CN102884204A - 利用纳米颗粒探针进行的核酸的序列选择性识别 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含纳米颗粒和至少一种寡核苷酸类似物的缀合物，其中，所述至少一种寡核苷酸类似物为磷酰二胺吗啉代寡核苷酸（PMO）或其衍生物，所述寡核苷酸类似物共价连接至所述纳米颗粒；本发明还涉及使用该缀合物来检测靶核酸的方法以及包含该缀合物的试剂盒。

Description

利用纳米颗粒探针进行的核酸的序列选择性识别
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年1月12日提交的新加坡专利申请No.201000176-6的优先权，为了所有目的，以引用的方式将其内容整体引入本文。
技术领域
本发明涉及用于核酸检测的缀合物(所述缀合物包含纳米颗粒和至少一种寡核苷酸类似物)、使用该缀合物的方法、该缀合物的用途及包含本发明的至少一种缀合物的试剂盒。
背景技术
在生命科学研究中，使用以杂交为基础的技术的核酸检测被广泛地应用。DNA的序列特异性检测一直是生物分析的焦点之一。在许多研究领域，单核苷酸变体的识别是很关键的，例如单核苷酸多态性(SNP)的基因分型和获得性点突变的检测。SNP代表了最高丰度的遗传变异类型，而SNP基因分型在将序列变体关联至表型改变中扮演着重要角色。由于很多人类疾病源自单个基因或多个基因中的突变，对突变检测的需求升高。点突变作为重要的癌症分子标记显现出来，并且，在远远过量(＞100倍)的野生型等位基因中检测低水平的体细胞点突变对于早期诊断和风险评估是必不可少的。
根据稳定性差异，通常将以杂交为基础的策略用于SNP鉴别。可通过测量完全匹配的双链和单碱基错配的双链间不同的解链曲线(meltingcurves)来区分两者之间的稳定性差异。必须应用严格杂交条件来减少等位基因特异性探针的交叉结合并完成选择性检测。虽然在这些研究里荧光测定仍然占据优势，但是在过去的十年间已经提出多种基于金纳米颗粒(NP)的方法。金纳米颗粒显示出强的距离依赖性的光学特性和大表面积。金纳米颗粒的消光系数可比有机染料的消光系数高～3个数量级。与分析物相关的金纳米颗粒的聚集将表面等离子共振(SPR)吸收峰移向较长的波长，实现容易读出的比色感测。以ssDNA修饰的金纳米颗粒聚合物网络的形成为基础，开发了比色DNA检测法(Elghanian，R.等，Science 1997，277，1078-1081)。通过严格控制温度，可以鉴别单碱基错配。对DNA的检测还可在由杂交引起的纳米颗粒稳定性变化的基础上进行。在另一个研究中，观察到在浓NaCl存在的情况下，固定在金纳米颗粒上的DNA探针与溶液中的靶的杂交可使胶体较不稳定并较易聚集(Sato，K.等，J.Am.Chem.Soc.，2003，125，8102-8103)。因为仅使用一套缀合物，该以缀合物稳定性为基础的方法提供了简便的优势。快速响应是该方法的另一个优点。因为聚集是由London-范德华吸引力引起、而不是通过靶的交联引起，可在几分钟内就观察到响应。
由于单链核酸拥有带负电荷的骨架，二级结构和双链的形成通常需要溶液中盐的存在以屏蔽静电相互作用。对于使用寡核苷酸探针的基于杂交的核酸检测，尤其当靶链包含大量二级结构时，对分析条件(即盐浓度和温度)的严格控制是至关紧要的。靶-探针双链体的稳定性和靶链内的碱基配对相互作用都高度依赖于盐浓度。一方面，由于链间静电排斥的屏蔽，低严格条件(即高盐或低温)有助于靶-探针双链体的形成，但是可能导致选择性的损失；尤其是，靶链中任何可能的二级结构也可被稳定，使得杂交探针无法接近与探针互补的靶序列。另一方面，高严格条件(即低盐或高温)可以提高识别选择性并有利于释放靶序列；然而，在这些条件下形成的靶-探针双链体是较不稳定的，导致信号强度的损失。因此，对杂交条件的精确控制并不是一项无足轻重的任务，假阴性和假阳性通常是不可避免的，这显著地降低了基于杂交的方法的可靠性。
除DNA探针以外，肽核酸(PNA)寡聚物也已与金纳米颗粒联合使用。因为PNA的骨架是非离子的，该PNA官能化的金纳米颗粒容易聚集；同时，随着DNA靶经杂交连接至纳米颗粒，该缀合物变得更加稳定。然而，PNA寡聚物在水溶液中的低溶解度使得PNA/纳米颗粒缀合物的制备极其困难。通过引入离子化的肽对PNA寡聚物进行修饰，对避免该缀合物的聚集十分必要。
因此，本发明的目的是提供改进的核酸检测方法，该方法在鉴别单点错配中具有高选择性。
发明内容
在第一个方面中，本发明提供了包含纳米颗粒和至少一种寡核苷酸类似物的缀合物。所述至少一种寡核苷酸类似物是磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(phosphorodiamidate morpholino oligo，PMO)或其衍生物，所述寡核苷酸类似物与所述纳米颗粒共价连接。
在第二个方面中，本发明提供了用于检测靶核酸的方法。该方法包括在能够使本发明的至少一种缀合物与靶核酸彼此杂交的条件下，将所述至少一种缀合物与包含所述靶核酸的样品接触，其中，所述磷酰二胺吗啉代寡核苷酸或其衍生物包含与靶核酸中含有的核苷酸序列互补的核苷酸序列；以及检测所形成的复合物。
在第三个方面中，本发明提供了用于检测靶核酸分子中至少一个单核苷酸多态性(SNP)的方法。该方法包括如下步骤：i)使所述靶核酸分子与本发明的缀合物接触，以形成缀合物与靶核酸分子的复合物；ii)测量所述复合物的解链转变温度(melting transition temperature)；以及iii)将在ii)中测量的复合物的解链转变温度与对照复合物的解链转变温度进行比较，其中，如果与对照复合物相比，所述缀合物与靶核酸分子的复合物具有较低的解链转变温度，这表明该靶核酸分子包含至少一个单核苷酸多态性。
在第四个方面中，本发明提供了本发明的至少一种缀合物在靶核酸分子检测中的用途。
在第五个方面中，本发明提供了用于检测靶核酸分子的试剂盒。该试剂盒包含本发明的至少一种缀合物。
附图说明
当与非限制实例和附图结合考虑时，参考详细的说明将更好地理解本发明，其中：
图1显示了将40nm金纳米颗粒上的巯基化吗啉代寡核苷酸的表面密度(链数/纳米颗粒)作为孵育时间的函数进行阐释的图。误差棒表示来自三次测量的标准差。混合物溶液包含10mM磷酸盐、～2nM含氟表面活性剂(FSN)封端(capped)的金纳米颗粒及～1μM巯基化吗啉代寡核苷酸。巯基化吗啉代寡核苷酸(MO)在40nm金纳米颗粒上的负载密度是～1200链/颗粒，所述负载密度远高于可被负载于同样尺寸的金纳米颗粒上的巯基化ssDNA的最大表面覆盖度。不希望受任何理论的约束，这可以归因于固定化MO间静电排斥力的缺失。观察到快速的连接动力学，其中，可以在1小时内达到饱和负载密度。
图2显示在添加浓度为20mM、80mM及200mM的NaCl后，缀合物溶液消光的时程(540nm处的吸光度)。测量使用384孔微孔板进行。添加NaCl后，缀合物溶液发生颜色变化。
图3显示了在与200mM NaCl孵育前及孵育0.5小时后的MO1/金纳米颗粒缀合物的UV-Vis光谱。MO1表示如SEQ ID NO：1所示的吗啉代寡核苷酸。图中的线条1(“分散的”)表示聚集前(即与NaCl孵育前)的MO1/金纳米颗粒缀合物的UV-Vis光谱。图中的线条2(“聚集的”)表示聚集后(即与NaCl孵育后)的MO1/金纳米颗粒缀合物的UV-Vis光谱。
图4显示了DNA靶与吗啉代寡核苷酸(MO)/纳米颗粒缀合物杂交的示意图。
图5显示了在50mM NaCl存在的情况下孵育1小时后，将缀合物溶液的吸光度(540nm处)作为DNA靶(PM1)浓度的函数进行测量的图。所述DNA靶PM1在表1中可得，如SEQ ID NO：4所示。使用384孔微孔板进行测量。发现本方法的检测限是～0.5nM。
图6显示了杂交的PM1-MO1/纳米颗粒缀合物的解链特性。在各个温度下将金纳米颗粒溶液孵育0.5h后得到其吸光度值。该溶液包含0.06nM MO1/纳米颗粒缀合物、10nM DNA靶(PM1；SEQ ID NO：4)、200mM NaCl及0.01％Triton X-100。插图显示溶液(500nM寡核苷酸、10mM磷酸盐缓冲液、pH 7.5)中游离PM1-MO双链体的热解离曲线。当温度足够高至使PM1-MO双链体不稳定时，经由杂交连接至纳米颗粒的DNA链将被释放至溶液中，导致纳米颗粒稳定性下降。因此，纳米颗粒开始聚集，并观察到快速的溶液光谱变化。光谱转变发生在解链转变温度(Tm)43.5℃。相比跨越宽温度范围(＞20℃)的游离PM1-MO双链体的转变(图6，插图)，PM1-MO/纳米颗粒的吸光度变化发生在较窄的范围内(～1℃)。
