CN106702005A - 用于检测人类vkorc1与cyp2c9基因多态性的引物、探针、试剂盒及方法 - Google Patents

用于检测人类vkorc1与cyp2c9基因多态性的引物、探针、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种用于检测人类VKORC1与CYP2C9基因多态性的引物和探针组合、含有该引物和探针组合的试剂盒以及采用该引物和探针组合或试剂盒进行人类VKORC1与CYP2C9基因多态性检测的荧光PCR方法。本发明基于TaqMan荧光PCR技术，简单、快捷，灵敏度高。此外，本发明通过合理的引物和探针搭配，有效避免了引物与引物之间、引物与探针之间以及探针与探针之间的相互作用，减少了检测误差。本发明提供的引物、探针和试剂盒用于检测人类VKORC1与CYP2C9基因多态性具有敏感度高、特异性强、操作简易快速、安全、结果判读简单直观并且可直接使用血液样品或者滤纸干血片样品作为模板等优势。

Description

用于检测人类VKORC1与CYP2C9基因多态性的引物、探针、试剂 盒及方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及用于检测人类VKORC1与CYP2C9基因多态性的引物、探针、试剂盒及方法。
背景技术
华法林是临床上常用的抗凝药物，是深静脉血栓、心房纤颤、心脏瓣膜置换术和肺栓塞等疾病的一线用药。但是华法林治疗窗很窄：药剂量小了，不能阻止血栓形成；剂量大了，又会导致出血，患者的最适用药量表现出明显的个体差异。目前已知与华法林药动学和药效学相关基因达30余种，其中维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1(Vitamin Kepoxidereductase complex subunit 1，VKORC1)和细胞色素P450 2C9(CytochromeP4502C9，CYP2C9)基因多态性是华法林个体剂量差异的主要影响因素。
CYP2C9基因存在野生型CYP2C9*1和突变型CYP2C9*2～CYP2C9*13，其中与华法林代谢最密切的突变型为CYP2C9*2(rs1799853)和CYP2C9*3(rs1057910)，这2个位点的突变导致CYP2C9活性降低。CYP2C9*2型等位基因在中国人中极少发现，CYP2C9*3型的频率为3％。CYP2C9*3纯合子和杂合子基因型个体S-华法林的口服清除率分别下降了90％和66％，因此按常规剂量给药会造成华法林血药浓度长时间维持在较高水平，导致患者出血风险增加。维生素k氧化还原酶(VKORC1)是华法林的作用靶点，VKORC1在其启动子区存在-1639G>A位点多态性(rs9923231)。大量研究发现，VKORC1启动子的基因多态性是影响华法林需求剂量中种族差异和个体差异的最主要因素。与该位点AA基因型患者相比，-1639GA和GG基因型患者平均华法林剂量分别增加52％和102％。美国FDA 2010年修改华法林说明书，建议结合VKORC1和CYP2C9基因型考虑华法林的初始用药剂量。临床上也可根据考虑了VKORC1和CYP2C9基因型、年龄、身高、体重、种族、是否合用肝药酶诱导剂和是否合用胺碘酮等因素的剂量计算公式确定华法林初始用药剂量。
目前临床应用的基因多态性检测方法主要有四种：直接测序法，PCR-基因芯片法，PCR-溶解曲线法和荧光定量PCR法。测序法虽然为基因多态性检测的“金标准”，但是由于其需要的检测时间长，操作复杂，并且灵敏度不高；PCR-基因芯片法的操作要求高，杂交和洗片都必须避光操作，并且芯片价格昂贵；PCR-溶解曲线法无特异性，并不能精确定位基因变化位置，并且只是因单个碱基差异造成的Tm差异不是很明显，通常会造成在溶解曲线上的峰不是很清晰，因而这三种方法在临床上的推广都存在一定困难。传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，该方法对样本数量以及多态性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确检测，对于检测人类VKORC1与CYP2C9基因多态性还无法满足高效、精准、简便等要求，同时还需要对样品进行基因组DNA提取等繁琐复杂的操作流程，所以亟需一种快速、有效、精准且无需DNA提取的检测方法。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，基于最新的科研动态和临床应用，重新设计了用于检测人类VKORC1与CYP2C9基因多态性的引物、探针以及方法。本发明的检测方法简便快速、精准有效、结果简单易辨别且对于小样本依然适用，甚至直接利用血液样品或滤纸干血片样品为模板进行检测也能得到很好的结果。
