CN105473736A - 基于纳米探针的遗传学检验 - Google Patents

Abstract

本申请涉及检测靶核酸分子中的突变的方法。相差至少一个碱基的两个磷酰二胺吗啉代寡聚物探针各自与纳米粒子共价偶联并且与靶序列杂交。对所述两个探针中的每一者与所述靶核酸之间的复合物的解链温度进行测量并比较以确定样品是否包含具有所述突变的核酸。另外，本发明涉及包含如本文所述的第一缀合物和第二缀合物的试剂盒以及此类试剂盒用于检测靶核酸分子中的突变或用于将基因型指定给靶核酸分子的用途。

Description

基于纳米探针的遗传学检验

技术领域

本发明属于生物化学领域并涉及检测靶核酸分子中的突变的方法。另外，本发明涉及包含如本文所述的第一缀合物和第二缀合物的试剂盒以及此类试剂盒用于检测靶核酸分子中的突变或用于将基因型指定给靶核酸的用途。

背景技术

全基因组关联研究日益将人遗传变体与个体对治疗剂的应答相联系。该增长的知识大大加速了个性化医学的进展。通过鉴定与药物功效和安全性相关联的遗传热点，药物基因组学(PGx)策略允许基于患者遗传组成的更加个体化的药物疗法。继而，个体化药物疗法可使副作用最小化并且改善结果(Daly,AK(2010)NatRevGenet,11,241-246)。现如今，PGx信息已被纳入许多药物标签中以辅助临床医生做出治疗决策。

一个实例是PGx指导的华法林给药。华法林是得到最广泛描述的口服抗凝药。尽管华法林有效，但其由于窄的治疗指数和高度可变的个体间给药要求而位列具有严重不良事件报告的前10种药物中。因此，重要的是用国际标准化比率(INR)来频繁监测抗凝状态，尤其是在开始华法林疗法后的早期。缺乏可用于鉴定适当初始剂量的信息通常导致多次剂量调整并增加血栓栓塞事件或出血的风险。在过去十年里，PGx研究揭示了华法林剂量要求与若干遗传学单核苷酸多态性(SNP)的存在之间的相关性。最显著相关的SNP包括细胞色素P450酶CYP2C9基因中的两种编码变异：CYP2C9*2(rs1799853)和CYP2C9*3(rs1057910)；和维生素K环氧化物还原酶复合物1(VKORC1)基因中的一种变异：启动子SNP-1639G>A(rs9923231)(TheInternationalWarfarinPharmacogeneticsConsortium(2009)NEnglJMed,360,753-764)。这些SNP可解释高达35％的患者间华法林剂量可变性。在2010年，美国FDA更新了带有PGx指导剂量范围的华法林的标签规定(Highlightsofprescribinginformation.Coumadin(2010)http://packageinserts.bms.com/pi/pi_coumadin.pdf)。可通过参考包含稳定维持剂量的表格来预测起始剂量，所述稳定维持剂量是在具有CYP2C9和VKORC1变体的不同组合的多位患者中观察得到。结合了传统临床因素和患者遗传状态的给药算法也是可用的。近来，大规模的前瞻性研究发现PGx指导的华法林疗法将刚开始华法林疗法的患者的住院率降低了～30％(Epstein,RS等人，(2010)JAmCollCardiol,22,2804–2812)。随机临床试验CoumaGen-II为将基因型知识整合到剂量选择中的临床益处提供了进一步的证据(Anderson,JL等人，(2012)Circulation,125,1997–2005)。随着华法林基因分型的价值被越来越多的临床试验所支持，可预期PGx结果对临床实践的重要性也会日益增加。快速且高性价比的基因型检验将大大促进此过程。

当前可用的基因分型平台包括DNA微阵列、实时聚合酶链反应(PCR)、单碱基延伸和高分辨率解链分析(Kim,S和Misra,A(2007)AnnuRevBiomedEng,9,289–320)。尽管这些平台在高通量研究中非常有用，但其由于涉及到昂贵的仪器和试剂而在按需临床检验中的性价比较低(Joyce,HS(2011)ExpertOpinPharmacol,12,435–441)。FDA已批准了四种针对华法林敏感性基因分型的商业测定，包括无限(Infinity)华法林测定(Autogenomics,Inc.,Vista,CA,USA)、E感应(eSensor)华法林敏感性试验(GenMarkDiagnostics,Inc.,Carlsbad,CA,USA)、eQ-PCRLC华法林基因分型试剂盒(TrimGen,Sparks,MD,USA)和威力基因(Verigene)华法林代谢核酸试验(Nanosphere,NorthBrook,IL,USA)。这些测定中的一些以护理点(point-of-care)应用为目标，但需要专门的仪器来进行检验。

高度异质样本(例如肿瘤样品)的基因型分析比SNP基因分型更具挑战性，因为体细胞突变检测必须在大的野生型DNA背景下进行。对于杂合SNP样品，MUT/WT等位基因比率为50％，而对于肿瘤样本中的体细胞突变而言，该比率可小于10％。需要高度敏感的检测方法来测量突变。通常，采用通过等位基因特异性PCR富集突变序列或PCR钳制策略来实现高敏感性(Milbury,CA(2009)ClinChem,55,632–640)。

近来，制备出一种新型等离子体纳米粒子(NP)探针：用非离子吗啉代寡核苷酸(MOR)功能化的金NP(Zu,Y等人，(2011)Small,7,306–310)。DNA靶的检测基于杂交时纳米探针稳定性的变化，即，纳米探针在结合至带负电的DNA靶时变得更加稳定。可简单地通过向溶液中添加盐来揭示NP稳定性变化。靶稳定化的纳米探针的颜色保持为红色，而未附接DNA的纳米探针将聚集，从而导致溶液颜色改变。可通过靶-探针杂交体的多种解链转变温度(T_m)(图1)对具有类似序列的靶加以区分。极其尖锐的转变确保了高检测特异性。

然而，由于基于纳米探针的方法的低敏感性(检测限～1nM)，不能直接对基因进行分析。在检测之前，需要通过PCR来扩增靶序列。在本研究中，已发现，T_m值高度依赖于靶浓度并且可受到测定溶液中存在盐的显著影响。由于PCR产率通常是未知的并且不同的主溶液可含有多种盐组分，因此难以通过使用单组纳米探针和不同的扩增模板DNA分子来分析PCR产物。此类检测方法描述于WO2011/087456中。

因此，尽管近年来付出了较大的研究努力，但仍未开发出允许结合护理点应用来测定基因型的稳健遗传学检验平台。尽管如此，本领域中需要此类遗传学检验平台来加速个性化医学的进展。

发明内容

本发明的目的是通过提供一种组合物来满足上述需求，所述组合物包含如本文所述的第一缀合物和第二缀合物或由其组成。意外的是，发明人已发现，使用至少两种不同的缀合物(这些缀合物中的每一者均包含寡核苷酸类似物和纳米粒子)允许对SNP(单核苷酸多态性)突变进行检测，而无需使用第二扩增模板DNA分子，即所谓的对照或参比分子。在本文中，提供一种基于双纳米探针测定的稳健的遗传学检验平台，由此采用一对纳米探针以允许对基因型的明确测定。所述平台利用不对称PCR(aPCR)进行靶序列扩增，并利用比色信号进行端点检测。检测所需的唯一设备是标准热循环仪。测定信号可通过肉眼观察或通过数码相机记录。因此，所述平台显著降低仪器和试剂的资本投资，并提供高性价比的检验。