图7显示DNA-MO/纳米颗粒缀合物解链转变的示意图。状态“a”至“e”与图6中所显示的相对应。DNA-MO/纳米颗粒缀合物的稳定性取决于连接在纳米颗粒上的DNA链的量。
图8显示了杂交的PM DNA-MO1/纳米颗粒缀合物和SNPDNA-MO1/纳米颗粒缀合物的解链转变。在各个温度下将纳米颗粒溶液孵育0.5小时后获得其吸光度值。溶液包含0.06nM MO/纳米颗粒缀合物、100nM DNA靶PM1(SEQ ID NO：4)或SNP1(SEQ ID NO：5)、200mMNaCl及0.01％Triton X-100。杂交的纳米颗粒缀合物独特的解链特性导致PM1和SNP1靶(100nM)解链曲线清楚地分开。在41-51.5℃之间的任何温度下，在200mM NaCl存在的情况下，与完全互补的DNA杂交的纳米颗粒缀合物保持稳定的粉红色，而突变DNA(SNP)(单点错配)不能稳定该缀合物，纳米颗粒的聚集迅速发生。通过肉眼可容易地观察到该溶液在几分钟内从粉红色到几乎无色的颜色变化。
图9显示了作为各自的靶DNA(PM1或SNP1)浓度的函数的杂交的PM1 DNA-MO1/纳米颗粒缀合物和SNP1 DNA-MO1/纳米颗粒缀合物的解链转变温度。
图10显示了在存在或不存在50nM PM1(SEQ ID NO：4)的情况下，将包含10μM SNP1(SEQ ID NO：5)的MO/纳米颗粒缀合物溶液孵育0.5小时后，在540nm处的吸光度值。已经减去在相同条件下孵育后的缀合物溶液(不含靶)的背景吸光度信号。
图11显示杂交的PM-10(SEQ ID NO：8)MO/纳米颗粒缀合物和SNP-10(SEQ ID NO：9)MO/纳米颗粒缀合物的解链转变。溶液含有200mM NaCl及0.01％Triton X-100。作为10个碱基的特异性序列，PM-10和单碱基错配的靶SNP-10的Tm值分别为19℃和32.5℃。ΔTm，PM-SNP增加至13.5℃。另外，短探针序列的应用使得能够在室温下方便地鉴别SNP。在本发明的上下文中，不受任何理论的约束，针对单碱基错配的寡核苷酸探针的识别选择性随其长度降低而升高。通过将探针序列的长度从15缩短到10，错配碱基对的百分比从7％增加到10％，这可能对双链稳定性具有实质上较大的影响。同时，纳米颗粒缀合物体系的解链转变可以移动至较低的温度范围。
图12显示MO/银纳米颗粒缀合物与200mM NaCl孵育前及孵育0.5小时后的UV-Vis光谱。图中线条1(“分散的”)表示聚集前(即与NaCl孵育前)MO1/银纳米颗粒缀合物的UV-Vis光谱。线条2(“聚集的”)表示聚集后(即与NaCl孵育后)MO1/银纳米颗粒缀合物的UV-Vis光谱。
图13显示用于测试杂合体类型和纯合体类型的UV-Vis光谱。分析溶液含有MO1修饰的金纳米颗粒、MO1SNP(SEQ ID NO：2)修饰的银纳米颗粒、200mM NaCl和0.01％Triton X-100。样品1：10nM PM1和10nM SNP1。样品2：10nM PM1。样品3：10nM SNP1。分析温度40℃。
图14(a)显示在5mM NaCl和2mM Tris缓冲溶液中，使用一对缀合物(MO 1，SEQ ID NO：1；MO2，SEQ ID NO：3)进行的核酸比色法检测的示意图。DNA靶通过与结合有纳米颗粒的吗啉代寡核苷酸序列杂交而作为连接(align)缀合物对的接头。
图14(b)显示通过靶DNA引起的聚集前及聚集后的MO/金纳米颗粒缀合物的UV-Vis光谱。“分散的纳米颗粒”表示分散在2mM Tris缓冲溶液中的MO/金纳米颗粒缀合物的UV-Vis光谱。“DNA连接的纳米颗粒”表示通过DNA靶连接的至少一对MO/金纳米颗粒缀合物的UV-Vis光谱。
图14(c)显示了作为DNA靶浓度的函数的MO/金纳米颗粒缀合物溶液的比色变化(在532nm处的吸光度)。13-nm纳米颗粒缀合物响应浓度≥1nM的DNA靶。
图15显示根据实施例11制备的探针1和探针2的DNA连接的聚集体的解链图形。DNA靶浓度为5nM。溶液为含有5mM NaCl的2mM Tris缓冲液(pH＝7.5)。
图16显示图15中所示解链图形的一阶导数曲线。
具体实施方式
本发明是根据杂交至靶核酸的本发明的缀合物的解链转变发生在～1℃的窄温度范围内的惊奇发现，使得能够检测单点错配。这可导致对单核苷酸多态性(SNP)鉴别的选择性因子大于200∶1。此外，本发明的两种缀合物通过杂交至靶核酸的方式交联使得能够在极低的盐条件下(例如在≤5mM NaCl时)检测靶核酸。这显著地降低了靶的二级结构对分析的不利作用(例如分析灵敏度的降低)，这是由于二级结构使得本发明的缀合物不易接近该靶序列。因此，本发明方法所使用的低盐条件还可引起例如靶核酸和SNP检测的选择性提高。当检测靶核酸时，这也消除了对分析条件进行严格控制的需求，并可显著地减少假阳性或假阴性的产生。
不希望受理论的约束，发现由于PMO同PNA相比具有较高的溶解度，本发明的缀合物在5mM磷酸盐缓冲溶液中分散得很好。因此，本发明缀合物的制备较以前已知的方法更简单。还发现本发明的缀合物可以通过杂交至靶核酸的两种缀合物交联的方式达到稳定。本发明中杂交至靶核酸的缀合物显示出尖锐的解链转变(sharp melting transitions)，可将完全匹配的靶从带有单碱基替换、缺失或插入的序列中明确地鉴别出来。该序列选择性方法能以更有效的方式提供用于基因变异研究的新工具。
在第一个方面中，本发明因此提供了用于检测靶核酸分子的缀合物。该缀合物包含纳米颗粒和至少一种寡核苷酸类似物。该至少一种寡核苷酸类似物为磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)或其衍生物，所述寡核苷酸类似物共价结合至所述纳米颗粒。
本文使用的术语“纳米颗粒”是指如下所述的任何颗粒：尺寸为约1nm至约250nm、并具有共价结合至本文所述的至少一种寡核苷酸类似物的能力。在某些实施方式中，所述纳米颗粒是金属纳米颗粒。在其它实施方式中，所述纳米颗粒是胶体金属。
在一些实施方式中，所述金属为贵金属。能使用的贵金属的非限制性实例可包括银、金、铂、钯、钌、锇、铱或它们的混合物，但不限于此。其它也可用于形成所述纳米颗粒的金属可包括但是不限于铝、铜、钴、铟、镍或其它任何能够形成纳米颗粒的金属。本文所述的纳米颗粒还可包括半导体(例如包括但不限于CdSe，CdS和镀有ZnS的CdS或CdSe)或磁性(例如铁磁性)胶体材料。在本发明的实施中有用的其它纳米颗粒包括、同样也不限于ZnS、ZnO、Ti、TiO2、Sn、SnO2、Si、SiO2、Fe、Ag、Cu、Ni、Al、钢、钴-铬合金、Cd、钛合金、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs。
制备ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs纳米颗粒的方法也是本领域已知的。参见例如Weller Angew.，Chem.Int.Ed.Engl.，32，41(1993)；Henglein，Top.Curr.Chem.，143，113(1988)。制备金属纳米颗粒、半导体纳米颗粒和磁性纳米颗粒的方法也是本领域已知的，参见例如Ahmadi，T.E.等，Science，272，1924(1996)；Henglein，A.等，J.Phys.Chem.，99，14129(1995)。合适的纳米颗粒也能购自例如：Ted Pella，Inc.(金)、Amersham公司(金)和Nanoprobes Inc(金)。包含本文所述的材料的纳米颗粒是可商购的；或它们可由溶液中的连续成核(例如通过胶体反应)来生产、或通过多种物理和化学气相沉积方法(如溅射沉积)生产。还可通过本领域已知的方法，利用HAuCl4和柠檬酸盐还原剂生产本文所述的纳米颗粒(参见例如Grabar，K.C.等，Anal.Chem.，1995，67，735-743)。
只要该纳米颗粒有能力提供光学性质(例如产生对杂交反应敏感的光学信号)，用于本发明的缀合物的纳米颗粒的尺寸可根据需要在任何尺寸范围内变化。本文所述的纳米颗粒的直径可在如下尺寸范围内变化：约1nm至约250nm；约1nm至约200nm；约1nm至约160nm；约1nm至约140nm；约1nm至约120nm；约1nm至约80nm；约1nm至约60nm；约1nm至约50nm；约5nm至约250nm；约8nm至约250nm；约10nm至约250nm；约20nm至约250nm；约30nm至约250nm；约40nm至约250nm；约85nm至约250nm；约100nm至约250nm；或约150nm至约250nm。在一些实施方式中，所述纳米颗粒的直径在约1nm至约100nm的范围内。