为此，本发明一方面提供了一种用于检测人类VKORC1与CYP2C9基因多态性的引物和探针组合，其中引物序列如序列1-4所示，探针序列如序列5-8所示，引物序列1-2以及探针序列5-6用于检测VKORC1基因的多态性，引物序列3-4以及探针序列7-8用于检测CYP2C9基因的多态性。
在本发明优选的实施方案中，该引物和探针组合中，探针的5’端有FAM或VIC修饰，3’端有NFQ-MGB修饰。
在本发明进一步优选的实施方案中，该引物和探针组合中，每条引物的浓度为300nM，每条探针的浓度为200nM。
本发明基于最新的科研动态和临床应用，重新设计了用于检测人类VKORC1与CYP2C9基因多态性的引物和探针。所设计的引物Tm值均在60℃附近，整合搭配各个引物，从而尽量避免了引物二聚体的产生。同时选用MGB探针使得Tm值均在70℃附近，避免了探针与其他非特异性序列之间的结合，同时也避免了探针相互之间形成复杂的二聚体，提高了荧光PCR扩增的特异性和效率。
针对人类VKORC1与CYP2C9基因多态性的检测，本发明设计的具体引物和探针情况如表1和表2所示。
表1、VKORC1基因检测的引物和探针情况表
表2、CYP2C9基因检测的引物和探针情况表
本发明另一方面提供了一种用于检测人类VKORC1与CYP2C9基因多态性的试剂盒，其包含本发明所述的引物和探针组合。
在本发明优选的实施方案中，本发明的试剂盒中还包含阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液为分别含有三种不同VKORC1等位基因和两种不同CYP2C9等位基因的五种细胞系DNA，所述空白对照液为TE缓冲液。
本发明另一方面提供了本发明所述的引物和探针组合在制备检测人类VKORC1与CYP2C9基因多态性试剂盒中的应用。
本发明再一方面提供了本发明所述的引物和探针组合，或者本发明所述的试剂盒在检测人类VKORC1与CYP2C9基因多态性中的应用。
本发明最后一方面提供了一种检测人类VKORC1与CYP2C9基因多态性的方法，其包含以下步骤：
1、获取待测样品基因组DNA、直接使用待测血液样品、或者直接使用待测滤纸干血片样品。
当待测样品为基因组DNA时，DNA的提取可以采用TIANGEN或者QIAGEN公司的DNA提取试剂盒，按照说明书进行操作即可。当待测样品为血液样品时，需要将血液与超纯水按照1：2的比例进行稀释，并混匀震荡，直接向反应孔中加入1ul即可。当待测样品为滤纸干血片样品时，直接将血液混匀后滴在滤纸上风干，用打孔取样器取出一片放入反应孔中即可。
2、采用本发明所述的引物和探针组合，或者采用本发明所述的试剂盒，以步骤1中获取的基因组DNA、血液样品或者滤纸干血片样品为模板，进行荧光PCR扩增。
3、收集荧光信号，将数据结果直接导入美国应用生物学技术公司开发的基因分型专业分析软件TaqMan Genotyper中进行分析。
在本发明优选的实施方案中，本发明直接使用待测血液样品或者待测滤纸干血片样品为模板进行荧光PCR扩增。
在本发明进一步优选的实施方案中，20ul荧光PCR反应体系包括：10ul的荧光PCR缓冲液、1.2ul的引物混合液、0.8ul的探针混合液、0.2ul的UNG酶、0.1ul的ROX ReferenceDye、1ul的DNA模板或血液模板(模板为滤纸干血片时只需一片即可)以及6.7ul的Nuclease-Free Water。
所述荧光PCR反应程序为：50℃预处理3分钟，95℃预变性15分钟，预变性后按照以下程序进行40个循环：95℃15秒，60℃32秒；50℃数据读取1分钟；如果模板为血液样品或者滤纸干血片样品，则将循环数增至45。
由上述描述可知，与现有技术相比，本发明具备如下优点。
1、与现有的其它基因多态性检测技术相比，本发明的检测方法基于MGB探针PCR技术，MGB探针与普通TaqMan探针相比，3’为非荧光淬灭基团，可大大降低本底信号强度，具有更高的特异性。
2、本发明的检测方法通过合理的引物和探针搭配，可以有效避免引物与引物之间、引物与探针之间以及探针与探针之间的相互作用，从而提高特异性，降低假阳性，减少检测误差。通过与一代测序的结果对比，其准确率可达到100％，最低可检测到1ng的基因组DNA。