在一个方面，本发明因此涉及一种检测样品中的靶核酸分子中的突变的方法，其包括以下步骤：(i)使包含第一纳米粒子和第一寡核苷酸类似物的第一缀合物与包含靶核酸序列的等分试样在允许所述第一缀合物和所述靶核酸分子彼此杂交的条件下接触，以形成第一缀合物:靶核酸分子复合物，其中所述第一寡核苷酸类似物为与所述第一纳米粒子共价偶联的磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)或其衍生物，其中所述第一寡核苷酸类似物包含与所述靶核酸的未突变序列互补的碱基序列；(ii)使包含第二纳米粒子和第二寡核苷酸类似物的第二缀合物与包含靶核酸序列的另一等分试样在允许所述第二缀合物和所述靶核酸分子彼此杂交的条件下接触，以形成第二缀合物:靶核酸分子复合物，其中所述第二寡核苷酸类似物为与所述第二纳米粒子共价偶联的磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)或其衍生物，其中所述第二寡核苷酸类似物包含碱基序列，所述碱基序列与所述靶核酸的突变序列互补并且与所述第一寡核苷酸类似物的所述碱基序列相差至少一个核碱基，并且其中所述第一寡核苷酸类似物和所述第二寡核苷酸类似物具有至少85％的序列同一性；和(iii)测定步骤(i)和(ii)的所述复合物的解链温度T_m并通过比较所述复合物的T_m来检测所述靶核酸分子是否包含所述突变。

在另一个方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含第一缀合物和第二缀合物，或由第一缀合物和第二缀合物组成，所述第一缀合物包含第一纳米粒子和第一寡核苷酸类似物，其中所述第一寡核苷酸类似物为与所述第一纳米粒子共价偶联的磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)或其衍生物，并且所述第二缀合物包含第二纳米粒子和第二寡核苷酸类似物，其中所述第二寡核苷酸类似物为与所述第二纳米粒子共价偶联的磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)或其衍生物，其中所述第一寡核苷酸类似物与所述第二寡核苷酸类似物相差至少一个核碱基，并且其中所述第一寡核苷酸类似物与所述第二寡核苷酸类似物具有至少85％的序列同一性。

在另一个方面，本发明涉及如本文所述的试剂盒用于检测靶核酸分子中的突变或用于将基因型指定给靶核酸的用途。

附图说明

当与非限制实施例和附图结合考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明。

图1示出通过纳米探针识别DNA靶的示意图。当靶序列与探针完全匹配时，纳米粒子在盐的存在下得以稳定。随着温度上升，靶/纳米探针杂交体在被称为T_m的温度下解离，导致纳米粒子聚集以及溶液色变。单碱基错配导致T_m下降5-15℃。当靶序列为随机的情况下，纳米探针溶液在与盐一起温育1分钟后在室温下转成无色。

图2示出作为靶序列的函数的T_m。纳米探针和靶序列的单碱基错配导致T_m降低5-15℃。当采用两组纳米探针WT和MUT探针时，每个靶可获得一对T_m。WT和MUT靶分别通过(T_m ^WT_WT、T_m ^MUT_WT)和(T_m ^WT_MUT、T_m ^MUT_MUT)来表征。

图3示出通过使用WT和MUT纳米探针获得的T_m的代表性散点图。根椐靶序列，数据点(T_m ^WT、T_m ^MUT)位于其特定的线性区域(WT、MUT和杂合区域)，这些线性区域几乎彼此平行。红色虚线表示与异质样品中的MUT/WT比率变化对应的数据点的迹线。

图4示出(a)p53WT纳米探针和(b)p53MUT纳米探针的作为合成靶浓度的函数的T_m值。T_m测量误差＝±1℃。

图5示出通过使用p53WT和MUT纳米探针和合成DNA靶获得的T_mWT和T_mMUT的散点图。

图6示出当合成DNA的MUT/WT序列比率变化时通过使用p53WT和MUT探针获得的T_m值。T_m测量误差＝±1℃。

图7示出针对p53基因分析的基于纳米探针的遗传学检验的工作流程。

图8示出p53基因的319-bpDNA片段的PCR扩增结果。

图9示出p53基因的基因分型密码子280G>A的散点图。gDNA样品提取自细胞系MCF-7和MDA-MB-230。杂合样品为WT和MUTgDNA的1:1混合物。每个样品的数据获自六次独立测定(一些数据点彼此重叠)。

图10示出当gDNA的MUT/WT序列比率变化时通过使用p53WT和MUT探针获得的T_m值。

图11示出靶向(a)CYP2C9*2SNP、(b)CYP2C9*3SNP和(c)VKORC1-1639G>ASNP的WT和MUT探针的作为合成靶浓度的函数的T_m值。T_m测量误差＝±1℃。

图12示出针对(a)CYP2C9*2、(b)CYP2C9*3和(c)VKORC1-1639的基因分型的合成DNA靶(灰色圆点)和人gDNA样品(红色三角形)的T_m ^WT和T_m ^MUT的散点图。使用与特定基因型对应的三个线性区域来测定人样品的基因型。T_m测量误差＝±1℃。

图13示出针对华法林敏感性试验的基于纳米探针的基因分型的工作流程。

图14示出在华法林基因分型期间接收到的PCR产物的凝胶图像。

图15(a)示出用于在热循环仪进行T_m测量的设置的照片。(b)华法林基因分型的T_m测量期间记录的典型照片。相应的基因型指定在图17中示出。

图16示出用于华法林基因分型中的PCR扩增的热循环仪方案。

图17示出在根据图15的实验中测量的T_m值和基于图12中示出的标准基因分型图指定的基因型。

具体实施方式

本发明人意外地发现，如本文所述的两种缀合物允许对突变进行稳健高效的检测(例如)以鉴定基因组DNA中的SNP(单核苷酸多态性)。与本领域中已知的检测系统(例如，WO2011/087456中公开的检测系统)相比，本发明的系统不需要对第二对照核酸模板分子上的同一基因座进行平行检测。

因此，在第一方面，本发明涉及一种检测样品中的靶核酸分子中的突变的方法，其包括以下步骤：

(i)使包含第一纳米粒子和第一寡核苷酸类似物的第一缀合物与怀疑包含靶核酸序列的样品的等分试样在允许所述第一缀合物和所述靶核酸分子彼此杂交的条件下接触，以形成第一缀合物:靶核酸分子复合物，其中所述第一寡核苷酸类似物为与所述第一纳米粒子共价偶联的磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)或其衍生物，其中所述第一寡核苷酸类似物包含与所述靶核酸的未突变序列互补的碱基序列；