在某些实施方式中，所述纳米颗粒包含表面活性剂。本文使用的“表面活性剂”是指在分子中既有亲水部分又有疏水部分的表面活性剂。该表面活性剂例如可用于稳定纳米颗粒。该表面活性剂还可用于防止纳米颗粒表面上寡核苷酸类似物的非特异性吸附。在一些实施方式中，该表面活性剂是非离子型表面活性剂。能使用的其它类型的表面活性剂可包括但不限于阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂。特定的表面活性剂可单独使用或者可与其它表面活性剂联合使用。一类表面活性剂包含亲水性的头基和疏水性的尾部。与阴离子表面活性剂相关的亲水性头基包括羧酸盐/酯、磺酸盐/酯、硫酸盐/酯、磷酸盐/酯和膦酸盐/酯。与阳离子表面活性剂相关的亲水性头基包括季胺、锍和鏻。季胺包括季铵、吡啶鎓、联吡啶鎓和咪唑鎓。与非离子型表面活性剂相关的亲水性头基包括醇和酰胺。与两性离子表面活性剂相关的亲水性头基包括甜菜碱。所述疏水性的尾部通常包括烃链。该烃链通常包含约6个碳原子至约24个碳原子，更通常包含约8个碳原子至约16个碳原子。
示例性的阴离子表面活性剂包括烷基膦酸盐/酯、烷基醚磷酸盐/酯、烷基硫酸盐/酯、烷基醚硫酸盐/酯、烷基磺酸盐/酯、烷基醚磺酸盐/酯、羧酸醚、羧酸酯、烷基芳基磺酸盐/酯和磺基琥珀酸盐/酯。阴离子表面活性剂包括任何硫酸酯，如以商品名ULTRAFAX出售的硫酸酯，包括十二烷基硫酸钠、十二烷基醚硫酸钠(2EO)、十二烷基醚钠(sodium laureth)、十二烷基醚硫酸钠(3EO)、十二烷基硫酸铵、十二烷基醚硫酸铵、TEA-十二烷基硫酸酯、TEA-十二烷基醚硫酸酯、MEA-十二烷基硫酸酯、MEA-十二烷基醚硫酸酯、十二烷基硫酸钾、十二烷基醚硫酸钾、癸基硫酸钠、辛基/癸基硫酸钠、2-乙基己基硫酸钠、辛基硫酸钠、壬基酚聚醚-4-硫酸酯钠、壬基酚聚醚-6-硫酸酯钠、异丙基苯硫酸钠和壬基酚聚醚-6-硫酸铵；磺酸酯，如α-烯基磺酸钠、二甲苯磺酸铵、二甲苯磺酸钠、甲苯磺酸钠、十二烷基苯磺酸酯和木素磺酸酯；磺基琥珀酸酯表面活性剂，如十二烷基磺基琥珀酸酯二钠、十二烷基醚磺基琥珀酸酯二钠；及其它表面活性剂，包括椰油酰羟乙基磺酸钠、十二烷基磷酸酯、ULTRAPHOS系列的任何磷酸酯、
Figure BDA00002129062100091
609(N，N-双(2-羟乙基)-N-(3′-十二烷氧基-2′-羟丙基)甲基硫酸甲酯铵)及
Figure BDA00002129062100092
LS((3-月桂酰胺丙基)三甲基硫酸甲酯铵)，可购自Cytec Industries。
示例性的阳离子表面活性剂包括季铵盐，如十二烷基三甲基氯化铵、鲸蜡基(cetyl)三甲基溴化铵盐及鲸蜡基三甲基氯化铵盐、十六烷基三甲基溴化铵盐及十六烷基三甲基氯化铵盐、烷基二甲基苄基氯化铵盐及烷基二甲基苄基溴化铵盐等。
一类非离子型表面活性剂可包括那些包含聚醚基团的非离子型表面活性剂，所述聚醚基团基于例如环氧乙烷(EO)重复单元和/或环氧丙烷(PO)重复单元。这些表面活性剂一般是非离子型的。具有聚醚链的表面活性剂可包含约1个到约36个EO重复单元、约1个到约36个PO重复单元、或约1个到约36个EO重复单元和PO重复单元的组合。更典型地，该聚醚链可包含约2个到约24个EO重复单元、约2个到约24个PO重复单元、或约2个到约24个EO重复单元和PO重复单元的组合。甚至更典型地，该聚醚链可以包含约6个到约15个EO重复单元、约6个到约15个PO重复单元、或约6个到约15个EO重复单元和PO重复单元的组合。这些表面活性剂可包含EO重复单元及PO重复单元的嵌段，例如被两个PO重复单元嵌段包围的EO重复单元嵌段、或被两个EO重复单元嵌段包围的PO重复单元嵌段。另一类聚醚类表面活性剂可包含交替的PO重复单元及EO重复单元。这些类型的表面活性剂中有聚乙二醇、聚丙二醇及聚丙二醇/聚乙二醇。
另一类非离子型表面活性剂可包含建立在醇基基团或酚基基团上的EO、PO或EO/PO重复单元，如甘油醚、丁醇醚、戊醇醚、己醇醚、庚醇醚、辛醇醚、壬醇醚、癸醇醚、十二醇醚、十四醇醚、酚醚、烷基取代的酚醚、α-萘酚醚及β-萘酚醚。关于烷基取代的酚醚，其苯酚基团被具有约1个到约10个碳原子的烃链取代(如约8个碳原子(辛基苯酚)或约9个碳原子(壬基苯酚))。该聚醚链可包含约1个到约24个EO重复单元、约1个到约24个PO重复单元、或约1个到约24个EO重复单元和PO重复单元的组合。更典型地，该聚醚链包含约8个到约16个EO重复单元、约8个到约16个PO重复单元、或约8个到约16个EO重复单元和PO重复单元的组合。甚至更典型地，该聚醚链包含约9个、约10个、约11个或约12个EO重复单元；约9个、约10个、约11个或约12个PO重复单元；或约9个、约10个、约11个或约12个EO重复单元和PO重复单元的组合。
示例性的β-萘酚衍生的非离子型表面活性剂为Lugalvan BN012，所述Lugalvan BN012是具有连接至萘酚羟基的12个环氧乙烷单体单元的β-萘酚聚氧乙烯醚。类似的表面活性剂为Polymax NPA-15，所述PolymaxNPA-15为壬基酚聚氧乙烯醚。另一种表面活性剂是
Figure BDA00002129062100101
-X100非离子型表面活性剂，所述
Figure BDA00002129062100111
-X100非离子型表面活性剂是通常具有约9个或10个EO重复单元的辛基酚聚氧乙烯醚。其它可商购的非离子型表面活性剂包括可购自BASF的
Figure BDA00002129062100112
系列的表面活性剂。表面活性剂包括P系列的EO/PO嵌段共聚物，包括P65、P84、P85、P103、P104、P105和P123，可购自BASF；F系列的EO/PO嵌段共聚物，包括F108、F127、F38、F68、F77、F87、F88、F98，可购自BASF；及L系列的EO/PO嵌段共聚物，包括L10、L101、L121、L31、L35、L44、L61、L62、L64、L81和L92，可购自BASF。
其它可商购的非离子型表面活性剂包括可购自DuPont并以商品名
Figure BDA00002129062100114
出售的水溶性乙氧基化非离子型含氟表面活性剂，包括FSN(Telomar B单醚与聚乙二醇非离子型表面活性剂)、
Figure BDA00002129062100116
FSN-100、FS-300、
Figure BDA00002129062100118
FS-500、FS-510、
Figure BDA000021290621001110
FS-610、
Figure BDA000021290621001111
FSP和
Figure BDA000021290621001112
UR。尤其优选FSN(Telomar B单醚与聚乙二醇非离子型表面活性剂)。其它非离子型表面活性剂包括胺缩合物，如以商品名ULTRAFAX出售的椰油酰胺DEA和椰油酰胺MEA。其它类型的非离子型表面活性剂包括酸性乙氧基化的脂肪酸(聚乙氧基-酯)，该表面活性剂含有被聚醚基团酯化的脂肪酸，该聚醚基团一般地包含约1个到约36个EO重复单元。甘油酯在甘油基上包含1个、2个或3个脂肪酸基团。
术语“寡核苷酸类似物”是指具有：(i)修饰的骨架结构(例如在天然寡核苷酸及多核苷酸中发现的标准磷酸二酯键之外的骨架)；和(ii)任选地，修饰的糖部分(例如吗啉代部分，而不是核糖部分或脱氧核糖部分)的寡核苷酸。该类似物使得碱基能根据Watson-Crick碱基配对以氢键键合至标准的多核苷酸碱基，其中，该类似物的骨架以如下方式展现其碱基：使得所述氢键键合能够在寡核苷酸类似物分子和标准多核苷酸(例如单链RNA或单链DNA)的碱基之间以序列特异性的方式发生。例如，该类似物可以包括那些具有大体上不带电荷的含磷骨架的类似物。
寡核苷酸类似物中的大体上不带电荷的含磷骨架例如可为如下骨架：该骨架中的大部分(例如60-100％)亚基键合在生理pH下不带电荷，并且该骨架含有单个磷原子。该寡核苷酸类似物可包含与下文定义的靶核酸序列互补的核苷酸序列。本发明的寡核苷酸类似物为磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，其中，糖和磷酸骨架被由氨基磷酸酯连接的吗啉基团取代，核碱基(如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶)连接至吗啉环或其衍生物。