3、本发明针对不同的基因多态性分别提供了细胞株DNA样本作为阳性对照，使基因多态性的荧光分型分析更为精准。同时本发明可以直接利用TaqMan Genotyper软件对单个或小(少)样本进行基因分型，结果判读直观方便。
4、本发明的检测方法可以直接使用血液(静脉采血或指尖采血)或滤纸干血片作为模板，有效避免了基因组DNA提取所消耗的时间、成本与精力。
综上所述，本发明提供了一种简便快速、精准有效、结果简单易辨别且对于小样本依然适用，甚至直接利用血液样品或滤纸干血片样品为模板进行人类VKORC1与CYP2C9基因多态性检测的方法，对人类VKORC1与CYP2C9基因多态性检测有着非常重要的意义。
附图说明
图1：实施例1中采用含VKORC1各基因多态性位点的细胞系DNA样本验证本发明检测体系特异性的荧光分型结果图。
图2：实施例2中采用人类基因组DNA样本检测VKORC1基因多态性验证本发明检测体系重复性的荧光分型结果图。
图3：实施例3中采用人类基因组DNA样本检测VKORC1基因多态性验证本发明检测体系灵敏度的检出限荧光分型结果图。
图4：实施例4中采用人类临床基因组DNA样本检测VKORC1基因多态性的荧光分型结果图。
图5：实施例5中采用人类临床血液样本检测VKORC1基因多态性的荧光分型结果图。
图6：实施例6中采用人类临床滤纸干血片样本检测VKORC1基因多态性的荧光分型结果图。
图7：实施例7中采用含CYP2C9各基因多态性位点的细胞系DNA样本验证本发明检测体系特异性的荧光分型结果图。
图8：实施例8中采用人类基因组DNA样本检测CYP2C9基因多态性验证本发明检测体系重复性的荧光分型结果图。
图9：实施例9中采用人类基因组DNA样本检测CYP2C9基因多态性验证本发明检测体系灵敏度的检出限荧光分型结果图。
图10：实施例10中采用人类临床基因组DNA样本检测CYP2C9基因多态性的荧光分型结果图。
图11：实施例11中采用人类临床血液样本检测CYP2C9基因多态性的荧光分型结果图。
图12：实施例12中采用人类临床滤纸干血片样本检测CYP2C9基因多态性的荧光分型结果图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
实施例1：采用含VKORC1各基因多态性位点的细胞系DNA样本验证本发明检测体系的特异性
本实施例以通过测序确定含有VKORC1-TT基因型的Kasumi-1细胞系、含有VKORC1-TC基因型的HCT116细胞系以及含有VKORC1-CC基因型的H2228细胞系来验证本发明检测方法的可行性及特异性。
具体检测方法如下：
采用本说明书已说明的PCR反应体系和反应条件，以Kasumi-1细胞系DNA、HCT116细胞系DNA和H2228细胞系DNA为模板，其中每个DNA样本重复点样一次，进行检测。
检测的基因分型结果如说明书附图1所示。其中NTC为阴性对照，Kasumi-1DNA样本孔为VKORC1-TT型，H2228DNA样本孔为VKORC1-CC型，HCT116DNA样本孔为VKORC1-TC型。
由此可见，本实施例的基因分型检测结果与各细胞系的VKORC1SNP突变位点相一致，表明利用本发明的检测体系可以特异性地进行人类VKORC1基因多态性的分型检测。因此本发明以这三种细胞系的DNA样本为不同基因型的阳性对照。
实施例2：采用人类基因组DNA样本检测VKORC1基因多态性验证本发明检测体系的重复性
本实施例采用人类基因组DNA样本，以其为模板进行荧光PCR基因分型检测，检测结果直接对比“金标准”的测序结果，以此来验证本发明检测体系的重复性与准确性。
具体检测方法如下：
采用本说明书已说明的PCR反应体系和反应条件，以人类基因组DNA样本为模板进行荧光PCR基因分型检测，代表性的82例人类基因组DNA样本的基因分型结果如说明书附图2A所示。其中NTC为阴性对照，除阳性对照外，68例样本为VKORC1-TT型纯合子，14例样本为VKORC1-TC型杂合子。在所有检测的204例人类基因组DNA样本中，171例样本为VKORC1-TT型纯合子，32例样本为VKORC1-TC型杂合子，1例样本为VKORC1-CC型纯合子。通过与“金标准”一代测序的结果比对，本发明的荧光PCR基因分型检测方法的正确率为100％。通过本实施例表明，利用本发明的检测体系进行VKORC1基因多态性荧光PCR分型具有很好的重复性与准确性。