(ii)使包含第二纳米粒子和第二寡核苷酸类似物的第二缀合物与怀疑包含靶核酸序列的样品的另一等分试样在允许所述第二缀合物和所述靶核酸分子彼此杂交的条件下接触，以形成第二缀合物:靶核酸分子复合物，其中所述第二寡核苷酸类似物为与所述第二纳米粒子共价偶联的磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)或其衍生物，其中所述第二寡核苷酸类似物包含碱基序列，所述碱基序列与所述靶核酸的突变序列互补并且与所述第一寡核苷酸类似物的所述碱基序列相差至少一个核碱基，并且其中所述第一寡核苷酸类似物和所述第二寡核苷酸类似物具有至少85％的序列同一性；和

(iii)测定步骤(i)和(ii)的所述复合物的解链温度T_m并通过比较(i)和(ii)的所述复合物的T_m来检测所述靶核酸分子是否包含所述突变。

在多种实施方案中，所述方法还包括在步骤(i)之前通过PCR扩增靶核酸分子的步骤。

在多种实施方案中，所述样品为异质样品。

在多种实施方案中，所述靶核酸分子包含SEQIDNo.3、4、13、14、15、16、17或18所示的核苷酸序列。

在另一个方面，本发明提供了如本文所述的组合物用于检测靶核酸分子中的突变或用于将基因型指定给靶核酸的用途。

在本发明的多种实施方案中，所述靶核酸分子与对应的野生型核酸分子相差1、2、3、4或5个核碱基。在多种其他实施方案中，所述靶核酸分子与对应的野生型核酸分子的差别在于一个或多个核苷酸的缺失或一个或多个核苷酸的插入。

在另一个方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含第一缀合物和第二缀合物或由第一缀合物和第二缀合物组成，所述第一缀合物包含第一纳米粒子和第一寡核苷酸类似物，其中所述第一寡核苷酸类似物为与所述第一纳米粒子共价偶联的磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)或其衍生物，并且所述第二缀合物包含第二纳米粒子和第二寡核苷酸类似物，其中所述第二寡核苷酸类似物为与所述第二纳米粒子共价偶联的磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)或其衍生物，其中所述第一寡核苷酸类似物与所述第二寡核苷酸类似物相差至少一个核碱基，并且其中所述第一寡核苷酸类似物与所述第二寡核苷酸类似物具有至少85％的序列同一性。

在本发明的多种实施方案中，所述组合物可用于检测至少一个靶核酸分子中的突变，其中所述第一寡核苷酸类似物包含与靶的野生型序列互补的序列并且所述第二寡核苷酸类似物包含与靶的突变序列互补的序列，或反之亦然。野生型序列和突变序列可相差一个或多个核碱基，优选地相差1、2、3、4或5个核碱基。除此类点突变之外，两种序列的差别还可在于一个或多个核苷酸的缺失或一个或多个核苷酸的插入。

检测原理基于以下事实：完全互补的探针:靶复合物与非完全互补的复合物相比具有较高的T_m。如本文所用的“互补性”涉及沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对，完全互补性意味着探针中的所有碱基与靶中的对应碱基沃森-克里克碱基配对。因此，可基于测量的解链转变温度值将基因型指定给靶核酸。如果对突变序列具有特异性的探针与对野生型序列具有特异性的探针相比形成具有较高T_m的复合物，则存在突变并可将突变基因型指定给靶序列。相反，如果对野生型序列具有特异性的探针与对突变序列具有特异性的探针相比形成具有较高T_m的复合物，则不存在突变并可将野生型基因型指定给靶序列。

在本发明的多种实施方案中，纳米粒子为金属纳米粒子。优选地，金属为贵金属。贵金属可选自银、金、铂、钯、钌、锇、铱及其混合物。在多种优选的实施方案中，金属为金。

在本发明的多种实施方案中，纳米粒子的直径在约1nm至约100nm的范围内。

在本发明的多种实施方案中，磷酰二胺吗啉代寡聚物或其衍生物的单体单元由式(I)表示

其中P₁为与另一嘌呤或嘧啶碱基形成沃森-克里克碱基对的嘌呤或嘧啶碱基，优选核碱基；并且X为NH₂、NHR或NR₂，其中R为C1-C6烷基，优选地R为甲基。在多种实施方案中，嘌呤或嘧啶碱基为选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)的核碱基。在多种其他实施方案中，核碱基选自前述核碱基的衍生物，例如5-甲基胞嘧啶(m5C)、假尿嘧啶核苷(Ψ)、二氢尿嘧啶核苷(D)、肌苷(I)和7-甲基鸟苷(m7G)以及黄嘌呤和次黄嘌呤。

在本发明的多种实施方案中，所述第一寡核苷酸类似物和第二寡核苷酸类似物包含约15至约35个单体单元。

在本发明的一个实施方案中，所述第一寡核苷酸类似物包含SEQIDNO:1所示的碱基序列，并且所述第二寡核苷酸包含SEQIDNO:2所示的碱基序列。

在本发明的另一个实施方案中，所述第一寡核苷酸类似物包含SEQIDNO:7所示的碱基序列，并且所述第二寡核苷酸包含SEQIDNO:8所示的碱基序列。

在本发明的另一个实施方案中，所述第一寡核苷酸类似物包含SEQIDNO:9所示的碱基序列，并且所述第二寡核苷酸包含SEQIDNO:10所示的碱基序列。

在本发明的另一个实施方案中，所述第一寡核苷酸类似物包含SEQIDNO:11所示的碱基序列，并且所述第二寡核苷酸包含SEQIDNO:12所示的碱基序列。

在所有上述实施方案中，寡核苷酸的主链为上文定义的磷酰二胺吗啉代主链。

在本发明的多种实施方案中，所述至少一种寡核苷酸类似物经由官能团与纳米粒子共价偶联，所述官能团任选地为连接分子的一部分。优选地，所述官能团包括硫醇基团。

在本发明的多种实施方案中，所述试剂盒还包含PCR引物。在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒用于p53基因的基因分型中，并且所述引物包含SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列或由SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列组成。在本发明的多种其他实施方案中，所述试剂盒用于测定华法林敏感性，其中所述引物对选自：SEQIDNO:19和SEQIDNO:20；SEQIDNO:21和SEQIDNO:22；或SEQIDNO:23和SEQIDNO:24。

在本发明的另一方面，如本文所述的试剂盒用于检测靶核酸分子中的突变或用于将基因型指定给靶核酸。

如本文所用的术语“组合物”涉及至少两个不同种类的化合物、元素、分子和/或缀合物的混合物。所述混合物可为包含至少两个不同类型的化合物、元素、分子和/或缀合物的呈固体形式的干燥混合物，或所述至少两个不同类型的化合物、元素、分子和/或缀合物可溶解于合适的溶剂中。

如本文所用的术语"缀合物"是指包含两个或更多个连接的化学基团的分子(例如，肽、碳水化合物、纳米粒子、小分子或核酸分子)。使用任何合适的化学键(例如共价键)使两个或更多个基团化学连接。合适的化学键是本领域中所熟知的并且包括二硫键、酸不稳定键、光不稳定键、肽酶不稳定键(例如肽键)、硫醚键和酯酶不稳定键。在本发明的一个优选实施方案中，化学键包括硫醇基团。