本文使用的术语“互补的”或“互补性”涉及两条不同的DNA或RNA链上的核苷酸/碱基的关系，或涉及寡核苷酸类似物的核苷酸序列与DNA/RNA链的核苷酸序列的核苷酸/碱基的关系，其中，所述碱基是配对的(例如通过Watson-Crick碱基配对：鸟嘌呤与胞嘧啶、腺嘌呤与胸腺嘧啶(DNA)或尿嘧啶(RNA))。因此，本文所述的至少一种寡核苷酸类似物可包含如下核苷酸序列：该核苷酸序列可通过传统的Watson-Crick碱基配对或其它非传统的配对类型(比如Hoogsteen氢键键合或反向Hoogsteen氢键键合)，与另一个核苷酸序列(例如DNA或RNA序列)在互补的核苷或核苷酸之间形成氢键。在本发明的上下文中，术语“使杂交”或“杂交”是指两条不同的DNA或RNA链之间、或寡核苷酸类似物的核苷酸序列和DNA/RNA序列的核苷酸序列的核苷酸/碱基之间，根据Watson-Crick DNA互补原则、Hoogsteen结合原则或本领域已知的其它序列特异性结合原则，通过氢键而进行的相互作用。在本发明的上下文中，本领域了解本文所述的寡核苷酸类似物的核苷酸序列不必与靶核酸序列100％互补以特异性杂交或者选择性杂交。此外，该寡核苷酸类似物可以在一个或多个区段上彼此杂交，由此使得位于其间的区段或相邻的区段不参与杂交事件(例如，环结构或发夹结构)。通过在可与第二个核酸分子形成氢键的核酸分子中的邻接残基的百分比来表示互补性。例如，如果第一个核酸分子具有10个核苷酸，第二个核酸分子具有10个核苷酸，那么在第一个核酸分子和第二个核酸分子之间5、6、7、8、9或10个核苷酸的碱基配对分别表示50％、60％、70％、80％、90％或100％的互补性，但不限于此。因此，在一些实施方式中，本文使用的寡核苷酸类似物可以为与靶核酸100％互补(即完全匹配)。在其它实施方式中，该寡核苷酸类似物可以为与靶核酸至少约95％互补、至少约85％互补、至少约70％互补、至少约65％互补、至少约55％互补、至少约45％互补或至少约30％互补。在一个实施方式中，“互补性”涉及仅通过Watson-Crick碱基配对的氢键键合。
本文所述的至少一种寡核苷酸类似物可以是磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)或其衍生物。在一些实施方式中，所述PMO或其衍生物的单体单元可以表示为式(I)：
Figure BDA00002129062100131
其中，P1为嘌呤或嘧啶碱基配对部分；X为NH2、NHR或NR2；其中，R为C1-C6烷基。术语“C1-C6烷基”是指包含1-6个碳原子的完全饱和脂肪烃。例如，该烷基可任选地被取代。在一些实施方式中，“C1-C6烷基”是指包含仅1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子的烷基。烷基的例子包括但是不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、叔戊基、戊基和己基等。
术语“任选地被取代”是指基团中的0个、1个或多于一个的氢原子被一个或多个基团取代的基团，所述取代基团相互独立地选自如下基团：烷基、杂烷基、卤代烷基、杂卤代烷基、环烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基、非芳族杂环、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、卤代、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰胺基(C-amido)、N-酰胺基、S-磺酰胺基、N-磺酰胺基、C-羧基、O-羧基、异氰酰基、氰硫基、异氰硫基、硝基、甲硅烷基、三卤代甲烷磺酰基以及氨基(包括单取代氨基和双取代氨基)。
术语“环烷基”是指完全饱和烃环。本发明所用环烷基基团可为C3至C8的范围。本发明的环烷基基团例如可任选地被取代。环烷基基团的例子包括但是不限于环丙基、环丁基、环戊基和环己基等。
术语“芳基”是指其中形成环的每一个原子均为碳原子的芳环。芳环可由5个、6个、7个、8个、9个或多于9个碳原子形成。芳基基团可任选地被取代。
术语“芳族”是指包含共价闭合平面环的基团，所述共价闭合平面环具有含有4n+2[pi]电子的离域[pi]-电子体系，其中n为整数。芳环可由5个、6个、7个、8个、9个或多于9个原子形成。芳族可任选地被取代。芳族基团的例子包括但是不限于苯基、萘基、菲基、蒽基、1，2，3，4-四氢-萘基(tetralinyl)、芴基、茚基和茚满基。术语“芳族”例如包括苯环型基团，该基团经由其中一个成环碳原子连接，并任选地带有一个或多个选自如下基团的取代基：芳基、杂芳基、环烷基、非芳族杂环、卤代、羟基、氨基、氰基、硝基、烷基酰胺基、酰基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、C1-C6氨基烷基、烷基氨基、烷基亚磺酰基、烷基亚硫酰基、烷基磺酰基、氨磺酰基或三氟甲基。在某些实施方式中，芳族基团在对位、间位和/或邻位的一个或多个位置上被取代。含有取代基的芳族基团的例子包括但是不限于苯基、3-卤代苯基、4-卤代苯基、3-羟苯基、4-羟苯基、3-氨苯基、4-氨苯基、3-甲苯基、4-甲苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、4-三氟甲氧基苯基、3-氰基苯基、4-氰基苯基、二甲基苯基、萘基、羟基萘基、羟甲基苯基、(三氟甲基)苯基、烷氧基苯基、4-吗啉-4-基苯基、4-吡咯烷-1-基苯基、4-吡唑基苯基、4-三唑基苯基及4-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯基。
术语“芳基烷基”是指包含连接至烷基的芳基基团。
术语“杂芳基”是指芳族杂环。杂芳基环可由3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或多于9个原子形成。杂芳基可任选地被取代。杂芳基基团的例子包括但是不限于芳族C3-8杂环基团，该杂环基团包含一个氧原子或硫原子或多至四个氮原子、或该杂环基团包含一个氧原子或硫原子及多至两个氮原子的组合；以及它们的取代衍生物和苯并稠合衍生物、吡啶并稠合衍生物(例如经由其中一个成环碳原子连接)。
术语“非芳族杂环”是指包含非芳族环的基团，其中，形成该环的一个或多个原子为杂原子。非芳族杂环可由3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或多于9个原子形成。非芳族杂环可任选地被取代。在某些实施方式中，非芳族杂环包含一个或多个羰基基团或硫代羰基基团，例如含氧和含硫的基团。非芳族杂环的例子包括但是不限于内酰胺、内酯、环酰亚胺、环硫代酰亚胺、环氨基甲酸酯、四氢噻喃、4H-吡喃、四氢吡喃、1，3-二噁烷、1，4-二噁英、1，4-二噁烷、哌嗪、1，3-氧硫杂环己烷、1，4-氧硫杂环己烷、四氢-1，4-噻嗪、2H-1，2-噁嗪、顺丁烯二酰亚胺、琥珀酰亚胺、巴比妥酸、硫代巴比妥酸、二氧代哌嗪、乙内酰脲(hydantom)、二氢尿嘧啶、吗啡酮、三噁烷、六氢化-1，3，5-三嗪、四氢噻吩、四氢呋喃、吡咯啉、吡咯烷、吡啶酮、吡咯烷酮、吡唑酮、吡唑烷、咪唑啉、咪唑烷、1，3-间二氧杂环戊烯、1，3-二氧戊环、1，3-二硫杂环戊烯、1，3-二硫戊环、异噁唑啉、异噁唑烷、噁唑啉、噁唑烷、噁唑烷酮、噻唑啉、噻唑烷和1，3-氧硫杂环戊烷。
术语“杂原子”是指除碳原子或氢原子之外的原子。杂原子通常独立地选自于氧原子、硫原子、氮原子和磷原子，但不限于这些原子。在存在两个或更多个杂原子的实施方式中，该两个或更多个杂原子可以都与彼此相同，或该两个或更多个杂原子中的有些杂原子或全部杂原子可以各自与其它杂原子不同。
术语“O-羧基”是指式R′(＝O)O的基团。
术语“C-羧基”是指式-C(＝O)OR′的基团。
术语“乙酰基”是指式-C(＝O)CH3的基团。
术语“三卤代甲烷磺酰基”是指式X3CS(＝O)2-的基团，其中X为卤素。
术语“氰基”是指式-CN的基团。
术语“异氰酰基”是指式-NCO的基团。
术语“氰硫基”是指式-CNS的基团。
术语“异氰硫基”是指式-NCS的基团。
术语“S-磺酰胺基”是指式-S(＝O)2NR′的基团。
术语“N-磺酰胺基”是指式R′S(＝O)2NH-的基团。
术语“O-氨基甲酰基”是指式-OC(＝O)-NR′的基团。
术语“N-氨基甲酰基”是指式R′OC(＝O)NH-的基团。
术语“O-硫代氨基甲酰基”是指式-OC(＝S)-NR′的基团。
术语“N-硫代氨基甲酰基”是指式R′OC(＝S)NH-的基团。
术语“C-酰胺基”是指式-C(＝O)-NR′2的基团。
术语“N-酰胺基”是指式R′C(＝O)NH-的基团。
以自身出现而不带有数字标识的取代基“R′”是指选自于如下基团的取代基：烷基、环烷基、芳基、杂芳基(通过环碳原子连接)和非芳族杂环(通过环碳原子连接)。
在某些实施方式中，X为NR2，R为甲基。