针对目前很多基因检测方法很难做到对于单个样本或少量样本精确分型，本发明亦对此做出改进，采用本说明的PCR反应体系、反应条件及分析方法，可直接检测单个样本或少量样本的基因型，结果真实可靠，说明本发明具有其它基因检测方法不具备的检测优势。具体实施例的基因分型结果如说明书附图2B所示，以本发明实施例1中的细胞系样本为阳性对照，随意检测单个样本，分型结果显示此样本的基因型为VKORC1-TC型杂合子。
实施例3：采用人类基因组DNA样本检测VKORC1基因多态性验证本发明检测体系的灵敏度
本实施例同样以人类基因组DNA样本为模板来验证本发明检测体系的灵敏性。
具体检测方法如下：
采用本说明书已说明的PCR反应体系和反应条件，选取7例人类基因组DNA样本为模板进行荧光PCR基因分型检测，同时设置各DNA模板检出限组分别为：0.05ng；0.1ng；0.5ng；1ng；10ng；50ng；100ng。结果显示，在DNA模板量只有1ng的条件下仍然可以得到清晰的分型结果，代表性的基因分型结果如说明书附图3所示，NTC为阴性对照，除阳性对照外，5例为VKORC1-TT型纯合子，1例样本为VKORC1-TC型杂合子，1例样本为VKORC1-CC型纯合子，分型结果真实、清晰。通过本实施例表明，利用本发明的检测体系进行VKORC1基因多态性荧光PCR分型具有非常高的灵敏性。
实施例4：采用人类临床基因组DNA样本检测VKORC1基因多态性
本实施例采用临床患者基因组样本并以其为模板，按照本发明的检测体系进行人类VKORC1基因多态性的分型检测。
本实施例采用本说明书已说明的PCR反应体系和反应条件，通过与医院的合作，获得91例临床患者基因组样本，并以此为模板进行荧光PCR基因分型检测，结果显示除阳性对照外，多态性呈VKORC1-TT纯合型的有82例，多态性呈VKORC1-TC杂合型的有9例，与中国人群中该基因分布频率基本吻合，基因分型结果如说明书附图4所示。本实施例说明本发明对于采用人类临床基因组DNA作为样本检测VKORC1基因多态性具有非常好的效果。
实施例5：采用人类临床血液样本检测VKORC1基因多态性
本实施例采集临床患者外周血或骨髓血样本并以其为模板，按照本发明的检测体系进行人类VKORC1基因多态性的分型检测。
本实施例采用本说明书已说明的PCR反应体系和反应条件，具体的操作方法与本发明其它实施例相同，但模板为血液，故取得血液样本后需将血液与超纯水1:2稀释，震荡摇匀，吸取1ul血液加入至PCR反应孔中，上机检测即可。在具有代表性的25例血液样本中，除阳性对照外，检测到多态性呈VKORC1-TT纯合型的有22例，多态性呈VKORC1-TC杂合型的有3例，基因分型结果如说明书附图5所示。本实施例不需要目前主流的基因分型检测依赖基因组DNA提取与纯化等繁琐步骤，极大地简化了检测条件，节约了大量成本与时间，为本发明的一大特色。
实施例6：采用人类临床滤纸干血片样本检测VKORC1基因多态性
本实施例采集临床患者滤纸干血片样本并以其为模板，按照本发明的检测体系进行人类VKORC1基因多态性的分型检测。
本实施例采用本说明书已说明的PCR反应体系和反应条件，具体操作时需在检测前制备好滤纸干血片，使用微孔取样器取出一片含有风干血样的样本加入至PCR反应孔中，上机检测即可。在具有代表性的6个滤纸干血片样本中，检测到除阳性对照外，多态性全部呈VKORC1-TT纯合型，荧光曲线特异、完好，结果真实可靠，基因分型结果如说明书附图6所示。本实施例同样不需要基因组DNA提取与纯化等繁琐步骤，简化了检测条件，节省了时间与成本，为本发明的一大特色。
实施例7：采用含CYP2C9各基因多态性位点的细胞系DNA样本验证本发明检测体系的特异性
本实施例以通过测序确定含有CYP2C9-AA基因型的HCT116细胞系与含有CYP2C9-AC基因型的H2228细胞系来验证本发明检测方法的可行性及特异性。
具体检测方法如下：
采用本说明书已说明的PCR反应体系和反应条件，以HCT116细胞系DNA和H2228细胞系DNA为模板，其中每个DNA样本重复点样一次，进行检测。
检测的基因分型结果如说明书附图7所示。其中NTC为阴性对照，HCT116DNA样本孔为CYP2C9-AA型，H2228DNA样本孔为CYP2C9-AC型。
由此可见，本实施例的基因分型检测结果与各细胞系的CYP2C9SNP突变位点相一致，表明利用本发明的检测体系可以特异性地进行人类CYP2C9基因多态性的分型检测。因此本发明以这两种细胞系的DNA样本为不同基因型的阳性对照。
实施例8：采用人类基因组DNA样本检测CYP2C9基因多态性验证本发明检测体系的重复性