如本文所用的术语“纳米粒子”涉及被定义为相对于其输运和性质而言作为整体单元发挥作用的小物体的粒子。一般来讲，粒子是根据其直径进行分类。纳米粒子的尺寸介于1纳米和100纳米之间。优选地，本发明的纳米粒子为贵金属纳米粒子，更优选地所述粒子选自银、金、铂、钯、钌、锇、铱及其混合物。在多种优选的实施方案中，纳米粒子为金纳米粒子。

如本文所用的术语“核酸分子”、“核酸序列”或“寡核苷酸”涉及呈任何可能构型(包括单链、双链构型或其组合)的任何核酸分子。分离的寡核苷酸包括例如磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)、DNA分子、RNA分子以及包含经修饰的主链、核苷酸间键、糖或碱基的DNA或RNA类似物。DNA或RNA可为染色体或合成来源的。此类核酸包括但不限于mRNA、cRNA、合成RNA、基因组DNA、cDNA、合成DNA和DNA/RNA杂交体。如上所述，寡核苷酸为合成构建体或从可与核酸一起天然存在的其他细胞组分(包括细胞碎片)分离的核酸或为使用已知方法合成的。所得核酸优选地为70％、80％或90％纯的，优选至少95％或98％纯的核酸，其包含低于30％，优选低于20％或10％并且最优选低于5％或2％的不能鉴定为本文所述核酸的污染物。术语"核酸分子/序列"还指呈单链形式或双链螺旋的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；"RNA分子")或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；"DNA分子")的磷酸酯聚合物形式或其任何磷酸酯类似物，例如硫代磷酸酯和硫酯。核苷还可包含核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(m5C)、假尿嘧啶核苷(Ψ)、二氢尿嘧啶核苷(D)、肌苷(I)和7-甲基鸟苷(m7G)以及黄嘌呤和次黄嘌呤。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子，特别是DNA或RNA分子，仅仅是指分子的一级结构和二级结构，并且其不限于任何特定的三级形式。

多种核苷酸类似物是已知的，并且可作为本发明的分离的寡核苷酸的一部分并入或以其整体替代。本文中所定义的核苷酸类似物为在主链、核苷酸间键、糖或碱基部分处被修饰的核苷酸。主链或核苷酸间键部分处的修饰包括肽核酸(PNA)，和硫代磷酸酯对磷酸酯基团的取代。糖部分的修饰包括六元吗啉环的并入。碱基部分的修饰包括A、T/U、G和C的改变。这些不同部分的修饰可同时施加于同一核苷酸上。将核苷酸类似物并入分离的寡核苷酸中可导致改善的核酸酶抗性。优选地，本发明的核酸分子在给定的鸟嘌呤碱基的N2-位置处具有至少一种修饰。

术语"寡核苷酸类似物"是指具有经修饰的糖部分的寡核苷酸。本发明的寡核苷酸类似物优选地具有至多50、45、40、35、30、25、20、15或10个碱基的长度。与天然存在的RNA或DNA相比，在此类修饰的寡核苷酸中，五元糖环被六元吗啉环替代。此类寡核苷酸分子在本领域中被称为磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)或吗啉基。磷酰二胺吗啉代寡聚物的衍生物包含其中与吗啉环的碳和/或氮原子连接的氢原子中的至少一个被取代基取代的分子。优选地，此类取代基为有机部分。

如本文所用的术语“共价偶联”涉及牵涉在原子之间共享电子对的化学键。原子在共享电子时，它们之间的吸引力与排斥力的稳定平衡被称为共价结合。

如本文所用的“至少一个(种)”涉及一个(种)或多个(种)，特别是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个(种)或更多个(种)。

术语“核碱基”涉及存在于核苷酸-脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的基本构件内的含氮生物化合物(含氮碱基)。通常，核碱基也被称为碱基并且其形成碱基对并且彼此堆叠的能力直接导致DNA的螺旋结构和RNA的二级结构。

如本文所用的术语“序列”涉及核酸分子的一级核苷酸序列。

如本文所用，两条核酸或肽序列语境中的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行最大对应性的比对时两个序列中处于同一位置的残基。当序列同一性百分比针对蛋白质使用时，认为不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸取代，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守取代时，可以上调百分比序列同一性以校正取代的保守性质。差异在于此类保守取代的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行此调整的方式是本领域中所熟知的。通常，这涉及将保守取代作为部分而非完全错配来评分，由此增加百分比序列同一性。因此，例如，当将相同的氨基酸给分为1且非保守取代给分为0时，保守取代给分在0和1之间。保守取代的评分例如根据程序PC/GENE(Intelligenetics,MountainView,Calif.)中所执行那样进行计算。

如本文所用，“序列同一性百分比”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。通过以下方式计算该百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分比。在本发明的多种实施方案中，第一寡核苷酸类似物和第二寡核苷酸类似物的序列同一性为至少85％、90％、95％、98％或99％。

如本文所用的术语“金属”涉及通常坚硬、不透明、有光泽并且特征在于良好导电性和导热性的元素、化合物或合金。与大多数贱金属不同，贵金属在湿空气中可抗腐蚀和氧化。贵金属往往比较贵重，这是由于它们在地壳中的稀有性所致。通常认为贵金属是钌、铑、钯、银、锇、铱、铂和金。

如本文所用的与磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)有关的术语“单体单元”是指低聚PMO分子内的一个指定的核苷。此类“单体单元”由本发明的式(I)表示(参考段落[00038])。

如本文所用的“沃森-克里克碱基对”涉及单链核酸内或至少两个不同核酸分子之间存在的分子内碱基对。标准或规范的沃森-克里克碱基对为A-U(T)和G-C。

如本文所用的术语“官能团”是指可附接到寡核苷酸或纳米粒子的任何化学分子或基团，包括保护基、荧光或以其他方式可检测到的基团、标记和/或高反应性部分。任选地，此类官能团可位于连接分子上。连接分子可包含不止一个官能团，从而连接分子可连接不同的寡核苷酸和纳米粒子。

如本文所用的术语“检测”涉及定量地或定性地鉴定核酸分子中的突变。在本发明的优选实施方案中，核酸分子源自基因组DNA。在多种其他实施方案中，基因组DNA是“异质的”。这意味着基因组DNA中的给定的遗传二倍体基因座以两种不同的变异形式存在。此类基因组DNA在一个基因座处包含基因的两个不同等位基因，其也被称为杂合的。

如本文所用的术语"接触"通常是指使一种组分、试剂、分析物或样品触及另一种组分、试剂、分析物或样品。例如，接触可包括将包含本发明缀合物的溶液与包含靶核酸的样品混合。任选地，接触可包括将包含本发明缀合物的溶液与先前已通过PCR扩增的基因组DNA混合。包含一种组分、试剂、分析物或样品的溶液也可包含另一种组分或试剂，例如二甲基亚砜(DMSO)或洗涤剂，其有助于混合、相互作用、吸收或有利于组分、试剂、分析物和/或样品之间接触的其他物理或化学现象。