在有些实施方式中，嘌呤或嘧啶碱基配对部分(P1)选自于由胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶组成的组。该嘌呤或嘧啶碱基配对部分在PMO的不同单体单元间可以不同。
在其它实施方式中，该嘌呤或嘧啶碱基配对部分选自于核碱基类似物(如次黄嘌呤或黄嘌呤)。
寡核苷酸类似物的“单体单元”是指该寡核苷酸类似物的一个核苷酸单元。
本文所述的寡核苷酸类似物的长度可以包含约5个单体单元至约40个单体单元；约10个单体单元至约35个单体单元；或约15个单体单元至约35个单体单元。
在一些实施方式中，本发明的缀合物用于至少一种靶核酸分子的检测，其中，所述至少一种寡核苷酸类似物可包含靶互补序列。在其它实施方式中，所述至少一种寡核苷酸类似物可以包含非靶互补序列(targetnon-complementary sequence)。
所述“非靶互补序列”可具有不干扰靶互补序列杂交至靶核酸分子的能力的任何序列。例如，该非靶互补序列与寡核苷酸类似物的剩余部分(即靶互补区域)不互补，或与靶核酸分子的剩余部分不互补。可将该非靶互补序列选择为不形成分子内二级结构。可将该寡核苷酸类似物的非靶互补序列设计为连接至纳米颗粒，从而使得该寡核苷酸类似物的靶互补序列与纳米颗粒的表面间隔开，并且更易与靶核酸分子杂交。本领域技术人员已知根据经验能够确定将靶互补序列与纳米颗粒有效间隔开的所述非靶互补序列的长度和序列。该非靶互补序列可以包含约10至30个单体单元，或可以具有约6、7、8、9或10个单体单元。
所述“靶互补序列”涉及可以与包含在靶核酸分子中的序列杂交的序列片段(sequence stretch)。对互补性的程度进行选择，以使靶互补序列在杂交条件(如高严格杂交条件)下杂交至靶。杂交优选经由Watson-Crick碱基对发生。
本文所用的与PMO相关的术语“衍生物”涉及PMO的化学衍生物，其中，例如吗啉环进一步带有取代基、或氨基磷酸酯基团被取代或被修饰(例如通过其它原子或基团替换一个或两个氧原子；或通过合适的取代基取代氮原子)。
在某些实施方式中，本文所述的寡核苷酸类似物可以包含任何下列碱基序列：
MO1：5′-CGG ACT ATG GAC ACC TTT TTT TTT T-3′-二硫酰胺(SEQID NO：1)
MO1 SNP：5′-CGG ACT AGG GAC ACC TTT TTT TTT T-3′-二硫酰胺(SEQ ID NO：2)
MO2：5′-AAC CAC ACA ACC TAC TTT TTT TTT T-3′-二硫酰胺(SEQID NO：3)
在某些实施方式中，该寡核苷酸类似物经由官能团共价结合至纳米颗粒。所述官能团一般包含于寡核苷酸类似物的间隔部分，用于与纳米颗粒共价连接。在一些实施方式中，该官能团可包括巯基(SH)基团，该基团例如可被用来共价连接至纳米颗粒表面。然而，还可以使用其它官能团。在3′端或5′端利用巯基官能化的寡核苷酸可以很容易地连接到金纳米颗粒。参见例如Mucic等，Chem.Commun.555-557(1996)，其中描述了将3′巯基DNA连接到平的金表面的方法。也可用该巯基部分把寡核苷酸连接至其它金属钠米颗粒、半导体钠米颗粒和磁性胶体钠米颗粒以及本文所述的其它类型的纳米颗粒。用于把寡核苷酸连接在固体表面的其它官能团包括硫代磷酸酯基团(参见例如，用于将寡核苷酸-硫代磷酸酯连接至金表面的美国专利号5,472,881)、取代的烷基硅氧烷(参见例如Grabar等，Anal.Chem.，67，735-743)。具有5′硫代核苷或3′硫代核苷的寡核苷酸也可用于把寡核苷酸连接至固体表面。本领域技术人员已知的可用于将寡核苷酸类似物连接至纳米颗粒的其它官能团可以包括但是不限于二硫化物(如二硫酰胺)；羧酸；芳环化合物；环丁砜；亚砜；硅烷，但不限于此。
在一些实施方式中，该至少一种寡核苷酸类似物经由它的3′端或5′端结合至纳米颗粒。
在一些实施方式中，本发明的缀合物包含多于一种寡核苷酸类似物，其中，所述多于一种寡核苷酸类似物具有不同的碱基序列。
在一些实施方式中，本发明的缀合物用于至少一种靶核酸分子的检测，其中，所述多于一种寡核苷酸类似物具有不同的靶互补序列。
本发明还提供用于检测靶核酸分子的方法。该方法包括如下步骤：i)在能够使至少一种缀合物与靶核酸分子彼此杂交的条件下，将所述至少一种缀合物与包含所述靶核酸分子的样品接触，以形成缀合物：靶核酸分子复合物；及ii)检测所形成的复合物。在本发明的上下文中，可通过如下方法检测该缀合物：靶核酸分子复合物：例如用肉眼观察分析中的比色变化；或例如利用分光光度计(例如UV-Vis分光光度计或IR分光光度计)，测量可见光区、紫外区或红外区的光吸收；或本领域已知的其它任何合适的方法。通过观察分析中的比色变化对所述缀合物：靶核酸分子复合物进行的检测是以纳米颗粒的光学性质(等离子共振)为基础的。这样的纳米颗粒(例如金属纳米颗粒)对周围介质的变化很敏感。例如，当通过肉眼检测该缀合物：靶核酸分子复合物时，可以通过颜色变化检测该复合物。该颜色变化例如可以是纳米颗粒在靶核酸分子存在的情况下聚集的结果。例如，用肉眼对颜色变化进行的观察在对比色背景下进行。例如，当使用金纳米颗粒时，通过将含有所述缀合物：靶核酸分子复合物的样品点样至固体白色表面(例如但不限于二氧化硅或氧化铝TLC板、滤纸、硝酸纤维素膜、尼龙膜或C-18二氧化硅TLC板)并让该点变十，可以促进对颜色变化的观察。包含该缀合物：靶核酸分子复合物的溶液颜色取决于靶核酸分子与缀合物杂交的程度，通常为粉红色/红色至紫红色/紫色。
在一些实施方式中，可将一种缀合物用于复合物的形成及检测。在本发明的上下文中，所述缀合物：靶核酸分子复合物例如可在浓度为约50mM至约500mM的电解质存在的情况下进行检测。不希望受理论的约束，在含有混合序列的样品中识别特异性核酸时，使用一种缀合物检测靶核酸的方法可产生高选择性。此外，发现使用本发明的方法检测核酸的高选择性远高于本领域中已知的其它杂交探针的选择性。已经发现可检测到低至0.5nM的靶浓度。因此，本发明的方法可用于罕见的体细胞点突变的检测。
在一些实施方式中，可将至少两种不同的缀合物用于复合物的形成及检测。在这样的实施方式中，两种不同的缀合物可包含它们的靶互补区域不同的寡核苷酸类似物。在一个实施方式中，所述两种缀合物的靶互补区域结合至同一靶核酸的不同序列片段。这导致经由靶核酸分子引起的所述缀合物的交联。已经发现通过像这样使用两种不同的缀合物用于复合物形成及检测，可以在极低的盐条件(例如0至5mM电解质)下检测靶核酸。尤其当靶核酸含有稳定的二级结构时，这些极低的盐条件极大简化了对核酸分析的严格控制。运用本方法，可检测低至2nM的靶浓度。在本方法的一个实施方式中，该方法可以进一步包括冷冻样品的步骤以加速交联。
本文使用的术语“核酸分子”是指至少两个碱基-糖-磷酸组合的序列的专业术语。核苷酸是核酸聚合物的单体单元。核酸分子可包括脱氧核糖核酸(DNA)、寡核苷酸形式的核糖核酸(RNA)、信使RNA、反义核酸、质粒DNA、质粒DNA的一部分或来源于例如病毒的遗传物质。RNA可以为如下形式：tRNA(转运RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA及核酶。DNA可以为如下形式：质粒DNA、病毒DNA、线性DNA或染色体DNA，或这些DNA的衍生物。另外，这些形式的DNA及RNA可以是单链、双链、三链或四链。因此，该核酸分子还可涉及包括一级结构、二级结构、三级结构或四级结构的任何结构。所述核酸分子还包括PNA(肽核酸)、硫代磷酸酯及其它天然核酸的磷酸骨架的变体。
本文使用的核酸分子可为来源于任何生物机体的遗传物质，所述遗传物质包含能够完全表征该有机体的特异信息。本文使用的核酸分子例如可以来源自个体的基因组。这样的核酸分子可以在特异的核苷酸序列中含有单核苷酸变异，例如单核苷酸多态性(SNP)。特异的核苷酸序列中的其它变异可包括但是不限于单个或者多个核苷酸的插入、缺失或重复。SNP遍及整个人类基因组，并且例如可存在于蛋白质编码区，在编码区中，蛋白质的性质和/或表达可被改变。SNP还可以存在于非编码区，在非编码区中，它们能够改变表达参数并修饰基因表达(例如外显子剪切或拼接)。不调节蛋白质的性质和/或表达的其它SNP例如可以改变信使RNA的稳定性、成熟和定位。
本文使用的术语“靶核酸分子”是指包含能够杂交至本发明的至少一种缀合物的核苷酸序列的核酸分子。因此，该靶核酸分子例如可以杂交至与纳米颗粒共价相连的磷酰二胺吗啉代寡核苷酸或其衍生物的靶互补序列。该靶核酸分子例如可以包含至少一个单核苷酸多态性。
在某些实施方式中，可以使用至少两种不同的缀合物来形成并检测缀合物：靶核酸分子复合物。例如，靶核酸分子的不同区域例如可杂交至至少两种不同的缀合物。
