特异性引物序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3与SEQIDNO:4；SEQIDNO:5和SEQIDNO:6；其中SEQIDNO:1、SEQIDNO:2与SEQIDNO:3、SEQIDNO:4为普通PCR引物，分别扩增包含CYP2C9*3和VKORC1基因多态性的DNA片段；其中SEQIDNO:5与SEQIDNO:6为ARMS引物，用于分别特异性扩增含有CYP2C9*3C密码子CTT，VKORC1-1639G密码子A的DNA片段。2条ARMS引物分别在3’模板碱基与待扩增类型的碱基配对，同时在其3’末端倒数第1-3位增加一个或者两个碱基错配，以增强特异性。

各引物序列列举如下：

CYP2C9*3上游引物5’-GCCCTACACAGATGCTGTGGTGC-3’SEQIDNO:1

CYP2C9*3下游引物5’-ATTTAATGTCACAGGTCACTGCATGGG-3’SEQIDNO:2

CYP2C9*3CARMS引物5’-ACGAGGTCCAGAGATATC-3’SEQIDNO:5

VKORC1-1639G>A上游引物5’-CCACCCACCTCGGCCTCCCA-3’SEQIDNO:3

VKORC1-1639G>A下游引物5’-AGGGATCCCTCTGGGAAGTCAA-3’SEQIDNO:4

VKORC1-1639AARMS引物5’-TATAGGCGTGAGCCACCGCATTT-3’SEQIDNO:6

在一些具体实施方案中，所述特异性探针5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有非荧光淬灭基团NFQ(Non-FluorescentQuencher)，该基团本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度，同时该特异性探针上还连接有MGB修饰基团，可以将该探针的Tm值提高10℃左右，因此同样的Tm值，MGB探针可以比普通Taqman探针设计的更短，使得探针在识别具有单个核苷酸多态性位点时，特异性更强。

在一些具体实施方案中，所述2组特异性探针序列分别为SEQIDNO:7与SEQIDNO:8，SEQIDNO:9与SEQIDNO:10，且其中SEQIDNO:7与SEQIDNO:8探针分别特异性检测CYP2C9*3A、CYP2C9*3C模板DNA，SEQIDNO:9与SEQIDNO:10探针分别特异性检测VKORC1-1639G、VKORC1-1639A模板DNA；

各探针序列列举如下：

CYP2C9*3A检测探针5’-FAM-AGGTCCAGAGATACATT-NFQ-MGB-3’SEQIDNO:7

CYP2C9*3C检测探针5’-VIC-GAGGTCCAGAGATACCTT-NFQ-MGB-3’SEQIDNO:8

VKORC1-1639G检测探针5’-FAM-GCCACCGCACCCGG-NFQ-MGB-3’SEQIDNO:9

VKORC1-1639A检测探针5’-VIC-CACCGCACCTGGCC-NFQ-MGB-3’SEQIDNO:10

在一些具体实施方案中，使用内标系统监测该荧光定量PCR反应是否存在抑制，由于待检测的样品中的某些成分可能含有导致PCR出现部分或完全抑制；此外，扩增仪可能存在高于允许范围的孔间差，导致不同管间扩增效率差异，另外人为加样错误也可能导致假阴性结果的出现，因此本发明在一些具体实施方案中采用内标系统来消除上述隐患，保证了检测结果的准确性。该内标系统优选包含内标引物和内标探针，本发明实施例中个可采用本领域技术人员熟知的其它内标系统。

在一些具体实施方案中，所述内标系统包含内标引物和内标探针。序列为SEQIDNO:11和SEQIDNO:12,所述内标探针序列为SEQIDNO:13；所述内标探针5’端修饰有ROX，3’端修饰有BHQ2。

在一些具体实施方案中，所述内标系统针对针对人类基因组序列设计，其中包含的内标引物序列如下所示：

内标正向引物F:5’-GGGCCACTAGGCGCT-3’SEQIDNO:11

内标反向引物R:5’-CCACCCGCGAACTCA-3’SEQIDNO:12

在一些具体实施方案中，内标探针5′端标记有报告基团，如ROX、FAM、VIC等，3′端标记有不发光荧光淬灭基团，如BHQ2等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在DNA链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离荧光淬灭基团，产生荧光信号。因此检测到的信号强度就代表了模板DNA的拷贝数。同时由于针对人源性基因设计的内标系统，可以有效避免实验操作人员的人为失误出现的假阴性结果，让本试剂盒结果更加准确、可靠。