在本发明的多种实施方案中，样品为生物样品，例如体液、细胞或组织样品。体液包括但不限于血液、血浆、血清、乳汁、脑脊液、耳垢(耵聍)、内淋巴和外淋巴、胃液、粘液(包括鼻腔排泄物和粘液)、腹膜液、胸膜液、唾液、皮脂(皮肤油)、精液、汗液、泪液、阴道分泌物、乳头抽吸液、呕吐物和尿液。细胞或组织样品可包含源自身体任意部位(例如结缔组织、肌肉组织、神经组织和上皮组织)的物质。如本文所用的术语“获得样品”涉及本领域已知的不同方法，其包括但不限于活组织检查、前哨淋巴结活组织检查或血液、骨髓、痰或支气管流体的去除。

如本文所用的术语“靶核酸分子”涉及核苷酸序列已被测定的核酸分子。靶核酸分子可为整条染色体或任选地为染色体的给定基因或仅为给定基因的内含子或外显子的一部分。优选地，靶核酸分子上的一个特定遗传基因座通过本发明的方法来测定。然而，在一个基因或染色体内测定两个或更多个不同的基因座也是可能的。通过使用与假定存在于另外的基因座上的突变互补的另外的缀合物来实现此类测定。或者，还可通过使用与各假定突变完全互补的缀合物来测试一个特定遗传基因座的不同突变的存在。在此语境中，“野生型序列”涉及与含有一个或多个突变的核苷酸序列不同的核苷酸序列。这意味着术语“野生型序列”可指存在于大部分个体中的核苷酸或核苷酸序列。在此语境中，大部分可理解为在代表性个体群组中具有最高频率的遗传变体。此类代表性群组可代表全人类，或可为代表基于年龄、性别、体重、家族病史和/或其他参数选择的个体的群组。然而，术语“野生型序列”还可指存在于自然界中并且与病理状况无关的物种的典型形式的基因型。在特定遗传基因座的语境中，如本文所用的术语“突变”或“突变的”涉及与野生型序列不同的任何核苷酸或核苷酸序列。

如本文所用的“互补”序列涉及其中反向平行配对使一条链上的A残基与另一条链上的T或U残基以及一条链上的G与另一条链上的C残基并列，使得可形成A:T、A:U以及G:C氢键合碱基对的序列。这些碱基对是在体内大部分DNA和RNA杂交体中存在的标准“沃森-克里克”碱基对。如本文所用，除非另外指明，术语“互补”当用于描述相对于第二核苷酸序列的第一核苷酸序列时，本领域技术人员将理解其是指在某些条件下包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双螺旋结构的能力。“互补”序列还可包括非沃森-克里克碱基对和/或包括由非天然和修饰的核苷酸形成的碱基对，或完全由上述碱基对形成，只要满足就其杂交能力而言的要求即可。

就双链核酸杂交体的有义链和反义链之间的碱基配对而言，可使用本文中的术语“互补的”、“完全互补的”和“基本上互补的”。“完全互补的”杂交体的一条链上的每个核苷酸均与相对链上其并列的对应核苷酸碱基配对。在“基本上互补的”杂交体中，两条链可完全互补，或杂交时它们可包括一个或多个，但优选不超过30、20或10个错配的碱基对，而在用于本文所述方法的条件下保持杂交的能力。在本发明的一个优选实施方案中，所比较的核苷酸序列是完全互补的。

如本文所用的术语“复合物”涉及其中本发明的缀合物结合靶核酸分子的分子。所述结合基于互补核苷酸序列的杂交。

术语“允许杂交的条件”涉及特定的缓冲条件(例如盐和洗涤剂的浓度)，以及允许两种或更多种不同的核酸分子彼此结合形成“沃森-克里克”或非沃森-克里克碱基对的温度条件。允许两种或更多种核酸分子杂交的条件主要取决于互补序列的长度以及它们的特定序列。此类结合条件在本领域中是已知的(Gilmartin,PM(1996)NucleicAcidHybridization:EssentialData,Wiley；第1版)。

如本文所用的术语“T_m”或“解链温度”被定义为一半核酸链呈无规卷曲或单链状态时的温度。解链温度取决于核酸分子的长度及其特定的核苷酸序列。

在基因型的语境中，术语“指定”和“测定”涉及鉴定给定遗传基因座的基因型。

如本文所用的术语“缺失”涉及其中染色体的一部分或DNA或RNA序列丢失的突变。缺失是遗传物质的丧失。任何数目的核苷酸都可被缺失，从单个碱基到染色体的整个片段。缺失可由减数分裂过程中染色体交换中的错误引起。相比之下，如本文所用的术语“插入”是指将一个或多个核苷酸碱基或碱基对添加到RNA或DNA序列中。这由于DNA聚合酶滑动而可经常发生在微卫星区域中。插入可在任何位置，尺寸为从不正确插入DNA序列的一个碱基对到插入一条染色体插入另一条的部分。

如本文所用的术语“PCR引物”涉及用作DNA合成的起点并且与应扩增的核酸序列的侧翼区杂交的核酸寡聚物。需要进行DNA复制，因为催化扩增过程的酶-DNA聚合酶仅可将新的核苷酸添加到现有的DNA链中。聚合酶在引物的3'-端开始复制，并拷贝相对的链。PCR引物通常具有至少10个核苷酸的长度。优选地，本发明的PCR引物的长度介于20个核苷酸和35个核苷酸之间。

获自样品的靶核酸分子可在使该靶核酸分子与本发明的缀合物接触的步骤之前进行扩增。此类扩增可利用聚合酶链反应(PCR)技术来进行。可使用不同类型的PCR技术来扩增靶核酸分子。此类PCR技术包括但不限于等位基因特异性PCR、装配PCR、不对称PCR、拨出PCR(dial-outPCR)、数字PCR、解旋酶依赖性扩增、热启动PCR、序列间特异性PCR(ISSR)、反向PCR、连接介导PCR、甲基化特异性PCR(MSP)、迷你引物PCR、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)、多重PCR、纳米粒子辅助的PCR(nanoPCR)、巢式PCR、重叠延伸PCR或重叠延伸拼接(SOEing)、PAN-AC、逆转录PCR(RT-PCR)、固相PCR、热不对称交错PCR(TAIL-PCR)、降落PCR(步降PCR)、通用快速步移或转录介导的扩增(TMA)。此类技术是本领域中所熟知的(McPherson,MJ和Moller,SG(2000)PCR(Basics),Springer-VerlagTelos；第一版)。

实施例

材料和方法

纳米探针的制备

此研究中所用纳米探针的制备与Zu等人(Zu,Y等人，(2011)Small,7,306–310)所报道的类似。简而言之，将用二硫化酰胺在3’末端修饰的MOR(GeneTools,LLC)用二硫苏糖醇处理，然后通过使用NAP-5柱(GEHealthcare)来纯化。将金纳米粒子(40nm直径，～0.1nm)与～2μM巯基化MOR和10mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)混合，然后在室温下温育2小时。接着，将MOR-纳米粒子缀合物用磷酸盐缓冲溶液(5mM,pH7.5)洗涤5次并离心以除去未反应的MORs。所述缀合物可直接用作纳米探针或储存在4℃冷藏机中直至使用。当在4℃下储存时，纳米探针稳定至少6个月。使用前，需要通过涡旋使纳米探针溶液均匀分散。