只要靶核酸分子的量足够运用本发明的方法检测，则可使用任何浓度的靶核酸分子。该靶核酸分子的浓度范围可以为约0.05nM至约2000nM；约0.05nM至约1500nM；约0.05nM至约1200nM；约0.05nM至约1000nM；约0.05nM至约800nM；约0.05nM至约500nM；约0.05nM至约200nM；约0.05nM至约100nM；约0.05nM至约50nM；约0.05nM至约20nM；约0.1nM至约10nM；约0.1nM至约100nM；约5nM至约100nM；约5nM至约50nM；约10nM至约50nM；或约20nM至约50nM。
下表1提供了在本发明中使用的靶核酸分子的非限制性实例。
表1：特异性序列由下划线示出。SNP位置由黑体突出。
Figure BDA00002129062100211
*具有二级结构的DNA靶。有10碱基对发夹结构的DNA靶的序列(配对碱基由下划线示出)。
在一些实施方式中，在电解质存在的情况下检测靶核酸分子。本文使用的术语“电解质”是指包含电解质固体(例如游离的离子)的任何材料或物质。该物质或材料例如可以为液态形式，包含溶液中的离子、靶核酸和至少一种缀合物。代表性的离子可以包括但不限于钠、钾、钙、镁、氯化物、磷酸根和重碳酸根。可使用的示例性的电解质包括但不限于NaCl、MgCl2、NiCl2、NaBr、ZnCl2、MnCl2、BrCl、CdCl2、CaCl2、CoCl2、CoCl3、CuCl2、CuCl、PbCl2、PtCl2、PtCl4、KCl、RbCl、AgCl、SnCl2、BrF、LiBr、KBr、AgBr、NaNO2、Na3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、KH2PO4或K2HPO4。
在一些实施方式中，使用的电解质的浓度范围可以为约0mM至约700mM；约0mM至约650mM；约0mM至约500mM；约10mM至约700mM；约20mM至约600mM；约50mM至约500mM；约1mM至约250mM；约1mM至约200mM；约1mM至约150mM；约1mM至约80mM；约1mM至约50mM；约5mM至约250mM；约10mM至约250mM；约20mM至约250mM；约50mM至约250mM；约80mM至约250mM；或约100mM至约250mM。
本发明还提供了在靶核酸分子中检测至少一个单核苷酸多态性的方法。该方法包括如下步骤：i)使所述靶核酸分子与至少一种缀合物接触，以形成缀合物：靶核酸分子复合物；ii)测量所述缀合物：靶核酸分子复合物的解链转变温度；以及iii)将在ii)中测量的复合物的解链转变温度与对照复合物的解链转变温度进行比较，其中，如果与对照复合物相比，该缀合物复合物具有较低的解链转变温度，这表明该靶核酸分子包含至少一个单核苷酸多态性。
在一些实施方式中，所述对照复合物包含不含有单核苷酸多态性的靶核酸分子。
术语“缀合物：靶核酸分子复合物”可以包含至少一种缀合物，其中，与纳米颗粒共价连接的至少一种磷酰二胺吗啉代寡核苷酸或其衍生物杂交至靶核酸分子。在一些实施方式中，该缀合物：靶核酸分子复合物还可以包含杂交至靶核酸分子的至少两种不同的缀合物。该缀合物：靶核酸分子复合物在靶核酸分子中例如可以包含至少一个单核苷酸多态性。
术语“解链转变温度”(Tm)是指测量到半最大吸光度时的温度。所述缀合物：靶核酸分子复合物的解链图形例如可由以下方式得到：在给定温度下孵育半小时后，测量达到相对稳定的值时的溶液吸光度。该解链图形可以使用带有温控仪的分光光度计获得。在本发明的上下文中，不希望受理论的约束，本文所述的缀合物：靶核酸分子复合物的稳定性取决于连接于纳米颗粒的靶DNA链的量。例如参照图6和图7，随着温度升高，DNA和PMO双链体的初始解离可能不引起纳米颗粒的聚集。只有当结合的核酸数降低到特定阈值以下时，由London-范德华吸引力引起的纳米颗粒的聚集才能够开始进行聚集。因此，少量DNA的初始释放(状态a到b)对光学信号的影响很小。一旦纳米颗粒开始聚集，可形成大尺寸的颗粒(状态c到d)。质量的增加及表面电荷密度的降低使得该较大粒子甚至更不稳定，并趋向于进一步聚集，直到从溶液沉淀出来(状态e)。不同于溶液中游离DNA-MO双链体的可逆形成及解离，缀合物：靶核酸分子复合物的解链转变是不可逆的，聚集可以迅速进行。结果，可以获得发生在例如1℃内的极其尖锐的解链曲线。
本发明也提供了本文所述的至少一种缀合物在靶核酸分子检测中的用途。在一些实施方式中，该靶核酸分子可以包含至少一个单核苷酸多态性。
本发明进一步提供了用于靶核酸分子检测的试剂盒。该试剂盒可以包含本文所述的至少一种缀合物。在一些实施方式中，该试剂盒可以包含一种或多种对照核酸分子，所述对照核酸分子与所述缀合物的至少一种寡核苷酸类似物的靶互补序列完全互补。在其它实施方式中，该试剂盒可以包含所述缀合物的至少一种寡核苷酸类似物的至少一种非靶互补序列。该试剂盒还可以包含一种或多种溶液，例如杂交缓冲液。该杂交缓冲液例如可包括但是不限于磷酸盐、柠檬酸盐、Tris、Hepes(4-(2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸)、TAPS(N-三羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、PIPES(哌嗪-1，4-二(2-乙磺酸)缓冲液、超级溶质(hypersolutes)(例如甘露糖基甘油酸盐/酯)或任何其它缓冲溶液(任选地含有变性剂、盐、惰性聚合物、表面活性剂等)。该试剂盒中的一种或多种溶液还可以包含本文所述的任何一种电解质。该试剂盒中的一种或多种溶液可以供应于一个或多个微孔板(例如384孔微孔板)的孔中，或供应于容器中以供随后应用于微孔板的孔中。
本文所述的发明可适宜地在缺少本文未特别公开的任意单个要素或多个要素、单个限制因素或多个限制因素时加以实施。因此，例如，术语“包含/包括/含有”(comprising/including/containing)等应该开放地及非限制性地理解。此外，本文使用的术语和表述被用作描述性的术语，而非限制性的术语，所述术语和表述的使用并不旨在排除这些术语和表述显示或记载的特征的任何等同特征或其一部分，但是应该认识到，在本发明请求保护的范围内的任何修改都是可以的。因此，应当明白，尽管已通过优选的实施方式和可选的特征具体公开了本发明，本领域技术人员仍可以采用此处所公开的其所包含的本发明的修改和变化，并且这些修改和变化被视为落入本发明的范围内。
本文已经对本发明进行了宽泛和一般性的描述。落入该一般性公开内容的每种范围较窄的形式和下位群组也构成本发明的一部分。这包括了利用但书和否定式限定从大类中排除了任何主题的本发明的上位说明，无论本文中是否对所排除的材料进行了具体叙述。
其它实施方式也落入下述权利要求和非限制性实施例内。此外，一旦本发明的特征和方面是以马库什组的方式进行描述，本领域技术人员将认识到，本发明也因此将以马库什组中任意的单个成员或成员亚组的方式进行描述。
实施例
实施例1：材料
化学试剂：四氯金(III)酸三水合物(HAuCl4·3H2O)、柠檬酸三钠、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)、Zonyl FSN-100(F(CF2CF2)3-8CH2CH2O(CH2CH2O)0-15H)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)及二硫苏糖醇(DTT)购自Sigma-Aldrich(St Louis，MO)。40-nm银纳米颗粒购自Ted Pella(Redding，CA)。其它所有经认证为分析纯的试剂均以其收到时的状态使用。吗啉代寡聚物购自Gene Tools LLC(Philomath，OR)。寡核苷酸自1st Base Pte Ltd(新加坡)获得。
仪器：用NanoDropTM1000分光光度计(Thermo Scientific)进行吗啉代寡核苷酸及ssDNA样品的定量。用Agilent G1103A UV-Vis分光光度计采集金纳米颗粒胶体的吸收光谱。该分光光度计也被用于解链分析。在微孔板酶标仪(Safire2微孔板酶标仪，Tecan Group Ltd，瑞士)上进行使用384孔微孔板的吸光度测量。用Eppendorf离心机5415R进行金纳米颗粒的离心。
实施例2：金纳米颗粒的合成