本实施例采用人类基因组DNA样本，以其为模板进行荧光PCR基因分型检测，检测结果直接对比“金标准”的测序结果，以此来验证本发明检测体系的重复性与准确性。
具体检测方法如下：
采用本说明书已说明的PCR反应体系和反应条件，以人类基因组DNA样本为模板进行荧光PCR基因分型检测，代表性的84例人类基因组DNA样本的基因分型结果如说明书附图8A所示，其中NTC为阴性对照，除阳性对照外，78例样本为CYP2C9-AA型纯合子，6例样本为CYP2C9-AC型杂合子。在所有检测的204例人类基因组DNA样本中，182例样本为CYP2C9-AA型纯合子，22例样本为CYP2C9-AC型杂合子。通过与“金标准”一代测序的结果比对，本发明的荧光PCR基因分型检测方法的正确率为100％。通过本实施例表明，利用本发明的检测体系进行CYP2C9基因多态性荧光PCR分型具有很好的重复性与准确性。
针对目前很多基因检测方法很难做到对于单个样本或少量样本精确分型，本发明亦对此做出改进，采用本说明的PCR反应体系、反应条件及分析方法，可直接检测单个样本或少量样本的基因型，结果真实可靠，说明本发明具有其它基因检测方法不具备的检测优势。具体实施例的基因分型结果如说明书附图8B所示，以本发明实施例7中的细胞系样本作为阳性对照，随意检测单个样本，分型结果显示此样本的基因型为CYP2C9-AC型杂合子。
实施例9：采用人类基因组DNA样本检测CYP2C9基因多态性验证本发明检测体系的灵敏度
本实施例以人类基因组DNA样本为模板来验证本发明检测体系的灵敏性。
具体检测方法如下：
采用本说明书已说明的PCR反应体系和反应条件，选取7例人类基因组DNA样本为模板进行荧光PCR基因分型检测，同时设置各DNA模板检出限组分别为：0.05ng；0.1ng；0.5ng；1ng；10ng；50ng；100ng。结果显示，在DNA模板量只有1ng的条件下仍然可以得到清晰的分型结果，代表性的基因分型结果如说明书附图9所示，除阳性对照外，6例为CYP2C9-AA型纯合子，1例为CYP2C9-AC型杂合子，分型结果真实、清晰。通过本实施例表明，利用本发明的检测体系进行CYP2C9基因多态性荧光PCR分型具有非常高的灵敏性。
实施例10：采用人类临床基因组DNA样本检测CYP2C9基因多态性
本实施例采用临床患者基因组样本并以其为模板，按照本发明的检测体系进行人类CYP2C9基因多态性的分型检测。
本实施例采用本说明书已说明的PCR反应体系和反应条件，通过与医院的合作，获得20例临床患者基因组样本，并以此为模板进行荧光PCR基因分型检测，结果显示除阳性对照外，多态性呈CYP2C9-AA纯合型的有19例，多态性呈VKORC1-TC杂合型的有1例，与中国人群中该基因分布频率基本吻合，基因分型结果如说明书附图10所示。本实施例说明本发明对于采用人类临床基因组DNA作为样本检测CYP2C9基因多态性具有非常好的效果。
实施例11：采用人类临床血液样本检测CYP2C9基因多态性
本实施例采集临床患者外周血或骨髓血样本并以其为模板，按照本发明的检测体系进行人类CYP2C9基因多态性的分型检测。
本实施例采用本说明书已说明的PCR反应体系和反应条件，具体的操作方法与本发明其它实施例相同，但模板为血液，故取得血液样本后需将血液与超纯水1:2稀释，震荡摇匀，吸取1ul血液加入至PCR反应孔中，上机检测即可。在具有代表性的27例血液样本中，除阳性对照外，检测到全部样本的多态性都呈CYP2C9-AA纯合型，基因分型结果如说明书附图11所示。本实施例不需要基因组DNA提取与纯化等繁琐步骤，优化了检测条件。
实施例12：采用人类临床滤纸干血片样本检测CYP2C9基因多态性
本实施例采集临床患者滤纸干血片样本并以其为模板，按照本发明的检测体系进行人类CYP2C9基因多态性的分型检测。
本实施例采用本说明书已说明的PCR反应体系和反应条件，具体操作时需在检测前制备好滤纸干血片，使用微孔取样器取出一片含有风干血样的样本加入至PCR反应孔中，上机检测即可。在具有代表性的8个滤纸干血片样本中，检测到除阳性对照外，全部样本的多态性都呈CYP2C9-AA纯合型，荧光曲线特异、完好，结果真实可靠，基因分型结果如说明书附图12所示。本实施例同样不需要基因组DNA提取与纯化等繁琐步骤，简化了检测条件，节省了时间与成本。
以上结果表明，本发明的人类VKORC1与CYP2C9基因多态性荧光PCR检测体系可以精准可靠地对人类VKORC1与CYP2C9基因的多态性进行快速检测。并且与其它检测方法相比，本发明的荧光PCR检测体系具有较高的灵敏度、特异性与准确性，检测工序简单，大大缩短了检测时间，节省了大量人力、物力与精力，提供了一种更加全新快速简便地检测人类VKORC1与CYP2C9基因多态性的方法，具有广泛的临床应用价值。