基因组DNA(gDNA)提取

从培养的细胞中提取gDNA是根据制造商的说明使用SV基因组DNA纯化系统(Promega)来进行。通过使用Nanodrop1000(ThermoScientific)测量吸光度来检查gDNA样品的数量(ng/μl)和质量(A260/A280比率)。对于MCF-7和MADMB-231gDNA样品，260nm和280nm处的吸光度比率(A260/A280比率)分别为1.78和1.81。

在华法林基因分型研究中，从人脸颊拭子的gDNA提取是根据制造商的说明使用以下商业试剂盒来进行：SV基因组DNA纯化系统(Promega)、GentraPuregeneDNA提取试剂盒(Qiagen)或QIAampDNAInvestigator试剂盒(Qiagen)。样品的A260/A280比率从1.62至1.95变化。

PCR

通过使用SEQIDNo.1-6所示的引物来进行用于扩增包含p53基因的外显子8中的密码子280的靶序列的PCR。最终体积为25μL的溶液包含～10nggDNA、12.5μLFermentas主混合物(2×)和1μM各引物。对于野生型DNA背景中的突变检测，将PCR混合物中的gDNA总量增加至100ng，使得低水平突变型模板的数量对于扩增而言是足够的。PCR循环在PTC-200DNAEngine(Bio-Rad)上根据以下条件进行：一个循环，95℃下2分钟；40个循环，95℃下20秒、55℃下30秒以及72℃下30秒。通过在含有SafeView的1.5％琼脂糖凝胶上运行5μLPCR产物的等分试样来验证PCR产生319-bp扩增子的成功性。为产生ssDNA靶，采用λ-核酸外切酶消化策略(Higuchi,RG和Ochman,H(1989)NucleicAcidsRes,17,5865–5865)。PCR中使用磷酸标记的反向引物。将20μLPCR产物与10单位的λ-核酸外切酶(Fermentas)一起温育10分钟，然后使酶在80℃下失活10分钟。

aPCR(不对称聚合酶链反应)

在华法林敏感性试验试剂盒中，使用aPCR来产生ssDNA靶。最终体积为25μL的PCR溶液包含～10nggDNA、12.5μL主混合物(Fermentas或Promega,2×)、1μM正向引物和100nm反向引物。PCR循环在PTC-200DNAEngine(Bio-Rad)上进行(循环参数在图16中示出)。通过在用SafeViewTM染料染色的1.5％琼脂糖凝胶上运行5μLPCR产物的等分试样来验证PCR产生特定大小的扩增子的成功性。

T_m测量

将合成靶或ssDNA扩增子分别与特定的WT和MUT纳米探针混合。接着，用热循环仪测量靶探针杂交体的T_m值。使温度以1.0℃的间隔从30℃增加。在每一温度下，在颜色可视化或用照相机记录之前使溶液温育1分钟。当观察到从红色到淡灰色的清楚色变时，将温度记录为T_m。

基因型指定

将通过合成DNA靶获得的(T_m ^WT-T_m ^MUT)散点图(图5和图12分别针对p53和华法林检验)用作标准基因分型图。实验数据点(T_m ^WT,T_m ^MUT)绘制在特定的图中，并且其位置用于测定样品的基因型。通常沿着三个基因型区域中的一个来对数据点进行分组。数据点位于WT标准区域下方的样品应被指定为WT，而数据点位于MUT标准区域上方的样品应被指定为MUT。

体细胞突变测定

根据图5，T_m ^WT的值用于确定T_m ^MUT的下限(即，T_m ^MUT_WT，针对100％的WT靶获得的值)。如果T_m ^MUT的测量值比下限高(≥2℃)，则样品应被指定为体细胞突变。

实施例1：p53基因的分析

为了证实双纳米探针基因分型方法，对来自两种人细胞系MCF-7和MDA-MB-231的基因组DNA(gDNA)进行提取并分析，以确定p53基因、密码子280的突变状态。p53基因被称为编码p53蛋白质的肿瘤抑制基因，其抑制肿瘤的发展和生长。基因的突变在各种类型的人类癌症中是常见的(Hollstein,M等人，(1992)Science,253,49–53)。密码子280G>A纯合突变发生于人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，而细胞系MCF-7的p53基因为野生型(Bartek,J(1990)Oncogene,5,893–899)。

用于制备WT和MUT纳米探针的MOR序列由SEQIDNo.1-6示出。WT和MUT纳米探针两者均稳定分散在5mM磷酸盐缓冲溶液(pH～7.5)中。当将50mMNaCl加入纳米探针溶液中时观察到清楚的色变。该特征与先前所报道的类似，尽管MOR序列是不同的(Zu,Y等人，(2011)Small,7,306–310)。

使用合成101-核苷酸单链DNA(ssDNA)靶来研究纳米探针在序列区分方面的能力。靶分别由p53基因区段的WT和MUT序列表示。G>A的单碱基变异位于序列的中间位点。在≥2nm的WT或MUT靶的存在下，WT和MUT纳米探针均得以稳定并且在与50mMNaCl一起温育后未观察到色变。通过增加温度，基于溶液颜色的变化来获得纳米探针-靶杂交体的T_m值。图4示出作为靶数量的函数的T_m值。在每种给定靶浓度下，单碱基错配导致WT和MUT探针的T_m差异；ΔTm^WT和ΔTm^MUT从10℃至12℃变化。纳米探针对(通过以1:1比率混合WT和MUT靶获得的)杂合样品的响应在图4中示出。

WT、MUT和WT/MUT＝1:1(表示杂合基因型)靶的(T_m ^WT-T_m ^MUT)的散点图在图5中示出。当靶浓度在5nm至500nm的相对宽范围上变化时，与3类靶序列对应的3个数据点组在沿着它们的特定线性区域被发现，并且彼此明显区分。这些结果证实双探针测定是稳健的，甚至在靶数量显著变化时也可工作。在PCR产物的分析中，通过模板数量和聚合酶反应产率来测定靶浓度。无需对测定条件进行严格控制而测定样品基因型的能力是高度所需的。

为了检查突变检测敏感性，使用双纳米探针方法分析总浓度为100nm的一系列杂合样品。图6示出作为MUT/WT比率的函数的T_m值。当比率小于20％时，T_m ^WT的值与T_m ^WT_WT相同。另一方面，T_m ^MUT的值大大高于T_m ^MUT_WT，只要比率大于2％即可。因此，对于高度异质的样品，T_m ^WT的值可用作T_m ^MUT_WT并且可用于根据图5确定T_m ^MUT_WT的对应值。突变序列的存在导致T_m ^MUT的值高于T_m ^MUT_WT的值。

实施例2：采用双纳米探针方法进行基因分型

用于分析人p53基因的密码子280基因型的实验工作流程在图7中示出。从具有已知基因型的两个细胞系，即MCF-7(野生型)和MDA-MB-231(纯合突变)提取gDNA样品。通过(以1:1比率)混合提取自MCF-7和MASMB-231细胞系的gDNA样品来获得杂合样品。将这些gDNA样品用作模板，通过PCR产生319bp的DNA片段。用于PCR的反向引物是磷酸标记的。凝胶电泳显示所需片段的特异性扩增(图8)。