在一些具体实施方案中，所述内标探针为：

ROX-5’-TCCCTCCGCGCAGCCG-3’-BHQ2SEQIDNO:13；

在一些具体实施方案中，酶溶液中含有Taq酶，其为PCR反应所必需的且该酶溶液还含有UNG酶，其中UNG酶(uracil-N-glycosylase)为尿嘧啶-N-糖基化酶，其特点是最佳活性温度为50℃，95℃灭活，其作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链。在PCR反应中，使用UNG酶可预防非特异性PCR扩增和污染。

在一些具体实施方案，本发明检测试剂盒还包括阳性对照液和空白对照液，设置阳性对照和空白对照可监测实时定量PCR反应的正常进行，所述阳性对照液中含有本发明中涉及的CYP2C9两种多态性CYP2C9*3A，CYP2C9*3C，VKORC1两种多态性VKORC1-1639G，VKORC1-1639A的4种质粒DNA混合液，该质粒可为本领域技术人员熟知的质粒，这4种质粒浓度相同，均为2500拷贝/μl；所述空白对照液为Tris-HCl(10mM)缓冲液。

本发明的另一目的在于提供一种用于检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的方法，该方法包括以下步骤：

(1)设计并筛选特异性扩增与检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物组合和探针组合；制备本发明的CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒。

(2)获得待测样品基因组DNA；

(3)进行荧光定量PCR扩增：每个样本分两个反应管分别检测CYP2C9和VKORC1基因的多态性，每管中加入特异性引物组和探针组、PCR反应缓冲液、Taq酶、UNG酶、内标系统，将上述获得的基因组DNA先后取相同的量加入所述2个反应管中并同时进行PCR反应。

在一些具体实施方案中，以25μl反应体系为例，向反应管中加入待检测样品后得到的混合物中各组分终浓度及含量如下：

上述体系仅为示例性，在实际应用中可以按照比例扩大或缩小该混合物体积及其中各组分含量。

在一些具体实施方案中，在上述25μl反应体系中，所述各对引物包括上述步骤(1)中的6对特异性引物，1对ARMS筛选引物及内标引物，所述各条探针包括上述步骤(1)中的特异性探针和内标探针，所述样品为基因组DNA。

在一些具体实施方案中，在步骤(3)中的荧光定量PCR反应条件为：

37℃处理10分钟，95℃预变性5分钟，

40个循环：95℃15秒，62℃60秒并收集荧光信号。

在上述PCR反应后，所得结果按表1进行结果判定：

表1.结果判定

本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、结果真实可信的优点，同时该检测方法操作简单快速，能在90分钟内完成检测，并且结果判读简单客观，便于分析。测序法需要两天才能完成检测。

以下通过具体实施例对本发明进一步阐述。

实施例1

制备本发明的CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒，包括以下步骤：

1.引物及探针合成：

设计并合成2组特异性引物SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3与SEQIDNO:4；SEQIDNO:5与SEQIDNO:6；2组特异性探针SEQIDNO:7与SEQIDNO:8，SEQIDNO:9与SEQIDNO:10，并在SEQIDNO:7和SEQIDNO:9的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记NFQ-MGB不发光淬灭基团，在SEQIDNO:8和SEQIDNO:10的5’端标记VIC荧光基团，3’端标记NFQ-MGB不发光淬灭基团。将引物、探针分别制备成100μM的母液储存。

2.制备内标系统：设计并合成针对志人源性基因GADPH的1对内标引物，该引物对序列为SEQIDNO:11和SEQIDNO:12；设计并合成内标探针，该探针为SEQIDNO:13。将该内标引物分别配制成100μM的母液储存，内标探针配制成100μM的母液储存。

3.制备其他试剂：制备PCR缓冲液，其中含有1.0mM的MgCl₂，dATP、dUTP、dGTP和dCTP各1.0mM；制备酶混合液，其中含有Taq酶0.5×10³U/ml，UNG酶0.1×10³U/ml。

4.制备阳性对照液和空白对照液，该阳性对照液中含有4种质粒DNA，这些质粒DNA中分别含有本发明试剂盒涉及的CYP2C9*3A、CYP2C9*3C、VKORC1-1639G、VKORC1-1639A基因4种不同的多态性质粒，该质粒的选择及设计为本领域技术人员熟知，均为2500拷贝/μl；该空白对照液为Tris-HCl(10mM)缓冲液。