序列表
<110> 上海荻硕贝肯生物科技有限公司
<120> 用于检测人类VKORC1与CYP2C9基因多态性的引物、探针、试剂盒及方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcctcccaaa atgctaggat tatag 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtgcaacagt aagggatccc tct 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gccacatgcc ctacacagat g 21
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcagtgtagg agaaacaaac ttacctt 27
<210> 5
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acccggccaa tgg 13
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cacctggcca atgg 14
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tccagagata ccttgac 17
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tccagagata cattgac 17

Claims (10)

1.一种用于检测人类VKORC1与CYP2C9基因多态性的引物和探针组合，其中引物序列如序列1-4所示，探针序列如序列5-8所示，引物序列1-2以及探针序列5-6用于检测VKORC1基因的多态性，引物序列3-4以及探针序列7-8用于检测CYP2C9基因的多态性。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其中探针的5’端有FAM或VIC修饰，3’端有NFQ-MGB修饰。
3.根据权利要求1或2所述的引物和探针组合，其中每条引物的浓度为300nM，每条探针的浓度为200nM。
4.一种用于检测人类VKORC1与CYP2C9基因多态性的试剂盒，其包含权利要求1-3中任一项所述的引物和探针组合。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中还包含阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液为分别含有三种不同VKORC1等位基因和两种不同CYP2C9等位基因的五种细胞系DNA，所述空白对照液为TE缓冲液。
6.权利要求1-3中任一项所述的引物和探针组合在制备检测人类VKORC1与CYP2C9基因多态性试剂盒中的应用。
7.权利要求1-3中任一项所述的引物和探针组合，或者权利要求4或5所述的试剂盒在检测人类VKORC1与CYP2C9基因多态性中的应用。
8.一种检测人类VKORC1与CYP2C9基因多态性的方法，其包含以下步骤：
(1)获取待测样品基因组DNA、直接使用待测血液样品、或者直接使用待测滤纸干血片样品；
(2)采用权利要求1-3中任一项所述的引物和探针组合，或者采用权利要求4或5所述的试剂盒，以步骤(1)中获取的基因组DNA、血液样品或者滤纸干血片样品为模板，进行荧光PCR扩增；
(3)收集荧光信号，将数据结果导入TaqMan Genotyper软件中进行分析。
9.根据权利要求8所述的方法，其中直接使用待测血液样品或者待测滤纸干血片样品为模板进行荧光PCR扩增。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中每条引物的浓度为300nM，每条探针的浓度为200nM，荧光PCR反应程序为：50℃预处理3分钟，95℃预变性15分钟，预变性后按照以下程序进行40个循环：95℃15秒，60℃32秒；50℃数据读取1分钟；如果模板为血液样品或者滤纸干血片样品，则将循环数增至45。
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