在PCR之后，通过对扩增子的磷酸标记的链进行λ-核酸外切酶消化来获得ssDNA靶(Higuchi,RG和Ochman,H(1989)NucleicAcidsRes,17,5865–5865)。接着，将ssDNA产物的两个等分试样分别与WT和MUT探针混合，并且测量T_m ^WT和T_m ^MUT。未进行PCR后清理。图9示出细胞系样品的基因分型的散点图。所有基因型均得以正确明确的测定。

注意到测定在引物、聚合酶和λ-核酸外切酶的存在下良好地工作，这表明纳米探针与这些物质之间的弱相互作用。纳米探针在DNA序列识别中的高特异性排除了引物附着的可能性。由于MOR的非离子和亲水性质，纳米探针还显示出对蛋白质的低亲和力。这些特征使得纳米探针在分析复杂样品方面具有稳健性，从而极大地简化了测定工作流程。

实施例3：高度异质样本的分析的敏感性

先前的研究表明，纳米探针的独特特征允许对低水平突变体的敏感检测(Zu,Y等人，(2011)Small,7,306–310)。在本文中，在高度异质样本的分析中使用双纳米探针测定。

通过以不同比率混合提取自MDB-MB-231和MCF-7细胞系的gDNA来制备一系列异质样品。图10示出作为gDNA比率的函数的T_m ^WT和T_m ^MUT的值。类似于通过使用合成DNA样品获得的结果(图6)，T_m ^WT的值可用于确定T_m ^MUT的下限(即，T_m ^MUT_WT，针对100％的WT靶获得的值)。如果T_m ^MUT的测量值比下限高(≥2℃)，则检测到体细胞突变。基于此标准，针对p53突变检测的双纳米探针测定的敏感性为～5％。该测定的敏感性高于Sanger测序(敏感性～20％)，并且与一些PCR富集技术相当(Higuchi,RG和Ochman,H(1989)NucleicAcidsRes,17,5865–5865)。作为端点检测方法，该测定与基于PCR的靶富集策略相容。当结合等位基因特异性PCR或钳制PCR使用双纳米探针测定时，将预期到较高的敏感性。

实施例4：华法林敏感性试验试剂盒的开发

在此研究中，采用3对WT和MUT纳米探针来测量与华法林敏感性相关联的3个SNP(SEQIDNo.7-12)。纳米探针可稳定分散在5mM磷酸盐缓冲溶液(pH～7.5)中。然而，在与50mMNaCl一起温育1分钟后发生清楚的色变。

首先，测试纳米探针在识别合成DNA靶方面的特征(SEQIDNo.13-18和图11)。在≥5nm完全匹配的靶、单碱基错配的靶或它们的1:1混合物(表示杂合靶)的存在下，纳米探针变得稳定并且在室温下未观察到色变，甚至在与50mMNaCl一起温育1天后也是如此。随着温度升高，基于比色信号获得纳米探针-靶杂交体的T_m值。T_m通常随着靶数量的增加而增加。在任意给定靶浓度下，单碱基错配导致T_m几乎一致的降低。

每对纳米探针的(T_m ^WT-T_m ^MUT)散点图在图12中示出。在较大的合成靶浓度范围(5nM至500nM)内，与3类靶序列对应的3个数据点组在它们的特定线性区域被发现，并且彼此明显区分。

通过执行简单的工作流程在对来自健康志愿者的脸颊拭子的人gDNA的分析过程中检查新的基因分型平台(图13)。当用商业试剂盒从样品中提取gDNA后，进行aPCR以产生ssDNA靶。

该测定包括3次aPCR反应来扩增包含SNP的序列片段。对引物进行设计并优化，使得扩增可在相同的热循环条件下进行(SEQIDNo.19-24和图14和16)。在aPCR之后，将每一反应产物的两个等分试样分别与特定的WT和MUT探针混合。接着，基于尖锐的解链转变测量靶/纳米探针杂交体的T_m值(图15和17)。通过对对应标准图中所获得的T_m数据进行绘图，可指定样品的基因型(图12)。该方案不包括任何纯化和洗涤步骤，并且可在2小时内完成。

对上文进行汇总并且将本发明与其他基因分型平台进行比较，注意到基于纳米探针的技术表现出一些独特的优点。首先，简单的溶液相测定导致高度可再现的结果。均匀分散的纳米探针与DNA靶在溶液中快速杂交。不涉及后PCR清理和杂交后洗涤步骤，从而大大简化了检测并且避免了对实验条件进行严格控制的需求。其次，由于极其尖锐的解链转变和明显的色变，纳米探针在识别DNA序列方面具有高度特异性，从而确保了测定的特异性和准确性。再次，等离子体纳米探针允许低成本比色检测，而非需要复杂光学元件和算法的基于荧光团的检测。由于所需的唯一仪器为标准热循环仪，因此平台可容易地与PCR一起部署在任何实验室中，而无需另外的资本设备投资。此外，溶液相测定可容易地与微流体系统整合以使测定小型化和自动化并且实现护理点检验。

本文中已对本发明进行了宽泛的和一般性的描述。落入概括性公开内容中的每一较窄的种类和亚类也构成本发明的一部分。这包括由附带条件或负面限制从所述类属中排除任何主题后的对本发明的概括性描述，无论被排除的材料是否在本文中被明确叙述。其他实施方案在以下权利要求书的范围内。此外,当本发明的特征和方面根据马库什群组进行描述时，本领域的技术人员将认识到本发明也因此根据该马库什群组的任何单个成员或成员亚组进行描述。

本领域技术人员将易于了解，本发明充分适于执行目标并且获得所提到的以及其中固有的结果和优点。另外，对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明精神和范围的前提下可对本文公开的发明进行各种替换和修改。本文描述的组合物、方法、工序、处理、分子和特定化合物为当前优选实施方案的代表，其为示例性的并且不旨在限制本发明的范围。本发明的精神内涵盖的本领域技术人员想到的其中的改变和其他用途由权利要求的范围限定。本说明书中对先前出版文献的列示或讨论不应必然被认为承认所述文献是现有技术水平的一部分或普遍的一般知识。

可将本文示例性描述的发明适宜地在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素、任何一个或多个限制的情况下实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应广义地阅读并且没有限定。词语“包含”或变型，例如“包括”或“含有”将相应地被理解为暗示包含所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。因此，本文已采用的术语和措辞是用作描述性而非限制性的术语，并且在这类术语和措辞的使用中并不意图排除所示的和所描述的特征或其部分的任何等同物，而是应认识到在受权利要求书保护的本发明的范围之内可以作出各种修改形式。因此，应当理解，尽管已经通过示例性实施方案和任选特征具体公开了本发明，但本领域技术人员可得到本文公开的其中体现的本发明的修改和变型，并且认为此类修改和变型在本发明的范围内。

本文中所引用的所有文献和专利文件的内容均整体以引用的方式并入本文。

Claims (38)