5.PCR反应液配制：按照下表进行两个不同体系PCR反应液配制

6.组装试剂盒：试剂盒中包含2管分别检测CYP2C9和VKORC1的基因多态性检测PCR反应液，根据PCR反应体系各成分使用量，计算12人份和24人份两种规格各成分使用量，配制试剂盒各管中成分并组装。

实施例2

用实施例1制备的CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒对待测样品进行检测。

本实施例中收集40例抗凝全血样品，从其中提取基因组DNA，用实施例1中得到的CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒检测待检样品的CYP2C9和VKORC1的基因多态性情况。

1.血液样品基因组DNA提取

取全血300μl，加入900μl的细胞裂解液CL，颠倒混匀，静置5min，10,000rpm(11,500×g)离心1min，吸去上清，留下细胞沉淀，向离心收集到的细胞沉淀中加200μl缓冲液GS，振荡至彻底混匀。加入20μlProteinaseK溶液，混匀。加200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次，直至溶液变清亮(如溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止)。加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。重复操作步骤7。12,000rpm(13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加100μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm(13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。取2μl所得溶液测OD值以确定DNA浓度，然后将样品DNA稀释到10ng/μl，分别取2μl加入至实施例1中制得的试剂盒中并进行下一步的PCR反应。

2.样本的荧光定量PCR检测

将步骤1中稀释后的DNA样品依次取2μl分别加入到23μl的实施例1的试剂盒的CYP2C9*3检测反应体系和VKORC1检测反应体系中，使两种反应体系总体积均为25μl，并放入荧光定量PCR仪，按如下所示设置PCR反应程序后进行扩增反应：

37℃10min；

95℃5min；

95℃15s，62℃60s，40个循环；每个循环后收集FAM、VIC和ROX的荧光信号。

3.样本的检测结果分析:40例样品的检测结果如下：

CYP2C9*3A/*3A纯合野生样本23例，其中一个检测结果如图1所示；

CYP2C9*3C/*3C纯合突变样本1例，其中一个检测结果如图2所示；

CYP2C9*3A/*3C杂合突变样本16例，其中一个检测结果如图3所示；

VKORC1-1639G/G纯合野生样本1例，其中一个检测结果如图4所示；

VKORC1-1639A/A纯合突变样本30例，其中一个检测结果如图5所示；

VKORC1-1639G/A杂合突变样本9例，其中一个检测结果如图6所示。

上述40例样本荧光定量PCR检测结果与测序结果一致。以上结果表明本发明实施例提供的检测试剂盒用于人类CYP2C9和VKORC1基因多态性检测结果可靠，与直接测序一致率达到100％，且本发明检测方法灵敏度高于传统测序方法，操作简单快速，利于大规模推广。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用于CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，dNTP，HotStartTaq酶，UNG酶，2组特异性引物，2组特异性探针和内标系统，其中，所述2组特异性引物序列分别为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2与SEQIDNO:3；SEQIDNO:4；SEQIDNO:5与SEQIDNO:6。

2.如权利要求1所述的CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述2组特异性探针序列分别为SEQIDNO:7与SEQIDNO:8，SEQIDNO:9与SEQIDNO:10，且所述特异性探针5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。

3.如权利要求1或2所述的CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述内标系统包含内标引物和内标探针，所述内标引物序列为SEQIDNO:11和SEQIDNO:12，所述内标探针序列为SEQIDNO:13。

4.如权利要求3所述的CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述内标探针5’端修饰有ROX，3’端修饰有BHQ2。

5.如权利要求1至4任一项所述的CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒含有阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液含有4种质粒DNA混合液，所述4种质粒DNA分别含有2种不同的CYP2C9等位基因和2种不同的VKORC1等位基因，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。

6.一种用于检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的方法，该方法包括以下步骤：

(1)设计并筛选特异性扩增与检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物组合和探针组合；制备如权利要求1至6任选一项所述试剂盒；

(2)获得待测样品基因组DNA；

(3)进行荧光定量PCR扩增：每个样本分两个反应管分别检测CYP2C9和VKORC1基因的多态性，每管中加入特异性引物组和探针组、PCR反应缓冲液、Taq酶、UNG酶、内标系统，将上述获得的基因组DNA先后取相同的量加入所述2个反应管中并同时进行PCR反应。