如Grabar，K.C.等，Anal.Chem.，1995，67，735-743所描述的，通过用柠檬酸盐还原HAuCl4来制备平均直径分别为～40nm及～13nm的金纳米颗粒。用来制备金纳米颗粒的所有玻璃器皿都要依次用新制备的王水(HNO3∶HCl＝1∶3)彻底清洗、并用超纯水充分漂洗，然后在100℃烘箱内干燥2-3个小时。将60mL 0.01％(w/v)HAuCl4在带有回流冷凝装置的圆底烧瓶中煮沸并剧烈搅拌。对于平均直径为～40nm的金纳米颗粒，添加0.6mL 1.0％(w/v)柠檬酸钠至HAuCl4溶液。对于平均直径为～13nm的金纳米颗粒，添加4.5mL 1.0wt％柠檬酸钠至HAuCl4溶液中。使反应混合物维持在沸点并持续搅拌约15分钟。于4℃储存该悬浮液直至后续使用。假定球状颗粒及相当于块材金(bulk gold)的密度(19.30g/cm3)，计算该金纳米颗粒的浓度及表面等离子体共振(SPR)吸收的消光系数(ε)(40-nm金纳米颗粒，～0.14nM，530nm处的ε＝8.57×109L/(mol·cm))。通过向胶体溶液中添加～0.05wt％FSN完成利用FSN进行的金纳米颗粒和银纳米颗粒(～40nm)的封端。通过添加0.6mL 2wt％FSN-100完成利用FSN进行的金纳米颗粒(～13nm)的封端。
实施例3：巯基化吗啉代寡核苷酸修饰的金属纳米颗粒的制备
通过活化巯基，利用0.2M磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 8.0)中的0.1MDTT处理3’端经二硫酰胺修饰的MO 1小时；然后利用NAP-5柱(GEHealthcare)纯化该巯基化MO。该纯化的巯基化MO样品被储存在4℃直到后续使用。为了避免该巯基化MO链间形成二硫化物，在该纯化的MO与金纳米颗粒或银纳米颗粒混合之前，将其在5mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)(pH 7.5)中孵育10分钟。除非另有说明，使该含有～2μM巯基化MO、～2nM或4nM FSN封端的纳米颗粒、～0.1wt％SDS及10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)的混合物溶液在室温下孵育1小时或2小时。然后，过量的ssDNA经7.0K rpm离心10分钟去除。未反应的MO经10.0Krpm离心10分钟去除。用5mM PBS或2mM Tris缓冲溶液(pH 7.5)重悬MO-纳米颗粒缀合物。至少重复该处理五次以完全去除未反应的MO。通过用标准比色杯测量532nm处的SPR吸光度来确定该纳米颗粒缀合物的终浓度。通过比尔定律(A＝εlc)将吸光度与纳米颗粒浓度相关联。使用524nm处的ε值(1.5×108L/(mol·cm))。
实施例4：金纳米颗粒上负载的吗啉代寡核苷酸的定量
通过利用UV-可见光分光光度计测量缀合物溶液的吸光度确定纳米颗粒缀合物的浓度。通过比尔定律(A＝εlc)将最大表面等离子共振(SPR)吸收值与纳米颗粒浓度相关联。
在将纳米颗粒与如实施例3所提供的MO进行孵育之后，对该混合物溶液进行离心并收集上清。将260nm或265nm处的吸光度用于确定上清中游离MO的浓度，根据剩余的游离MO和起始添加的MO间的浓度差来计算固定于纳米颗粒上的MO的量。所有测量至少重复3次。
实施例5：缀合物：靶核酸分子复合物解链特性的研究
使用带有温控仪的分光光度计(Agilent G1103A)进行解链研究。温度精确度为±0.3℃。对于溶液中的游离DNA/MO双链体，温度以1℃的间隔从25℃升至80℃，在各次测量前的各个点，使温度保持1分钟。对于纳米颗粒缀合物，温度在解链转变发生的窄范围(～5℃)内以0.5℃的间隔变化。在各个点，使用新鲜样品，每次测量前的平衡时间为30分钟。因为解链转变发生在～1℃内，Tm值被确定为转变的中点。
实施例6：在提高的DNA靶浓度中对负载有吗啉代寡核苷酸的金纳米颗粒的平均ζ电位的研究
MO负载至金纳米颗粒导致颗粒表面电荷显著变化。在MO连接后，金纳米颗粒的平均ζ电位极大下降。
表2显示了在与浓度提高的靶DNA杂交后纳米颗粒负电荷的增加。当DNA序列与MO探针不互补时，未测量到纳米颗粒表面电荷的明显变化。随着更多靶ssDNA链被连接，纳米颗粒的稳定性明显提高。在5nMDNA靶存在的情况下，添加50mM NaCl后缀合物仍然稳定，表明足够量的DNA链杂交至该纳米颗粒缀合物。当DNA靶浓度较低时，杂交DNA的量减少并且缀合物较不稳定。
表2.40nm金纳米颗粒的ζ电位。
Figure BDA00002129062100261
实施例7：在不同DNA靶浓度下预测的SNP鉴别能力
在很宽的靶浓度范围内检测与PM(PM1)和SNP(SNP1)靶杂交的缀合物的Tm值。图9显示每个Tm曲线可被分成两个区域。随着靶浓度增加，Tm值作为靶浓度对数的函数几乎是线性上升。当靶浓度高于1μM时，该Tm曲线趋于平稳，表明Tm变得对靶浓度提高较不敏感。
表3.在不同PM靶浓度下预测的检测选择性。
  [PM]   5nM   20nM   50nM   100nM
  α   8   26   335   1627
对于PM靶，等式1在5-500nM的浓度范围成立。当PM浓度高于500nM时，等式2成立。
Tm/PM＝3.31Ln[PM]+35.78    (1)
Tm/PM＝1.11Ln[PM]+49.86    (2)
对于SNP靶，等式3和等式4分别在5-1000nM及＞1000nM的浓度范围内成立。
Tm/SNP＝2.18Ln[SNP]+31.05    (3)
Tm/SNP＝0.88Ln[SNP]+39.94    (4)
在特定浓度的PM靶存在的情况下，在T＝Tm/PM-0.5℃时无法观察到颜色变化。在同样的温度，不能稳定缀合物(即Tm/SNP＝T-0.5℃)的最高SNP浓度可以由等式3及等式4获得。根据PM及SNP体系的稳定性差异，可由等式5估计在SNP靶存在下检测PM靶的选择性因子(α)。
α＝[SNP](Tm＝T-0.5℃)/[PM](Tm＝T+0.5℃)    (5)
如上所述，表3显示该方法在不同的PM靶浓度下预测的SNP鉴别能力。因为SNP曲线在较高浓度时趋于平稳(图9)，当靶PM的浓度接近或高于50nM时，检测选择性变得极其高(α＞200∶1)。
实施例8：竞争分析
为了证实根据实施例7的非常高的选择性，在48.5℃下进行了竞争分析。缀合物溶液的一个等份含有10μM SNP靶，而另一等份含有10μMSNP靶和50nM PM靶。在孵育0.5小时后，观察到明显的颜色差异(图10)。在PM靶存在时，未观察到颜色变化；而在PM靶不存在时，溶液变得几乎无色。该实验中的选择性因子为～200∶1。
实施例9：与DNA靶(PM)及带有SNP的DNA靶杂交的缀合物的Tm值
与PM和不同SNP(100nM靶)杂交的缀合物的Tm值在表4中示出。这些体系的稳定性顺序，即T-A＞T-G＞T-T～T-C，与Watson-Crick碱基对的稳定性预测顺序一致。完全匹配和SNP体系间Tm的差异(ΔTm，PM-SNP)通常为～10℃，所述差异使得能够精确检测单碱基替换。
表4与PM和不同SNP(100nM靶)杂交的MO/纳米颗粒缀合物的解链温度
  靶   PM1(T-A)  SNP2(T-G)  SNP3(T-T)  SNP1(T-C)
  Tm±0.5(℃)   51.5  42  41  41
实施例10：纯合体和杂合体基因分型的识别
制备根据实施例3的吗啉代寡核苷酸和40nm银纳米颗粒的缀合物，以检测在特定基因座处的SNP的两个等位基因(即，野生型等位基因和该等位基因的突变体)。银纳米颗粒缀合物在～420nm处显示吸收峰，很好地区别于40nm金纳米颗粒缀合物的吸收峰。图12显示分散的和聚集的MO1/银纳米颗粒缀合物(在与200nM NaCl孵育0.5小时后获得聚集)的UV-Vis光谱特征。观察到响应DNA靶的银纳米颗粒体系的类似特征。因此，如果金纳米颗粒和银纳米颗粒分别经PM和突变体吗啉代寡核苷酸探针(MO1SNP)官能化，该方法可用来识别个体的基因型。如图13所示，当样品仅由PM靶组成，金纳米颗粒在538nm处的吸收峰维持，而银纳米颗粒在410nm处的吸收峰消失(谱线2)。与之相反，在SNP样品的情况下，仅观察到银纳米颗粒吸收峰(谱线3)。当样品同时含有PM靶和SNP靶时，检测到两个吸收峰(谱线1)。显然地，该方法可用于识别纯合体和杂合体的基因型。
实施例11：巯基化吗啉代寡核苷酸修饰的金属纳米颗粒的制备以及两种MO/金纳米颗粒缀合物与DNA靶的杂交
通过将巯基化的25个碱基的MO固定在金纳米颗粒(平均直径13nm)上制备纳米颗粒缀合物。在此使用的每条MO链同时含有10个碱基(T10)的间隔区和用于杂交的15个碱基的特异性序列。通过在室温下孵育巯基化MO和金纳米颗粒混合溶液2小时来进行MO的负载。为了最大限度减少在纳米颗粒表面上MO的非特异性吸附，在与巯基化MO混合前，用非离子含氟表面活性剂(例如Zonyl FSN)为该金纳米颗粒封端。所得纳米颗粒缀合物分散在2mM Tris缓冲溶液中(图14b)。该纳米颗粒的表面电荷大约为-20mV。当在5℃储存时，该缀合物溶液至少在3个月内保持稳定。设计两套纳米颗粒缀合物(探针1和探针2)，以使DNA靶可以通过与结合有纳米颗粒的MO序列杂交，作为接头连接一对纳米颗粒探针(图14a)。