1.一种检测样品中的靶核酸分子中的突变的方法，其包括以下步骤：

(i)使包含第一纳米粒子和第一寡核苷酸类似物的第一缀合物与包含靶核酸序列的等分试样在允许所述第一缀合物和所述靶核酸分子彼此杂交的条件下接触，以形成第一缀合物:靶核酸分子复合物，

其中所述第一寡核苷酸类似物为与所述第一纳米粒子共价偶联的磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)或其衍生物，其中所述第一寡核苷酸类似物包含与所述靶核酸的野生型序列互补的碱基序列；

(ii)使包含第二纳米粒子和第二寡核苷酸类似物的第二缀合物与包含所述靶核酸序列的另一等分试样在允许所述第二缀合物和所述靶核酸分子彼此杂交的条件下接触，以形成第二缀合物:靶核酸分子复合物，

其中所述第二寡核苷酸类似物为与所述第二纳米粒子共价偶联的磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)或其衍生物，其中所述第二寡核苷酸类似物包含碱基序列，所述碱基序列与所述靶核酸的突变序列互补并且与所述第一寡核苷酸类似物的所述碱基序列相差至少一个核碱基，并且其中所述第一寡核苷酸类似物和所述第二寡核苷酸类似物具有至少85％的序列同一性；和

(iii)测定步骤(i)和(ii)的所述复合物的解链温度T_m并通过比较所述复合物的T_m来检测所述靶核酸分子是否包含所述突变。

2.根据权利要求1所述的方法，其还包括在步骤(i)之前通过PCR扩增所述靶核酸分子的步骤。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述样品为异质样品。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述靶核酸分子包含SEQIDNo.3、4、13、14、15、16、17或18所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含SEQIDNO:1所示的碱基序列，并且所述第二寡核苷酸包含SEQIDNO:2所示的碱基序列。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含SEQIDNO:7所示的碱基序列，并且所述第二寡核苷酸包含SEQIDNO:8所示的碱基序列。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含SEQIDNO:9所示的碱基序列，并且所述第二寡核苷酸包含SEQIDNO:10所示的碱基序列。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含SEQIDNO:11所示的碱基序列，并且所述第二寡核苷酸包含SEQIDNO:12所示的碱基序列。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述磷酰二胺吗啉代寡聚物或其衍生物的单体单元由式(I)表示

其中

P₁为与另一嘌呤或嘧啶碱基形成沃森-克里克碱基对的嘌呤或嘧啶碱基；并且

X为NH₂、NHR或NR₂，其中R为C1-C6烷基。

10.根据权利要求9所述的方法，其中与所述P₁的嘌呤或嘧啶碱基形成沃森-克里克碱基对的所述另一嘌呤或嘧啶碱基为核碱基。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其中X为NR₂并且R为甲基。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述嘌呤或嘧啶碱基为选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)的核碱基。

13.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述嘌呤或嘧啶碱基为选自5-甲基胞嘧啶(m5C)、假尿嘧啶核苷(Ψ)、二氢尿嘧啶核苷(D)、肌苷(I)和7-甲基鸟苷(m7G)、黄嘌呤和次黄嘌呤的核碱基。

14.一种试剂盒，其包含第一缀合物和第二缀合物或由第一缀合物和第二缀合物组成，

所述第一缀合物包含第一纳米粒子和第一寡核苷酸类似物，其中所述第一寡核苷酸类似物为与所述第一纳米粒子共价偶联的磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)或其衍生物，并且

所述第二缀合物包含第二纳米粒子和第二寡核苷酸类似物，其中所述第二寡核苷酸类似物为与所述第二纳米粒子共价偶联的磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)或其衍生物，

其中所述第一寡核苷酸类似物与所述第二寡核苷酸类似物相差至少一个核碱基，并且其中所述第一寡核苷酸类似物与所述第二寡核苷酸类似物具有至少85％的序列同一性。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述第一和/或所述第二纳米粒子为金属纳米粒子。

16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述金属为贵金属。

17.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述贵金属选自金、银、铂、钯、钌、锇、铱及其混合物。

18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述贵金属为金。

19.根据权利要求14至18中任一项所述的试剂盒，其中所述纳米粒子的直径在约1nm至约100nm的范围内。

20.根据权利要求14至19中任一项所述的试剂盒，其中所述磷酰二胺吗啉代寡聚物或其衍生物的单体单元由式(I)表示

其中

P₁为与另一嘌呤或嘧啶碱基形成沃森-克里克碱基对的嘌呤或嘧啶碱基；并且

X为NH₂、NHR或NR₂，其中R为C1-C6烷基。

21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中与所述P₁的嘌呤或嘧啶碱基形成沃森-克里克碱基对的所述另一嘌呤或嘧啶碱基为核碱基。

22.根据权利要求20或21所述的试剂盒，其中X为NR₂并且R为甲基。

23.根据权利要求20至22中任一项所述的试剂盒，其中所述嘌呤或嘧啶碱基为选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)的核碱基。

24.根据权利要求20至22中任一项所述的试剂盒，其中所述嘌呤或嘧啶碱基为选自5-甲基胞嘧啶(m5C)、假尿嘧啶核苷(Ψ)、二氢尿嘧啶核苷(D)、肌苷(I)和7-甲基鸟苷(m7G)、黄嘌呤和次黄嘌呤的核碱基。

25.根据权利要求14至24中任一项所述的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸类似物和第二寡核苷酸类似物包含约15至约35个单体单元。

26.根据权利要求14至25中任一项所述的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸类似物包含SEQIDNO:1所示的碱基序列，并且所述第二寡核苷酸包含SEQIDNO:2所示的碱基序列。

27.根据权利要求14至25中任一项所述的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸包含SEQIDNO:7所示的碱基序列，并且所述第二寡核苷酸包含SEQIDNO:8所示的碱基序列。

28.根据权利要求14至25中任一项所述的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸包含SEQIDNO:9所示的碱基序列，并且所述第二寡核苷酸包含SEQIDNO:10所示的碱基序列。

29.根据权利要求14至25中任一项所述的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸包含SEQIDNO:11所示的碱基序列，并且所述第二寡核苷酸包含SEQIDNO:12所示的碱基序列。

30.根据权利要求14至29中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种寡核苷酸类似物经由官能团与所述纳米粒子共价偶联。

31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述官能团包含硫醇基团。

32.根据权利要求30或31所述的试剂盒，其中所述官能团为连接分子的一部分。

33.根据权利要求14至32中任一项所述的试剂盒，其还包含PCR引物。

34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述PCR引物包含SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列或由SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列组成。

35.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述PCR引物选自由SEQIDNO:19和SEQIDNO:20；SEQIDNO:21和SEQIDNO:22；以及SEQIDNO:23和SEQIDNO:24组成的引物对。

36.根据权利要求14至35中任一项所述的试剂盒，其中所述第一缀合物和所述第二缀合物储存在各自的容器中。

37.根据权利要求14至35中任一项所述的试剂盒，其中所述第一缀合物和所述第二缀合物一起储存在一个容器中。

38.根据权利要求14至37中任一项所述的试剂盒用于检测靶核酸分子中的突变或用于将基因型指定给靶核酸的用途。