制备含有5mM NaCl的DNA靶和探针1及探针2(在2mM Tris缓冲溶液中，各含～2nM)的溶液。用于本方法的DNA靶为从表1处获得。在室温下孵育24小时后，未观察到溶液颜色变化。然而，冷冻-融化处理后，即干冰浴冷冻该溶液(10分钟)并随后在室温下融化，溶液颜色从红色变为紫色或灰色，表明靶连接的较大颗粒的形成(图14b)。不希望受理论的约束，由DNA靶引起的MO/纳米颗粒缀合物的交联由冷冻步骤加快。这可归因于靶和MO/纳米颗粒探针在冰结构中的袋内的局部高浓度。在无DNA链存在或所添加的DNA的序列为随机的对照实验中，探针不聚集并且未观察到溶液颜色变化。这些结果表明结合有纳米颗粒的MO和DNA靶之间的杂交在低盐缓冲溶液中发生，并且由于纳米颗粒探针的LSPR光谱变化，使得配对事件肉眼可见。该分析方式不需要对杂交条件的严格控制，可大大简化核酸检测。
实施例12：DNA靶-交联的MO/纳米颗粒聚集体的解链特性的研究。
DNA靶-交联的MO/纳米颗粒聚集体的形成是可逆的。随着温度上升，DNA-MO双链体的解链导致纳米颗粒探针再次分散，因而溶液颜色变回红色。图15显示随着解链转变发生的溶液光谱变化。PM靶的Tm值是～40.5℃。该解链曲线很尖锐。该解链图形的一阶导数的半最大值的全宽度(FWHM)为～3.3℃。根据这些结果，甚至在非常低盐的条件下，DNA连接的聚集体的解离发生在窄温度范围内。
由于尖锐的解链转变，完全匹配序列可以明确地从单碱基错配链中区别出来(图15)。表5显示了不同序列的Tm和FWHM值。单碱基替换通常使Tm降低～12-14℃。根据Tm差异，MO-靶双链体碱基对稳定性的顺序是C:G＞C:T＞C:A＞C:C，这与本领域已知的针对DNA双链观察到的错配碱基的不稳定效应很好地吻合。一个碱基缺失导致Tm值降低14.3℃，而一个碱基插入对于杂合链稳定性的影响小得多(Tm降低3.3℃)。
为了检测二级结构对于靶序列可利用性的可能影响，用具有10个碱基对发夹结构的DNA链与纳米颗粒探针反应。在低盐条件(5mM NaCl)下，已观察到探针溶液清楚的颜色变化，表明二级结构无法稳定形成，杂交反应成功地进行。
表5.解链温度值和解链图形的一阶导数的半最大值的全宽度值
Figure BDA00002129062100301
Figure IDA00002129063000011
Figure IDA00002129063000021
Figure IDA00002129063000031

Claims (34)

1.一种包含纳米颗粒和至少一种寡核苷酸类似物的缀合物，其中，所述至少一种寡核苷酸类似物是磷酰二胺吗啉代寡核苷酸（PMO）或其衍生物，所述寡核苷酸类似物共价连接至所述纳米颗粒。
2.权利要求1所述的缀合物，其中，所述纳米颗粒是金属纳米颗粒。
3.权利要求2所述的缀合物，其中，所述金属是贵金属。
4.权利要求3所述的缀合物，其中，所述贵金属选自于由银、金、铂、钯、钌、锇、铱以及它们的混合物所组成的组。
5.权利要求1-4中任一项所述的缀合物，其中，所述纳米颗粒的直径在约1nm至约100nm的范围内。
6.权利要求1-5中任一项所述的缀合物，其中，所述纳米颗粒包含表面活性剂。
7.权利要求6所述的缀合物，其中，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。
8.权利要求7所述的缀合物，其中，所述非离子型表面活性剂是含氟表面活性剂。
9.权利要求1-8中任一项所述的缀合物，其中，所述磷酰二胺吗啉代寡核苷酸或其衍生物的单体单元表示为式（I）：
其中，
P1为嘌呤或嘧啶碱基配对部分；以及
X为NH2、NHR或NR2；其中，R为C1-C6烷基。
10.权利要求9所述的缀合物，其中，X为NR2；R为甲基。
11.权利要求9或10所述的缀合物，其中，所述嘌呤或嘧啶碱基配对部分选自于由胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶及胸腺嘧啶所组成的组。
12.权利要求1-11中任一项所述的缀合物，其中，所述至少一种寡核苷酸类似物包含约15个至约35个单体单元。
13.权利要求1-12中任一项所述的缀合物，其中，所述缀合物用于至少一种靶核酸分子的检测；其中，所述至少一种寡核苷酸类似物包含靶互补序列。
14.权利要求13所述的缀合物，其中，所述至少一种寡核苷酸类似物包含非靶互补序列。
15.权利要求1-13中任一项所述的缀合物，其中，所述至少一种寡核苷酸类似物经由官能团共价连接至所述纳米颗粒。
16.权利要求15所述的缀合物，其中，所述官能团包括巯基。
17.权利要求1-16中任一项所述的缀合物，其中，所述至少一种寡核苷酸类似物经由它的3’端或5’端连接至所述纳米颗粒。
18.权利要求1-17中任一项所述的缀合物，其中，所述缀合物包含多于一种寡核苷酸类似物，其中，所述多于一种寡核苷酸类似物具有不同的碱基序列。
19.权利要求18所述的缀合物，其中，所述缀合物用于至少一种靶核酸分子的检测；其中，所述多于一种寡核苷酸类似物包含不同的靶互补序列。
20.一种用于检测靶核酸分子的方法，该方法包括如下步骤：
（i）在能够使权利要求1-19中任一项所述的至少一种缀合物与靶核酸彼此杂交的条件下，将所述至少一种缀合物与包含所述靶核酸分子的样品接触，以形成缀合物:靶核酸分子复合物，其中，所述磷酰二胺吗啉代寡核苷酸或其衍生物包含与所述靶核酸中含有的核苷酸序列互补的核苷酸序列；以及
（ii）检测所形成的复合物。
21.权利要求20所述的方法，其中，至少两种不同的缀合物被用于复合物的形成和检测。
22.权利要求21所述的方法，其中，所述至少两种不同的缀合物的寡核苷酸类似物的靶互补序列不同。
23.权利要求22所述的方法，其中，所述至少两种不同的缀合物的不同靶互补序列杂交至同一靶核酸上的不同序列，从而使所述至少两种缀合物交联。
24.权利要求20-23中任一项所述的方法，其中，在电解质存在的情况下检测所述靶核酸。
25.权利要求24所述的方法，其中，所述电解质选自于由NaCl、MgCl2、NiCl2、NaBr、ZnCl2、MnCl2、BrCl、CdCl2、CaCl2、CoCl2、CoCl3、CuCl2、CuCl、PbCl2、PtCl2、PtCl4、KCl、RbCl、AgCl、SnCl2、BrF、LiBr、KBr、AgBr、NaNO2、Na3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、KH2PO4和K2HPO4所组成的组。
26.权利要求24或25所述的方法，其中，所述电解质的浓度在约0mM至约500mM的范围内。
27.权利要求20-26中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸的浓度在约0.05nM至约2000nM的范围内。
28.权利要求20-27中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸包含至少一个单核苷酸多态性。
29.一种用于检测靶核酸分子中至少一个单核苷酸多态性的方法，该方法包括如下步骤：
i）将所述靶核酸分子与权利要求1-19中任一项所述的至少一种缀合物接触，以形成缀合物:靶核酸分子复合物，其中，所述磷酰二胺吗啉代寡核苷酸或其衍生物包含与所述靶核酸中含有的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
ii）测量所述缀合物:靶核酸分子复合物的解链转变温度；以及
iii）将在ii）中测量的所述复合物的解链转变温度与对照复合物的解链转变温度进行比较，其中，如果与对照复合物相比，所述缀合物:靶核酸分子复合物具有较低的解链转变温度，这表明该靶核酸分子包含至少一个单核苷酸多态性。
30.权利要求29所述的方法，其中，所述对照复合物包括不含有单核苷酸多态性的靶核酸。
31.权利要求1-19中任一项所述的至少一种缀合物在靶核酸分子检测中的用途。
32.权利要求31所述的用途，其中，所述靶核酸分子包含至少一个单核苷酸多态性。
33.一种用于靶核酸分子检测的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-19中任一项所述的至少一种缀合物。
34.权利要求33所述的试剂盒，该试剂盒进一步包含一种或多种对照核酸分子，所述对照核酸分子与所述缀合物的至少一种寡核苷酸类似物的靶互补序列完全互补。
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